專利名稱：利用已標(biāo)記的、針對(duì)腫瘤特異性表位的活化淋巴細(xì)胞進(jìn)行腫瘤的檢測(cè)、定位和分級(jí)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于包括診斷和治療在內(nèi)的臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及針對(duì)例如腫瘤特異性表位等細(xì)胞特異性抗原的已活化淋巴細(xì)胞的用途、它們遷移并附著于它們被致敏的腫瘤表位的能力、這些細(xì)胞將極小腫瘤的定位信號(hào)擴(kuò)大化的能力；以及它們?cè)阼b別具有已知免疫原性表位的未知原發(fā)性腫瘤(尤其是產(chǎn)生粘蛋白的腺癌)中的用途。
背景技術(shù)：
應(yīng)用各種成像劑或抗體進(jìn)行完整人體內(nèi)諸如淋巴組織等組織的成像的方法是已知的。例如，于1988年4月5日頒予Goldenberg的美國(guó)專利4,735,210公布了淋巴系造影和器官成像方法和試劑盒，尤其是針對(duì)淋巴系閃爍掃描法或磁共振淋巴系造影術(shù)的改良方法，該方法包括從用特異抗體成像劑所產(chǎn)生的陽(yáng)性圖像中扣除用總成像劑所產(chǎn)生的陰性圖像。本發(fā)明的另一實(shí)施方案是將針對(duì)淋巴組織的抗體作為淋巴系統(tǒng)的成像劑。進(jìn)一步的實(shí)施方案包括將磁共振成像增強(qiáng)劑用于磁共振淋巴造影術(shù)。還有另一實(shí)施方案是將已標(biāo)記的針對(duì)器官抗原的抗體用于閃爍掃描和磁共振器官成像。
在完整人體中對(duì)諸如淋巴細(xì)胞等放射性標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行成像也是眾所周知的。例如，Wagstaff，J等在文獻(xiàn)“利用銦-111 8-羥基喹啉標(biāo)記跟蹤人淋巴細(xì)胞途徑的方法(A method for following humanlymphocyte traffic using indium-111 oxine labeling)”Clin ExpImmunol.Mar；43(3)435-442(1981a)中公布了一種方法，通過(guò)此方法將大量人淋巴細(xì)胞從外周血液中分離出來(lái)并用銦-111 8-羥基喹啉進(jìn)行體外標(biāo)記。在自體再注射后，用系列血液采樣、表面探針計(jì)數(shù)和γ攝影成像的方式跟蹤它在體內(nèi)的分布。作者報(bào)道了利用γ攝影成像得到了高分辨率的淋巴結(jié)構(gòu)圖象，且器官分布中所顯示的改變與由淋巴細(xì)胞遷移的動(dòng)物模型獲得的數(shù)據(jù)有很好的相關(guān)性。因此，人淋巴細(xì)胞的銦-111 8-羥基喹啉標(biāo)記提供了一種非侵入性的方法，借此可以追蹤人淋巴細(xì)胞的遷移特性。Wagstaff，J等在文獻(xiàn)“利用銦-111 8-羥基喹啉標(biāo)記跟蹤人淋巴細(xì)胞途徑的方法臨床觀察數(shù)據(jù)(A method forfollowing human lymphocyte traffic using indium-111 oxinelabelingclinical observation)”Clin Exp Immunol。Mar；43(3)443-449(1981b)中公布了利用人外周血淋巴細(xì)胞的銦-111 8-羥基喹啉標(biāo)記進(jìn)行的臨床研究。其中論述了在γ攝影成像中骨髓和肝定位的生理學(xué)意義，并且在解釋結(jié)果時(shí)強(qiáng)調(diào)了考慮所研究淋巴細(xì)胞特征性的表面標(biāo)記的重要性。
有多種淋巴細(xì)胞已被用于進(jìn)行整個(gè)哺乳動(dòng)物身體的成像，包括外周血中不同類型的細(xì)胞。例如，Reynolds等在文獻(xiàn)“在大鼠中天然殺傷細(xì)胞的活性。IV.靜脈內(nèi)和腹膜內(nèi)轉(zhuǎn)移后大顆粒淋巴細(xì)胞(LGL)的分布Natural killer activity in the rat.IV.Distribution of largegranular lymphocytes (LGL) following intravenous andintraperitoneal transfer，”Cell Immunol.86371-380(1984)中公布了在不連續(xù)密度梯度的Percoll上制備高度富集的大鼠大顆粒淋巴細(xì)胞(LGL)和T淋巴細(xì)胞群，用111銦-8-羥基喹啉或51Cr進(jìn)行標(biāo)記并通過(guò)靜脈內(nèi)(iv)或腹膜內(nèi)(ip)注射到正常的同系受體中。將標(biāo)記好的LGL或T細(xì)胞靜脈內(nèi)注射接種入正常受體中后，于數(shù)分鐘內(nèi)在肺中回收了大比例的放射性(18-33％)。到轉(zhuǎn)移后2-4小時(shí)時(shí)，肺中殘留的LGL(13.5％)明顯多于T細(xì)胞(6.4％)。這個(gè)差異持續(xù)了48小時(shí)(5.4對(duì)0.8％)。在肺中放射性水平的降低伴隨著在脾和肝中放射性計(jì)數(shù)的相應(yīng)增加。在較早的時(shí)間點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)顯著較高比例的T細(xì)胞分布于脾臟中，而標(biāo)記的LGL在血液及肺中持續(xù)存在較長(zhǎng)的時(shí)間。在腹膜內(nèi)注射接種于正常受體中后，放射性標(biāo)記的LGL和T細(xì)胞從腹膜腔緩慢清除，到24小時(shí)時(shí)在外周器官中僅有不到20％的放射標(biāo)記。這些結(jié)果被認(rèn)為證實(shí)了LGL和T細(xì)胞的分布模式，與以前所報(bào)道的這些細(xì)胞在各種器官中所占的比例類似。
放射性標(biāo)記還被用于闡明在各種條件下通過(guò)體外保溫被制備成具有細(xì)胞毒性的自體“殺傷”血液?jiǎn)魏思?xì)胞在輸注入各種癌癥病人體內(nèi)后的分布，這是一種通常稱為過(guò)繼淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移或過(guò)繼免疫療法的步驟。例如，Stevenson，H.C.等人在文獻(xiàn)“過(guò)繼轉(zhuǎn)移入腹膜癌擴(kuò)散病人腹腔內(nèi)的γ-干擾素活化的殺傷血液?jiǎn)魏思?xì)胞的命運(yùn)(Fate ofgamma-interferon-activated killer blood monocytes adoptivelytransferred into the abdominal cavity of patients with peritonealcarcinomatosis)”Cancer Res.，476100-6103(1987)中報(bào)告了結(jié)腸直腸癌廣泛轉(zhuǎn)移至腹膜表面的5個(gè)病人被腹膜內(nèi)輸注了通過(guò)與人γ-干擾素進(jìn)行體外保溫而具有細(xì)胞毒性的自體血液?jiǎn)魏思?xì)胞。所述單核細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞部分分離(cytapheresis)和逆流離心淘析步驟的聯(lián)合使用進(jìn)行純化；每周將約350百萬(wàn)個(gè)活化的單核細(xì)胞作為過(guò)繼免疫治療通過(guò)一次腹膜內(nèi)滴注施用于患者。在第8個(gè)療程中通過(guò)用111In預(yù)先標(biāo)記細(xì)胞來(lái)觀察兩名患者中腹膜內(nèi)輸注的血液?jiǎn)魏思?xì)胞的運(yùn)輸。這些活化的細(xì)胞變得廣泛分布在腹腔中。注入2天和5天后它們?cè)诟鼓?nèi)的位置沒(méi)有變化。在111In標(biāo)記的單核細(xì)胞注入后36小時(shí)收獲腹膜樣本，通過(guò)放射自顯影分析證實(shí)經(jīng)標(biāo)記的單核細(xì)胞與漿膜表面相關(guān)。腹腔外閃爍掃描結(jié)構(gòu)表明腹膜內(nèi)注入的111In標(biāo)記單核細(xì)胞在試驗(yàn)的5天內(nèi)未轉(zhuǎn)移至其它器官中。作者推斷自體殺傷單核細(xì)胞的腹膜內(nèi)過(guò)繼轉(zhuǎn)移是將這些具有細(xì)胞毒性的細(xì)胞運(yùn)送至癌癥患者腹膜表面腫瘤位點(diǎn)處的有效方法。
Swift，R.I.等人在有關(guān)殺傷淋巴細(xì)胞成像的另一篇報(bào)道“通過(guò)腫瘤活化的殺傷單核細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌的成像(Imaging ofmetastatic colorectal cancer with tumour-activated killerlymphocytes)”Lancet3371511-1512(1991)中公布了從6名轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌患者中提取淋巴細(xì)胞并與獲自原發(fā)癌患者的細(xì)胞一起培養(yǎng)，產(chǎn)生腫瘤活化的殺傷(TAK)淋巴細(xì)胞。為了使轉(zhuǎn)移情況可見(jiàn)，這些工作人員將111In標(biāo)記的TAK細(xì)胞再注射入每名患者體內(nèi)。在注射后用γ攝像機(jī)攝取圖像達(dá)48小時(shí)。在肺中早到4小時(shí)就出現(xiàn)了轉(zhuǎn)移，在腹部晚到48小時(shí)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。肝臟圖像產(chǎn)生了相應(yīng)于轉(zhuǎn)移性損傷的“冷”斑點(diǎn)。淋巴結(jié)不可見(jiàn)。針對(duì)自體結(jié)腸直腸腫瘤產(chǎn)生的TAK細(xì)胞的再注入顯示了轉(zhuǎn)移的位置。作者還注意到TAK細(xì)胞在體內(nèi)施用后不需要IL-2。
