專利名稱：纖調(diào)蛋白聚糖通過調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)來誘導組織再生的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過施用纖調(diào)蛋白聚糖來調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)以在組織損傷后誘導組織再生。
背景技術(shù)：
受到傷害后，成年人的皮膚需要通過諸如疤痕形成這種非再生性過程來修復(fù)，這個過程的特點是損傷組織由紊亂的膠原沉積和各種細胞外基質(zhì)成分代替，其總稱為“疤痕”。相反，胎兒皮膚的修復(fù)通過有組織的膠原沉積和細胞外基質(zhì)成分進行細胞再生和重建正常皮膚的結(jié)構(gòu)，得到不留疤痕的修復(fù)。研究表明再生性皮膚修復(fù)的能力是胎兒的皮膚與生俱來的，而且并不需要胎兒的免疫系統(tǒng)、胎兒血清或羊水(Bleacher JCet al.，1993，J Pediatr Surg，281312-1315；Ihara，S andMotobayashi，Y，1992，Development，114573-582)。例如，將分離的人胎兒皮膚移植到無胸腺小鼠中其治愈過程中并沒有產(chǎn)生典型的疤痕組織(Adzick，NS and Lorenz，HP，1994，Ann Surg，22010-18)。
胎兒皮膚的細胞外基質(zhì)的組成與成年人皮膚具有明顯差異。這樣，胎兒的成纖維細胞和胎兒的細胞外基質(zhì)之間的動態(tài)關(guān)系是唯一的，其顯然不同于成人皮膚中的成纖維細胞和細胞外基質(zhì)的相互作用。例如，胎兒的成纖維細胞產(chǎn)生的III型膠原高于I型膠原，還伴隨著不同結(jié)構(gòu)的蛋白聚糖；蛋白聚糖是攜帶一種或多種糖胺多糖側(cè)鏈，在對細胞外基質(zhì)裝配、細胞的相互作用和生長因子的儲存中起到關(guān)鍵作用的核心蛋白(Ruoslahti，E，1989，J Biol Chem，264；13369-13372)。
核心蛋白聚糖，雙糖鏈蛋白聚糖，基膜聚糖和纖調(diào)蛋白聚糖是小亮氨酸富集的蛋白聚糖，具有通過它們的核心蛋白的相互作用調(diào)節(jié)膠原原纖維生成和確定膠原沉積模式(有序或紊亂)的能力。Kresse，H，Schonherr，E，and Bittner，K，1994，Eur J Clin Chem Clin Biochem，32259-264。例如，已經(jīng)顯示核心蛋白聚糖和纖調(diào)蛋白聚糖結(jié)合到三螺旋膠原分子上的獨特的分離位點，以調(diào)節(jié)膠原原纖維生成。
除了調(diào)節(jié)膠原的裝配，核心蛋白聚糖，雙糖鏈蛋白聚糖和纖調(diào)蛋白聚糖都可以結(jié)合到轉(zhuǎn)化生長因子-β配體中(TGF-β1，β2和-β3)，它們在個體發(fā)生中涉及由胎兒的無痕修復(fù)轉(zhuǎn)化到成人的有疤修復(fù)中。特別是，TGF-β1和TGF-β2可以促進疤痕形成而TGF-β3可以減少疤痕形成。
另外，還顯示出在體外當對腎小球性腎炎的大鼠模型經(jīng)靜脈內(nèi)施用核心蛋白聚糖時，通過減少TGF-β-介導的細胞外基質(zhì)聚集而改善了腎小球的損傷。這樣，核心蛋白聚糖通過其與TGF-β的結(jié)合而能夠抑制或扼制TGF-β的生物活性。
