專利名稱：用于治療多發(fā)性骨髓瘤的埃坡霉素衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對(duì)患有骨髓瘤、尤其是患有對(duì)常規(guī)細(xì)胞毒化學(xué)療法有抗性的骨髓瘤的溫血?jiǎng)游?、尤其是人進(jìn)行治療的方法，該方法包括將治療有效量的埃坡霉素、尤其是如本文所定義的式I埃坡霉素施用于所述動(dòng)物；涉及用于同時(shí)、分別或依次使用的組合，該組合包含埃坡霉素和選自烷化劑、皮質(zhì)類固醇和蒽環(huán)霉素類的化合物，以及任選至少一種可藥用載體；并且還涉及包含所述組合的藥物組合物和商業(yè)包裝。
紫杉烷類，例如紫杉醇(paclitaxel)和多西他賽(docetaxel)，代表一類通常用于多種增殖性疾病、例如實(shí)體瘤疾病、如卵巢癌的微管穩(wěn)定劑。然而，紫杉烷類在骨髓瘤的治療中沒有表現(xiàn)出很好的前景。埃坡霉素類，例如埃坡霉素A、B和D，及其類似物代表一類新的微管穩(wěn)定劑(參見Gerth，K.等人，J.Antibiot.49，560-3(1996)；或Hoefle等人，DE 41 38 042)?，F(xiàn)在令人驚奇地發(fā)現(xiàn)埃坡霉素類、尤其是如本文所定義的式I埃坡霉素、特別是埃坡霉素B可直接抑制骨髓瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活。
另外，患者多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)的粘連可增強(qiáng)埃坡霉素抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)與BMSC粘連的骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞死亡的能力。
因此，本發(fā)明涉及治療骨髓瘤、尤其是對(duì)常規(guī)細(xì)胞毒化學(xué)療法有抗性的骨髓瘤的方法，該方法包括將治療有效量的埃坡霉素、優(yōu)選治療有效量的式I埃坡霉素或其可藥用鹽 其中，A表示O或NRN，其中RN為氫或低級(jí)烷基，R為氫或低級(jí)烷基，R’為甲基、甲氧基、乙氧基、氨基、甲氨基、二甲氨基或甲硫基，以及Z為O或鍵，施用于需要其的溫血?jiǎng)游铮瑑?yōu)選是人。
本發(fā)明特別涉及治療骨髓瘤的方法，其中(a)可觀察到多藥耐藥蛋白p170的過表達(dá)，和/或(b)骨髓瘤對(duì)紫杉烷如紫杉醇或多西他賽有耐受性。
如此處所用的術(shù)語“骨髓瘤”涉及由通常在骨髓中所發(fā)現(xiàn)類型的細(xì)胞構(gòu)成的腫瘤。如此處所用的術(shù)語“多發(fā)性骨髓瘤”指漿細(xì)胞的彌散性惡性腫瘤，其以多發(fā)性骨髓腫瘤病灶且分泌M成分(單克隆免疫球蛋白片段)為特征，伴有導(dǎo)致骨痛的散在性溶骨性病變、病理性骨折、高血鈣癥和正色素性正常紅細(xì)胞性貧血(normochromic normocytic anaemia)。通過使用常規(guī)的細(xì)胞毒和高劑量化學(xué)療法不能治愈多發(fā)性骨髓瘤。
在整個(gè)說明書和權(quán)利要求書中，骨髓瘤優(yōu)選指多發(fā)性骨髓瘤(MM)。
除非另外指明，在本文所公開的內(nèi)容中，指明為“低級(jí)”的有機(jī)基團(tuán)和化合物含有不多于7個(gè)、優(yōu)選不多于4個(gè)碳原子。
其中A表示O、R為氫、R’為甲基且Z為O的式I化合物稱為埃坡霉素A；其中A表示O、R為甲基、R’為甲基且Z為O的式I化合物稱為埃坡霉素B；其中A表示O、R為氫、R’為甲基且Z為鍵的式I化合物稱為埃坡霉素C；其中A表示O、R為甲基、R’為甲基且Z為鍵的式I化合物稱為埃坡霉素D。
