專利名稱：重組t4噬菌體油乳化疫苗的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及雞傳染性囊病病毒基因工程疫苗的制備方法及其在傳染性囊病疫苗免疫中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
傳染性囊病病毒(IBDV)屬于雙RNA病毒科(Bimaviridae)禽雙RNA病毒屬(Avibirnavirus)，它是雞傳染性囊病的病原。目前普遍認(rèn)為IBDV具有4種成熟蛋白質(zhì)VP1、VP2、VP3和VP4，分子量分別為90kDa、37-40kDa、32-35kDa和24-30kDa。其中VP2和VP3是主要的結(jié)構(gòu)蛋白，分別占病毒總蛋白的51％和40％。VP2分子量約為40kDa，它含有血清型特異性的能誘導(dǎo)中和抗體的抗原決定簇，是病毒的主要宿主保護(hù)性免疫原(Hudson et al，1986)。
自Azad et al(1986)首次在大腸桿菌中表達(dá)002-73株的結(jié)構(gòu)蛋白以來，IBDV所有的結(jié)構(gòu)蛋白，包括VP1、VP2、VP3和多聚蛋白前體，以及非結(jié)構(gòu)蛋白VP5，先后在各種表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行了表達(dá)。特別是IBDV主要免疫原VP2，已先后在大腸桿菌、酵母、痘病毒、昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)、腺病毒等表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行了表達(dá)。但還沒有用噬菌體表達(dá)IBDV結(jié)構(gòu)蛋白的報(bào)道。
噬菌體表面展示技術(shù)(phage display)是1980年代發(fā)展起來的一項(xiàng)新的生物技術(shù)(Smith，1985)，它能將表達(dá)的外源多肽和蛋白質(zhì)以融合蛋白的形式展示在噬菌體表面，并保持相對(duì)獨(dú)立的空間構(gòu)象和生物活性。T4噬菌體屬于有尾噬菌體中A群A2亞群的典型成員，其基本形態(tài)結(jié)構(gòu)是頭長(zhǎng)徑約95nm，橫徑約為65nm。T4噬菌體衣殼由3種必需衣殼蛋白組成，主要的衣殼蛋白gp23和2個(gè)次要衣殼蛋白gp24、gp20。其中分子量為45kDa的gp23在每個(gè)病毒顆粒中有960個(gè)拷貝，而其余2個(gè)次要衣殼蛋白拷貝數(shù)較少，gp24有55個(gè)拷貝，而gp20只有12個(gè)拷貝。此外，在衣殼的外表面包被著2種非必需外殼蛋白分子量為9kDa的SOC和分子量為40kDa的HOC，二者相距7nm，以對(duì)稱的形式分布于噬菌體二十面體表面。SOC和HOC僅提供噬菌體額外的穩(wěn)定能力，是在噬菌體衣殼裝配完成后才組裝到衣殼表面的，它們的缺失不影響T4噬菌體的繁殖和感染。將外源蛋白與T4噬菌體表面的SOC或者HOC蛋白形成融合蛋白，從而可以獲得具有外源蛋白的重組T4噬菌體。采用這樣的方法，獲得了表達(dá)愛滋病毒(HIV)gp120 V3肽、脊髓灰質(zhì)炎病毒VP1(Ren et al，1996)、腦膜炎奈氏菌PorA(Jiang et al，1997)抗原蛋白的重組T4噬菌體。
獲得表達(dá)傳染性囊病病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP2的重組T4噬菌體，并以此重組噬菌體為抗原制作傳染性囊病疫苗目前未見報(bào)導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于獲得表達(dá)傳染性囊病病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP2的重組T4噬菌體，并以此重組噬菌體為抗原制作傳染性囊病疫苗，為傳染性囊病的防治提供一種新型的疫苗。