因此，具有結(jié)合和/或中和TGF-βs特點的分子顯示能夠減少疤痕。在這個思路的基礎(chǔ)上，已經(jīng)申請了涉及經(jīng)由在包括核心蛋白聚糖，雙糖鏈蛋白聚糖和纖調(diào)蛋白聚糖的核心蛋白聚糖的蛋白聚糖族之內(nèi)的TGF-β分子調(diào)節(jié)子來中和TGF-β活性而降低疤痕組織的能力的若干專利申請(Ruoslahti的美國專利5,583,103；Logan et al.的美國專利5,958,411；Ruoslahti的美國專利5,654,270；和Border的美國專利5,824,655)。
上述所有專利均以蛋白聚糖如核心蛋白聚糖可以通過它們的TGF-β結(jié)合能力減少疤痕這一假設(shè)為基礎(chǔ)。未有文獻涉及到蛋白聚糖中核心蛋白聚糖族影響膠原原纖維形成和沉積作用的能力。膠原原纖維形成和沉積作用是直接確定組織修復(fù)過程中是以有序(無痕)還是無序(有痕)的方式的因素；其最終在無痕修復(fù)中更為重要。
這樣，上述所有專利提及纖調(diào)蛋白聚糖通過其TGF-β結(jié)合能力而作為一種潛在的疤痕減少劑，只是基于這樣的事實，即纖調(diào)蛋白聚糖和核心蛋白聚糖一樣屬于相同的蛋白聚糖族，其證明具有抗-TGF-β調(diào)節(jié)活性。在現(xiàn)有的專利中沒有真實的實驗使用纖調(diào)蛋白聚糖來減少疤痕。剔除小鼠模型顯示不嚴格地說纖調(diào)蛋白聚糖和核心蛋白聚糖都屬于相同的蛋白聚糖家族，但它們之間有不可互換的明顯的不同作用。例如，核心蛋白聚糖缺陷小鼠顯示皮膚脆弱，而纖調(diào)蛋白聚糖缺陷小鼠顯示未知的皮膚缺陷(Ameye L和Young M，2002，Glycobiology，12(9)107R-116R)。另外，更類似于核心蛋白聚糖而不是纖調(diào)蛋白聚糖的另一種小亮氨酸富集的蛋白聚糖-雙糖鏈蛋白聚糖導致骨質(zhì)減少和沒有見到描述過皮膚異常。因此，很顯然，盡管纖調(diào)蛋白聚糖、核心蛋白聚糖和雙糖鏈蛋白聚糖屬于相同的蛋白聚糖家族，其中核心蛋白聚糖和雙糖鏈蛋白聚糖屬于蛋白聚糖的同一亞族，但它們各自具有不可互換的不同的生理功能，它們對膠原纖維的合成具有不同的影響。
而且，研究表明單獨中和TGF-β配體并不足以消除疤痕組織(Shah，Met al.，1995，J Cell Sci，108985-1002)。例如，通過應(yīng)用TGF-β抗體中和TGF-β活性僅僅能減少疤痕組織并不能完全消除疤痕。因此，通過施用TGF-β結(jié)合分子來抑制TGF-β的過表達并不能完全阻止疤痕的形成。所以，在傷口愈合的過程中還存在其他的分子及其分子作用。


圖1顯示了纖調(diào)蛋白聚糖和抗纖調(diào)蛋白聚糖抗體處理過的胎兒傷口的蘇木精-曙紅染色圖片。傷口是在受傷后72小時采集的，并伴有對照，左圖放大200X，右圖放大400X。紅色箭頭表示永久性染色，黑色箭頭表示毛囊。
A.通常，如果不存在永久性染色和肉膜肌肉的斷裂(藍色箭頭)的話，則難以區(qū)別E16天胎兒傷口無痕愈合與E19天對照皮膚(插入圖)，注意毛囊再生以及沒有炎癥。
B.用抗纖調(diào)蛋白聚糖抗體處理E16天傷口誘導的疤痕形成。沒有毛囊再生，并出現(xiàn)炎癥。
C.相反，用IgG對照溶液處理胎兒E16天傷口沒有誘發(fā)疤痕。注意毛囊。
D.通常，E18天胎兒傷口有疤愈合。在疤痕中存在炎癥細胞(藍色箭頭)，但沒有毛囊。
E.然而，用外源性纖調(diào)蛋白聚糖處理E18天胎兒傷口抑制了疤痕的形成。這些傷口僅僅可以通過永久性染色和肉膜肌肉的斷裂(藍色箭頭)來鑒別，因為沒有明顯的炎癥并且包含毛囊。