尤其在專利和專利申請(qǐng)WO 93/10121、US 6,194,181、WO 98/25929、WO 98/08849、WO 99/43653、WO 98/22461和WO 00/31247中，特別是在其各自的化合物權(quán)利要求和實(shí)施例的終產(chǎn)物中，概括地和具體地公開了如下定義的式I埃坡霉素衍生物以及制備該埃坡霉素衍生物的方法其中A表示O或NRN，其中RN為氫或低級(jí)烷基，R為氫或低級(jí)烷基，R’為甲基且Z為O或鍵；這些文獻(xiàn)的終產(chǎn)物、藥物制劑和權(quán)利要求的主題在此處被引入本申請(qǐng)作為公開內(nèi)容的參考。同樣還包括在所述文獻(xiàn)中公開的相應(yīng)的立體異構(gòu)體和相應(yīng)的結(jié)晶變體(crystal modifications)，如溶劑化物和多晶型物。式I埃坡霉素衍生物、尤其是埃坡霉素B可作為WO 99/39694中所公開的藥物組合物的一部分施用。
尤其在專利申請(qǐng)WO 99/67252中，概括地和具體地公開了如下定義的式I埃坡霉素衍生物以及制備和施用該埃坡霉素衍生物的方法其中A表示O或NRN，其中RN為氫或低級(jí)烷基，R為氫或低級(jí)烷基，R’為甲氧基、乙氧基、氨基、甲氨基、二甲氨基或甲硫基，以及Z為O或鍵；其在此處被引入本申請(qǐng)作為參考。同樣還包括該文獻(xiàn)所公開的相應(yīng)的立體異構(gòu)體和相應(yīng)的結(jié)晶變體，如溶劑化物和多晶型物。
埃坡霉素B向相應(yīng)的內(nèi)酰胺的轉(zhuǎn)化在WO 99/02514的流程圖21(第31和32頁(yè))及實(shí)施例3(第48-50頁(yè))中公開。不同于埃坡霉素B的式I化合物向相應(yīng)的內(nèi)酰胺的轉(zhuǎn)化也可類似地完成。其中RN為低級(jí)烷基的相應(yīng)的式I埃坡霉素衍生物可通過本領(lǐng)域已知的方法如還原烷基化反應(yīng)、以其中RN為氫的埃坡霉素衍生物為原料來制備。
應(yīng)當(dāng)理解，在方法的討論部分中所提及的活性成分還包括可藥用鹽。如果這些活性成分具有例如至少一個(gè)堿性中心，則它們可形成酸加成鹽。如果需要的話，還可形成存在有其它堿性中心的相應(yīng)的酸加成鹽。含酸性基團(tuán)(例如COOH)的活性成分還可與堿形成鹽?；钚猿煞只蚱淇伤幱名}也可以以水合物的形式使用或者包含在結(jié)晶過程中所用的其它溶劑。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用其中A表示O、R為低級(jí)烷基(尤其是甲基、乙基或正丙基)或氫、R’為甲基且Z為O或鍵的式I埃坡霉素衍生物。更優(yōu)選使用其中A表示O、R為甲基、R’為甲基且Z為O的式I埃坡霉素衍生物，該化合物也稱為埃坡霉素B。
如此處所用的術(shù)語“治療”包括對(duì)患有骨髓瘤或處于所述疾病前期的患者進(jìn)行的治療，該治療可在所述患者中延緩疾病的發(fā)展，并優(yōu)選旨在對(duì)治療完全響應(yīng)、對(duì)治療部分響應(yīng)或使疾病穩(wěn)定。
如此處所用的術(shù)語“完全響應(yīng)”特別指所有可測(cè)定或可評(píng)價(jià)的疾病消除。
如此處所用的術(shù)語“部分響應(yīng)”特別指在任何特定的疾病部位沒有發(fā)展的情形下可測(cè)定或可評(píng)價(jià)疾病的消除高于或等于50％。
如此處所用的術(shù)語“疾病穩(wěn)定”特別指可測(cè)定或可評(píng)價(jià)的疾病減少低于50％或增加低于25％。
本發(fā)明還涉及含有(a)埃坡霉素和(b)至少一種選自烷化劑、皮質(zhì)類固醇和蒽環(huán)霉素類的化合物的組合。特別是用于同時(shí)、分別或依次使用來治療骨髓瘤的組合。
如此處所用的術(shù)語“烷化劑”包括但不限于烷基磺酸酯類、吖丙啶類、環(huán)氧化物類、氮雜環(huán)丙烷類、甲基蜜胺類、氮芥類、亞硝基脲類、咪唑并四嗪酮類(imidazotetrazinones)、達(dá)卡巴嗪、甘露莫司汀、二溴甘露醇、二溴衛(wèi)矛醇、哌泊溴烷和丙卡巴肼。
如此處所用的術(shù)語“烷基磺酸酯類”包括但不限于白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡。
如此處所用的術(shù)語“吖丙啶類”包括但不限于苯佐替派、卡波醌、美妥替哌和烏瑞替派。
如此處所用的術(shù)語“氮雜環(huán)丙烷類和甲基蜜胺類”包括但不限于六甲蜜胺、曲他胺、三乙烯磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙烯硫代磷酰胺(塞替派)和三羥甲蜜胺。
