專利名稱：一種用骨基質凝膠構建組織工程軟骨的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于體外再建軟骨組織，特別涉及一種用骨基質凝膠構建組織工程軟骨的方法。
背景技術：
目前國內外組織工程研究的進展為軟骨疾病的研究和治療開辟了新的途徑，是未來醫(yī)學由“替代”向“重建”轉變的重要手段之一，其發(fā)展前景令人鼓舞。隨著分子生物學和細胞生物學的飛速發(fā)展，對各種疾病的基礎理論研究，已不僅在整體動物、離體器官和組織水平上，人們日益認識到，從分子和細胞水平，尤其從活組織細胞的角度研究細胞的形態(tài)和功能，對研究各種疾病的病因、發(fā)病機理、病理變化以及治療等問題，具有非常重要的意義。組織工程是生物醫(yī)學和材料科學交叉融合的產(chǎn)物，其含義是應用生命科學和工程學原理及方法，認識哺乳動物正常和病理組織的結構功能關系，研究、開發(fā)生物代用品，以修復、維持或改善人體組織和器官的形態(tài)和功能。目前國內外有個別報道用骨基質明膠(bone matrix gelatin，BMG)植入肌肉組織，能誘導骨、軟骨生成。而目前的研究中尚存在不少問題亟待解決1).種子細胞組織工程的先決條件是足夠數(shù)量的、具有再生能力和功能的種子細胞。軟骨組織工程中軟骨種子細胞的主要來源是軟骨和間充質干細胞(是以骨髓為主的)；目前，國內外采用人或動物的軟骨，用酶消化、分離、培養(yǎng)，能獲得高存活率、高純度、足夠數(shù)量的軟骨細胞，方法比較成熟。但軟骨細胞長期培養(yǎng)、傳代，容易發(fā)生去分化，逐漸變?yōu)楸馄降某衫w維細胞樣細胞，喪失軟骨細胞的分化表型。給予骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、胰島素樣生長因子(IGF)、轉化生長因子(TGF)等細胞因子，能促進軟骨細胞的分化和保持其表型。骨髓間充質干細胞(亦有用脂肪基質干細胞、胚胎干細胞等)作為軟骨種子細胞的來源，日益受到重視，分離的骨髓間充質干細胞加入TGF和成纖維細胞生長因子(FGF)培養(yǎng)，可分化為具合成分泌II型膠原等軟骨特異性標記物的軟骨細胞，用其修復關節(jié)軟骨取得良好的效果。且因骨髓具有取材方便、對供體損傷小等優(yōu)點，其應用前景更為看好。但骨髓基質干細胞是由多種細胞組成的，需要進一步純化，并需選擇合適的條件誘導其向軟骨細胞分化。因此，如何在體內外調控軟骨細胞的增殖、分化，并維持其表型特征是需要進一步研究的問題。2).三維細胞支架種植軟骨細胞的支架也是軟骨組織工程成功的關鍵。支架材料應具有良好的生物相容性、無毒副作用、具多孔三維結構、生物可降解性、良好的細胞貼附界面、可塑性和一定的機械強度。目前，國內外研究的生物材料很多，如聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、骨基質明膠(BMG)、膠原海綿、藻酸鹽、透明質酸等，但各材料還都存在一些問題。如目前國內外較為看好，應用也最廣泛的PGA和PLA是人工合成的高分子聚合物，具良好的生物相容性、可降解性和可塑性等，但兩者均為疏水性物質，對細胞吸附力較弱，降解產(chǎn)物為酸性，對細胞生長不利。目前雖采取了許多改進措施，但作為合成材料，仍存在缺乏細胞識別信號、費用昂貴等缺點。BMG以天然骨材料制備而來，具有很好的生物相容性、可降解性，并因其含有BMP，故具有較強的誘導骨、軟骨生長、分化和維持其表型的作用，但也存在材料孔隙不均一，植入體內后吸收過快、機械強度不足和人骨材料來源不足等缺點，這些都是需要進一步研究解決的問題。3).組織工程軟骨的形成軟骨種子細胞與骨基質明膠構建組織工程化軟骨的穩(wěn)定性融合是最終要解決的問題。將軟骨細胞-支架復合物植入無胸腺裸鼠皮下，是產(chǎn)生組織工程軟骨的常用方法。我國學者曹誼林等在耳形PGA支架上接種軟骨細胞，經(jīng)體外培養(yǎng)后植入裸鼠背部皮下，成功地再造了人耳形軟骨。目前對人鼻形軟骨、支氣管軟骨、半月板軟骨和關節(jié)軟骨等也有研究。在有免疫功能的動物體內，也已成功地移植自體或同種異體軟骨細胞-支架復合物，形成軟骨組織或修復關節(jié)軟骨缺損。植入早期局部有輕度炎癥反應，或淋巴細胞浸潤，以后逐漸消退，一般不影響軟骨的生成。4).組織工程軟骨的評價和臨床應用組織工程軟骨在應用于臨床之前必須通過嚴格的生物學、機械力學評價和動物實驗驗證。