同樣的，已通過(guò)放射性標(biāo)記細(xì)胞的成像確定了被腫瘤細(xì)胞離體刺激的各種類型的放射性標(biāo)記自體外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞的分布。因此，SpencerR.P.和B.Mukherji等在文獻(xiàn)“腫瘤激活(“培訓(xùn)”)并放射性標(biāo)記的淋巴細(xì)胞在腫瘤定位中的應(yīng)用(Utilization of tumour-sensitized(‘educated’)and radiolabelled lymphocytes for tumourlocalization)”Nucl Med Commun.9783-786(1988)中公布了在受輻射自體腫瘤細(xì)胞存在的條件下進(jìn)行外周血液淋巴細(xì)胞(PBL)的共培養(yǎng)時(shí)，按照體外細(xì)胞毒性特征所顯示的，PBL能對(duì)腫瘤致敏(或者可能更確切地稱為“重致敏”)。所述細(xì)胞能在干擾素-2存在的情況下增殖、用111In進(jìn)行放射性標(biāo)記并再注射入該細(xì)胞供體內(nèi)。用此技術(shù)，7名患者中有5名的腫瘤塊被定位。作為對(duì)此研究的進(jìn)一步拓展，Mukherji，B.等人在文獻(xiàn)“事先體外致敏并用干擾素-2擴(kuò)展的自體淋巴細(xì)胞在人癌癥中的成像模式(Imaging pattern of previously in vitrosensitized and interleukin-2 expanded autologous lymphocytes inhuman cancer)”Int J Rad Appl Instrum B，15419-427(1988)中公布了針對(duì)7名轉(zhuǎn)移性癌癥患者中被研究的自體腫瘤(體外)而致敏的淋巴細(xì)胞的體內(nèi)模式，它們是放射免疫檢測(cè)和過(guò)繼免疫治療備選方法的可能候選試驗(yàn)對(duì)象。外周血液淋巴細(xì)胞(PBL)或者在白介素-2(IL-2)中被激活[淋巴因子激活的殺傷(LAK)細(xì)胞]或者通過(guò)體外共培養(yǎng)(IVC)并在IL-2中擴(kuò)展(已培訓(xùn)好的細(xì)胞)而對(duì)自體腫瘤細(xì)胞敏感；然后二者均用111In標(biāo)記。將標(biāo)記后的自體細(xì)胞(1×107-5×108)施用于患者并通過(guò)γ攝像機(jī)成像在各種時(shí)間間隔點(diǎn)研究其生物分布。在7個(gè)案例的4個(gè)中，用“培訓(xùn)過(guò)的”細(xì)胞成象后在與臨床可檢測(cè)的轉(zhuǎn)移性腫瘤正相關(guān)的位點(diǎn)表現(xiàn)出放射性的集中。與之形成對(duì)照的是，用LAK細(xì)胞成像只觀察到一個(gè)陽(yáng)性攝入的案例。培訓(xùn)過(guò)的淋巴細(xì)胞對(duì)于自體腫瘤細(xì)胞而言是有細(xì)胞毒性的，且在IL-2中連續(xù)培養(yǎng)4-6周仍保持該培訓(xùn)過(guò)的細(xì)胞的細(xì)胞毒反應(yīng)性。放射性標(biāo)記的培訓(xùn)過(guò)的自體細(xì)胞以顯著高于LAK細(xì)胞的頻率進(jìn)行積累的證據(jù)據(jù)說(shuō)暗示了體外擴(kuò)充的培訓(xùn)后PBL可能對(duì)于人癌癥的放射免疫檢測(cè)而言是更好的候選細(xì)胞，且這樣的培訓(xùn)過(guò)的自體PBL的連續(xù)培養(yǎng)物可能是這些效應(yīng)細(xì)胞重復(fù)施用的來(lái)源。
已用于過(guò)繼免疫療法并通過(guò)放射性標(biāo)記而在人體內(nèi)成像的另一類型淋巴樣細(xì)胞是腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞(TIL)，例如，象S.A.Rosenberg及其同事所開(kāi)發(fā)的。因此，F(xiàn)isher，B.等人在文獻(xiàn)“過(guò)繼性轉(zhuǎn)移的銦-111標(biāo)記的腫瘤浸潤(rùn)型淋巴細(xì)胞在轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者中的腫瘤定位(Tumor localization of adoptively transferred indium-111labeled tumor infiltrating lymphocytes in patients withmetastatic melanoma)”J Clin Oncol.7250-261(1989)中透露，浸潤(rùn)到人腫瘤中的淋巴樣細(xì)胞可在含白介素-2(IL-2)的培養(yǎng)基中體外擴(kuò)充。作者已對(duì)被注入的銦-111(111In)8-羥基喹啉標(biāo)記的TIL是否能運(yùn)輸并定位于轉(zhuǎn)移性腫瘤塊進(jìn)行了研究?；加衅は?、結(jié)節(jié)和/或內(nèi)臟多重位點(diǎn)疾病的6名轉(zhuǎn)移型惡性黑素瘤患者是該試驗(yàn)的對(duì)象?；颊呓邮墉h(huán)磷酰胺36小時(shí)后，接受TIL靜脈內(nèi)(IV)輸注隨后每8小時(shí)接受一次IL-2IV處理。用連續(xù)的整體γ攝像機(jī)成像、系列血液和尿液采樣以及系列的腫瘤和正常組織的活組織切片檢查確定TIL的分布和定位。111In標(biāo)記的TIL在活性輸注入2小時(shí)后定位于肺、肝和脾中。肺中的活性在24小時(shí)內(nèi)減少。早在111In標(biāo)記的TIL注射后24小時(shí)時(shí)，用成像試驗(yàn)或生物活組織樣本切片檢查或者二者結(jié)合在全部6名患者中證實(shí)了TIL定位于轉(zhuǎn)移塊的位置。腫瘤組織活組織切片檢查中111In的活性比正常組織中的活性高3-40倍。在腫瘤堆積的位置處觀察到放射性計(jì)數(shù)的漸進(jìn)性增加。此試驗(yàn)顯示了標(biāo)記好的TIL可優(yōu)先定位于腫瘤，并提供了有關(guān)TIL治療效應(yīng)的可能機(jī)制的信息。
許多有關(guān)過(guò)繼免疫療法的其它研究，包括將TIL成像和其它來(lái)源的淋巴樣細(xì)胞成像進(jìn)行比較都已有報(bào)道。例如，Griffith K.D.等人在文獻(xiàn)“過(guò)繼性轉(zhuǎn)移的銦-111標(biāo)記腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞和外周血液淋巴細(xì)胞在轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者中的體內(nèi)分布(In vivo distribution ofadoptively transferred indium-111-labeled tumor infiltratinglymphocytes and peripheral blood lymphocytes in patients withmetastatic melanoma)”J Natl Cancer Inst.811709-1717(1989)中透露，對(duì)用環(huán)磷酰胺(CPM)、腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞(TIL)和白介素-2(IL-2)治療的轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者，利用γ攝像機(jī)成像和活組織切片檢查研究了它們111的In標(biāo)記的TIL或外周血液淋巴細(xì)胞(PBL)定位于腫瘤位點(diǎn)的能力。對(duì)18名患者輸注19劑放射性標(biāo)記的TIL，而在TIL治療期間有5名患者接受放射性標(biāo)記的自體PBL。在對(duì)111In-TIL受體進(jìn)行的18個(gè)核掃描系列中有13個(gè)觀察到了清楚的腫瘤定位，而在用111In-PBL處理的患者的四個(gè)掃描序列中只有一個(gè)有腫瘤成像。對(duì)一名患者進(jìn)行了CPM、TIL和IL-2三個(gè)連續(xù)處理過(guò)程的核掃描研究。他最初通過(guò)111In-TIL在多個(gè)位點(diǎn)顯示出清楚的腫瘤定位，然后用111In-PBL在單一位點(diǎn)顯示出微弱的定位，隨后重復(fù)輸注111In-TIL顯示了在多個(gè)位點(diǎn)有陽(yáng)性腫瘤成像。這些結(jié)果證實(shí)并擴(kuò)充了我們的最初數(shù)據(jù)，證明用CPM預(yù)處理及隨后通過(guò)IL-2轉(zhuǎn)移的人TIL優(yōu)先定位于腫瘤位點(diǎn)，并顯示出TIL的定位作用大于PBL。
用TIL進(jìn)行的其它成像研究包括Chin.Y.等人的研究文獻(xiàn)“癌癥患者中放射性標(biāo)記的腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞的體內(nèi)分布(In vivodistribution of radio-labeled tumor infiltrating lymphocytes incancer patients)”In Vivo727-30(1993)，其中透露，為了評(píng)估腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞在治療中的效用，對(duì)這些淋巴細(xì)胞的體內(nèi)遷移和分布進(jìn)行了嘗試性研究。分離自5名惡性轉(zhuǎn)移型乳癌或黑素瘤的患者并用低劑量重組白介素-2進(jìn)行體外培養(yǎng)和擴(kuò)展的腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞用111銦-8-羥基喹啉進(jìn)行了標(biāo)記并輸注入患者體內(nèi)。用大視野γ攝像機(jī)評(píng)估所注入的TIL的分布和定位。注射后2小時(shí)內(nèi)在肺中觀察到了111銦標(biāo)記的TIL的定位，24小時(shí)時(shí)在肺、肝和脾中觀察到高水平的放射性。72小時(shí)后在肺中的活性減弱。在轉(zhuǎn)移位點(diǎn)未觀察到111In標(biāo)記的TIL的特異性定位。