如此處所用的術(shù)語“氮芥類”包括但不限于苯丁酸氮芥、萘氮芥、環(huán)磷氮芥、雌莫司汀、異環(huán)磷酰胺、氮芥、鹽酸氧氮芥(mechlorethamine oxidehydrochloride)、美法侖、新氮芥、苯芥膽甾醇、潑尼莫司汀、曲磷胺和烏拉莫司汀。
如此處所用的術(shù)語“亞硝基脲類”包括但不限于卡莫司汀、氯脲菌素、cytemustine、福莫司汀、洛莫司汀(CCNU)、尼莫司汀和雷莫司汀。
如此處所用的術(shù)語“咪唑并四嗪酮類”包括但不限于替莫唑胺和米托唑胺。
“替莫唑胺”在US 5,260,291中有描述。替莫唑胺的合成是眾所周知的，例如參見Wang等人，J.Org.Chem.1997，62，7288-7294。替莫唑胺可例如以商標(biāo)TEMODALTM、TEMODARTM或TEMOXOLTM自商業(yè)購(gòu)得，并且可例如按照US 5,942,247中的描述或根據(jù)包裝說明書的信息來施用。術(shù)語“洛莫司汀”指例如在Johnson P等人，J.Med.Chem.1966，9，892中描述和制備的化合物。洛莫司汀可以以商標(biāo)BETULUSTINETM自商業(yè)購(gòu)得，并且可根據(jù)包裝說明書的信息來施用。
如此處所用的術(shù)語“蒽環(huán)霉素類”包括但不限于多柔比星(doxorubicine)和柔紅霉素(daunorubicine)。
另外，此處以名稱提及的活性藥物的結(jié)構(gòu)可從標(biāo)準(zhǔn)概述“默克索引”的現(xiàn)行版本或數(shù)據(jù)庫(kù)如Patents International(如IMS World Publications)中獲得。其相應(yīng)的內(nèi)容在此處引入作為參考?；谶@些參考資料，本領(lǐng)域的任何技術(shù)人員完全能夠制備這些化合物并在體內(nèi)和體外標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭袦y(cè)試其藥學(xué)適應(yīng)征和性質(zhì)。
下文將包含下述成分的組合稱為本發(fā)明的組合(a)埃坡霉素和(b)至少一種選自烷化劑、皮質(zhì)類固醇和蒽環(huán)霉素類的化合物，其中活性成分在每種情形下以游離形式或可藥用鹽的形式存在，并且還可任選包含至少一種可藥用載體。
本發(fā)明的組合可以是組合制劑或藥物組合物。
如此處所用的術(shù)語“組合制劑”特別定義為其中如上定義的活性成分單獨(dú)給藥或通過使用含不同量活性成分的不同固定組合給藥、即同時(shí)或在不同時(shí)間點(diǎn)給藥的“成套藥盒”。因而藥盒的各部分可例如同時(shí)施用或按時(shí)間順序交替施用，所述的按時(shí)間順序交替施用指成套藥盒的任何部分在不同的時(shí)間點(diǎn)以相同或不同的時(shí)間間隔施用。非常優(yōu)選地，選擇時(shí)間間隔為具有下述效果的時(shí)間間隔各部分組合使用對(duì)所治療疾病的效果強(qiáng)于僅使用活性成分中的任何一種所獲得的效果。在組合制劑中，所欲施用的活性成分1和活性成分2的總含量的比率可以有所變化，例如為了滿足所欲治療的患者亞群體的需要或滿足單個(gè)患者的需要(所述需要因患者的年齡、性別和體重等而不同)而有所變化。優(yōu)選至少有一種有益效果，例如，第一種活性成分和第二種活性成分的作用相互增強(qiáng)且特別是協(xié)同作用(如不止是累加作用)、額外的有利作用、副作用較少、第一種活性成分和第二種活性成分中的一種或兩種的非有效劑量所獲得的組合治療效果且尤其是第一種活性成分和第二種活性成分具有強(qiáng)的協(xié)同作用。
