專(zhuān)利名稱(chēng)：新角蒽環(huán)聚酮類(lèi)抗生素的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于抗生素技術(shù)領(lǐng)域，具體的講，本發(fā)明是關(guān)于用委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(Streptomyces venezuelae)ISP5230(ATCC NO.10712)制造一系列新角蒽環(huán)化合物的方法。新角蒽環(huán)化合物是委內(nèi)瑞拉鏈霉菌代謝產(chǎn)物，將其培養(yǎng)產(chǎn)物用乙酸乙酯提取經(jīng)硅膠層析獲得。純化后的產(chǎn)物經(jīng)核磁共振分析證明結(jié)構(gòu)與已報(bào)到捷達(dá)霉素B(簡(jiǎn)稱(chēng)JB)類(lèi)似，但本發(fā)明公開(kāi)的化合物在結(jié)構(gòu)上具有新的特征，生物活性試驗(yàn)表明，這些化合物能抑制G+菌和腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。
背景技術(shù)：
抗生素是在低濃度下能夠選擇性地抑制或殺死微生物或腫瘤細(xì)胞的化合物。目前，國(guó)內(nèi)外均采用化學(xué)或生物合成的方法生產(chǎn)，是人類(lèi)治療微生物、病毒感染和腫瘤等疾病的主要藥物。
1991年Ayer等人發(fā)現(xiàn)，委內(nèi)瑞拉鏈霉菌在半乳糖—異亮氨酸培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)產(chǎn)生一種新的有顏色的抗生素，定名為捷達(dá)霉素(Jadomycin，簡(jiǎn)稱(chēng)JA)結(jié)構(gòu)式如圖1a所示。1993年Doull等人發(fā)現(xiàn)在上述培養(yǎng)條件下，生物代謝的主要產(chǎn)物以角蒽環(huán)聚酮化合物的糖基化形式存在，稱(chēng)之為捷達(dá)霉素B(簡(jiǎn)稱(chēng)JB)，其結(jié)構(gòu)式如圖1b所示。
研究表明，JB是由芳香聚酮衍生而來(lái)的角蒽環(huán)類(lèi)化合物，在第二個(gè)環(huán)上因?yàn)橐粋€(gè)異亮氨酸分子插入形成一個(gè)含氮五元雜環(huán)。生物活性試驗(yàn)證明，JB能抑制革蘭氏陽(yáng)性菌生長(zhǎng)。
目前，在克隆合成基因簇的基礎(chǔ)上，已完成JB代謝途徑的部分研究。JB合成基因簇(jad基因簇)中，聚酮合酶基因(jadABC)及jadJMN等，負(fù)責(zé)聚酮碳鏈的合成；酮還原酶基因(jadE)和兩個(gè)推測(cè)的環(huán)化酶基因(jadDI)編碼碳鏈修飾及環(huán)化相關(guān)蛋白；三個(gè)氧化酶基因(jadFGH)可能與開(kāi)環(huán)和環(huán)化后修飾有關(guān)；JadOPQSTUVX編碼糖基合成和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白；另外，還有六個(gè)基因可能參與JB合成的調(diào)控，jadR1是一個(gè)途徑特異性的應(yīng)答調(diào)控因子，促進(jìn)JB的合成，jadR2，jadR*和jadW1是負(fù)調(diào)控基因。委內(nèi)瑞拉鏈霉菌的生長(zhǎng)細(xì)胞可視為一個(gè)多酶催化體系，相互協(xié)調(diào)，合成捷達(dá)霉素類(lèi)化合物。
專(zhuān)利WO/94/20061報(bào)道了JB化合物及其抗微生物活性，目前，國(guó)內(nèi)外僅報(bào)道了上述的角蒽環(huán)聚酮抗生素是JB一種，而且沒(méi)有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的角蒽環(huán)聚酮抗生素的制造方法，并且還提供由該方法得到的一組新角蒽環(huán)聚酮類(lèi)似物，它們分別命名為新角蒽環(huán)聚酮JF，新角蒽環(huán)聚酮JT，新角蒽環(huán)聚酮JS等。它們結(jié)構(gòu)式分別如圖2所示。應(yīng)當(dāng)指出的是，從結(jié)構(gòu)式中可以看出第二個(gè)環(huán)分別插入不同的氨基酸分子，可以獲得具有不同結(jié)構(gòu)的抗生活性的類(lèi)似物，所形成的五元雜環(huán)上可以相應(yīng)地帶有不同氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)。經(jīng)查新，上述的一組新的角蒽環(huán)聚酮抗生素為新化合物。生物活性實(shí)驗(yàn)表明，這些化合物的抗菌活性與JB相似或較強(qiáng)，此外還具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，在國(guó)內(nèi)外至今均未見(jiàn)有關(guān)報(bào)道。