TIL成像的另一項(xiàng)研究公開(kāi)在Pockaj，B.A.等人的文章“在接受過(guò)繼性免疫治療的患者中111銦標(biāo)記的腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞定位于腫瘤。用環(huán)磷酰胺進(jìn)行的擴(kuò)增以及與反應(yīng)的相關(guān)性(Localization of111Indium-labeled tumor infiltrating lymphocytes to tumor inpatients receiving adoptive immunotherapy.Augmentation withcyclophosphamide and correlation with response)”Cancer731731-1737(1994)，其中揭示了白介素-2(IL-2)培養(yǎng)的腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞(TIL)的過(guò)繼性轉(zhuǎn)移可造成轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者體內(nèi)的腫瘤消退。通過(guò)γ攝像機(jī)成像和活組織切片檢查研究了38位接受大劑量IL-2和TIL的轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者中自體111In標(biāo)記的TIL定位于轉(zhuǎn)移腫瘤塊的能力。通過(guò)γ攝像機(jī)成像在26個(gè)(68.4％)治療案例中觀察到111In標(biāo)記的TIL的腫瘤定位。在對(duì)影響TIL運(yùn)輸?shù)囊蜃舆M(jìn)行的單變量分析中，環(huán)磷酰胺的施用與通過(guò)放射性核素成像定位于腫瘤的能力顯著相關(guān)(P2＝0.026)。作者推斷腫瘤內(nèi)的定位在TIL抗腫瘤活性機(jī)制中是重要的，因?yàn)樵谄渲械哪[瘤未被111In-TIL所成像的患者中未觀察到臨床反應(yīng)，在TIL和IL-2治療前進(jìn)行的環(huán)磷酰胺的施用和大量TIL的施用顯現(xiàn)出提高了TIL定位于腫瘤的頻率。
TIL成像還公開(kāi)在Dillman，R.O.的文章中“轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌、黑素瘤和結(jié)腸直腸癌患者中用銦-111標(biāo)記的腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞的腫瘤定位(Tumor localization by tumor infiltrating lymphocytes labeledwith indium-111 in patients with metastatic renal cell carcinoma，melanoma，and colorectal cancer，)”Cancer Biother Radiopharm.1265-71(1997)。此文章透露了在用自體腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞(TIL)進(jìn)行的過(guò)繼性免疫療法中的一個(gè)問(wèn)題是所述細(xì)胞在靜脈內(nèi)輸注后是否確實(shí)遷移到了腫瘤位置處。作者提及了數(shù)篇報(bào)道是關(guān)于轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者內(nèi)放射性標(biāo)記的TIL的腫瘤攝取的，但據(jù)報(bào)道，在其它腫瘤類型中用放射性標(biāo)記的TIL使腫瘤顯現(xiàn)的努力未獲得成功。在此，8名轉(zhuǎn)移性癌癥患者(5名腎癌、2名黑素瘤、1名結(jié)腸癌)接受了20-1000億的自體TIL靜脈內(nèi)輸注，包括已與500μCi銦-111綴合的5千萬(wàn)TIL，與白介素-2(IL-2)共同施用。一名患者在接受TIL前一天接受了1gm/m2的環(huán)磷酰胺；7名患者在接受TIL前接受α2b干擾素共4天。在24小時(shí)和48小時(shí)時(shí)進(jìn)行整體γ攝像機(jī)成像，包括單光子發(fā)射電腦化X線斷層攝影術(shù)(SPECT)。8名患者全都在腫瘤的一個(gè)或多個(gè)已知位點(diǎn)明顯吸收了111銦標(biāo)記的TIL。沒(méi)有已知的腫瘤位點(diǎn)未成像的。被成像的轉(zhuǎn)移位點(diǎn)包括骨、腦、縱隔和門(mén)周邊淋巴結(jié)、肺和肝實(shí)質(zhì)、腹部主動(dòng)脈周邊的結(jié)節(jié)和骨盆腔質(zhì)。用一名患者作為陰性對(duì)照，因?yàn)楫?dāng)她未顯示出明顯病征時(shí)，其TIL掃描是陰性的，但數(shù)周后呈現(xiàn)陽(yáng)性TIL掃描結(jié)果，從而被診斷為腋窩復(fù)發(fā)。作者推斷轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌和其它癌癥對(duì)放射性標(biāo)記的TIL(無(wú)論是CD8+或CD4+)的攝取與先前所報(bào)道的黑素瘤中的攝取是相似的。用環(huán)磷酰胺預(yù)處理不是成像的先決條件，且TIL的攝取并不預(yù)示著腫瘤反應(yīng)。
來(lái)自患有涉及淋巴樣組織之疾病的患者的外周血液的淋巴細(xì)胞也被放射性標(biāo)記上以用于體內(nèi)成像，其無(wú)需體外刺激，用作對(duì)該疾病進(jìn)行分級(jí)的一個(gè)輔助手段。由此，Grimfors，G.等人在文獻(xiàn)“用銦-111-8-羥基喹啉標(biāo)記的自體淋巴細(xì)胞的腫瘤成像作為對(duì)何杰金病進(jìn)行分級(jí)的方法(Tumor imaging of indium-111 oxine-labeled autologouslymphocytes as a staging method in Hodgkin’s disease，)”Eur JHaematol.42276-283(1989)中披露了在注入銦-111-8-羥基喹啉標(biāo)記的自體淋巴細(xì)胞后，在35名何杰金病(HD)患者中進(jìn)行了39次淋巴細(xì)胞閃爍掃描。在白細(xì)胞去除術(shù)(leukapheresis)和進(jìn)行Lymphoprep梯度離心后獲取淋巴細(xì)胞，并通過(guò)粘附步驟去除單核細(xì)胞而進(jìn)行進(jìn)一步的純化。用6.7(范圍1.9-16.6)Mbq銦-111-8-羥基喹啉標(biāo)記大約1.2(0.2-3.7)×109個(gè)細(xì)胞并再注入患者體內(nèi)。用GE400AT進(jìn)行γ攝像機(jī)成像。在淋巴結(jié)腫大的61個(gè)位置中有54個(gè)位置處觀察到了放射性的積累。在先前無(wú)臨床腫瘤跡象的16個(gè)位點(diǎn)也觀察到了放射性的增強(qiáng)。這些作者認(rèn)為上述數(shù)據(jù)看起來(lái)很有意義，并且，在完成進(jìn)一步的方法學(xué)上的改進(jìn)后，淋巴閃爍掃描術(shù)可被證實(shí)是HD患者分級(jí)及后續(xù)治療中重要的補(bǔ)充。
未經(jīng)體外激活的放射性標(biāo)記的外周血液淋巴細(xì)胞的成像也已被用于其它的淋巴惡性腫瘤中。例如，Muller，C.在文獻(xiàn)“惡性淋巴腫瘤患者中銦-111 8-羥基喹啉標(biāo)記的人外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞的體內(nèi)追蹤(Invivo tracing of indium-111 oxine-labeled human peripheral bloodmononuclear cells in patients with lymphatic malignancies，)”J Nucl Med.301005-1011(1989)中透露了對(duì)20名患有各種惡性淋巴腫瘤及淋巴結(jié)腫大可觸知的患者研究了體內(nèi)[111In]8-羥基喹啉標(biāo)記的外周單核細(xì)胞(PMNC)的遷移。發(fā)現(xiàn)最大標(biāo)記劑量10μCi(0.37MBq)[111In]8-羥基喹啉/108PMNC也不會(huì)對(duì)細(xì)胞生存力或淋巴細(xì)胞體外增殖產(chǎn)生負(fù)面的影響。為了進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)，通過(guò)淋巴細(xì)胞去除術(shù)收獲1.5×109個(gè)PMNC并在經(jīng)過(guò)150μCi(5.55MBq)放射性標(biāo)記后重新靜脈內(nèi)注射入體內(nèi)。三名何杰金病患者和5名重度惡性淋巴瘤患者全部完成了可觸知的腫大淋巴節(jié)的標(biāo)記，而在7名輕度惡性淋巴瘤患者中只有三名患者具有陽(yáng)性淋巴結(jié)成像，慢性淋巴細(xì)胞性白血病患者中沒(méi)有陽(yáng)性成像。作者因此推斷PMNC在經(jīng)[111In]8-羥基喹啉標(biāo)記后保持了其遷移的能力且這些細(xì)胞運(yùn)輸至一些血液惡性腫瘤(而非全部)所涉及的淋巴結(jié)。