F.相反，用膠原對照溶液處理的E18天傷口仍然是有疤修復(fù)。注意炎癥細胞(藍色箭頭)并且無毛囊。
圖2顯示了纖調(diào)蛋白聚糖和抗纖調(diào)蛋白聚糖抗體處理的胎兒傷口的共焦顯微鏡圖片。傷口和對照采自受傷后72小時。膠原纖維用Sirius-red染色呈現(xiàn)白色。紅色空心箭頭表示毛囊。
A.來自E19天胎兒的未受傷皮膚的，用于與E16天傷口進行比較。放大200X。
B.通常，E16天胎兒傷口無痕愈合(200X)。真皮膠原纖維較薄，它們的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)與未受傷皮膚的膠原構(gòu)建不能區(qū)別。
C.相反，在抗纖調(diào)蛋白聚糖抗體處理的E16天胎兒傷口中，膠原纖維較厚，并且更加不規(guī)則排列。放大400X。
D.用IgG對照溶液處理的E16天胎兒傷口膠原纖維較薄，并具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。放大400X。
E.來自E21天胎兒的未受傷皮膚，用于與E18天傷口進行比較。左圖放大400X，右圖放大1000X。
F.通常，E18天胎兒傷口有疤愈合。在疤痕中看不到毛囊。左圖放大400X。在疤痕區(qū)域的膠原纖維較厚，排列不規(guī)則，纖維之間的間隙較大，在高倍放大(右圖1000X)下看得更清楚。
G.然而，給E18天傷口加入纖調(diào)蛋白聚糖抑制了疤痕形成。左圖400X，右圖1000X。此圖中的膠原纖維較薄，傷口創(chuàng)面的膠原的結(jié)構(gòu)非常類似于E21天未受傷皮膚的結(jié)構(gòu)。
H.用膠原對照溶液處理的傷口具有較厚、排列不規(guī)則、間隙較大的膠原纖維。左圖放大400X，右圖放大1000X。
圖3顯示用纖調(diào)蛋白聚糖(0.4μg/μl)或PBS對照溶液處理的成人傷口。傷口采自受傷后2周，組織切片用蘇木精-曙紅染色或者用Sirius-red染色(用于共焦顯微鏡)。黑色箭頭表示傷口創(chuàng)面，紅色箭頭表示永久性染色和肉膜肌肉的斷裂。
A.用纖調(diào)蛋白聚糖處理的成人傷口的蘇木精-曙紅染色，左圖放大200X，右圖放大400X。在較高放大倍數(shù)時，可見真皮膠原纖維呈現(xiàn)平行排列。
B.纖調(diào)蛋白聚糖處理的成人傷口的真皮淺層(靠近表皮和真皮交界處)的共焦顯微鏡圖片。左圖放大400X，右圖放大1000X。白色膠原纖維具有相對均勻、線形外觀，并與上面的表皮相平行。
C.纖調(diào)蛋白聚糖處理的成人傷口的真皮深層的共焦顯微鏡圖片。左圖放大400X，右圖放大1000X。同樣也可以觀察到膠原纖維的平行排列。
D.用對照PBS溶液處理的成人傷口的蘇木精-曙紅染色圖片。左圖放大200X，右圖放大400X。傷口面積大于用纖調(diào)蛋白聚糖處理的傷口面積。
E.對照成人傷口的真皮淺層的共焦顯微鏡圖片，可觀察到膠原纖維不規(guī)則沉積，左圖放大400X，右圖放大1000X。
對照成人傷口的真皮深層的共焦顯微鏡圖片，可更清楚地觀察到膠原纖維不規(guī)則沉積模式，并且膠原纖維形態(tài)變化很大，左圖放大400X，右圖放大1000X。
發(fā)明概要本發(fā)明的總目的是為了提供一種通過利用蛋白聚糖和細胞外基質(zhì)成分改善受傷組織的局部和經(jīng)皮的治療方法，蛋白聚糖和細胞外基質(zhì)成分在疤痕形成中調(diào)節(jié)膠原原纖維形成以促進有序再生的組織修復(fù)而不是導致疤痕形成的無序組織修復(fù)。