通過大體觀察、組織形態(tài)學、組織化學、免疫組織化學和原位雜交等技術，分析組織工程軟骨的外形特征，軟骨細胞的形態(tài)、分布及活性，軟骨基質的成分、含量比例等。通過對比測試組織工程軟骨的壓縮模數(shù)、表面滲透性、聚集模數(shù)等，了解其機械性能。通過各種動物實驗，研究組織工程軟骨移植到實驗動物模型的有效性、安全性和免疫反應性等。目前研制的組織工程軟骨只能替代缺損組織的部分功能，維持時間較短，離永久性功能重建尚有一定距離。而對于人類臨床應用，除需解決以上述及的問題外，還需就如何建立評價體系，保證組織工程軟骨的質量，以及移植物對機體的長期效果和安全性如何等問題予以深入的研究和解決。在生物支架材料研究方面，目前國內外采用的種類很多，在具有良好的生物相容性、無毒副作用、具多孔三維結構、生物可降解性、良好的細胞貼附界面、可塑性和一定的機械強度等要素上各有所長和一些有待改善的問題。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種用骨基質凝膠構建組織工程軟骨的方法，用本發(fā)明構建的組織工程軟骨能夠獲得正常或接近正常結構與功能的骨軟骨組織。
為達到上述目的，本發(fā)明采用的制備方法是1)種子細胞獲取軟骨細胞的分離培養(yǎng)①取材出生4周左右的新西蘭兔1只，處死脫毛，洗滌干凈，用0.1％的新潔爾滅浸泡20-30分鐘；或以無菌操作獲取水囊引產(chǎn)2小時內的人胚胎1個，經(jīng)皮膚消毒后，以無菌操作截取肱骨近端，股骨近、遠端和脛骨近端，置于含P/S各100個單位/ml的D-Hanks′液中，清除一切軟組織，片狀削下各關節(jié)面軟骨，置入盛有含P/S各100個單位/ml的D-Hanks′液的容器內，而后吸出液體棄去，用10ml質量百分比濃度為0.05％的透明質酸酶室溫下消化3分鐘，棄去酶液，用含P/S各100個單位/ml的D-Hanks′液洗滌后，將軟骨切成1mm3大小的小粒；②細胞分離將軟骨小粒轉入消化小室內室，加入5ml質量百分比濃度為0.2％的胰蛋白酶，于37℃磁力攪拌下消化30分鐘，而后吸出酶液棄去，再加入5ml質量百分比濃度為0.2％的膠原酶，于37℃磁力攪拌下消化60分鐘，吸出含細胞酶液，置入對半盛有含15％體積比的小牛血清和P/S各100個單位/ml的DMEM培養(yǎng)液的10ml離心管內，在1500rpm離心3分鐘，棄去上清收集細胞，重復消化一次后合并兩次收集的細胞，用含P/S各100個單位/ml的D-Hanks′液或含15％體積比的小牛血清和P/S各100個單位/ml的DMEM培養(yǎng)液洗滌1-2次；③原代培養(yǎng)以40萬個/瓶將細胞接種于5cm×5cm×3cm的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基為含15％體積比的小牛血清和P/S各100個單位/ml的DMEM培養(yǎng)液4ml，于37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，首次換液間隔72小時，以后則隔日換液，直至形成細胞單層；④傳代培養(yǎng)將原代培養(yǎng)已形成細胞單層的各瓶中培養(yǎng)液棄去，用含P/S各100個單位/ml的D-Hanks′液將細胞洗1-2次，加入4ml質量百分比濃度為0.25％trypsin+0.02％EDTA的消化酶液，于37℃消化10分鐘，將含細胞酶液倒入50ml離心管內，再用含P/S各100個單位/ml的D-Hanks′液或含15％體積比的小牛血清和P/S各100個單位/ml的DMEM培養(yǎng)液2ml洗滌1-2次，使瓶內細胞全部洗脫下來，于1500rpm離心3分鐘，棄去上清即獲得軟骨細胞；2)骨基質凝膠BMG的制備①相對無菌條件下取新西蘭兔或人胚胎長骨和干骺端松質骨，除去所有軟組織及骨髓后用蒸餾水洗凈；②用3mol/L的疊氮鈉沖洗2～3次再用蒸餾水洗；用1∶1氯仿/甲醇于室溫磁力攪拌下過夜脫脂，蒸餾水洗；③用0.6mol/L的鹽酸在4℃磁力攪拌脫鈣，期間每4小時換液一次，直至骨塊變軟且具一定彈性時終止脫鈣，再用蒸餾水洗至中性；④4℃磁力攪拌下用2mol/L氯化鈣處理1小時，蒸餾水洗；0.5mol/L的EDTA處理1小時，蒸餾水洗；8mol/L氯化鋰處理1小時，蒸餾水洗；