本發(fā)明提供的重組T4噬菌體是采用基因重組的方法獲得的。其構(gòu)建方法是(1)將傳染性囊病病毒vp2基因的cDNA片段插入pR質(zhì)粒(Renet al，1996)中，構(gòu)建重組整合質(zhì)粒pR-VP2，其操作步驟如下用EcoR I在37℃分別消化vp2基因的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pR，接著在T4連接酶的作用之下，連接消化的vp2的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pR。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。經(jīng)Ampr抗性篩選，獲得插入了vp2基因的重組子。然后用1對(duì)特異性引物SOC-S(5′-GAATCATATGGCTAGTCTCGCGG-3′)/VP2-A(5′-ATTTGAATTCCTATAGGCCCGAATTAGTCCTT-3′)進(jìn)行PCR篩選。對(duì)PCR篩選陽(yáng)性的細(xì)菌，挑取單菌落接種于3mL LA培養(yǎng)基中，37℃，200r/m振搖培養(yǎng)16-20h，抽提質(zhì)粒，再經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化和序列測(cè)定，獲得重組整合質(zhì)粒pR-VP2。
(2)用重組整合質(zhì)粒pR-VP2和缺陷性T4噬菌體T4-Z1(Ren et al，1996)進(jìn)行同源重組，獲得表達(dá)VP2蛋白的重組T4噬菌體，其操作步驟如下用整合質(zhì)粒pR-VP2轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得的大腸桿菌為E-VP2；在裝入500μL SC培養(yǎng)液的器皿中加入1μL氨卞青霉素(Amp)，然后加入10μL E-VP2，在37℃培養(yǎng)至光密度值OD600大約為0.5時(shí)，加入50μL T4-Z1，在35℃200r/m振搖培養(yǎng)至有細(xì)菌碎片出現(xiàn)，獲得的產(chǎn)物為未鑒定的重組T4噬菌體；在1個(gè)經(jīng)過滅菌的器皿中加入培養(yǎng)超過12小時(shí)的大腸桿菌DH5α600μL，不加溶菌酶，將在2-10℃儲(chǔ)存的SC頂層培養(yǎng)基放在微波爐中溶解，待瓊脂溫度降到45℃左右的時(shí)候取2mL倒入裝有大腸桿菌DH5α的器皿中，將混合液混勻，立即倒在平皿上，當(dāng)瓊脂完全冷凝時(shí)，在SC頂層培養(yǎng)基上分別點(diǎn)10μL未鑒定的重組T4噬菌體，待吸收完畢后，放在37℃培養(yǎng)16小時(shí)以上如果E-VP2中的質(zhì)粒與T4-Z1發(fā)生了重組，成功地將vp2基因轉(zhuǎn)入T4噬菌體中，則在沒有加溶菌酶的平皿上可以生長(zhǎng)出噬菌斑；再在平皿上鋪SC頂層培養(yǎng)基，用滅菌牙簽把生長(zhǎng)出的噬菌斑在SC頂層培養(yǎng)基上點(diǎn)梅花斑，放在37℃培養(yǎng)12小時(shí)以上，生長(zhǎng)良好的梅花斑用消毒好的刀片將其剝下，浸泡在磷酸緩沖液中6小時(shí)；用特異性引物VP2-S(5′-TGAAGAATTCTATGACGAACCTGCAA-3′)/VP2-A從陽(yáng)性梅花斑浸泡液中擴(kuò)增到特異性條帶，則說明表達(dá)VP2蛋白的重組T4噬菌體已獲得。
SC培養(yǎng)液按下列方法配制每1000mL中含有10g Tryptone和5gNaCl，加雙蒸水定容至1000mL，15lpf/in2高壓滅菌20min后4℃保存。
SC底層培養(yǎng)基按下列方法配制每1000mL中含有10g Tryptone，5g NaCl和12g瓊脂粉，雙蒸水定容至1000mL，15lpf/in2高壓滅菌20min，冷卻至50℃，加入滅菌的50mL 1mol/L HCl和10mL 25％檸檬酸鈉·2H2O溶液，搖勻后倒平板，4℃保存。
SC頂層培養(yǎng)基按下列方法配制每1000mL中含有10g Tryptone，5g NaCl和7g瓊脂粉，雙蒸水定容至1000mL，15lpf/in2高壓滅菌20min，4℃保存。用時(shí)加熱溶解，冷卻至50℃，加入滅菌的50mL 1mol/L HCl和10mL 25％檸檬酸鈉·2H2O溶液，搖勻后備用。
重組T4噬菌體油乳化疫苗的制備方法如下將重組T4噬菌體滅活，其方法是向裝有重組T4噬菌體的容器中加入福爾馬林，使福爾馬林的最終濃度達(dá)到0.1％，37℃保溫20小時(shí)以上。