本發(fā)明提供了一種利用生物合成的系列新角蒽環(huán)聚酮化合物在制備臨床抗G+菌藥物和腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)的藥物中的應(yīng)用。
新角蒽環(huán)聚酮類(lèi)抗生素的制備方法涉及的步驟1.以委內(nèi)瑞拉鏈霉菌ISP5230(ATCC NO.10712)為生產(chǎn)菌，在半乳糖—氨基酸的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基組成以水為基質(zhì)(100ml)半乳糖1.8g，氨基酸30mM，MgSO4·7H2O 0.02g，KH2PO40.102g，K2HPO40.044g，NaCl 0.088g，CaCl20.0065g，ZnSO4·7H2O 0.4mg，CuSO4·5H2O0.018mg，MnSO4·H2O 2.7mg，硼酸2.6mg，四水鉬酸銨1.7mg，pH 7.0--7.5。在上述培養(yǎng)基中所述的氨基酸可以是Phe、Ser、Thr及其它芳香族和雜環(huán)族類(lèi)氨基酸的一種，加入不同類(lèi)型的氨基酸，形成不同的產(chǎn)物。如前所述的新角蒽環(huán)聚酮類(lèi)似物是在捷達(dá)霉素(Jadomycin)英文第一個(gè)字母“J”之后加上底物氨基酸的單字母符號(hào)來(lái)命名，例如，苯丙氨酸發(fā)酵產(chǎn)物命名為JF，蘇氨酸發(fā)酵產(chǎn)物命名為JT，絲氨酸發(fā)酵產(chǎn)物命名為JS。
2.收集上述微生物發(fā)酵液的上清液，通過(guò)有機(jī)化合物常規(guī)提取的方法，常規(guī)方法包括利用化合物抗生素與雜質(zhì)在溶解度、離子親和力、吸附力、分子量等方面的差異進(jìn)行提取制備新角蒽環(huán)聚酮類(lèi)似物。這些方法可以單獨(dú)使用，也可以配合離心分離、膜分離，有機(jī)溶劑萃取、離子交換或吸附，等方法使用。本發(fā)明的另外一個(gè)特點(diǎn)在于除上述一般制備步驟外，產(chǎn)物的純化步驟可以簡(jiǎn)化為收集發(fā)酵液培養(yǎng)物，離心后用乙酸乙酯提取，提取物在硅膠板上純化、有機(jī)溶劑溶解、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮獲得產(chǎn)物。
3.純化后的產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振測(cè)定分析，確定為角蒽環(huán)聚酮化合物，是JB的類(lèi)似物，但在五元環(huán)上有以前沒(méi)有報(bào)道過(guò)的側(cè)鏈。
4.獲得的新化合物經(jīng)過(guò)抗菌、抗腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活性實(shí)驗(yàn)。與報(bào)道的JB活性相似，有明顯的抗革蘭氏陽(yáng)性菌活性，本專(zhuān)利首次報(bào)道這類(lèi)化合物的抗腫瘤細(xì)胞活性。
本發(fā)明的特點(diǎn)1.利用微生物的次生代謝合成抗生素，其工藝簡(jiǎn)便，周期短，成本低。
2.本發(fā)明生物法合成抗生素對(duì)環(huán)境無(wú)污染。
3.發(fā)明涉及的化合物是已公開(kāi)的JB的類(lèi)似物，但分子結(jié)構(gòu)不同于已報(bào)道JB，這些化合物的抗菌譜與JB相似，至今還未見(jiàn)有相同的報(bào)道。本發(fā)明首次公開(kāi)這些化合物的抗G+菌和抗腫瘤活性。
4.本發(fā)明涉及的化合物的角蒽環(huán)骨架與JB類(lèi)似，但其側(cè)鏈的特征未見(jiàn)報(bào)道，因此，本發(fā)明的抗生素的結(jié)構(gòu)不同于現(xiàn)有專(zhuān)利WO 94/20061中公開(kāi)的化合物的結(jié)構(gòu)。