還研究了通過(guò)不同途徑注入后人PBL在動(dòng)物和人中的分布。例如，Nelson，H.等人在文獻(xiàn)“在人結(jié)腸癌異種移植物中抗腫瘤x抗CD3異種聚集抗體和人工培養(yǎng)的人外周血液淋巴細(xì)胞的區(qū)域性和全身分布(Regional and systemic distribution of anti-tumor x anti-CD3heteroaggregate antibodies and cultured human peripheral bloodlymphocytes in a human colon cancer xenograft，)”J Immunol.1453507-3515(1990)中公布了與抗CD3抗體(OKT3)共價(jià)偶聯(lián)的抗腫瘤抗體(317G5)產(chǎn)生了雜聚集(HA)抗體，該抗體能使PBL定向溶解表達(dá)適當(dāng)腫瘤抗原的腫瘤細(xì)胞。用含有由人結(jié)腸腫瘤系LS174T建立的腹膜內(nèi)實(shí)體瘤的無(wú)胸腺裸鼠研究了放射性標(biāo)記的HA抗體317G5xOKT3和放射性標(biāo)記的人工培養(yǎng)人PBL的靜脈內(nèi)和腹膜內(nèi)分布。用125I標(biāo)記的HA抗體、125I標(biāo)記的抗腫瘤mAb或111In標(biāo)記的PBL注射小鼠，在指定的時(shí)間點(diǎn)收獲組織并檢測(cè)其放射性。125I-317G5xOKT3特異性地定位于腫瘤位點(diǎn)。在125I-317G5xOKT3的靜脈內(nèi)和腹膜內(nèi)施用之間觀察到的放射性水平的主要差異是在靜脈內(nèi)施用HA抗體后肝的放射性增加。放射自顯影證實(shí)了抗腫瘤x抗CD3HA抗體特異性地定位于腹膜內(nèi)腫瘤；腹膜內(nèi)給予的HA抗體直接滲入腫瘤；靜脈內(nèi)施用的HA抗體沿著腫瘤血管結(jié)構(gòu)分布。人工培養(yǎng)的人PBL在腹膜內(nèi)施用時(shí)以適當(dāng)濃度分布于腹膜內(nèi)腫瘤處，但靜脈內(nèi)施用時(shí)則不會(huì)如此。作者推測(cè)靜脈內(nèi)注射的PBL很少定位于腫瘤處這一現(xiàn)象可能反映了歸巢受體和/或內(nèi)皮配基的物種差異，這是用同系模型可能克服的問(wèn)題。他們推斷這些結(jié)果表明對(duì)于最初的臨床試驗(yàn)而言，用HA抗體和PBL進(jìn)行局部治療可能優(yōu)于全身性治療。
還對(duì)來(lái)自除了腫瘤實(shí)體(即TIL)或外周血液之外的組織的淋巴細(xì)胞進(jìn)行了有關(guān)過(guò)繼性免疫療法的研究，包括通過(guò)對(duì)放射性標(biāo)記的淋巴細(xì)胞或其抗體進(jìn)行成像研究其分布。例如，1998年9月29日頒予Martin，Jr.等人的美國(guó)專利5,814,295中披露了在腫瘤反應(yīng)性細(xì)胞中富集的淋巴結(jié)的確定、它們的增殖和它們?cè)谶^(guò)繼性細(xì)胞療法中的用途。特別是，本發(fā)明涉及可靠地確定富集了腫瘤反應(yīng)性細(xì)胞的淋巴結(jié)的方法，如CD4+腫瘤特異性淋巴細(xì)胞。該方法包括對(duì)患者施用特異性結(jié)合腫瘤組織所產(chǎn)生或與其相關(guān)的標(biāo)記物的有效量放射性標(biāo)記定位劑。在施用后維持一段時(shí)間，以使放射性標(biāo)記定位劑優(yōu)先集中于任何腫瘤組織中，并清除未結(jié)合的放射性標(biāo)記定位劑，從而提高患者中腫瘤組織光子發(fā)射占背景光子發(fā)射的比率。在這段時(shí)間過(guò)去后，使患者接觸放射性檢測(cè)探針，通過(guò)用探針檢測(cè)淋巴結(jié)位點(diǎn)處輻射水升高來(lái)確定展示出放射性標(biāo)記定位劑增多的淋巴結(jié)位點(diǎn)。切下展示出所述輻射水平提高的淋巴結(jié)部位并進(jìn)行純粹的光學(xué)分析，盡管所述部位或者可以用于進(jìn)行組織學(xué)分析。選擇并培養(yǎng)同樣由總的觀察確定無(wú)腫瘤或無(wú)轉(zhuǎn)移性病征的那些已測(cè)定并切下的淋巴結(jié)以增殖腫瘤活性細(xì)胞。對(duì)選定的淋巴結(jié)進(jìn)行促有絲分裂刺激。在白介素-2、抗CD3單克隆抗體和腫瘤組織存在的條件下培養(yǎng)所述淋巴結(jié)，所述腫瘤可以是自體或同種異體腫瘤。此專利還宣稱兩名接受所述刺激過(guò)的淋巴結(jié)細(xì)胞的患者(編號(hào)3和4)在外源IL-2存在或不存在的條件下都呈現(xiàn)出腫瘤消退的跡象，他們已收集了大量的免疫學(xué)數(shù)據(jù)，包括用111In標(biāo)記的細(xì)胞(患者5)進(jìn)行的細(xì)胞運(yùn)輸試驗(yàn)，但對(duì)于做出任何確定的結(jié)論而言還為時(shí)尚早。
近來(lái)過(guò)繼性的免疫療法已應(yīng)用各種來(lái)源的經(jīng)抗原呈遞細(xì)胞體外刺激的T細(xì)胞，尤其是已用各種來(lái)源的抗原刺激過(guò)的樹(shù)突細(xì)胞。例如，Peng，L.等人在文獻(xiàn)“無(wú)需輔助且具有廣泛抗腫瘤效力的L-選擇蛋白低CD8+T細(xì)胞在腫瘤發(fā)展過(guò)程中被自然激活(Helper-independent，L-selectinlowCD8+T cells with broad anti-tumor efficacy arenaturally sensitized during tumor progression，)”J Immunol.1655738-5749(2000)中披露，作者最近報(bào)道了在腫瘤引流淋巴結(jié)(TDLN)中L-選擇蛋白低表達(dá)的CD4(+)T細(xì)胞亞類(CD62Llow)即使在未與IL2共施用的情況下也可人工培養(yǎng)激活并過(guò)繼性的轉(zhuǎn)移從而根除同系小鼠中已確認(rèn)的肺部和顱內(nèi)腫瘤。此報(bào)道將這些研究延伸至對(duì)自然存在于帶弱免疫原性腫瘤的小鼠TDLN中的L-選擇蛋白lowCD8(+)T細(xì)胞小亞類進(jìn)行定性。分離的L-選擇蛋白lowCD8(+)T細(xì)胞呈現(xiàn)無(wú)需輔助的T細(xì)胞的功能表型，且象L-選擇蛋白lowCD4(+)T細(xì)胞一樣，在過(guò)繼性轉(zhuǎn)移時(shí)無(wú)需與外源IL-2共施用即可穩(wěn)定根除已確定的肺部和顱內(nèi)腫瘤。人工培養(yǎng)活化的L-選擇蛋白lowCD8(+)T細(xì)胞在體外不溶解相關(guān)的腫瘤靶，但當(dāng)用相關(guān)腫瘤制品特異刺激時(shí)分泌IFN-γ和GM-CSF。作者推斷這些資料表明，即使未經(jīng)特殊疫苗處理，進(jìn)行性的腫瘤生長(zhǎng)也會(huì)導(dǎo)致CD4(+)和CD8(+)抗腫瘤T細(xì)胞二者在TDLN中被獨(dú)立致敏，在收獲時(shí)呈現(xiàn)L-選擇蛋白low的表型，每一種都只需培養(yǎng)物活化來(lái)顯現(xiàn)非常強(qiáng)的獨(dú)立效應(yīng)器功能。
還報(bào)道了用接觸過(guò)自體樹(shù)突細(xì)胞的T細(xì)胞治療患者的過(guò)繼性免疫療法，其中的樹(shù)突細(xì)胞已用各種來(lái)源的腫瘤抗原脈沖處理過(guò)。由此，Santin，A.D.等人在文獻(xiàn)“接觸過(guò)腫瘤溶解物敏化的自體樹(shù)突細(xì)胞的過(guò)繼性轉(zhuǎn)移的T細(xì)胞在子宮內(nèi)膜癌患者中的顯影和治療作用(Developmentand therapeutic effect of adoptively transferred T cells primedby tumor lysate-pulsed artologous dendritic cells in a patientwith metastatic endometrial cancer，)”Gynecol Obstet Invest.49194-203(2000)中描述了一名65歲的婦女，患有在外科上不能切除且抗化療劑的子宮內(nèi)膜癌大型肝轉(zhuǎn)移，通過(guò)輸注用經(jīng)腫瘤溶解物脈沖處理的自體樹(shù)突細(xì)胞(DC)刺激的外周血T細(xì)胞進(jìn)行治療。DC激活的T細(xì)胞的大量體外表征包括表型分析、細(xì)胞毒性和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子分泌。觀察到了針對(duì)自體腫瘤細(xì)胞的高細(xì)胞毒性，但沒(méi)有針對(duì)NK敏感的K562細(xì)胞、自體Con-A淋巴母細(xì)胞或自體EB病毒轉(zhuǎn)化的類淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性。阻斷試驗(yàn)證實(shí)了細(xì)胞溶解活性是HLAI型限制性的。雙色流式細(xì)胞儀分析顯示，有相當(dāng)一部分CD8+T細(xì)胞也是CD56+，細(xì)胞內(nèi)IFN-γ和IL-4表達(dá)分析顯示出對(duì)1型細(xì)胞因子的偏愛(ài)。以3-4周為間隔給患者輸注3次腫瘤特異性T細(xì)胞，通過(guò)111In-8-羥基喹啉標(biāo)記和連續(xù)的γ攝像機(jī)成像追蹤T細(xì)胞的體內(nèi)分布。每次注射后在連續(xù)的時(shí)間點(diǎn)一直檢測(cè)標(biāo)記過(guò)的淋巴細(xì)胞的腫瘤定位和積累。不過(guò)，由單光子發(fā)射電腦化X線斷層攝影術(shù)(SPECT)成像在三維空間上進(jìn)行評(píng)估所顯示的，活化T細(xì)胞向大腫瘤實(shí)體的深度浸潤(rùn)是極微弱的。臨床上，在治療期間獲得了巨大肝轉(zhuǎn)移得以穩(wěn)定的效果。總而言之，這些結(jié)果被認(rèn)為表明了子宮內(nèi)膜癌患者內(nèi)可產(chǎn)生腫瘤特異的CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答，表明T細(xì)胞免疫療法對(duì)于轉(zhuǎn)移性疾病患者可能具有治療價(jià)值。正如在圖5中可見(jiàn)的，與99mTc-硫膠體閃爍掃描法相比，[111In]-8-羥基喹啉標(biāo)記的CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的放射性在腫瘤周圍的定位強(qiáng)于剩余的正常肝實(shí)質(zhì)的定位。