⑤無菌蒸餾水55℃處理1小時；⑥將處理好的BMG修剪成實驗設計所需的尺寸，凍干，60鈷源照射滅菌后于0℃～-20℃冰箱內保存?zhèn)溆茫?)組織工程軟骨的構建將分離培養(yǎng)收獲的種子細胞按4-10萬/mm2密度接種于皮質骨或松質骨BMG上進行體外培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含15％體積比的小牛血清和P/S各100個單位/ml的DMEM培養(yǎng)液，每3天換液一次。
本發(fā)明種子細胞獲取還可用基質干細胞分離培養(yǎng)誘導為軟骨細胞，采用密度梯度離心和粘附分離法獲取骨髓間充質干細胞取四月齡左右新西蘭純種兔或成人行骨髓穿刺，抽取骨髓按1∶1的體積比緩慢注于70％的Percoll細胞分離液表面，于1500轉離心20分鐘，吸取上層和中層之間的含有骨髓間充質干細胞的液層，用含15％體積比的小牛血清和P/S各100個單位/ml的DMEM培養(yǎng)液將骨髓間充質干細胞制成單細胞懸液，計數(shù)有核細胞后接種于培養(yǎng)瓶中進行單層培養(yǎng)，第一次5天，以后每3天更換含15％體積比的小牛血清和P/S各100個單位/ml的DMEM培養(yǎng)液一次，約2周形成細胞單層后進行傳代；將原代培養(yǎng)已形成細胞單層的各瓶中培養(yǎng)液棄去，用含P/S各100個單位/ml的D-Hanks′液將細胞洗1-2次，加入4ml質量百分比濃度為0.25％ trypsin+0.02％ EDTA的消化酶液于37℃消化10分鐘，將含細胞酶液倒入離心管內，再用含P/S各100個單位/ml的D-Hanks′液或含15％體積比的小牛血清和P/S各100個單位/ml的DMEM培養(yǎng)液2ml洗滌，使瓶內細胞全部洗脫下來，1500rpm離心3分鐘棄去上清，用含15％體積比的小牛血清和P/S各100個單位/ml的DMEM培養(yǎng)液制成細胞懸液，計數(shù)細胞后接種進行傳代培養(yǎng)，此時加入誘導骨髓間充質干細胞向軟骨細胞轉化的誘導因子10ng/ml轉化生長因子β1，10ng/ml胰島素樣生長因子和50μg/ml維生素C，以誘導骨髓間充質干細胞轉化為軟骨細胞。
本發(fā)明在計數(shù)有核細胞后接種于培養(yǎng)瓶中進行單層培養(yǎng)時可在培養(yǎng)瓶底預鋪以5μg/ml纖維粘連蛋白，以促進骨髓間充質干細胞的粘附。
由于本發(fā)明采用骨基質明膠，發(fā)揮其具有較好的生物相容性、可降解性，較強的誘導骨、軟骨生長、分化作用的優(yōu)勢，克服植入體內后吸收過快、機械強度不足的問題；開展異種骨基質明膠使用的實驗研究以克服人骨材料來源不足等問題，將取得用本發(fā)明構建的組織工程軟骨能夠獲得正常或接近正常結構與功能的骨軟骨組織的良好效果。


圖1是本發(fā)明軟骨細胞復合皮質骨BMG培養(yǎng)6天的切片HE染色圖，10X；圖2是本發(fā)明軟骨細胞復合松質骨BMG培養(yǎng)6天的切片HE染色圖，10X；圖3是本發(fā)明軟骨細胞復合皮質骨BMG培養(yǎng)12天的切片HE染色圖；，10X；圖4是本發(fā)明軟骨細胞復合松質骨BMG培養(yǎng)12天的切片PG染色圖，10X；圖5是本發(fā)明軟骨細胞復合皮質骨BMG培養(yǎng)18天的切片HE染色圖，10X；圖6是本發(fā)明軟骨細胞復合松質骨BMG培養(yǎng)18天的切片HE染色圖，10X；圖7是本發(fā)明軟骨細胞復合皮質骨BMG培養(yǎng)18天的切片PG染色圖，10X；圖8是本發(fā)明軟骨細胞復合松質骨BMG培養(yǎng)18天的切片PG染色圖，20X；圖9是本發(fā)明軟骨細胞復合皮質骨BMG培養(yǎng)24天的切片HE染色圖；，10X；圖10是本發(fā)明軟骨細胞復合松質骨BMG培養(yǎng)24天的切片膠原染色圖，10X；具體實施方式