依照本發(fā)明的一方面，這些和其他目的由所提供的纖調(diào)蛋白聚糖，一種調(diào)節(jié)膠原纖維裝配和沉積模式的細胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)蛋白而實現(xiàn)。
依照本發(fā)明的一方面，這些和其他目的由所提供的方法而實現(xiàn)，該方法通過釋放與不同的細胞外基質(zhì)成分組合的治療量的纖調(diào)蛋白聚糖來進行組織修復(fù)。
依照本發(fā)明的一方面，這些和其他目的由所提供的方法而實現(xiàn)，該方法通過在可溶的膠原凝膠中以0.5μg/μl至1000μg/μl的治療量的纖調(diào)蛋白聚糖來進行組織修復(fù)。
依照本發(fā)明的一方面，這些和其他目的由所提供的方法而實現(xiàn)，該方法通過釋放含大約0.2g/ml至約4g/ml的透明質(zhì)酸和/或血纖蛋白膠的治療量的纖調(diào)蛋白聚糖來進行組織修復(fù)。
依照本發(fā)明的一方面，這些和其他目的由所提供的方法而實現(xiàn)，該方法通過釋放在可溶的膠原凝膠中的治療量的纖調(diào)蛋白聚糖，或含大約0.01μg/μl至1μg/μl的透明質(zhì)酸和/或血纖蛋白膠的纖調(diào)蛋白聚糖來用于進行美容組織修復(fù)。
發(fā)明詳述這里將對本發(fā)明的具體實施方案進行描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員不背離本發(fā)明的思路的任何修改都是允許的。
在本發(fā)明中，利用了兩種傷口愈合模型1)通過疤痕形成而修復(fù)的成年大鼠皮膚傷口模型；和2)一種獨特的大鼠胎兒傷口愈合模型，在懷孕16(E16)至18(E18)天之間的由胎兒型無痕修復(fù)轉(zhuǎn)化到成年型疤痕組織修復(fù)中。兩種模型都用于發(fā)現(xiàn)不同的基因表達模式，即不同疤痕模型的修復(fù)如成年的和懷孕后期胎兒的傷口愈合，和無痕修復(fù)模型如懷孕早期的胎兒的傷口愈合。兩個模型的應(yīng)用可鑒別胎兒的無痕愈合傷口的獨特的基因和重要性。
通常，在成年的傷口和懷孕后期的胎兒的皮膚中核心蛋白聚糖和雙糖鏈蛋白聚糖都被正調(diào)節(jié)。成年和懷孕后期的胎兒傷口都要經(jīng)由疤痕形成修復(fù)。這樣，這些發(fā)現(xiàn)暗示了核心蛋白聚糖和雙糖鏈蛋白聚糖并不是在正常的環(huán)境下的胎兒型無痕修復(fù)的生理效應(yīng)子。
另外，還表明懷孕早期胎兒的傷口表現(xiàn)的無痕胎兒型修復(fù)和懷孕后期胎兒的傷口表現(xiàn)的成年型有痕修復(fù)都是在皮膚受傷后提高了TGF-β的表達水平。這樣，TGF-β表達水平的提高并不能確定其傷口的愈合是有痕的還是無痕的。換句話說，盡管TGF-β的存在，懷孕早期胎兒的傷口仍然能夠進行無痕修復(fù)。這樣，除了TGF-β之外的分子可能對決定是否無痕修復(fù)顯得更為重要。
更特別的，還表明纖調(diào)蛋白聚糖的蛋白和mRNA在成年或懷孕后期胎兒的表現(xiàn)為有痕成人型修復(fù)的傷口中是負調(diào)節(jié)或最低限度的正調(diào)節(jié)。相反，纖調(diào)蛋白聚糖的蛋白和mRNA在早期懷孕的胎兒表現(xiàn)為無痕胎兒型修復(fù)的傷口中是正調(diào)節(jié)。這樣，作為潛在的抗-疤痕分子，僅纖調(diào)蛋白聚糖實現(xiàn)了和疤痕的發(fā)展成反比關(guān)系的標準。(Soo，C.Et al.，2000，AmJ of Pathol，157(2)423-433；and data in press)。