人粘蛋白1(MUC1，也稱MUC-1)是在包括乳癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、結(jié)腸癌和卵巢癌在內(nèi)的所有腺癌中90％過(guò)表達(dá)的表皮粘蛋白糖蛋白。MUC1是免疫干預(yù)的目標(biāo)，因?yàn)樵趯?shí)體腺癌患者中已觀察到了針對(duì)MUC1的低水平細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，這種應(yīng)答強(qiáng)度不足以根除正在生長(zhǎng)的腫瘤。例如，Hiltbold，E.M.等人在文獻(xiàn)“用來(lái)自腫瘤抗原MUC1的天然加工的II型表位觸發(fā)人CD4+T細(xì)胞Naturally processedclass II epitope from the tumor antigen MUC1 primes human CD4+T cells，”Cancer Res.585066-5070(1998)中報(bào)道了上皮細(xì)胞粘蛋白MUC1以低糖基化形式表達(dá)于腺癌上，充當(dāng)乳癌、胰腺癌、卵巢癌和其它腫瘤的腫瘤抗原，且在患者在發(fā)現(xiàn)了兩種主要的MUC1特異的免疫應(yīng)答CD8+CTLs，它識(shí)別MUC1蛋白質(zhì)核心上的串聯(lián)重復(fù)表位，以及IgM抗體。該文章宣稱以前未有癌癥患者中MUC1特異性CD4+T輔助細(xì)胞的有關(guān)報(bào)道，并證明了MUC1特異性CD4+T細(xì)胞既未被消除也未被耐受，且在使用適當(dāng)?shù)目扇苄问組UC1時(shí)可產(chǎn)生CD4+T細(xì)胞應(yīng)答。用樹(shù)突細(xì)胞呈遞的、代表5個(gè)未糖基化的串聯(lián)重復(fù)片段的100個(gè)氨基酸長(zhǎng)的合成MUC1肽體外觸發(fā)來(lái)自健康供體的原初CD4+T細(xì)胞。它們產(chǎn)生了IFN-γ且具有中等的細(xì)胞溶解活性。作者還鑒定了一段核心肽序列PGSTAPPAHGVT，當(dāng)其通過(guò)HLA-DR3呈遞時(shí)會(huì)引起此反應(yīng)。
MUC1在會(huì)出現(xiàn)MUC1抗原上腫瘤特異肽表位的MHC非限制性TCR識(shí)別的情況中是不常見(jiàn)的。因此，Magarian-Blander，J.等人在文獻(xiàn)“上皮抗原MUC1上腫瘤特異性肽表位的MHC非限制性TCR識(shí)別后的細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)(Intercellular and intracellular events following theMHC-unrestricted TCR recognition of a tumor-specific peptideepitope on the epithelial antigen MUC1，)”J Immunol.1603111-3120(1998)中論述了MUC1上腫瘤特異肽表位的直接TCR識(shí)別中所涉及的功能和分子參數(shù)。此肽表位是串聯(lián)重復(fù)的，并在天然分子中被識(shí)別，而非被加工并結(jié)合MHC。按照Magarian-Blander，J.等人的文章中所述，T淋巴細(xì)胞通常識(shí)別APC表面上自身MHC分子溝中呈遞出的抗原性肽。此MHC限制性識(shí)別是通過(guò)TCR/CD3復(fù)合物介導(dǎo)的。通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活動(dòng)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，抗原肽被TCR/CD3復(fù)合物的識(shí)別導(dǎo)致T細(xì)胞的活化。T細(xì)胞的活化最終導(dǎo)致引起細(xì)胞因子釋放的各種基因的增殖和轉(zhuǎn)錄激活、新表面分子表達(dá)和效應(yīng)器功能成熟。
Magarian-Blander，J.等人還提及，他們先前已報(bào)道過(guò)識(shí)別MUC1(一種表達(dá)于管道上皮細(xì)胞以及同一來(lái)源的癌瘤性細(xì)胞的表面的I型跨膜糖蛋白)上肽表位的MHC非限制性βT細(xì)胞。它的胞外結(jié)構(gòu)域部分由含T細(xì)胞表位的串聯(lián)重復(fù)的20個(gè)氨基酸長(zhǎng)的序列組成。MUC1串聯(lián)重復(fù)片段表位的MHC非限制性識(shí)別被抗TCR和CD3復(fù)合物的抗體阻斷，表明此識(shí)別是TCR所介導(dǎo)的。這些工作人員還提出，MUC1串聯(lián)重復(fù)片段將未加工表位的密集排列象剛性結(jié)構(gòu)一樣直接呈遞給TCR，從而無(wú)需通過(guò)MHC分子進(jìn)行呈遞。利用合成肽類似物對(duì)MUC1串聯(lián)重復(fù)片段蛋白質(zhì)核心進(jìn)行的結(jié)構(gòu)研究已證實(shí)，T細(xì)胞表位采取了一種穩(wěn)定有序的結(jié)構(gòu)，形成一個(gè)突出穿過(guò)多肽核心伸展的β轉(zhuǎn)角螺旋結(jié)構(gòu)的環(huán)。
最近，還有針對(duì)某些MUC1表位的報(bào)道，是通過(guò)只與表位呈遞肽保溫，而無(wú)需用分開(kāi)制備的抗原呈遞細(xì)胞進(jìn)行肽呈遞，由此在體外活化MUC1抗原特異性抗腫瘤淋巴細(xì)胞。因此，Wright S.E.等人在文獻(xiàn)“用天然MUC1粘蛋白和一個(gè)糖基化位點(diǎn)突變的粘蛋白肽刺激來(lái)自腺癌患者的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T lymphocytes from humans withadenocarcinomas stimulated by native MUC1 mucin and a mucinpeptide mutated at a glycosylation site，)”J Immunother.232-10(2000)中披露了MUC1粘蛋白肽刺激來(lái)自腺癌患者的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)。分別用來(lái)自乳腺癌或卵巢癌患者的單核細(xì)胞，通過(guò)以下成分刺激外周血單核細(xì)胞(PBMC)、腫瘤引流淋巴結(jié)(TDLN)細(xì)胞或腫瘤浸潤(rùn)型淋巴細(xì)胞(TIL)(a)20個(gè)氨基酸長(zhǎng)的天然MUC1粘蛋白串聯(lián)重復(fù)肽(MUC1-mtr1)加上重組的人白介素-2(IL-2)；(b)突變的(T3N)MUC1-mtr1加上IL-2；或者(c)固定化的抗CD3加上IL-2，或(d)只用IL-2。這四種條件中每一種刺激的CTL都主要是CD4+。不過(guò)，與用抗CD3+IL-2或單獨(dú)用IL-2刺激的CTL相比，用天然MUC1-mtr1或(T3N)MUC1-mtr1刺激的CTL顯示出對(duì)表達(dá)MUC1的乳癌細(xì)胞系的細(xì)胞毒性高5-10倍。每一種保溫條件都產(chǎn)生具有不同的可變?chǔ)禄蚣易錞細(xì)胞受體的CTL，意味著對(duì)于每種條件而言有限的CTL組成成分得到寡克隆式擴(kuò)充。因此，肽刺激的T細(xì)胞顯示出細(xì)胞毒性細(xì)胞的表達(dá)，這不是通過(guò)非特異(抗CD3或IL-2)刺激誘發(fā)的。此外，這些作者報(bào)道了經(jīng)粘蛋白-肽刺激的細(xì)胞系的細(xì)胞毒性是非HLA限制型的，大概對(duì)于來(lái)自乳癌供體的PBLC而言是I型和II型HLA水平，而對(duì)于來(lái)自卵巢癌供體的TIL而言至少是I型HLA。本發(fā)明的發(fā)明者拓展了此項(xiàng)工作(Wright，S.E....，Phillips，C.A.等人“用粘蛋白1刺激人外周血單核細(xì)胞的治療腺癌的過(guò)繼性免疫療法(Adoptive immunotherapy of mucin 1expressing adenocarcinomas with mucin1 stimulated humanperipheral blood mononuclear cells，)”Int J Mol Med.9401-404(2002))，證明了經(jīng)粘蛋白1刺激的來(lái)自乳癌患者的造血單核細(xì)胞(M1SHMC)在過(guò)繼性的轉(zhuǎn)移至患非肥胖型糖尿病樣且嚴(yán)重綜合性免疫缺陷(NOD SCID)小鼠后，提高總體腺癌治療模型的生存并預(yù)防了最低限度疾病模型中的腫瘤生長(zhǎng)。M1SHMC呈現(xiàn)出特異溶解表達(dá)粘蛋白1的人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7并產(chǎn)生γ干擾素。在皮下(SC)注射MCF-7后出現(xiàn)肥大的可觸知腫瘤后，將M1SHMC從腹膜內(nèi)(IP)注射入NOD SCID小鼠。與無(wú)M1SHMC的對(duì)照相比，生存率得以提高。不過(guò)腫瘤最終在所有小鼠中都繼續(xù)生長(zhǎng)。為了確定輕微的疾病(MD)是否可被控制，用MCF-7細(xì)胞注射NOD SCID，并在同一天腹膜內(nèi)注射M1SHMC。注射了M1SHMC的小鼠因受保護(hù)而使腫瘤不再生長(zhǎng)。這些結(jié)果意味著M1SHMC能延長(zhǎng)生存期，但不會(huì)治愈患肥大可觸知腺癌的NOD SCID小鼠。不過(guò)在輕微疾病模型中腫瘤的生長(zhǎng)得以阻止。