實施例11)種子細胞獲取軟骨細胞的分離培養(yǎng)①取材出生4周左右的新西蘭兔1只，以空氣拴塞或擊枕后部處死，質量百分比濃度為8％的硫化鈉脫毛，流水洗滌干凈，用0.1％的新潔爾滅浸泡20-30分鐘；以無菌操作截取肱骨近端，股骨近、遠端和脛骨近端，置于盛有含P/S各100個單位/ml的D-Hanks′液的容器中，清除一切軟組織，片狀削下各關節(jié)面軟骨，置入含P/S各100個單位/m1的D-Hanks′液的容器內，而后吸出液體棄去，用10ml質量百分比濃度為0.05％的透明質酸酶室溫下消化3分鐘，棄去酶液，用含P/S各100個單位/ml的D-Hanks′液洗滌后，將軟骨片切成1mm3大小的軟骨小粒；②細胞分離將軟骨小粒轉入消化小室內室，加入5ml質量百分比濃度為0.2％的胰蛋白酶，于37℃磁力攪拌下消化30分鐘，而后吸出酶液棄去，再加入5ml質量百分比濃度為0.2％的膠原酶，于37℃磁力攪拌下消化60分鐘，吸出含細胞酶液，置入對半盛有含15％體積比的小牛血清和P/S各100個單位/ml的DMEM培養(yǎng)液的10ml離心管內，在1500rpm離心3分鐘，棄去上清，收集細胞，重復消化一次后合并兩次收集的細胞，用D-Hanks′液洗滌1-2次；③原代培養(yǎng)以40萬個/瓶將細胞接種于5cm×5cm×3cm的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基為含15％體積比的小牛血清和P/S各100個單位/ml的DMEM培養(yǎng)液4ml，于37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)中每日在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，原代培養(yǎng)一般在24小時內細胞貼壁，48-72小時細胞開始有伸突，并開始分裂增殖，兔軟骨細胞在10天左右可行成單層，人胚軟骨細胞要相應推遲2天，首次換液間隔72小時，以后則隔日換液，直至形成細胞單層；④傳代培養(yǎng)將原代培養(yǎng)已形成細胞單層的各瓶中培養(yǎng)液棄去，用含P/S各100個單位/ml的D-Hanks′液將細胞洗1-2次，加入4ml質量百分比為0.25％trypsin+0.02％EDTA的消化酶液，于37℃消化10分鐘，在倒置顯微鏡下觀察細胞脫壁后，將含細胞酶液倒入50ml離心管內，再用含P/S各100個單位/ml的D-Hanks′液2ml洗滌1-2次，使瓶內細胞全部洗脫下來，于1500rpm離心3分鐘，棄去上清即獲得細胞；此方法動物和消化酶用量均較少，基質消化完全，細胞獲得量較多，一只兔子或一個人胚胎可獲得軟骨細胞一千萬以上。但因酶作用強度大以及消化時間長，細胞在分離時受損傷較大，原代接種后死亡比率相對較大，為了使實驗結果更可靠，而且為了增加細胞數(shù)量，一般多于傳第一代細胞進行實驗研究。傳代細胞基本都能成活，而且細胞獲得數(shù)量大(可上億)，實驗重復性好，結果較為穩(wěn)定。
2)骨基質凝膠(BMG)的制備①相對無菌條件下取新西蘭兔或人胚胎長骨和干骺端松質骨，除去所有軟組織及骨髓后用蒸餾水洗凈；②用3mol/L的疊氮鈉沖洗2～3次，蒸餾水洗；用1∶1氯仿/甲醇于室溫磁力攪拌下過夜脫脂，蒸餾水洗；③用0.6mol/L的鹽酸在4℃磁力攪拌脫鈣，期間每4小時換液一次，直至骨塊變軟且具一定彈性時終止脫鈣，再用蒸餾水洗至中性；④4℃磁力攪拌下用2mol/L氯化鈣處理1小時，蒸餾水洗；0.5mol/L EDTA處理1小時，蒸餾水洗；8mol/L氯化鋰處理1小時，蒸餾水洗；⑤無菌蒸餾水55℃處理1小時；⑥將處理好的BMG修剪成實驗設計所需的尺寸，凍干，60鈷源照射滅菌后于0℃～-20℃冰箱內保存?zhèn)溆茫?)組織工程軟骨的構建將分離培養(yǎng)收獲的種子細胞按4-10萬/mm2密度接種于皮質骨或松質骨BMG上進行體外培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含15％體積比的小牛血清和P/S各100個單位/ml的DMEM培養(yǎng)液，每3天換液一次。
實施例21)種子細胞獲取軟骨細胞的分離培養(yǎng)①取材以無菌操作獲取水囊引產(chǎn)2小時內的人胚胎1個，碘酒和酒精消毒皮膚后，以無菌操作截取肱骨近端，股骨近、遠端和脛骨近端，置于盛有含P/S各100個單位/ml的D-Hanks′液的容器中，清除一切軟組織，片狀削下各關節(jié)面軟骨，置入含有含P/S各100個單位/ml的D-Hanks′液的容器內，而后吸出液體棄去，用10ml質量百分比濃度為0.05％的透明質酸酶室溫下消化3分鐘，棄去酶液，用含P/S各100個單位/ml的D-Hanks′液洗滌后，將軟骨切成1mm3大小的軟骨小粒；②細胞分離將軟骨小粒轉入消化小室內室，加入5ml質量百分比濃度為0.2％的胰蛋白酶，于37℃磁力攪拌下消化30分鐘，而后吸出酶液棄去，再加入5ml質量百分比濃度為0.2％的膠原酶，于37℃磁力攪拌下消化60分鐘，吸出含細胞酶液，置入