另外，本發(fā)明提供了治療骨髓瘤的方法，該方法包括將抗骨髓瘤的聯(lián)合治療有效量的本發(fā)明的組合施用于需要其的溫血?jiǎng)游铩?br> 相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員完全能夠選擇相關(guān)的試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠碜C明在上下文中所提及的埃坡霉素或本發(fā)明的組合對(duì)骨髓瘤的有益效果。埃坡霉素或本發(fā)明的組合的藥理學(xué)活性可例如在適宜的臨床研究中或者通過下文所述的實(shí)施例來證明。通過下文所述的方法，可以證明例如，埃坡霉素B可抑制MM細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活，其IC90為1至10nM。埃坡霉素B使MM細(xì)胞的G2M期停止，隨后引起細(xì)胞凋亡。適宜的臨床研究例如是在晚期骨髓瘤患者中進(jìn)行的開放標(biāo)記的非隨機(jī)劑量遞增研究。該研究特別證明了用本發(fā)明的組合所觀察到的協(xié)同作用。對(duì)骨髓瘤的有益效果可直接由該研究的結(jié)果或通過改變研究方案來確定，其中所述的改變對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的。例如，一種組合組分以固定劑量施用，第二種組合組分的劑量遞增至達(dá)到最大耐受劑量(MTD)?；蛘?，為了證明此處所提及的本發(fā)明的組合的有益效果，可進(jìn)行安慰劑對(duì)照的雙盲研究。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供包含有抗骨髓瘤的聯(lián)合治療有效量的本發(fā)明的組合的藥物組合物。在該組合物中，組合組分可以以一個(gè)組合單位劑型或兩個(gè)單獨(dú)的單位劑型一起、相繼或分別施用。該單位劑型還可以是固定組合。
根據(jù)本發(fā)明，用于分別施用組合組分和用于以含至少兩種組合組分的固定組合(即單個(gè)蓋侖組合物)施用的藥物組合物可按照本身已知的方法制備，并且所述藥物組合物是適于經(jīng)腸內(nèi)(如經(jīng)口或直腸)和胃腸道外施用于哺乳動(dòng)物(溫血?jiǎng)游?、包括人的那些，其可僅包含治療有效量的至少一種藥理學(xué)活性的組合組分，或者還包含一種或多種可藥用載體、尤其是適于經(jīng)腸內(nèi)或胃腸道外施用的載體。
新的藥物組合物含有例如約10％至約100％、優(yōu)選約20％至約60％的活性成分。用于經(jīng)腸內(nèi)或胃腸道外施用的組合療法的藥物制劑例如是單位劑型的那些，例如糖包衣片、片劑、膠囊或栓劑以及安瓿。如果沒有另外指出，這些制劑以本身已知的方法制備，例如通過常規(guī)的混合、制粒、包糖衣、溶解或冷凍干燥方法來制備。可以理解的是，包含在各劑型的獨(dú)立劑量中的組合組分的單位含量不一定構(gòu)成其有效量，因?yàn)榭赏ㄟ^施用多個(gè)劑量單位來達(dá)到必需有效量。
特別地，本發(fā)明的組合中治療有效量的各組合組分可同時(shí)或以任何順序依次施用，并且各組分可分別或作為固定組合施用。例如，本發(fā)明的治療骨髓瘤的方法包括同時(shí)或以任何順序依次施用聯(lián)合治療有效量的、優(yōu)選協(xié)同有效量的(i)游離或可藥用鹽形式的組合組分(a)和(ii)游離或可藥用鹽形式的組合組分(b)，例如以與此處所述的量相一致的日劑量施用。本發(fā)明的組合的各組合組分可以以分開或單個(gè)的組合形式在治療期間的不同時(shí)間分別施用或者同時(shí)施用。此外，術(shù)語施用還包括使用在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為所述組合組分的前藥。因此，本發(fā)明應(yīng)當(dāng)理解為包含所有的同時(shí)或交替治療的方案，并且術(shù)語“施用”也相應(yīng)地被解釋。
埃坡霉素及本發(fā)明的組合中所用的組合組分的有效劑量可根據(jù)所用的具體化合物或藥物組合物、施用模式、所治療的骨髓瘤類型及所治療的骨髓瘤的嚴(yán)重程度而有所變化。因此，可根據(jù)多種因素來選擇本發(fā)明的組合的給藥方案，所述因素包括給藥途徑和患者的肝腎功能。具有普通技能的主治醫(yī)師、臨床醫(yī)師或獸醫(yī)可容易地確定并建議用于預(yù)防、逆轉(zhuǎn)或停止病癥發(fā)展所需的埃坡霉素或本發(fā)明的組合中單個(gè)活性成分的有效量。使活性成分的濃度位于有效但無毒的范圍內(nèi)的最佳處方量需要有基于活性成分被靶點(diǎn)利用的動(dòng)力學(xué)的給藥方案。