5.建立了在含有半乳糖和不同氨基酸的培養(yǎng)基中，用委內(nèi)瑞拉鏈霉菌ISP5230(ATCC NO.10712)合成一系列角蒽環(huán)化合物的方法，為篩選新抗生素藥物提供了新資源。


圖1.JB的分子結(jié)構(gòu)式圖2.新角蒽環(huán)聚酮化合物的分子結(jié)構(gòu)式新角蒽環(huán)聚酮JF，新角蒽環(huán)聚酮JT，新角蒽環(huán)聚酮新角蒽環(huán)聚酮JS。
圖3.新角蒽環(huán)聚酮化合物高壓液相圖譜(313nm)新角蒽環(huán)聚酮JF，新角蒽環(huán)聚酮JT，新角蒽環(huán)聚酮新角蒽環(huán)聚酮JS具體實(shí)施方式
以下實(shí)例將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，本發(fā)明的保護(hù)范圍不受這些實(shí)例的限制。
實(shí)施例1新角蒽環(huán)聚酮抗生素JF的制備將50μl委內(nèi)瑞拉鏈霉菌孢子懸液接種于100ml含酵母膏、麥芽糖和麥芽汁的培養(yǎng)基(MYM)中，27℃，200~250rpm震蕩培養(yǎng)24小時(shí)作為種子備用。在250mL的三角瓶中加入100mL培養(yǎng)基，其組成(100ml)半乳糖1.8g，苯丙氨酸30mM，MgSO4·7H2O 0.02g，KH2PO40.102g，K2HPO40.044g，NaCl 0.088g，CaCl20.0065g，ZnSO4·7H2O 0.4mg，CuSO4·5H2O0.018mg，MnSO4·H2O 2.7mg，硼酸2.6mg，四水鉬酸銨1.7mg，pH 7.0--7.5，8磅/30min滅菌。將培養(yǎng)好的新鮮種子，在無(wú)菌條件下，接種到上述三角瓶中，接種量為10％。27℃震蕩培養(yǎng)6-9小時(shí)，加入6％乙醇刺激提高產(chǎn)物的量，繼續(xù)培養(yǎng)40-48小時(shí)，培養(yǎng)液由微黃色變成暗紅色停止培養(yǎng)，收集培養(yǎng)物。
離心(4000rpm)，收集上清，用1M鹽酸調(diào)節(jié)pH至3.0--4.0，在分液漏斗中加入1/3發(fā)酵液體積的乙酸乙酯，充分混勻，室溫下放置20min，待溶液分層后，收集上部乙酸乙酯。發(fā)酵液如此被反復(fù)提取三次，合并收集的乙酸乙酯提取液，放入蒸餾瓶中，在37-40℃的水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得到深紅色的產(chǎn)物。
產(chǎn)物溶解于乙醇中，濃度為50-100μg/mL。取10-20μL點(diǎn)樣于硅膠版(GF254)上，用不加乙醇刺激的發(fā)酵提取物和JB作參照物，干燥后在氯仿∶甲醇∶乙酸(95∶10∶0.2)的混合溶液中上行展開(kāi)，展開(kāi)劑上行至離邊緣1cm處時(shí)，從層析缸中取出硅膠板，干燥后觀察，由于制備的化合物帶有顏色，層析斑點(diǎn)或條帶在硅膠板(GF254)上可以看到。將所要的產(chǎn)物從硅膠板上刮下，浸泡在無(wú)水乙醇中，室溫下放置30min，離心(5000轉(zhuǎn)/min)，收集上清，反復(fù)提取三次，合并收集的乙醇溶液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮并在氮?dú)獯嬖诘臈l件下將乙醇溶液風(fēng)干，獲得純化的深紅色的角蒽環(huán)聚酮化合物JF。
實(shí)施例2產(chǎn)物分析對(duì)實(shí)施例1中得到的純化的角蒽環(huán)聚酮化合物JF，進(jìn)行如下分析1. 313nm波長(zhǎng)下，高壓液相色譜檢測(cè)該化合物的滯留時(shí)間為12.7min，JB的滯留時(shí)間約15.4min(圖3)。
2.電噴霧電離源(ESI)高分辨質(zhì)譜確定分子式為C33H30NO9，分子量為583。正脈沖大氣壓化學(xué)電離源(APCI)譜示584[M+H]+，540[M+H-CO2]+，454[M+H-digitoxose]+，410[M+H-digitoxose-CO2]，306[M+H-digitoxose-C9H8O2]。
3.紅外譜示，IR(KBr)v＝3468(br，m)，2928(br，w)，1804，1684(sh，s)，1777，1516(sh，w)，1454(sh，m)，1381(sh，w)，1273(sh，w)，1211(sh，s)，1136(sh，s)，970(sh，m)843(sh，m)，804(sh，m)，726(sh，m)cm-1。