對半盛有含15％體積比的小牛血清和P/S各100個單位/ml的DMEM培養(yǎng)液的10ml離心管內，在1500rpm離心3′，棄去上清，收集細胞，重復消化一次后合并兩次收集的細胞，用含P/S各100個單位/ml的D-Hanks′液洗滌1-2次；③原代培養(yǎng)以40萬個/瓶將細胞接種于5cm×5cm×3cm的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基為含15％體積比的小牛血清和P/S各100個單位/ml的DMEM培養(yǎng)液4ml，于37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)中每日在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，原代培養(yǎng)一般在24小時內細胞貼壁，48小時-72小時細胞開始有伸突，并開始分裂增殖，人胚軟骨細胞在兩周左右可行成單層，首次換液間隔72小時，以后則隔日換液，直至形成細胞單層；④傳代培養(yǎng)將原代培養(yǎng)已形成細胞單層的各瓶中培養(yǎng)液棄去，用含P/S各100個單位/ml的D-Hanks′液將細胞洗1-2次，加入4ml質量百分比濃度為0.25％的trypsin+0.02％EDTA的消化酶液，于37℃消化10分鐘，在倒置顯微鏡下觀察細胞脫壁后，將含細胞酶液倒入50ml離心管內，再用含P/S各100個單位/ml的D-Hanks′液2ml洗滌1-2次，使瓶內細胞全部洗脫下來，于1500rpm離心3分鐘，棄去上清即獲得細胞；2)骨基質凝膠(BMG)的制備①相對無菌條件下取新西蘭兔或人胚胎長骨和干骺端松質骨，除去所有軟組織及骨髓后用蒸餾水洗凈；②用3mol/L的疊氮鈉沖洗2～3次，蒸餾水洗；用1∶1氯仿/甲醇于室溫磁力攪拌下過夜脫脂，蒸餾水洗；③用0.6m0l/L的鹽酸在4℃磁力攪拌脫鈣，期間每4小時換液一次，直至骨塊變軟且具一定彈性時終止脫鈣，再用蒸餾水洗至中性；④4℃磁力攪拌下用2mol/L氯化鈣處理1小時，蒸餾水洗；0.5mol/L EDTA處理1小時，蒸餾水洗；8mol/L氯化鋰處理1小時，蒸餾水洗；⑤無菌蒸餾水55℃處理1小時；⑥將處理好的BMG修剪成實驗設計所需的尺寸，凍干，60鈷源照射滅菌后于0℃～-20℃冰箱內保存?zhèn)溆茫?)組織工程軟骨的構建將分離培養(yǎng)收獲的種子細胞按4-10萬/mm2密度接種于皮質骨或密質骨BMG上進行體外培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含15％體積比的小牛血清和P/S各100個單位/ml的DMEM培養(yǎng)液，每3天換液一次。
實施例31)種子細胞獲取軟骨細胞的分離培養(yǎng)基質干細胞分離培養(yǎng)誘導為軟骨細胞①采用密度梯度離心和粘附分離法獲取骨髓間充質干細胞取四月齡左右新西蘭純種兔，抽取骨髓按1∶1的體積比緩慢注于70％的Percoll細胞分離液表面，于1500轉離心30分鐘，吸取上層和中層之間的含有骨髓間充質干細胞的液層，用含15％體積比的小牛血清和P/S各100個單位/ml的DMEM培養(yǎng)液將骨髓間充質干細胞制成單細胞懸液，計數(shù)有核細胞后接種于培養(yǎng)瓶中進行單層培養(yǎng)，第一次5天，以后每3天更換含15％體積比的小牛血清和P/S各100個單位/ml的DMEM培養(yǎng)液一次，約2周形成細胞單層后進行傳代；②傳代培養(yǎng)誘導轉化為軟骨細胞將原代培養(yǎng)已形成細胞單層的各瓶中培養(yǎng)液棄去，用含P/S各100個單位/ml的D-Hanks′液將細胞洗1-2次，加入4ml質量百分比為0.25％trypsin+0.02％ EDTA的消化酶液，于37℃消化10分鐘，將含細胞酶液倒入離心管內，在倒置顯微鏡下觀察細胞脫壁后，將含細胞酶液倒入離心管內，再用含P/S各100個單位/ml的D-Hanks′液2ml洗滌，使瓶內細胞全部洗脫下來，1500rpm離心3分鐘棄去上清，用含15％體積比的小牛血清和P/S各100個單位/ml的DMEM培養(yǎng)液制成細胞懸液，計數(shù)細胞后接種進行傳代培養(yǎng)，此時加入誘導骨髓間充質干細胞向軟骨細胞轉化的誘導因子10ng/ml轉化生長因子β1，10ng/ml胰島素樣生長因子和50μg/ml維生素C，以誘導骨髓間充質干細胞轉化為軟骨細胞；③其它如胚胎、脂肪干細胞等可參照骨髓間充質干細胞分離法獲取。