2003年7月29日頒予Agrawal等人的美國(guó)專利6,600,012涉及脂質(zhì)修飾的muc-1衍生物，其中公布了通過(guò)將數(shù)種外周血淋巴細(xì)胞(PBL)與負(fù)載了抗原的脂質(zhì)體相結(jié)合產(chǎn)生負(fù)載抗原的PBL，并將負(fù)載抗原的PBL與原發(fā)的、無(wú)反應(yīng)性或記憶型T細(xì)胞結(jié)合，形成活化T細(xì)胞混合物，從而產(chǎn)生活化T細(xì)胞的方法。所述的活化作用在體內(nèi)或體外進(jìn)行。按照本發(fā)明方法制備的負(fù)載抗原的PBL和活化的T細(xì)胞被認(rèn)為可用作細(xì)胞疫苗，用于治療癌癥和病毒性疾病。此專利和其中引用的文獻(xiàn)中教導(dǎo)了樹(shù)突細(xì)胞(DC)最初被視為是觸發(fā)原初T細(xì)胞的潛在APC，還教導(dǎo)了DC已被用作APC用于在體外刺激初發(fā)抗原特異性CTL反應(yīng)。已顯示出DC能與未觸發(fā)的T細(xì)胞形成強(qiáng)聚集并表達(dá)高密度的輔助分子，諸如B7.1和B7.2，它們對(duì)于天然靜止T細(xì)胞的刺激作用而言是重要的。不過(guò)，Agrawal等人進(jìn)一步教導(dǎo)了DC并不適用于(1)測(cè)定用于免疫療法的各種肽的免疫原性和(2)刺激T細(xì)胞用于擴(kuò)充過(guò)繼性細(xì)胞療法。在這點(diǎn)上，先前的技術(shù)涉及用DC產(chǎn)生抗原特異的CD8.sup.+CTL反應(yīng)。按照Agrawal等人的文章，此項(xiàng)公開(kāi)發(fā)明提供了產(chǎn)生活化T細(xì)胞的方法，包括(a)將脂質(zhì)體包裹的肽抗原與外周血淋巴細(xì)胞群結(jié)合而產(chǎn)生負(fù)載抗原的抗原呈遞細(xì)胞；(b)將原初的或無(wú)反應(yīng)性的T細(xì)胞與所述抗原負(fù)載型抗原呈遞細(xì)胞結(jié)合；(c)從步驟(b)的結(jié)合物中分離活化的T細(xì)胞。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了其中所述的活化T細(xì)胞是T輔助細(xì)胞的方法和其中所述的活化T細(xì)胞是細(xì)胞毒性T細(xì)胞的方法。優(yōu)選的實(shí)施方案涉及產(chǎn)生MUC-1肽特異的活化CD4+和CD8+T細(xì)胞群，它們通過(guò)用事先負(fù)載了脂質(zhì)體包裹的肽抗原的PBL(作為APC)激活原初T細(xì)胞而在體外產(chǎn)生。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用原初T細(xì)胞、記憶型T細(xì)胞和無(wú)反應(yīng)性T細(xì)胞或所有這三種細(xì)胞類型的混合物與脂質(zhì)體膠囊化的抗原和自體完整型外周血淋巴細(xì)胞(PBL)一起作為抗原呈遞細(xì)胞產(chǎn)生活化的T細(xì)胞。
還公布了將淋巴細(xì)胞用于非腫瘤細(xì)胞特異性抗原的成像。例如，Mazzoni，G.等人在文獻(xiàn)“用于診斷移植排斥反應(yīng)的銦標(biāo)記預(yù)敏化的T細(xì)胞(Indium-labeled presensitized T cells for diagnosis of graftrejection，)”J Surg Res.5285-88(1992)中披露了進(jìn)行所報(bào)道的實(shí)驗(yàn)的目的是為了測(cè)試一種安全的、非侵入性的方法，以便用于安全準(zhǔn)確的診斷早期同種異體移植的排斥反應(yīng)。用Brown Norway(BN)大鼠作為供體和Lewis(LEW)作為受體異位性地進(jìn)行心-肺同種異體移植。T細(xì)胞懸浮液是由特異性致敏化的、含有被強(qiáng)烈排斥的全厚度BN皮膚移植物的LEW大鼠的淋巴結(jié)制備的。細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)節(jié)到50×10(6)個(gè)細(xì)胞/ml。將所述懸浮液與111In氧化物(1mCi-ml)一起在體外保溫。在心-肺移植3天和6天后，將含40×106個(gè)細(xì)胞且總放射性為200mCi的標(biāo)記過(guò)的細(xì)胞懸浮液等分試樣經(jīng)靜脈內(nèi)途徑給予各個(gè)動(dòng)物中。在大視野γ攝像機(jī)下跟蹤T細(xì)胞在體內(nèi)和在分離的器官中的運(yùn)輸。γ攝像顯示在手術(shù)后第5天移植物上開(kāi)始出現(xiàn)放射性，這時(shí)心臟正在活躍的跳動(dòng)；在同系移植器官位點(diǎn)則未顯示出放射性。組織學(xué)顯示出與放射成像強(qiáng)度的等級(jí)相應(yīng)的輕微至中等的細(xì)胞浸潤(rùn)。在無(wú)排斥反應(yīng)的臨床癥狀和/或排斥級(jí)聯(lián)反應(yīng)可被逆轉(zhuǎn)時(shí)，注射銦標(biāo)記的預(yù)敏化T細(xì)胞就能檢測(cè)早期的排斥反應(yīng)過(guò)程。
已知多種其它以放射標(biāo)記為基礎(chǔ)的方法可用于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)胞成像。例如，Anders，G.T.等人在文獻(xiàn)“在早期人免疫缺陷病毒(HIV)感染中掃描的SPECT鎵-67。與免疫分級(jí)相關(guān)的掃描異常的消退(SPECTgallium-67 scanning in early human immunodeficiency virus(HIV)infection.Failure of scanning abnormalities to correlate withimmunologic staging，)”Clin Nucl Med.15295-302(1990)中披露了鎵掃描在治療AIDS患者中的用途。此外，Korf，J.等在文獻(xiàn)“以二價(jià)鈷為標(biāo)記用PET和SPECT研究淋巴細(xì)胞的分布(Divalent cobalt asa label to study lymphocyte distribution using PET and SPECT，)”J Nucl Med.39836-841(1998)中教導(dǎo)了PET和SPECT可以用于研究活人體中淋巴細(xì)胞的分布，條件是這些細(xì)胞被充分的進(jìn)行離體預(yù)標(biāo)記，該文獻(xiàn)中還進(jìn)一步描述了二價(jià)鈷同位素(55Co2+，對(duì)于PET而言半衰期為17.5小時(shí)；57Co2+，對(duì)于SPECT而言半衰期為270天)用于標(biāo)記淋巴細(xì)胞的潛力。還有更進(jìn)一步的有，1998年11月24日頒予Lambert等人的美國(guó)專利5,840,859描述了用于通過(guò)例如放射性同位素碘，即123I、125I或131I對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行放射性標(biāo)記的(氨基苯乙烯基)吡啶鎓化合物；或含諸如111In或99mTc等金屬放射性同位素一個(gè)當(dāng)量的螯合基團(tuán)，其通過(guò)多羧酸螯合。Lambert等人教導(dǎo)了按所公布方法標(biāo)記的自體淋巴細(xì)胞可用于體內(nèi)淋巴細(xì)胞跟蹤以及淋巴惡性腫瘤的臨床成像，還提出了所公布的化合物可替代111銦-8-羥基喹啉作為優(yōu)選的試劑用于在進(jìn)行過(guò)繼性免疫治療前標(biāo)記人工培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞使轉(zhuǎn)移性黑素瘤成像。
2000年11月14日頒予Rubin等人的美國(guó)專利6,146,614是針對(duì)通過(guò)成像測(cè)定哺乳動(dòng)物中淋巴細(xì)胞的分布和運(yùn)輸?shù)姆椒ā；蛘邔⒛芘c哺乳動(dòng)物淋巴細(xì)胞特異性相互作用的被標(biāo)記配體施用于哺乳動(dòng)物，以便該被標(biāo)記的配體在體內(nèi)與淋巴細(xì)胞相互作用而產(chǎn)生被標(biāo)記的淋巴細(xì)胞，或者，將被標(biāo)記的配體與淋巴細(xì)胞在體外進(jìn)行接觸，以便被標(biāo)記的配體與淋巴細(xì)胞相互作用而產(chǎn)生被標(biāo)記的淋巴細(xì)胞，然后將這些被標(biāo)記的淋巴細(xì)胞施用于哺乳動(dòng)物。通過(guò)成像方法確定被標(biāo)記的淋巴細(xì)胞在哺乳動(dòng)物內(nèi)的分布或運(yùn)輸。此專利文件還論述了通過(guò)測(cè)定哺乳動(dòng)物淋巴細(xì)胞的分布或運(yùn)輸模式來(lái)診斷哺乳動(dòng)物內(nèi)疾病進(jìn)展程度的方法、用于監(jiān)測(cè)患病的哺乳動(dòng)物內(nèi)對(duì)某一療法的反應(yīng)的方法、用于評(píng)估某試劑改變淋巴細(xì)胞的分布或運(yùn)輸?shù)哪芰Φ姆椒ê陀糜阼b定可用于治療患病哺乳動(dòng)物的試劑的方法。在某些實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物患有疾病，如HIV感染、自身免疫性疾病、傳染病或惡性腫瘤。淋巴細(xì)胞可以是例如B細(xì)胞或T細(xì)胞。對(duì)于某些實(shí)施方案而言，優(yōu)選淋巴細(xì)胞是CD4陽(yáng)性細(xì)胞或CD8陽(yáng)性細(xì)胞。配體可以是例如抗體，如多克隆抗體或單克隆抗體，如抗CD4單克隆抗體，抗體片段、重組抗體、肽、擬肽、碳水化合物或糖蛋白。