如果本文沒有特別指出，則當(dāng)本發(fā)明的組合中所用的組合組分以市售單個(gè)藥物的形式使用時(shí)，可根據(jù)各市售藥物的包裝說明書上提供的信息來確定其劑量和施用模式，以獲得此處所述的有益效果。
如果溫血?jiǎng)游锸侨耍瑒t對(duì)成年患者而言，式I化合物的劑量?jī)?yōu)選為約0.1至75、優(yōu)選0.25至50、例如2.5或6mg/m2，每周一次，共計(jì)2至4周，例如3周，之后6至8天停藥。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在前次治療后間隔1至6周、尤其是間隔1周后，以約0.1至6mg/m2、優(yōu)選0.1至3mg/m2、例如2.5mg/m2的劑量每周施用埃坡霉素B，共計(jì)3周。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述埃坡霉素B優(yōu)選以約0.5至7.5mg/m2的劑量每18至24天施用于人。
替莫唑胺優(yōu)選以50至300mg/m2/天、最優(yōu)選以200mg/m2/天的劑量每日施用，每28天為一周期，每周期連續(xù)施用5天。對(duì)于以前進(jìn)行過化療的患者，通常以150mg/m2/天的劑量開始治療。
洛莫司汀優(yōu)選以60至180mg/m2的單次劑量、優(yōu)選以130mg/m2的劑量每6周施用一次。
此外，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的組合作為活性成分的商業(yè)包裝，該包裝還含有同時(shí)、分別或依次使用該組合來治療骨髓瘤的說明。
本發(fā)明還提供了如此處所定義的式I化合物和本發(fā)明的組合在制備用于治療骨髓瘤的藥物中的用途。
實(shí)施例概述可從Rockville，MD的美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得RPMI8226和U266人MM細(xì)胞系。從患者BM樣品中純化得到源自患者的MM細(xì)胞，如Y.T.Tai，G.Teoh，Y.Shima等人在J.Immunol.Methods23511，2000中所描述的。將所有的人MM細(xì)胞系在RPMI-1640培養(yǎng)基(Sigma Chemical，St.Louis，MO)中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基含有10％胎牛血清(FBS)、2mmol/L L-谷氨酰胺(L-glut，GIBCO，Grand Island，NY)、100U/mL青霉素和100mg/mL鏈霉素(P/S，GIBCO)。MM患者的細(xì)胞≥95％為CD38+和CD45RA-。按照D.Gupta，S.Treon，Y.Shima等人在Leukemia，2001中以及S.Gartner和H.S.Kaplan在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 774756，1980中所描述內(nèi)容，從MM患者及健康捐獻(xiàn)者的抽出物中制備骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)。細(xì)胞在含有20％FBS、2mmol/L L-glut和100ug/mL P/S的ISCOVE′s modified Dulbecco培養(yǎng)基中培養(yǎng)。從Clonetics，Biowhittaker購(gòu)得人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC P168)，并維持在EGM-2MV培養(yǎng)基(Clonetics，Biowhittaker)中。將埃坡霉素溶于二甲基亞砜(DMSO；Sigma)中，作為儲(chǔ)備液于-20℃貯存?zhèn)溆谩?duì)于所有測(cè)定法，將化合物在培養(yǎng)基中稀釋至濃度為例如0.01至100μM。測(cè)定由上述共培養(yǎng)系統(tǒng)得到的上清液中細(xì)胞因子的水平。使用商購(gòu)ELISA試劑盒(R&D系統(tǒng))測(cè)定VEGF和IL-6的濃度。