2)骨基質凝膠(BMG)的制備①相對無菌條件下取新西蘭兔或人胚胎長骨和干骺端松質骨，除去所有軟組織及骨髓后用蒸餾水洗凈；②用3mol/L的疊氮鈉沖洗2～3次，蒸餾水洗；用1∶1氯仿/甲醇于室溫磁力攪拌下過夜脫脂，蒸餾水洗；③用0.6mol/L的鹽酸在4℃磁力攪拌脫鈣，期間每4小時換液一次，直至骨塊變軟且具一定彈性時終止脫鈣，再用蒸餾水洗至中性；④4℃磁力攪拌下用2mol/L氯化鈣處理1小時，蒸餾水洗；0.5mol/L EDTA處理1小時，蒸餾水洗；8mol/L氯化鋰處理1小時，蒸餾水洗；⑤無菌蒸餾水55℃處理1小時；⑥將處理好的BMG修剪成實驗設計所需的尺寸，凍干，60鈷源照射滅菌后于0℃～-20℃冰箱內保存?zhèn)溆茫?)組織工程軟骨的構建將分離培養(yǎng)收獲的種子細胞按4-10萬/mm2密度分別接種于皮質骨和松質骨BMG上進行體外培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含15％體積比的小牛血清和P/S各100個單位/ml的DMEM培養(yǎng)液，每3天換液一次。
實施例4
1)種子細胞獲取軟骨細胞的分離培養(yǎng)基質干細胞分離培養(yǎng)誘導為軟骨細胞①采用密度梯度離心和粘附分離法獲取骨髓間充質干細胞對成人行骨髓穿刺，抽取骨髓按1∶1的體積比緩慢注于70％的Percoll細胞分離液表面，于1500轉離心30分鐘，吸取上層和中層之間的含有骨髓間充質干細胞的液層，用含15％體積比的小牛血清和P/S各100個單位/ml的DMEM培養(yǎng)液將骨髓間充質干細胞制成單細胞懸液，計數(shù)有核細胞后接種于培養(yǎng)瓶中進行單層培養(yǎng)，第一次5天，以后每3天更換含15％體積比的小牛血清和P/S各100個單位/ml的DMEM培養(yǎng)液一次，約2周形成細胞單層后進行傳代；②傳代培養(yǎng)誘導轉化為軟骨細胞將原代培養(yǎng)已形成細胞單層的各瓶中培養(yǎng)液棄去，用含P/S各100個單位/ml的D-Hanks′液將細胞洗1-2次，加入4ml質量百分比為0.25％trypsin+0.02％ EDTA的消化酶液，于37℃消化10分鐘，將含細胞酶液倒入離心管內，在倒置顯微鏡下觀察細胞脫壁后，將含細胞酶液倒入離心管內，再用含P/S各100個單位/ml的D-Hanks′液2ml洗滌，使瓶內細胞全部洗脫下來，1500rpm離心3分鐘棄去上清，用含15％體積比的小牛血清和P/S各100個單位/ml的DMEM培養(yǎng)液制成細胞懸液，計數(shù)細胞后接種進行傳代培養(yǎng)，此時加入誘導骨髓間充質干細胞向軟骨細胞轉化的誘導因子10ng/ml轉化生長因子β1，10ng/ml胰島素樣生長因子和50μg/ml維生素C，以誘導骨髓間充質干細胞轉化為軟骨細胞；③其它如胚胎、脂肪干細胞等可參照骨髓間充質干細胞分離法獲取。
2)骨基質凝膠(BMG)的制備①相對無菌條件下取新西蘭兔或人胚胎長骨和干骺端松質骨，除去所有軟組織及骨髓后用蒸餾水洗凈；②用3mol/L的疊氮鈉沖洗2～3次，蒸餾水洗；用1∶1氯仿/甲醇于室溫磁力攪拌下過夜脫脂，蒸餾水洗；
③用0.6mol/L的鹽酸在4℃磁力攪拌脫鈣，期間每4小時換液一次，直至骨塊變軟且具一定彈性時終止脫鈣，再用蒸餾水洗至中性；④4℃磁力攪拌下用2mol/L氯化鈣處理1小時，蒸餾水洗；0.5mol/L EDTA處理1小時，蒸餾水洗；8mol/L氯化鋰處理1小時，蒸餾水洗；⑤無菌蒸餾水55℃處理1小時；⑥將處理好的BMG修剪成實驗設計所需的尺寸，凍干，60鈷源照射滅菌后于0℃～-20℃冰箱內保存?zhèn)溆茫?)組織工程軟骨的構建將分離培養(yǎng)收獲的種子細胞按4-10萬/mm2密度分別接種于皮質骨和松質骨BMG上進行體外培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含15％體積比的小牛血清和P/S各100個單位/ml的DMEM培養(yǎng)液，每3天換液一次。
按照本發(fā)明的制備方法制得的工程軟骨，參見圖1，2，種植于BMG的軟骨細胞培養(yǎng)6d形成細胞薄層；參見圖3、4，培養(yǎng)12d形成8～10層細胞的類軟骨組織，細胞周圍氨基多糖染色明顯；參見圖5、6、7、8，培養(yǎng)18d形成12～15層細胞的類軟骨組織，細胞周圍氨基多糖染色更明顯并出現(xiàn)膠原成分；參見圖9、10，培養(yǎng)到24d直至42d形成20層以上細胞的類軟骨組織。不同的是，培養(yǎng)在皮質骨BMG形成的類軟骨組織圍繞于BMG表面，類似于關節(jié)表面軟骨；培養(yǎng)在松質骨BMG形成的類軟骨組織，細胞分布于松質骨BMG網(wǎng)眼中形成渾然一體。