發(fā)明概述本發(fā)明的特點(diǎn)是通過(guò)施用被標(biāo)記的抗原特異性淋巴細(xì)胞優(yōu)選通過(guò)將所述細(xì)胞暴露于展示出該細(xì)胞特異性抗原的免疫原性表位的肽而從哺乳動(dòng)物外周血單核細(xì)胞中獲取的活化T細(xì)胞，并通過(guò)成像確定哺乳動(dòng)物中被標(biāo)記的淋巴細(xì)胞的分布而在哺乳動(dòng)物中檢測(cè)和定位細(xì)胞特異性抗原的方法。本發(fā)明部分地基于發(fā)明者認(rèn)同的以下重要成分針對(duì)腫瘤特異性表位的放射性標(biāo)記的活化淋巴細(xì)胞群可用于本發(fā)明的診斷方法；所述細(xì)胞具有遷移和附著于它們所致敏的腫瘤表位的能力；所述細(xì)胞具有將很小的腫瘤(例如，直徑≤2mm)的定位放大的能力；和所述細(xì)胞可用于鑒定具有已知免疫原性表位的未知原發(fā)瘤，如可以用抗粘蛋白肽的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)(即被來(lái)自粘蛋白多肽或其它腫瘤抗原氨基酸序列的免疫原性肽激活的T細(xì)胞)檢測(cè)的產(chǎn)生粘蛋白的腺癌。
因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包括從患者血液或含有可針對(duì)特異腫瘤表位被激活的物質(zhì)(如粘蛋白)的其它淋巴類組織中獲得淋巴樣細(xì)胞群；評(píng)估活化的淋巴樣細(xì)胞在體外殺死或識(shí)別特異腫瘤的能力；活化的淋巴樣細(xì)胞群可在體外用銦-8-羥基喹啉或其它類似的放射性同位素進(jìn)行放射性標(biāo)記或“被貼上標(biāo)簽”；將放射性細(xì)胞經(jīng)靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)(腹腔腫瘤)途徑進(jìn)行投遞；通過(guò)核醫(yī)學(xué)監(jiān)測(cè)其生物分布計(jì)48小時(shí)，按ProstaScint前列腺篩查技術(shù)分析圖像中“熱點(diǎn)”的存在；
將SPECT核醫(yī)學(xué)成像與CT或MRI成像相結(jié)合來(lái)測(cè)定在這些位點(diǎn)是否有可確定的腫瘤，還可將這些圖像與PET圖像比較以便進(jìn)一步證實(shí)測(cè)定結(jié)果。
發(fā)明者還認(rèn)為使用這些非侵入性的診斷形式可以防止外科手術(shù)恢復(fù)中(如在鑒定無(wú)轉(zhuǎn)移情況發(fā)生的探察性手術(shù)后)不必要的時(shí)間損失，并且，若在開(kāi)始治療后在例如新的位點(diǎn)檢測(cè)到轉(zhuǎn)移時(shí)，則還可有助于選用更有效的治療方案。已顯示單獨(dú)使用正電子發(fā)射斷層掃描(PET)的診斷方法顯著改變了臨床治療效果。發(fā)明者因此認(rèn)為單獨(dú)使用本方法或?qū)⑵渑cPET等其它技術(shù)相結(jié)合可以更早的探測(cè)出腫瘤并對(duì)腫瘤進(jìn)行更好的分級(jí)。
關(guān)于本發(fā)明方法最初的臨床研究參閱文獻(xiàn)Phillips，C.A.等，“運(yùn)輸問(wèn)題是過(guò)繼性免疫療法中需要考慮的一個(gè)因素施用途徑如何影響了細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞向腫瘤的運(yùn)送(Trafficking as a consideration inadoptive immunotherapyHow does the route of administrationaffect the delivery of cytotoxic T lymphocytes to tumor？)”J.Immunol.25(6)S34(2002年11月/12月)，其內(nèi)容如下使用特異細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的過(guò)繼性免疫療法是試圖摧毀常規(guī)手術(shù)、放療和化療后殘余腫瘤的試驗(yàn)性療法。對(duì)患者中通過(guò)不同途徑施用的過(guò)繼性轉(zhuǎn)移的CTL制品的遷移模式很少有研究。我們已檢測(cè)到了經(jīng)針對(duì)腫瘤粘蛋白肽刺激的111銦標(biāo)記的CTL制品在體內(nèi)的運(yùn)動(dòng)。這些細(xì)胞在靜脈內(nèi)施用后與腹膜內(nèi)施用后其生物分布非常不同。在一小組乳癌患者(兩名患乳癌，兩名未患)和5名卵巢癌復(fù)發(fā)患者(BB IND 8620)中施用活化的淋巴細(xì)胞制品。每個(gè)月記錄兩種注射的流程(一種為放射性標(biāo)記，一種未標(biāo)記，實(shí)驗(yàn)周期為4個(gè)月)。在乳癌患者中靜脈內(nèi)給予的CTL制劑的生物分布一般通過(guò)銦-8-羥基喹啉白細(xì)胞掃描進(jìn)行檢測(cè)。在生物分布隨時(shí)間的變化的定量分析結(jié)果顯示非細(xì)胞毒性T細(xì)胞和非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞不流向腫瘤?？梢燥@示，細(xì)胞遷移隨時(shí)間的變化細(xì)節(jié)。在卵巢癌患者中，此移動(dòng)模式相當(dāng)不尋常。腹膜內(nèi)輸注的放射性標(biāo)記CTL制劑在第一次成像時(shí)就確定了可識(shí)別的模式，它在緊接的數(shù)天內(nèi)自我精制，且對(duì)于各名患者而言是獨(dú)一無(wú)二的。從腹膜出來(lái)的運(yùn)動(dòng)是快速的，在1小時(shí)時(shí)約有10％，在98小時(shí)時(shí)約有30％。放射性標(biāo)記的CTL制品定位于已知腫瘤(通過(guò)CT掃描鑒定的)和由于腫瘤轉(zhuǎn)移而先前未鑒定的腹膜內(nèi)和腹膜外區(qū)域。文章將顯示乳癌和卵巢癌患者特殊案例中放射性標(biāo)記的CTL制品的生物分布以及將CT掃描與SPECT成像結(jié)合檢測(cè)卵巢癌患者的結(jié)果。文獻(xiàn)還將詳述CTL遞送的可取之處。
鑒于上述理由，本發(fā)明的目的是提供一種安全、有效、方便且優(yōu)選非侵入性用于通過(guò)探測(cè)被激活的抗原特異性淋巴細(xì)胞在受試者中的分布和運(yùn)輸情況而檢測(cè)細(xì)胞特異性抗原的方法。
本發(fā)明的另一目的是利用成像技術(shù)從受試者被活化的淋巴細(xì)胞分布和運(yùn)輸模式確定細(xì)胞特異性抗原的定位。
本發(fā)明還有另一目的是通過(guò)從受試者被活化的淋巴細(xì)胞分布和運(yùn)輸模式確定細(xì)胞特異性抗原的定位來(lái)評(píng)估受試者中疾病的進(jìn)展情況。
本發(fā)明的又一目的是通過(guò)對(duì)從受試者被活化的淋巴細(xì)胞分布和運(yùn)輸模式評(píng)估治療方法對(duì)細(xì)胞特異性抗原的定位的影響來(lái)評(píng)價(jià)相應(yīng)療法對(duì)疾病的效力。
因此，本發(fā)明一方面提供了在諸如人類等哺乳動(dòng)物中檢測(cè)和定位細(xì)胞特異性抗原的方法，包括以下步驟(a)從哺乳動(dòng)物中獲取外周血單核細(xì)胞；(b)在使外周血單核細(xì)胞中的T淋巴細(xì)胞經(jīng)歷抗原特異性活化(從而產(chǎn)生結(jié)合該細(xì)胞特異性抗原的活化的抗原特異性T淋巴細(xì)胞)的條件下，將外周血單核細(xì)胞暴露于呈現(xiàn)細(xì)胞特異性抗原的免疫原性表位的免疫原性肽；(c)用通過(guò)成像可探測(cè)的標(biāo)記物標(biāo)記該抗原特異性T淋巴細(xì)胞；(d)將標(biāo)記好的抗原特異性T淋巴細(xì)胞施用于哺乳動(dòng)物，并(e)通過(guò)成像測(cè)定被標(biāo)記的抗原特異性T淋巴細(xì)胞在哺乳動(dòng)物中的分布，從而在哺乳動(dòng)物中檢測(cè)并定位細(xì)胞特異性抗原。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，在白介素-2(IL-2)存在的條件下進(jìn)行上述步驟(b)的將外周血單核細(xì)胞暴露于免疫原性肽的操作，從而便于T細(xì)胞的活化。
有利地，通過(guò)添加無(wú)細(xì)胞的肽制品至外周血單核細(xì)胞中進(jìn)行步驟(b)中所述的將外周血單核細(xì)胞(PBMC)暴露于免疫原性肽這一步，在進(jìn)行將被標(biāo)記的抗原特異性T淋巴細(xì)胞施用于哺乳動(dòng)物的步驟(d)之前不添加額外細(xì)胞至PBMC中。因此，與以前公布的T細(xì)胞活化的方法的(例如Agrawal等人的美國(guó)專利6,600,012，其中通過(guò)用作為抗原呈遞細(xì)胞(APC)的外周血單核細(xì)胞(PBL)激活PBMC中的原初T細(xì)胞，在體外產(chǎn)生MUC-1肽特異性的活化CD4+和CD8+T細(xì)胞群)形成對(duì)照。這些PBL事先在獨(dú)立培養(yǎng)物中裝載封裝有肽抗原的脂質(zhì)體，然后加入到來(lái)自PBMC的原初T細(xì)胞培養(yǎng)物中，從而增加了T細(xì)胞活化過(guò)程的復(fù)雜性以及由于污染或多重細(xì)胞培養(yǎng)操作中固有的其它原因造成損失的風(fēng)險(xiǎn)。