細(xì)胞蛋白溶解產(chǎn)物、免疫沉淀法和蛋白質(zhì)印跡分析將MM細(xì)胞在含有10％FBS的RPMI中饑餓培養(yǎng)12小時(shí)，然后在不含F(xiàn)BS但含有埃坡霉素或DMSO對(duì)照的RPMI-1640中培養(yǎng)1小時(shí)。然后如K.Podar，Y.T.Tai等人在Blood 98428，2001中所描述的，用100nM VEGF165刺激這些細(xì)胞。然后將細(xì)胞在含有1mM PMSF、1mM釩酸鈉和蛋白酶抑制劑混合物的RIPA緩沖液(Boehringer Mannheim)中溶解。將溶解產(chǎn)物直接在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE凝膠)上分析，或者用抗Flt-1抗體(Ab)和瓊脂糖偶聯(lián)的蛋白G(均來自于SantaCruz Biotechnology，CA)培養(yǎng)過夜。全細(xì)胞溶解產(chǎn)物(每泳道30μg)或免疫沉淀物在8％至10％的SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行分析；轉(zhuǎn)移至Hybond CSuper paper(Amersham，Arlington Heights，IL)上；然后使用抗磷酸化ERK鼠單克隆抗體、抗磷酸化酪氨酸殘基鼠單克隆抗體或者抗Flt-1或ERK2抗體(Santa Cruz)做探針進(jìn)行檢測(cè)；用HRP-偶聯(lián)抗鼠或抗兔抗體(均來自于Santa Cruz)和增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL)底物溶液(Amersham)進(jìn)行測(cè)定。
蛋白質(zhì)印跡使用RIPA緩沖液，在蛋白酶抑制劑混合物(Roche)、1mM PMSF和1mM原釩酸鈉的存在下由經(jīng)藥物處理的MM細(xì)胞和對(duì)照MM細(xì)胞制備蛋白溶解產(chǎn)物。將溶解產(chǎn)物直接在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠上進(jìn)行分析；轉(zhuǎn)移至Hybond C Super paper(Amersham，Arlington Heights，IL)上；用抗bcl-2鼠單克隆抗體(Santa Cruz，CA)、bax(Santa Cruz)或PARP(Biomol，West Grove，PA)或者抗caspase-3兔多克隆抗體(Santa Cruz)以及抗肌動(dòng)蛋白羊多克隆抗體(Santa Cruz)做探針進(jìn)行檢測(cè)；用HRP-偶聯(lián)抗鼠或抗羊抗體(均來自于Santa Cruz)和增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL)底物溶液(Amersham)進(jìn)行測(cè)定。
增殖和細(xì)胞成活力的測(cè)定首先將MM細(xì)胞在含有10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中饑餓培養(yǎng)12小時(shí)，然后在藥物或DMSO對(duì)照的存在下，將其鋪至96孔微量滴定板(Costar，Cambridge，MA)中。還可在有或無VEGF165的存在下進(jìn)行試驗(yàn)(R和D系統(tǒng))。通過引入[3H]-胸苷(NEN Products，波士頓，MA)測(cè)定增殖。具體而言，在48小時(shí)培養(yǎng)的最后6個(gè)小時(shí)，將細(xì)胞用[3H]-胸苷(0.5μCi/孔)進(jìn)行脈沖，使用自動(dòng)細(xì)胞收集器(Cambridge Technology，Cambridge，MA)將細(xì)胞收集至玻璃濾器上，使用LKB Betaplate閃爍計(jì)數(shù)儀(Wallac，Gaithersburg，MD)計(jì)數(shù)。使用CellTiter96AQueousOneSolution Reagent(Promega，Madison，WI)，由MTS測(cè)定法通過比色來測(cè)定細(xì)胞成活力。在48小時(shí)培養(yǎng)的最后2個(gè)小時(shí)，將細(xì)胞暴露于MTS，使用ELISA板讀數(shù)儀(Molecular Devices Corp.，Sunnyvale，CA)于OD為570nm處測(cè)定吸收度。