按以下配方制備油相，每100mL油相組成為4mL司本80，2mL司本85，94mL 10號(hào)礦物油，2g硬脂酸鋁，15lpf/in2高壓滅菌20min，冷卻待用；按以下配方制備水相，每100mL水相組成為96mL噬菌體懸液，4mL滅菌過的吐溫80，3000r/m攪拌均勻；在組織搗碎機(jī)加入200mL油相，一邊慢速攪拌，一邊緩緩加入100mL水相，待混合均勻之后，10 000r/m快速攪拌2min，獲得的白色油乳劑即為重組T4噬菌體油乳化疫苗；重組T4噬菌體油乳化疫苗具有以下特征1.重組T4噬菌體油乳化疫苗是以含有傳染性囊病病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP2的重組T4噬菌體為抗原制備的，重組T4噬菌體的特征為(1)重組T4噬菌體具有序列表中序列1的核苷酸序列。序列1又稱為vp2基因，由1350個(gè)堿基對(duì)組成，是IBDV主要結(jié)構(gòu)蛋白VP2的編碼基因。序列1和T4噬菌體soc基因組成融合基因。該融合基因位于重組T4噬菌體溶菌酶基因(e)和den V基因之間。該序列采用PCR方法可以擴(kuò)增出特異性條帶。
(2)重組T4噬菌體具有序列表中序列2的氨基酸序列。序列2又稱為VP2蛋白，是由序列1編碼的。其分子量約為40kDa，由450個(gè)氨基酸殘基組成，它含有血清型特異性的能誘導(dǎo)中和抗體的抗原決定簇，是IBDV的主要宿主保護(hù)性免疫原。VP2上的抗原決定簇為構(gòu)象依賴性的，其誘導(dǎo)的中和抗體能被動(dòng)地保護(hù)宿主免受IBDV的感染。該序列和T4噬菌體SOC蛋白組成融合蛋白，位于重組T4噬菌體頭部表面。采用抗SOC或抗VP2的特異性抗體，可以檢測(cè)到該融合蛋白。
(3)本發(fā)明提供的重組T4噬菌體還包括具有vp2等同基因的T4噬菌體。vp2等同基因，是與vp2基因的核苷酸序列或氨基酸殘基序列相比有一個(gè)或若干個(gè)核苷酸或氨基酸殘基的差別，包括堿基或氨基酸殘基的改變、缺失、添加、或插入，或與vp2基因序列中的連續(xù)200堿基以上的區(qū)段有85％以上的同源性。
2.重組T4噬菌體油乳化疫苗中油相和水相的比例一般為2∶1，但這一比例是可以改變的，其變化幅度在1∶1和3∶1之間。
本發(fā)明提供的重組T4噬菌體疫苗具有重要的應(yīng)用價(jià)值。應(yīng)用之一是用該疫苗免疫雞，可以獲得抗VP2的特異性抗體，并能保護(hù)免疫雞抵抗傳染性囊病病毒的攻擊。
本發(fā)明具有明顯的優(yōu)點(diǎn)和效果。本發(fā)明提供的重組T4噬菌體易于純化，展示在T4噬菌體表面的VP2蛋白具有完整的空間構(gòu)象。由于SOC位點(diǎn)在T4噬菌體頭部表面具有960個(gè)拷貝，所以與SOC融合表達(dá)的VP2蛋白的拷貝數(shù)高。由于VP2蛋白分布于T4噬菌體頭部表面，因而T4噬菌體本身充當(dāng)了VP2蛋白的載體，當(dāng)本發(fā)明提供的重組T4噬菌體作為抗原時(shí)，VP2的免疫原性比單獨(dú)的VP2蛋白強(qiáng)。作為疫苗的抗原、或者作為免疫檢測(cè)的抗原使用時(shí)，和其它的蛋白表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的VP2蛋白相比，本發(fā)明所述的重組T4噬菌體具有明顯的優(yōu)點(diǎn)。
以下結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明提供的表達(dá)傳染性囊病病毒VP2的重組T4噬菌體的構(gòu)建、特征分析、重組T4噬菌體油乳化疫苗的制備方法、應(yīng)用途徑作具體說明。


圖1為重組整合質(zhì)粒pR-VP2的構(gòu)建示意圖。pR表示整合質(zhì)粒，pR-VP2表示插入了vp2基因的重組整合質(zhì)粒。Ampr表示氨卞青霉素抗性，Kpr表示卡那霉素抗性。e、soc、den V都是T4噬菌體上的基因。EcoRI、BamHI、NdeI、HindIII、PstI、PvuI是質(zhì)粒上的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。
圖2為VP2蛋白在重組T4噬菌體SOC位點(diǎn)展示模式圖。A為重組整合質(zhì)粒pR-VP2；B為缺陷型T4噬菌體ФT4-Z1；C、重組后攜帶有目的基因VP2的重組T4噬菌體ФT4-VP2。
圖3為在平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)重組T4噬菌體。A為10-6稀釋的噬菌體，B為10-7稀釋的噬菌體，C為10-8稀釋的噬菌體，D為10-10稀釋的噬菌體，E為10-11稀釋的噬菌體，F(xiàn)為10-12稀釋的噬菌體。