4.紫外譜示，UV/Vis(Methanol)λmax(ε)＝497(1000)，393(1400)，310(9300)，289(sh)，239(9100)，211(13000)nm。
5.1H-NMR譜(400MHz，d6-丙酮，TMS)和13C-NMR譜(100MHz，d6-丙酮，TMS)分析表明，該化合物有兩種可互變的構(gòu)型，如圖2所示，分別為結(jié)構(gòu)I(1S，3aS；60％)，結(jié)構(gòu)II(1S，3aR；40％)，結(jié)果見(jiàn)表1。
表1.新角蒽環(huán)聚酮化合物JF核磁共振結(jié)構(gòu)I(1S，3aS；60％)



結(jié)構(gòu)II(1S，3aR)40％



e可變，*高級(jí)效應(yīng)實(shí)施例3_抗菌活性實(shí)驗(yàn)例2中已確定的新聚酮角蒽環(huán)化合物進(jìn)行抗菌活性實(shí)驗(yàn)。待測(cè)菌株的孢子懸浮液1ml(105CFU)，加入19ml 0.6％的軟瓊脂，混勻，鋪成平板，將含有100ug JB類(lèi)似物的紙片平貼在平板上，培養(yǎng)后測(cè)抑菌圈直徑。由下列表2可見(jiàn)，新角蒽環(huán)化合物對(duì)格蘭氏陽(yáng)性菌具有較強(qiáng)的抑制作用。
表2.部分新角蒽環(huán)聚酮化合物的抗菌活性

實(shí)施例4新角蒽環(huán)聚酮化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響用MTT法試驗(yàn)了新角蒽環(huán)化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，結(jié)果見(jiàn)下列表3。由見(jiàn)表3可見(jiàn)，這些角蒽環(huán)化合物能抑制瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，其中JF有較好的抗腫瘤活性，抑制50％肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抗生素摩爾濃度(IC50)為12.4μm，抗腫瘤活性高于JB，JB為21.8μm。
表3.部分新角蒽環(huán)聚酮化合物的抗腫瘤活性
注IC50[μm]抑制50％腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抗生素摩爾濃度。
實(shí)施例5合成系列角蒽環(huán)聚酮化合物。
在同實(shí)施例1的培養(yǎng)基中加入一種新氨基酸進(jìn)行微生物發(fā)酵，如加蘇氨酸，絲氨酸或其它芳香族和雜環(huán)族氨基酸之一取代苯丙氨酸。分別按照實(shí)施例1中的方法進(jìn)行微生物發(fā)酵培養(yǎng)和提取、純化抗生素；按照實(shí)施例2中的方法進(jìn)行產(chǎn)物分析，證明JT，JS具有如圖2所示的結(jié)構(gòu)；按照實(shí)施例3中的方法檢測(cè)抗菌活性；按照實(shí)施例4中的方法檢測(cè)對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。由于在培養(yǎng)基中加入不同類(lèi)型的氨基酸，結(jié)果獲得委內(nèi)瑞拉鏈霉菌的代謝產(chǎn)物不同，得到不同分子結(jié)構(gòu)的新角蒽環(huán)聚酮化合物新角蒽環(huán)聚酮JT，新角蒽環(huán)聚酮新角蒽環(huán)聚酮JS。它們的高壓液相色譜檢測(cè)的滯留時(shí)間不同(圖3)。上述不同氨基酸合成的新角蒽環(huán)聚酮化合物其結(jié)構(gòu)如圖2所示。
權(quán)利要求
1.一種新抗菌素新角蒽環(huán)聚酮類(lèi)似物的制造方法，該新角蒽環(huán)聚酮類(lèi)抗生素具有如下式所示的結(jié)構(gòu)式 其中R代表Phe、Ser、Thr及其它芳香族和雜環(huán)族類(lèi)的氨基酸的側(cè)鏈，該方法包括在半乳糖-氨基酸無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中先培養(yǎng)委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(Streptomyces venezuelae)ISP5230 ATCC