細(xì)胞周期的分析將MM細(xì)胞(1×106個(gè)細(xì)胞)在埃坡霉素B或DMSO對(duì)照的存在下培養(yǎng)24、48和72個(gè)小時(shí)。然后將細(xì)胞用磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)洗滌，用70％乙醇固定，并用RNAse(Sigma)處理。接著將細(xì)胞用碘化丙啶(PI，5μg/mL)染色，使用M軟件在Epics流式細(xì)胞儀(Coulter Immunology，Hialeah，F(xiàn)L)上測(cè)定細(xì)胞周期性質(zhì)。
實(shí)施例1MM細(xì)胞在粘連體系中的增殖將BMSC(1×104個(gè)細(xì)胞/孔)鋪在96孔微量滴定板上并于37℃在ISCOVE′s培養(yǎng)基(20％FBS)中培養(yǎng)24小時(shí)。然后在埃坡霉素B或DMSO對(duì)照的存在下，將MM細(xì)胞加入含有BMSC的孔中(5×104個(gè)細(xì)胞/孔)。當(dāng)使用MM.1S細(xì)胞時(shí)，將BMSC和MM細(xì)胞兩者在含有2％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中饑餓培養(yǎng)12小時(shí)。當(dāng)使用患者PCL細(xì)胞時(shí)，在含有10％FBS的RPMI培養(yǎng)基中進(jìn)行共培養(yǎng)。還可分別培養(yǎng)BMSC和MM細(xì)胞以作為對(duì)照。在48小時(shí)后，如上文所述分析增殖和細(xì)胞成活力。為確保收集所有細(xì)胞用于增殖測(cè)定法，在收集細(xì)胞前10分鐘向每個(gè)孔中加入10×胰蛋白酶(Sigma)。
實(shí)施例2MM細(xì)胞在改良Boyden Chamber Transwell系統(tǒng)中的增殖在改良Boyden Chamber Transwell系統(tǒng)中，使用孔內(nèi)徑為0.4mm的24孔板(Costar)測(cè)定增殖。將BMSC(4×104個(gè)細(xì)胞/孔)鋪在下室，進(jìn)行饑餓培養(yǎng)，并如上所述在埃坡霉素B中培養(yǎng)。然后將MM細(xì)胞(20×104個(gè)細(xì)胞/孔)置入上室(嵌入)，如上文所述在48小時(shí)時(shí)測(cè)定各室中[3H]-胸苷攝取量。
實(shí)施例3細(xì)胞因子濃度的測(cè)定測(cè)定由上述共培養(yǎng)系統(tǒng)得到的上清液中細(xì)胞因子的水平。使用自商購(gòu)ELISA試劑盒(R&D系統(tǒng))測(cè)定VEGF和IL-6的濃度。
實(shí)施例4埃坡霉素B對(duì)MM.1S細(xì)胞增殖的作用將MM.1S細(xì)胞置于跨孔(transwell)共培養(yǎng)系統(tǒng)的上室，以避免MM細(xì)胞和BMSC直接接觸，但是盡管如此，允許體液因子的擴(kuò)散。雖然這兩種細(xì)胞類型之間沒有接觸，但是用BMSC培養(yǎng)的MM.1S細(xì)胞所攝取的[3H]-dT在48小時(shí)時(shí)增加2.2倍(p＜0.0001)。與.之相反，共培養(yǎng)系統(tǒng)中BMSC所攝取的[3H]-dT沒有顯著增加。通過該共培養(yǎng)系統(tǒng)可以證明埃坡霉素B可減少M(fèi)M.1S細(xì)胞的增殖。
實(shí)施例5埃坡霉素B在體內(nèi)對(duì)人MM細(xì)胞的作用將小鼠右腋皮下接種在100ml RPMI 1640中的3×107個(gè)MM細(xì)胞和100uL基質(zhì)膠基底膜基質(zhì)(matrigel basement membrane matrix)(BectonDickinson，Bedford，MA)。在注射后第6天，將小鼠分為兩個(gè)接受埃坡霉素B的治療組和一個(gè)對(duì)照組。從第6天開始，以2.5mg/kg劑量尾靜脈注射埃坡霉素B進(jìn)行治療，每周一次，共計(jì)四周，或者在第6天一次給予4mg/kg劑量。對(duì)照組每周僅接受載體(30％PEG-300，在0.9％氯化鈉中)。用卡鉗每周兩次測(cè)定腫瘤最長(zhǎng)的垂直直徑，使用公式4/3×(寬/2)2×(長(zhǎng)/2)來估計(jì)腫瘤的體積，該公式表示橢圓體的三維體積。當(dāng)腫瘤達(dá)2cm或當(dāng)小鼠瀕臨死亡時(shí)，將動(dòng)物處死。評(píng)價(jià)從腫瘤注射第一天起至死亡的存活率。