圖4為重組T4噬菌體的PCR鑒定結(jié)果圖。泳道1-5是含有IBDV vp2基因的重組噬菌體的PCR產(chǎn)物，泳道M為分子量標(biāo)記。
圖5為野生型T4噬菌體及重組T4噬菌體免疫電鏡圖譜。A為野生型T4噬菌體。B為與IBD陽(yáng)性血清反應(yīng)的野生型T4噬菌體。C為重組T4噬菌體。D為與IBD陽(yáng)性血清反應(yīng)的重組T4噬菌體。
具體實(shí)施例方式
1、整合質(zhì)粒pR-VP2的構(gòu)建采用pR質(zhì)粒(Ren et al，1996)構(gòu)建重組整合質(zhì)粒pR-VP2。用EcoRI在37℃分別消化vp2基因的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pR，接著在T4連接酶的作用之下，連接消化的vp2的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pR。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。轉(zhuǎn)化方法為CaCl2法。經(jīng)Ampr抗性篩選，獲得插入了vp2基因的重組子。然后用1對(duì)特異性引物SOC-S/VP2-A進(jìn)行PCR篩選。對(duì)PCR篩選陽(yáng)性的細(xì)菌，挑取單菌落接種于3mL LA培養(yǎng)基中，37℃，200r/m振搖培養(yǎng)16-20小時(shí)。采用E.Z.N.A.Plasmid Minipreps Kit抽提質(zhì)粒，再經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化和序列測(cè)定，獲得重組整合質(zhì)粒pR-VP2。
2、表達(dá)VP2蛋白的重組T4噬菌體的獲得用重組整合質(zhì)粒pR-VP2和缺陷性T4噬菌體T4-Z1(Ren et al，1996)進(jìn)行同源重組，獲得表達(dá)VP2蛋白的重組T4噬菌體。
先用整合質(zhì)粒pR-VP2轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得的大腸桿菌為E-VP2。然后進(jìn)行以下操作。
在裝入500μL SC培養(yǎng)液的試管中加入1μL Amp，然后加入10μLE-VP2，在37℃培養(yǎng)至OD600大約0.5時(shí)，加入50μL T4-Z1，繼續(xù)在35℃200r/m振搖培養(yǎng)至有細(xì)菌碎片出現(xiàn)，獲得的產(chǎn)物為未鑒定的重組T4噬菌體；在1個(gè)經(jīng)過滅菌的器皿中加入培養(yǎng)超過12小時(shí)的大腸桿菌DH5α600μL，不加溶菌酶，將在4℃儲(chǔ)存的SC頂層培養(yǎng)基放在微波爐中溶解，待瓊脂溫度降到45℃左右的時(shí)候取2mL倒入裝有大腸桿菌DH5α的器皿中，將混合液在旋渦震蕩器上混勻，立即倒在平皿上。等到瓊脂完全冷凝時(shí)，在SC頂層培養(yǎng)基上分別點(diǎn)10μL未鑒定的重組T4噬菌體，待吸收完畢后，放在37℃培養(yǎng)16小時(shí)以上，如果E-VP2中的質(zhì)粒與T4-Z1發(fā)生了重組，成功地將vp2基因轉(zhuǎn)入T4噬菌體中，則在不加溶菌酶的平皿上可以生長(zhǎng)出噬菌斑；
在滅菌的平皿上鋪SC頂層培養(yǎng)基，然后用滅菌牙簽把生長(zhǎng)出的噬菌斑在SC頂層培養(yǎng)基上點(diǎn)梅花斑，放在37℃培養(yǎng)12小時(shí)以上，生長(zhǎng)良好的梅花斑用消毒好的刀片將其剝下，浸泡在磷酸緩沖液中6小時(shí)；采用PCR篩選T4噬菌體轉(zhuǎn)化子。檢測(cè)vp2基因的PCR反應(yīng)體系組成如下每25μL反應(yīng)體系中含2.5μL 10×PCR緩沖液，2μL dNTPs，0.3μL Taq酶，0.5μL VP2-S(5′-TGAAGAATTCTATGACGAACCTGCAA-3′)，0.5μL VP2-A，1μL梅花斑浸泡液和18.2μL雙蒸水。將反應(yīng)混合物混勻、離心后，在PCR儀上進(jìn)行溫度循環(huán)。溫度循環(huán)程序如下首先94℃3min；然后94℃40sec、51℃40sec、72℃90sec，共循環(huán)30次；最后72℃10min。采用1％瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mL溴化乙啶)電泳對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。如果觀察到特異性條帶，則說明已獲得了表達(dá)VP2蛋白的重組T4噬菌體。