I.復合皮質骨BMG組織工程軟骨毒損實驗采用細胞培養(yǎng)方法，將培養(yǎng)的人胚胎或新西蘭純種幼兔軟骨細胞種植于自體皮質骨骨基質明膠(BMG)上，于體外再建軟骨組織模型。采用配伍組設計，加入含不同濃度的可疑KBD致病因子T-2毒素、雪腐鐮刀菌烯醇(NIV)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)和保護因子硒，作用于體外再建軟骨組織，建立軟骨變性壞死模型。結果見對照組BMG表面有多層軟骨細胞。組間隨著T-2、NIV和DON毒素濃度的增加，細胞密度降低，損傷加劇，并出現(xiàn)壞死；加硒后趨勢不變，與相應未加硒組比較損傷減輕。
II.復合松質骨BMG組織工程軟骨移植修復關節(jié)軟骨缺損手術將體外培養(yǎng)12天形成的松質骨BMG-軟骨細胞復合體植于同種異體兔膝關節(jié)的骨軟骨缺損處(直徑4mm)，術后2、4、8、12、24周進行功能評價及解剖顯微鏡、組織學、電鏡等動態(tài)觀察。結果見全部實驗兔于術后10天內恢復正?；顒?；術后2周軟骨細胞在松質骨BMG支架間分裂增殖形成軟骨團塊；隨著術后2、4、8周時間的延長，BMG支架間形成的軟骨細胞團塊逐漸增大，BMG逐漸被吸收，至8周BMG被完全吸收，形成軟骨組織；術后24周骨軟骨缺損處以軟骨組織修復。松質骨BMG在體內與宿主組織有較好的組織相容性，并具有可降解性，結合體外實驗結果，認為松質骨BMG是一種合適的細胞支架，軟骨細胞負載于松質骨BMG上能修復兔關節(jié)骨軟骨缺損。
III.結論軟骨細胞種植于骨基質明膠體外培養(yǎng)1～6周，能獲得具分泌氨基多糖和膠原功能的類軟骨組織；培養(yǎng)在皮質骨BMG形成的類軟骨組織較適合用于體外功能代謝和損傷實驗研究；培養(yǎng)在松質骨BMG形成的類軟骨組織較適合用于移植修復骨軟骨缺損。
本發(fā)明將體外分離培養(yǎng)或誘導培養(yǎng)的軟骨細胞種植在骨基質明膠(BMG)上，構建組織工程軟骨，已經(jīng)獲得近似于正常結構與功能的骨軟骨組織，用于體外組織細胞功能和代謝研究及用于移植修復骨軟骨缺損。
權利要求
1.一種用骨基質凝膠構建組織工程軟骨的方法，其特征在于1)種子細胞獲取軟骨細胞的分離培養(yǎng)①取材出生4周左右的新西蘭兔1只，處死脫毛，洗滌干凈，用0.1％的新潔爾滅浸泡20-30分鐘；或以無菌操作獲取水囊引產(chǎn)2小時內的人胚胎1個，經(jīng)皮膚消毒后，以無菌操作截取肱骨近端，股骨近、遠端和脛骨近端，置于含P/S各100個單位/ml的D-Hanks′液中，清除一切軟組織，片狀削下各關節(jié)面軟骨，置入盛有含P/S各100個單位/ml的D-Hanks′液的容器內，而后吸出液體棄去，用10ml質量百分比濃度為0.05％的透明質酸酶室溫下消化3分鐘，棄去酶液，用含P/S各100個單位/ml的D-Hanks′液洗滌后，將軟骨切成1mm3大小的小粒；②細胞分離將軟骨小粒轉入消化小室內室，加入5ml質量百分比濃度為0.2％的胰蛋白酶，于37℃磁力攪拌下消化30分鐘，而后吸出酶液棄去，再加入5ml質量百分比濃度為0.2％的膠原酶，于37℃磁力攪拌下消化60分鐘，吸出含細胞酶液，置入對半盛有含15％體積比的小牛血清和P/S各100個單位/ml的DMEM培養(yǎng)液的10ml離心管內，在1500rpm離心3分鐘，棄去上清收集細胞，重復消化一次后合并兩次收集的細胞，用含P/S各100個單位/ml的D-Hanks′液或含15％體積比的小牛血清和P/S各100個單位/ml的DMEM培養(yǎng)液洗滌1-2次；③原代培養(yǎng)以40萬個/瓶將細胞接種于5cm×5cm×3cm的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基為含15％體積比的小牛血清和P/S各100個單位/ml的DMEM培養(yǎng)液4ml，于37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，首次換液間隔72小時