在上述研究的基礎(chǔ)上，纖調(diào)蛋白聚糖被體內(nèi)應(yīng)用于懷孕后期的E18胎兒的通常表現(xiàn)為無組織再生的成人型修復(fù)的傷口。如圖2G所示，Sirius-red免疫染色方法和用共焦顯微鏡分析顯示在纖調(diào)蛋白聚糖的細胞外基質(zhì)中的膠原原纖維治療的傷口的有序的排列方式和在普通未受傷皮膚組織中所觀察到的相似(圖2E)。Sirius-red免疫染色方法是一種有力的工具因為提供了愈合傷口的三維圖象。圖1E所示為用纖調(diào)蛋白聚糖處理的E18天傷口的蘇木精和曙紅(H&E)切片。盡管不能像共焦顯微鏡那樣清楚地顯示膠原纖維的排列和結(jié)構(gòu)，但可觀察到皮膚再生和無痕修復(fù)的存在。
與用纖調(diào)蛋白聚糖處理的E18傷口組織相反，沒有用纖調(diào)蛋白聚糖處理的E18胎兒傷口的組織和形態(tài)上表現(xiàn)為缺乏組織再生的成年型傷口修復(fù)的特點，如圖1D和2F所示。這些結(jié)果顯示通常為無序的膠原結(jié)構(gòu)的E18天胎兒傷口在加入纖調(diào)蛋白聚糖后，有效地調(diào)理了在傷口修復(fù)中的膠原原纖維形成和沉積方式以促進皮膚再生。
更進一步，用抗纖調(diào)蛋白聚糖抗體替代纖調(diào)蛋白聚糖做上述處理進行補充的研究，如圖1B和2C所示。用抗纖調(diào)蛋白聚糖抗體處理通常表現(xiàn)為皮膚再生的E16天傷口有效地防止了皮膚再生(圖1B)和有序的膠原沉積(圖2C)。
另外，用纖調(diào)蛋白聚糖處理的成人傷口與未處理的成人傷口(圖3D-F)相比，也明顯顯示了更有序的膠原結(jié)構(gòu)(圖3B、C)并促進了組織再生(圖3A)。
這些結(jié)論表明纖調(diào)蛋白聚糖能夠在體內(nèi)轉(zhuǎn)化和減少疤痕的能力從來沒有公開過。因此，這樣的結(jié)果是意想不到的。
在體外的其他研究表明纖調(diào)蛋白聚糖結(jié)合纖維狀的膠原(例如，I，II，III，V，和XI型)延緩原纖維形成和原纖維的直徑縮小(Font B，etal.，1998，Eur J Biochem，254580-587；Vogel KG和Trotter JA，1987，Collagen Related Res，7105-114；Hedbom B and Heinegard D，1989，J Biol Chem，2646898-6905)。另外，有證據(jù)表明纖調(diào)蛋白聚糖和核心蛋白聚糖結(jié)合到膠原分子上的不同位點，并對膠原原纖維的形成有不同影響(Hedbom，E and Heinegard，D，1993，J Biol Chem，26827307-27312)。這暗示了纖調(diào)蛋白聚糖以與核心蛋白聚糖的截然不同的方式調(diào)節(jié)膠原的原纖維形成和沉積，附加的核心蛋白聚糖不能顯示顯著的疤痕減少。該結(jié)論是由先前的在成年傷口和懷孕后期的胎兒皮膚中核心蛋白為正調(diào)節(jié)的事實支持的。
簡單來說，令人驚訝的是，在圖1、2和圖3中清楚的顯示了，膠原的結(jié)構(gòu)被改善或與無痕組織無法區(qū)別，其過程很可能歸因于纖調(diào)蛋白聚糖調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)的能力。如上述所示，纖調(diào)蛋白聚糖調(diào)節(jié)的真皮傷口顯示了更均一直徑的膠原原纖維和更有序的膠原沉積模式，其與普通的、未受傷皮膚相似。