SC培養(yǎng)液按下列方法配制每1000mL中含有10g Tryptone和5gNaCl，加雙蒸水定容至1000mL，15lpf/in2高壓滅菌20min后4℃保存。
SC底層培養(yǎng)基按下列方法配制每1000mL中含有10g Tryptone，5g NaCl和12g瓊脂粉，雙蒸水定容至1000mL，15lpf/in2高壓滅菌20min，冷卻至50℃，加入滅菌的50mL 1mol/L HCl和10mL 25％檸檬酸鈉·2H2O溶液，搖勻后鋪平板，4℃保存。
SC頂層培養(yǎng)基按下列方法配制每1000mL中含有10g Tryptone，5g NaCl和7g瓊脂粉，雙蒸水定容至1000mL，15lpf/in2高壓滅菌20min，4℃保存。用時(shí)加熱溶解，冷卻至50℃，加入滅菌的50mL 1mol/L HCl和10mL 25％檸檬酸鈉.2H2O溶液，搖勻后備用。
3、重組T4噬菌體的免疫電鏡觀察分別取野生型T4噬菌體、重組T4噬菌體和1/3體積IBD陽(yáng)性血清混合，37℃放置1小時(shí)后，直接涂片。同時(shí)用不加陽(yáng)性血清的上述噬菌體作對(duì)照。磷鎢酸負(fù)染，JEM-1010型透射電鏡觀察。比較與IBD抗血清反應(yīng)前后的噬菌體形態(tài)，發(fā)現(xiàn)野生型T4噬菌體的形態(tài)不受IBD陽(yáng)性血清的影響；而重組T4噬菌體的形態(tài)受IBD陽(yáng)性血清影響明顯。未與IBD陽(yáng)性血清反應(yīng)的重組T4噬菌體的形態(tài)與野生型T4噬菌體形態(tài)相同，頭部為白色；而與抗血清作用之后的重組T4噬菌體頭部變黑。
4、重組T4噬菌體的ELISA檢測(cè)將重組T4噬菌體用包被緩沖液進(jìn)行系列稀釋，然后在96孔聚乙烯酶標(biāo)板上每孔加入稀釋的噬菌體200μL，4℃放置12小時(shí)以上。棄去溶液，用PBS緩沖液洗3次。接著每孔加入封閉液100μL，37℃保溫1小時(shí)。棄去溶液后，用清洗緩沖液洗3次。接著每孔加入100μL 1000倍稀釋的IBD特異性血清，37℃保溫1h。棄去血清后，用清洗緩沖液洗3次。然后每孔加入100μL 1∶2500稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗雞IgG，37℃保溫1h。棄去溶液后，用清洗緩沖液洗3次。再加入100μL反應(yīng)底物，25℃保溫20min后，加入2％硫酸作為反應(yīng)終止液。最后用Emax酶標(biāo)儀于630nm波長(zhǎng)讀數(shù)。結(jié)果表明，重組T4噬菌體與IBDV陽(yáng)性血清呈特異性反應(yīng)，當(dāng)重組T4噬菌體1∶10000以內(nèi)稀釋時(shí)，S/N均超過2.0。
反應(yīng)底物的配制方法5gTMB溶于5mL無(wú)水乙醇，取4mL加0.2mol/LpH6.0的醋酸鈉溶液16mL，用時(shí)加等體積的0.03％的H2O2，現(xiàn)配現(xiàn)用。
5、重組T4噬菌體油乳化疫苗的制備重組T4噬菌體油乳化疫苗的制備方法如下將重組T4噬菌體滅活，其方法是向裝有重組T4噬菌體的容器中加入福爾馬林，使福爾馬林的最終濃度達(dá)到0.1％，37℃保溫20小時(shí)以上；按以下配方制備油相，每100mL油相組成為4mL司本80，2mL司本85，94mL 10號(hào)礦物油，2g硬脂酸鋁。15lpf/in2高壓滅菌20min，冷卻待用。再按以下配方制備水相。每100mL水相組成為96mL噬菌體懸液，4mL滅菌過的吐溫80。3 000r/m攪拌均勻。在組織搗碎機(jī)加入200mL油相，一邊慢速攪拌，一邊緩緩加入100mL水相。待混合均勻之后，10 000r/m快速攪拌2min。獲得的白色油乳劑即為重組T4噬菌體油乳化疫苗。將制備好的重組T4噬菌體油乳化疫苗置于4℃保存。
6、重組T4噬菌體油乳化疫苗免疫雞的實(shí)驗(yàn)效果40只1天齡SPF白來航雞隨機(jī)分成2組，每組20只，飼養(yǎng)在隔離器中，飲水和飼料均經(jīng)過滅菌消毒處理。飼養(yǎng)至28天時(shí)，進(jìn)行皮下接種。第1組為空白對(duì)照組，不免疫；第2組為重組T4噬菌體免疫組，每只雞的免疫劑量為2×109個(gè)噬菌體。42天齡時(shí)進(jìn)行第2次免疫，分組處理及免疫劑量與28天齡時(shí)相同，免疫途徑為肌肉注射。