，以后則隔日換液，直至形成細胞單層；④傳代培養(yǎng)將原代培養(yǎng)已形成細胞單層的各瓶中培養(yǎng)液棄去，用含P/S各100個單位/ml的D-Hanks′液將細胞洗1-2次，加入4ml質量百分比濃度為0.25％trypsin+0.02％EDTA的消化酶液，于37℃消化10分鐘，將含細胞酶液倒入50ml離心管內，再用含P/S各100個單位/ml的D-Hanks′液或含15％體積比的小牛血清和P/S各100個單位/ml的DMEM培養(yǎng)液2ml洗滌1-2次，使瓶內細胞全部洗脫下來，于1500rpm離心3分鐘，棄去上清即獲得軟骨細胞；2)骨基質凝膠BMG的制備①相對無菌條件下取新西蘭兔或人胚胎長骨和干骺端松質骨，除去所有軟組織及骨髓后用蒸餾水洗凈；②用3mol/L的疊氮鈉沖洗2～3次再用蒸餾水洗；用1∶1氯仿/甲醇于室溫磁力攪拌下過夜脫脂，蒸餾水洗；③用0.6mol/L的鹽酸在4℃磁力攪拌脫鈣，期間每4小時換液一次，直至骨塊變軟且具一定彈性時終止脫鈣，再用蒸餾水洗至中性；④4℃磁力攪拌下用2mol/L氯化鈣處理1小時，蒸餾水洗；0.5mol/L的EDTA處理1小時，蒸餾水洗；8mol/L氯化鋰處理1小時，蒸餾水洗；⑤無菌蒸餾水55℃處理1小時；⑥將處理好的BMG修剪成實驗設計所需的尺寸，凍干，60鈷源照射滅菌后于0℃～-20℃冰箱內保存?zhèn)溆茫?)組織工程軟骨的構建將分離培養(yǎng)收獲的種子細胞按4-10萬/mm2密度接種于皮質骨或松質骨BMG上進行體外培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含15％體積比的小牛血清和P/S各100個單位/ml的DMEM培養(yǎng)液，每3天換液一次。
2.根據(jù)權利要求1所述的用骨基質凝膠構建組織工程軟骨的方法，其特征在于種子細胞獲取還可用基質干細胞分離培養(yǎng)誘導為軟骨細胞，采用密度梯度離心和粘附分離法獲取骨髓間充質干細胞取四月齡左右新西蘭純種兔或成人行骨髓穿刺，抽取骨髓按1∶1的體積比緩慢注于70％的Perco11細胞分離液表面，于1500轉離心20分鐘，吸取上層和中層之間的含有骨髓間充質干細胞的液層，用含15％體積比的小牛血清和P/S各100個單位/ml的DMEM培養(yǎng)液將骨髓間充質干細胞制成單細胞懸液，計數(shù)有核細胞后接種于培養(yǎng)瓶中進行單層培養(yǎng)，第一次5天，以后每3天更換含15％體積比的小牛血清和P/S各100個單位/ml的DMEM培養(yǎng)液一次，約2周形成細胞單層后進行傳代；將原代培養(yǎng)已形成細胞單層的各瓶中培養(yǎng)液棄去，用含P/S各100個單位/ml的D-Hanks′液將細胞洗1-2次，加入4ml質量百分比濃度為0.25％trypsin+0.02％EDTA的消化酶液，于37℃消化10分鐘，將含細胞酶液倒入離心管內，再用含P/S各100個單位/ml的D-Hanks′液或含15％體積比的小牛血清和P/S各100個單位/ml的DMEM培養(yǎng)液2ml洗滌，使瓶內細胞全部洗脫下來，1500rpm離心3分鐘棄去上清，用含15％體積比的小牛血清和P/S各100個單位/ml的DMEM培養(yǎng)液制成細胞懸液，計數(shù)細胞后接種進行傳代培養(yǎng)，此時加入誘導骨髓間充質干細胞向軟骨細胞轉化的誘導因子10ng/ml轉化生長因子β1，10ng/ml胰島素樣生長因子和50μg/ml維生素C，以誘導骨髓間充質干細胞轉化為軟骨細胞。
3.根據(jù)權利要求2所述的用骨基質凝膠構建組織工程軟骨的方法，其特征在于所說的計數(shù)有核細胞后接種于培養(yǎng)瓶中進行單層培養(yǎng)時可在培養(yǎng)瓶底預鋪以5μg/ml纖維粘連蛋白，以促進骨髓間充質干細胞的粘附。
全文摘要
一種用骨基質凝膠構建組織工程軟骨的方法，首先用軟骨細胞分離培養(yǎng)或基質干細胞分離培養(yǎng)誘導為軟骨細胞即獲取種子細胞，然后取新西蘭兔或人胚胎長骨和干骺端松質骨構建骨基質凝膠BMG，將分離培養(yǎng)收獲的種子細胞按4－10萬/mm
文檔編號A61L27/22GK1546654SQ20031011898
公開日2004年11月17日 申請日期2003年12月11日 優(yōu)先權日2003年12月11日
發(fā)明者曹峻嶺, 宋紅星, 李思遠, 孫健, 謝龍, 尹戰(zhàn)海, 師鐘麗 申請人:西安交通大學