另外，盡管通過中和TGF-β來減少疤痕組織的形成已在多個美國專利中被描述(如先前所引用的)，但截止今日，并沒有公開應(yīng)用局部或經(jīng)皮輸送纖調(diào)蛋白聚糖(或核心蛋白聚糖)以影響普通表現(xiàn)為無組織再生的成人型修復(fù)的傷口為胎兒型再生修復(fù)的方法。
而且，因為單獨阻斷TGF-β不能完全逆轉(zhuǎn)疤痕組織的形成，并且因為TGF-β也在無痕組織，懷孕早期的胎兒傷口中表達，因此TGF-β的活性不會單獨導致疤痕組織的形成，還包含了其他分子和生長因子(如，纖調(diào)蛋白聚糖)。
本發(fā)明由下列實施例來說明。這些實施例僅僅說明但不限制本發(fā)明。
例1與可溶性膠原凝膠混合的治療量的纖調(diào)蛋白聚糖以大約0.5μg/μl至約1000μg/μl的劑量施用給哺乳動物。
例2與透明質(zhì)酸和血纖蛋白膠混合的治療量的纖調(diào)蛋白聚糖以大約0.5μg/μl至1000μg/μl的劑量施用給哺乳動物。
例3與可溶性膠原凝膠混合的纖調(diào)蛋白聚糖或與透明質(zhì)酸混合的治療量的纖調(diào)蛋白聚糖作為一種美容品以大約0.001μg/μl至0.5μg/μl的劑量施用給哺乳動物。
例4治療量的纖調(diào)蛋白聚糖與潛在的抗炎劑如乳糖-6-磷酸或甘露糖-6-磷酸混合。
以上實施例僅為了說明本發(fā)明，而并不是要將本發(fā)明嚴格地限定到以上所詳細列舉的實施例上。
權(quán)利要求
1.纖調(diào)蛋白聚糖在制備用于促進皮膚再生藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述纖調(diào)蛋白聚糖的量為0.5μg/μl到1000μg/μl。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其中所述纖調(diào)蛋白聚糖的量為0.001μg/μl到0.5μg/μl。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的用途，其中所述纖調(diào)蛋白聚糖與可溶性凝膠混合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2的用途，其中所述纖調(diào)蛋白聚糖與透明質(zhì)酸或血纖蛋白膠混合。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2的用途，其中所述纖調(diào)蛋白聚糖與潛在的抗炎劑，如乳糖-6-磷酸鹽或甘露糖-6-磷酸鹽混合。
7.纖調(diào)蛋白聚糖在制備用于美容性皮膚再生的產(chǎn)品中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種直接用纖調(diào)蛋白聚糖，蛋白聚糖的核心蛋白聚糖族的成員處理成年傷口而誘導組織再生的方法。直接用纖調(diào)蛋白聚糖處理傷口將膠原的沉積逆轉(zhuǎn)到在無痕組織中觀察到的方式。這種膠原沉積的逆轉(zhuǎn)可以通過應(yīng)用標準的免疫組織化學技術(shù)和Sirius－red共焦顯微鏡而被顯現(xiàn)出來。
文檔編號A61P17/02GK1572319SQ200310118328
公開日2005年2月2日 申請日期2003年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月26日
發(fā)明者蘇加璐 申請人:蘇加璐