分別在第2次免疫后15天(57天齡)、30天(72天齡)采血，按常規(guī)方法分離血清，保存在-20℃，每組每次抽10只雞采血。采用IDEXX公司的IBD ELISA試劑盒測(cè)定血清中IBD抗體，用S/P表示抗體水平。57天齡時(shí)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組S/P分別為0.18和0.53；72天齡時(shí)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組S/P分別為0.23和0.90。
7、用重組T4噬菌體作為抗原檢測(cè)雞血清中IBD抗體以重組T4噬菌體為包被抗原，建立檢測(cè)IBD抗體的ELISA方法。將重組噬菌體稀釋為1×108/ml，每孔加入100μL稀釋稀T4噬菌體，4℃放置12小時(shí)以上。用清洗緩沖液(PBS，pH7.2，含0.05％吐溫20)洗3次后，每孔加入100μL5％的脫脂奶粉/PBS，37℃放置2h。用清洗緩沖液洗3次后，每孔加入100μL 1∶100稀釋的IBD陽(yáng)性血清，37℃反應(yīng)1h。再用清洗緩沖液洗3次后，每孔加入100μL適當(dāng)稀釋的辣根過氧化酶標(biāo)記的鼠抗雞IgG抗體，37℃反應(yīng)1h。每孔加入反應(yīng)底物100μL，室溫觀察顏色變化。在10-30min時(shí)達(dá)到顯色高峰。每孔加入100μL終止液(1mol/L H2SO4)，終止顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上讀取OD450值。該方法具有良好的特異性。用該方法檢測(cè)雞新城疫(ND)特異性血清、雞腦脊髓炎(AE)特異性血清、雞傳染性支氣管炎(IB)特異性血清、雞傳染性喉氣管炎(ILT)特異性血清、禽流感(AI)特異性血清，無(wú)交叉反應(yīng)性。對(duì)采自現(xiàn)場(chǎng)的92份IBD陽(yáng)性血清的檢測(cè)結(jié)果與IDEXX公司的IBD ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性為97.8％。
序列表序列數(shù)2序列1(1)類型DNA(2)長(zhǎng)度1350堿基對(duì)(3)序列atgacgaacc tgcaagatca aacccaacag attgttccgt tcatacggag ccttctgatg60ccaacaaccg gaccggcgtc cattccggac gacaccctag agaagcacac tctcaggtca 120gagacctcga cctacaattt gactgtgggg gacacagggt cagggctaat tgtctttttc 180cctggtttcc ctggctcaat tgtgggtgct cactacacac tgcagagcaa tgggaactac 240aagttcgatc agatgctcct gactgcccag aacctaccgg ccagctacaa ctactgcagg 300ctagtgagtc ggagtctcac agtgaggtca agcacactcc ctggtggcgt ttatgcacta 360aatggcacca taaacgccgt gaccttccaa ggaagcctga gtgaactgac agatgttagc 420tacaatgggt tgatgtctgc aacagccaac atcaacgaca aaatcgggaa cgtcctagta 480ggggaagggg taaccgtcct cagcttaccc acatcatatg atcttgggta tgtgagactc 540ggtgacccca ttcccgctat agggctcgac ccaaaaatgg tagcaacatg tgacagcagt 600gacaggccca gagtctacac cataactgca gccgatgatt accaattctc atcacagtac 660caagcaggtg gggtaacaat cacactgttc tcagctaata tcgatgccat cacaagcctc 720agcatcgggg gagaactcgt gtttcaaaca agcgtccaag gccttatact gggtgctacc 