權(quán)利要求
1.治療患有骨髓瘤的溫血?jiǎng)游锏姆椒?，該方法包括施用治療有效量的埃坡霉素?br> 2.權(quán)利要求1的方法，其中用于需要其的溫血?jiǎng)游锏陌Ｆ旅顾貫槭絀化合物或其可藥用鹽 其中，A表示O或NRN，其中RN為氫或低級(jí)烷基，R為氫或低級(jí)烷基，R’為甲基、甲氧基、乙氧基、氨基、甲氨基、二甲氨基或甲硫基，以及Z為O或鍵。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中所述的方法，其中溫血?jiǎng)游餅槿恕?br> 4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中骨髓瘤對(duì)常規(guī)細(xì)胞毒化學(xué)療法有抗性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中可觀察到多藥耐藥蛋白p170的過表達(dá)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中骨髓瘤對(duì)紫杉烷如紫杉醇有耐受性。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中該疾病為多發(fā)性骨髓瘤。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中式I化合物是埃坡霉素B。
9.根據(jù)權(quán)利要求8中所述的方法，該方法包括在前次治療后間隔1至6周后，以約0.1至6mg/m2的劑量每周施用埃坡霉素B，共計(jì)3周。
10.用于同時(shí)、分別或依次使用來治療骨髓瘤的組合，該組合包含(a)式I埃坡霉素 其中，A表示O或NRN，其中RN為氫或低級(jí)烷基，R為氫或低級(jí)烷基，R’為甲基、甲氧基、乙氧基、氨基、甲氨基、二甲氨基或甲硫基，以及Z為O或鍵，和(b)至少一種選自烷化劑、皮質(zhì)類固醇和蒽環(huán)霉素類的化合物，其中活性成分(a)和(b)在每種情形下以游離形式或可藥用鹽的形式存在，并且還任選包含至少一種可藥用載體。
11.根據(jù)權(quán)利要求10中所述的組合，其中埃坡霉素為埃坡霉素B。
12.用于同時(shí)、分別或依次使用來治療多發(fā)性骨髓瘤的權(quán)利要求11或12的組合。
13.權(quán)利要求11或12的組合在制備用于治療骨髓瘤的藥物中的用途。
14.治療骨髓瘤的方法，該方法包括將如權(quán)利要求11中所定義的組合以抗骨髓瘤的聯(lián)合治療有效量施用于需要其的溫血?jiǎng)游铩?br> 15.藥物組合物，該組合物包含抗骨髓瘤的聯(lián)合治療有效量的權(quán)利要求11的組合以及至少一種可藥用載體。
16.商業(yè)包裝，該商業(yè)包裝包含如權(quán)利要求11中所定義的組合以及同時(shí)、分別或依次使用該組合來治療骨髓瘤的說明。
全文摘要
本發(fā)明涉及對(duì)患有骨髓瘤、尤其是患有對(duì)常規(guī)細(xì)胞毒化學(xué)療法有抗性的骨髓瘤的溫血?jiǎng)游?、尤其是人進(jìn)行治療的方法，該方法包括將治療有效量的埃坡霉素、尤其是式(I)埃坡霉素施用于所述動(dòng)物；涉及用于同時(shí)、分別或依次使用的包含埃坡霉素的組合；并且還涉及包含所述組合的藥物組合物和商業(yè)包裝。
文檔編號(hào)A61K45/06GK1703216SQ200380101065
公開日2005年11月30日 申請(qǐng)日期2003年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月11日
發(fā)明者B·林, K·C·安德森, J·D·格里芬 申請(qǐng)人:達(dá)納-法伯癌癥研究公司