NO.10712，再?gòu)钠渑囵B(yǎng)物的上清液中通過(guò)有機(jī)化合物常規(guī)提取的方法，利用化合物抗生素與雜質(zhì)在溶解度、離子親和力、吸附力、分子量的差異、離心分離、膜分離，有機(jī)溶劑萃取、離子交換或吸附進(jìn)行提取制得新角蒽環(huán)聚酮類(lèi)似物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，收集培養(yǎng)物上清液，離心后用乙酸乙酯提取，提取物在硅膠板上純化、有機(jī)溶劑溶解、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮制得新角蒽環(huán)聚酮類(lèi)似物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，半乳糖-氨基酸無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基其組成以水為基質(zhì)100ml半乳糖1.8g，氨基酸30mM，MgSO4·7H2O0.02g，KH2PO40.102g，K2HPO40.044g，NaCl 0.088g，CaCl20.0065g，ZnSO4·7H2O0.4mg，CuSO4·5H2O 0.018mg，MnSO4·H2O 2.7mg，硼酸2.6mg，四水鉬酸銨1.7mg，pH7.0-7.5，上述氨基酸為Phe、Thr、Ser及其它芳香族和雜環(huán)族氨基酸的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所示的新角蒽環(huán)聚酮類(lèi)抗生素結(jié)構(gòu)式中的R為絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸取代或其它芳香族和雜環(huán)族氨基酸其中之一的側(cè)鏈基團(tuán)取代。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所示的新角蒽環(huán)聚酮類(lèi)抗生素結(jié)構(gòu)式中的R為絲氨酸取代的為新角蒽環(huán)聚酮JS；蘇氨酸取代的為新角蒽環(huán)聚酮JT；苯丙氨酸取代的為新角蒽環(huán)聚酮JF.。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的其新角蒽環(huán)聚酮JF、新角蒽環(huán)聚酮JT、新角蒽環(huán)聚酮JS分別具有如圖2所示的結(jié)構(gòu)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的的方法，其中所示的新角蒽環(huán)聚酮類(lèi)抗生素結(jié)構(gòu)式中的R為其它芳香族和雜環(huán)族氨基酸其中之一的側(cè)鏈基團(tuán)取代的新角蒽環(huán)聚酮化合物，除去它們依各自的氨基酸取代R外分別具有如權(quán)利要求1所示的相同結(jié)構(gòu)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法在制備臨床抗G+菌藥物和腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)的新角蒽環(huán)聚酮藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及的一組新角蒽環(huán)聚酮抗生素由委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(Streptomyces venezuelae)ISP5230(ATCC no.10712)在半乳糖－氨基酸的培養(yǎng)基中，27－30℃培養(yǎng)，外界刺激的條件下產(chǎn)生。化合物用乙酸乙酯提取，經(jīng)硅膠層析獲得。純化后的產(chǎn)物經(jīng)核磁共振分析證明結(jié)構(gòu)與已報(bào)導(dǎo)捷達(dá)霉素B(簡(jiǎn)稱(chēng)JB)類(lèi)似，但本發(fā)明公開(kāi)的化合物在結(jié)構(gòu)上具有新的特征，生物活性試驗(yàn)表明，這些化合物能抑制G
文檔編號(hào)A61P31/00GK1629173SQ200310122330
公開(kāi)日2005年6月22日 申請(qǐng)日期2003年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月16日
發(fā)明者楊克遷, 鄭艦艇, 陳義華, 寇秀芬 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所