780atctacctta taggctttga tgggactgcg gtaatcacca gagctgtggc cgcagacaat 840gggctaacgg ccggcactga caaccttatg ccattcaaca ttgtgattcc aaccagcgag 900ataacccagc caatcacatc catcaaactg gagatagtga cctccaaaag tggtggtcag 960gcgggggatc agatgtcatg gtcagcaagt gggagcctag cagtgacgat ccacggaggc 1020aactacccag gggccctccg tcccgtcaca ctagtagcct acgaaagagt ggcaacaggg 1080tctgtcgtta cggtcgccgg ggtgagcaac ttcgagctga tcccaaatcc tgaactagca 1140aagaacctgg tcacagaata cggccgattt gacccagggg ccatgaacta cacaaaattg 1200atactgagtg agagggaccg tcttggcatc aagaccgtat ggccaacaag ggagtacact 1260gactttcgcg agtacttcat ggaggtggca gacctcaact ctcccctgaa gattgcagga 1320gcatttggct tcaaggacat aattcgggca 1350
序列2(1)類型蛋白質(zhì)(2)長(zhǎng)度450氨基酸殘基(3)序列MTNLQDQTQQ IVPFIRSLLM PTTGPASIPD DTLEKHTLRS ETSTYNLTVG DTGSGLIVFF 60PGFPGSIVGA HYTLQSNGNY KFDQMLLTAQ NLPASYNYCR LVSRSLTVRS STLPGGVYAL 120NGTINAVTFQ GSLSELTDVS YNGLMSATAN INDKIGNVLV GEGVTVLSLP TSYDLGYVRL 180GDPIPAIGLD PKMVATCDSS DRPRVYTITA ADDYQFSSQY QAGGVTITLF SANIDAITSL 240SIGGELVFQT SVQGLILGAT IYLIGFDGTA VITRAVAADN GLTAGTDNLM PFNIVIPTSE 300ITQPITSIKL EIVTSKSGGQ AGDQMSWSAS GSLAVTIHGG NYPGALRPVT LVAYERVATG 360SVVTVAGVSN FELIPNPELA KNLVTEYGRF DPGAMNYTKL ILSERDRLGI KTVWPTREYT 420DFREYFMEVA DLNSPLKIAG AFGFKDIIRA 450
權(quán)利要求
1.重組T4噬菌體油乳化疫苗的制備方法，其特征在于先將已制備的油相放于組織搗拌機(jī)內(nèi)，一邊搗拌，一邊緩緩和加入水相，待混合均勻后，10000r/m快速攪拌2min，獲得白色重組T4噬菌體油乳化疫苗，油相與水相比例為1-3∶1；油相的制備每100ml油相組成為4mL司本80，2mL司本85，94mL10號(hào)礦物油，2g硬脂酸鋁，15lpf/in2高壓滅菌20min，冷卻即成；水相的制備每100mL水相組成為96mL噬菌體懸液，4mL滅菌過吐溫，3000r/m攪拌均勻，即成。
全文摘要
本發(fā)明涉及雞傳染性囊病病毒基因工程疫苗的制備，尤其是重組T4噬菌體油乳化疫苗的制備。本發(fā)明提供了一個(gè)用含有雞傳染性囊病病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP2的重組T4噬菌體為抗原制備油乳化疫苗的方法，該疫苗含有傳染性囊病病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP2。本發(fā)明還涉及重組T4噬菌體在傳染性囊病疫苗免疫中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P31/14GK1554445SQ20031011751
公開日2004年12月15日 申請(qǐng)日期2003年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月25日
發(fā)明者曹永長(zhǎng), 畢英佐, 馬靜云 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)