本發(fā)明的另一優(yōu)勢(shì)在于使用了對(duì)于表達(dá)細(xì)胞特異性抗原的細(xì)胞具有細(xì)胞溶解性的抗原特異性T淋巴細(xì)胞。因此，細(xì)胞溶解性(或，更通常的是，細(xì)胞毒性)T細(xì)胞(CTL)可以比非細(xì)胞溶解性抗原特異性T細(xì)胞更有效的與攜帶被靶向的細(xì)胞特異性抗原的細(xì)胞結(jié)合；不過(guò)，與過(guò)繼性免疫療法應(yīng)用形成對(duì)照的是，本診斷方法并非絕對(duì)需要能有效殺死攜帶抗原的靶細(xì)胞的T細(xì)胞。因此，本發(fā)明方法的活化的抗原特異性T細(xì)胞可能包含CD4+淋巴細(xì)胞或CD8+淋巴細(xì)胞或其混合物。本發(fā)明方法中的被活化的抗原特異性細(xì)胞還可包括記憶型T細(xì)胞，尤其是CD45RO+記憶型T細(xì)胞。本發(fā)明通過(guò)將來(lái)自PBMC的T細(xì)胞暴露于無(wú)細(xì)胞抗原(諸如展示靶抗原表位的多肽或肽)而產(chǎn)生抗原特異性T淋巴細(xì)胞的方法的另一優(yōu)勢(shì)在于，這樣的抗原特異性T淋巴細(xì)胞可能包含的天然殺傷(NK)細(xì)胞量可忽略不計(jì)(如，按具有CD3-、CD8-、CD56+表型的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)所顯示的，少于約10％，優(yōu)選少于約6％，更優(yōu)選少于約3％)。
某些實(shí)施方案中，在進(jìn)行步驟(e)測(cè)定哺乳動(dòng)物中被標(biāo)記的抗原特異性T淋巴細(xì)胞的分布之前，可以方便的進(jìn)行步驟(d)的操作，即對(duì)哺乳動(dòng)物施用標(biāo)記的抗原特異性T淋巴細(xì)胞，而無(wú)需與該T淋巴細(xì)胞一起或在此之后對(duì)哺乳動(dòng)物施用細(xì)胞因子，尤其是IL-2。因此，盡管用TIL細(xì)胞等T細(xì)胞進(jìn)行的過(guò)繼性免疫療法通常需要在施用活化的細(xì)胞毒性T細(xì)胞的同時(shí)和之后對(duì)患者施用高劑量的細(xì)胞因子，尤其是IL-2，來(lái)維持它們的細(xì)胞毒性，但當(dāng)用于本發(fā)明的診斷目的時(shí)，活化的T細(xì)胞不必開(kāi)始就處于或保持在活化的細(xì)胞毒性狀態(tài)。因此，通過(guò)使用按本發(fā)明方法活化的T細(xì)胞，可以避免其它類型的活化T細(xì)胞過(guò)繼性轉(zhuǎn)移中所需的高劑量IL-2施用的額外成本和潛在副作用。
在本發(fā)明方法的某些實(shí)施方案中，步驟(d)的對(duì)哺乳動(dòng)物施用已標(biāo)記的抗原特異性T淋巴細(xì)胞包括腹膜內(nèi)施用淋巴細(xì)胞。因此，如Phillips，C.A.等人(見(jiàn)上文)所公布的，針對(duì)腫瘤粘蛋白肽刺激過(guò)的過(guò)繼性轉(zhuǎn)移CTL制品的遷移模式在靜脈內(nèi)施用和腹膜內(nèi)施用時(shí)是非常不同的。在乳癌患者中靜脈內(nèi)施用的CTL制品的生物分布具有銦-8-羥基喹啉白細(xì)胞掃描的特征。例如，Reynolds，C.W.等人(見(jiàn)上文)指出，在將標(biāo)記過(guò)的LGL或T細(xì)胞靜脈內(nèi)接種入正常受試者體內(nèi)后，數(shù)分鐘內(nèi)在肺里回收到大比率放射性(18-33％)。在肺中放射性水平的下降伴隨著在脾和肝中計(jì)數(shù)的相應(yīng)增加。類似的，Chin.Y.等(見(jiàn)上文)報(bào)告了在注入后兩小時(shí)內(nèi)觀察到111In-標(biāo)記的TIL在肺中的定位，在24小時(shí)時(shí)在肺、肝和脾中觀察到高水平的放射性。72小時(shí)后在肺中的活性減少，但在轉(zhuǎn)移位點(diǎn)未觀察到111In-標(biāo)記TIL的特異定位。最后，Swift，R.I.等人(見(jiàn)上文)報(bào)道了111In標(biāo)記的腫瘤活化殺傷(TAK)細(xì)胞在肺中早至4小時(shí)、在腹部晚至48小時(shí)時(shí)顯示出轉(zhuǎn)移的跡象，但肝成像則產(chǎn)生了相應(yīng)于轉(zhuǎn)移損傷部位的“冷”斑點(diǎn)，據(jù)推測(cè)大概是由于在正常肝組織中細(xì)胞的高背景造成的。
與靜脈內(nèi)施用各種淋巴細(xì)胞的一般發(fā)現(xiàn)形成對(duì)照的是，本發(fā)明的發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)腹膜內(nèi)注入的放射性標(biāo)記的CTL制品在首次成像時(shí)建立了一個(gè)可識(shí)別的模式，它在隨后數(shù)天內(nèi)自我改善并且對(duì)于每名患者而言都是獨(dú)一無(wú)二的。從腹膜內(nèi)移出來(lái)的運(yùn)動(dòng)是快速的，大約是1小時(shí)時(shí)出來(lái)10％，而98小時(shí)時(shí)出來(lái)大約30％。放射性標(biāo)記的CTL制品定位于已知的腫瘤(CT掃描所確定的)和先前未被確定為腫瘤轉(zhuǎn)移的腹膜內(nèi)和腹膜外區(qū)域。
在本發(fā)明方法的其它實(shí)施方案中，將標(biāo)記的抗原特異性T淋巴細(xì)胞施用于所述哺乳動(dòng)物的步驟(d)包括靜脈內(nèi)施用淋巴細(xì)胞。有利地，在所述實(shí)施方案中，靜脈內(nèi)施用淋巴細(xì)胞還包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用糖綴合物的方法，從而使其與只施用淋巴細(xì)胞而不施用糖綴合物相比，淋巴細(xì)胞的運(yùn)輸情況有所改變。因此，國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US93/07834(在2003年3月14日公布為WO03/077864A2，在此全部收編作為參照)公布了將細(xì)胞導(dǎo)向于靶細(xì)胞的方法。這些方法的一些實(shí)施方案包括同時(shí)或依次向哺乳動(dòng)物施用碳水化合物呈遞分子(如，糖綴合物)和細(xì)胞的步驟。在這些方法中，包括諸如脫唾液酸血清類粘蛋白(脫唾液酸α-(1)-酸糖蛋白)等脫唾液酸血漿蛋白質(zhì)在內(nèi)的糖綴合物，尤其是脫唾液酸糖綴合物，被認(rèn)為瞬時(shí)結(jié)合肝的脫唾液酸糖蛋白受體并因此競(jìng)爭(zhēng)性的抑制細(xì)胞的附著，包括淋巴細(xì)胞，尤其是CD4+細(xì)胞，它們攜帶被那些肝受體結(jié)合的脫唾液酸決定子。不受理論限制，本發(fā)明的發(fā)明者認(rèn)為低唾液酸化或去唾液酸化蛋白/糖綴合物(也稱脫唾液酸糖綴合物)和攜帶相似決定子的細(xì)胞由于與肝的脫唾液酸糖蛋白受體結(jié)合而被束縛或“截留”于肝中。脫唾液酸綴合物對(duì)受體的占據(jù)抑制了攜帶相似目的決定子的細(xì)胞在肝中的匯集。因此，在本發(fā)明的方法中，在靜脈內(nèi)施用抗原特異性T淋巴細(xì)胞(具體而言是CD4+淋巴細(xì)胞)之前施用或同時(shí)施用諸如脫唾液酸血清類粘蛋白等唾液酸糖綴合物，防止了所述淋巴細(xì)胞在正常肺和肝組織中的積聚，從而降低了在所述組織中被標(biāo)記細(xì)胞的背景并增強(qiáng)了對(duì)這些組織中諸如腫瘤細(xì)胞等攜帶抗原的細(xì)胞的檢測(cè)。此外，以上PCT公布內(nèi)容顯示出所公布發(fā)明的糖綴合物阻止了所注入細(xì)胞在肺泡脈管系統(tǒng)中的濃縮。因此，在靜脈內(nèi)施用抗原特異性T淋巴細(xì)胞(具體而言是CD4+淋巴細(xì)胞)之前或同時(shí)施用諸如血清類粘蛋白等唾液酸糖綴合物還阻止了所述淋巴細(xì)胞在正常肺組織中的積聚，從而降低了被標(biāo)記細(xì)胞在該組織中的背景，同時(shí)增強(qiáng)了細(xì)胞向肝和脾的遞送。
另一方面，本發(fā)明提供了探測(cè)和定位細(xì)胞特異性抗原的方法，其中所述細(xì)胞特異性抗原是腫瘤特異性抗原。有利的是，所述抗原是腫瘤特異性粘蛋白，諸如人粘蛋白1(MUC-1)，而肽免疫原展示了MUC-1的表位。MUC-1(也稱MUC1)是在包括乳癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、結(jié)腸癌和卵巢癌等所有腺癌的90％中會(huì)過(guò)表達(dá)的上皮粘糖蛋白。有利的是，利用了MUC-1免疫原性肽表位的本發(fā)明方法提供了包含CD4+淋巴細(xì)胞的T細(xì)胞，所述CD4+淋巴細(xì)胞對(duì)攜帶MUC-1表位的細(xì)胞呈現(xiàn)出MHC非限制性細(xì)胞毒性。由此，Magarian-Blander等(見(jiàn)上文)論述了MHC非限制性TCR對(duì)MUC-1上的腫瘤特異肽表位的識(shí)別。此外，WrightS.E.等(見(jiàn)上文)公布了MUC1粘蛋白肽刺激了腺癌病人外周血單核細(xì)胞(PBMC)中的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)。因此，肽刺激的T細(xì)胞顯示出細(xì)胞毒性細(xì)胞的表達(dá)，這不是被非特異性(抗CD3或IL-2)刺激所誘導(dǎo)的。此外，這些作者報(bào)道了粘蛋白-肽刺激的細(xì)胞系的細(xì)胞毒性是非HLA限制性的(即，MHC非限制性的)。利用提供了呈現(xiàn)出MHC非限制性細(xì)胞毒性的抗原特異性T淋巴細(xì)胞的免疫原的優(yōu)勢(shì)在于，單純這樣的免疫原就能用于本發(fā)明方法中以產(chǎn)生任何患者的抗原特異性T淋巴細(xì)胞，而不管MHC背景如何。
還有文獻(xiàn)描述了抗原特異性MHC非限制性識(shí)別的其它例子，如Magarian-Blander，J.等人文章及其中引用的文獻(xiàn)所公布的。例如，已從類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的滑液中和用結(jié)核桿菌免疫的小鼠中分離了特異于分枝桿菌抗原的MHC-非限制性T細(xì)胞。還分離了MHC非限制性T細(xì)胞，其特異于諸如B細(xì)胞腫瘤上的Ig Ids、皰疹病毒糖蛋白和非肽異戊二烯基焦磷酸酯等抗原。還有文獻(xiàn)已描述了針對(duì)諸如抗生物素蛋白和髓鞘堿性蛋白等復(fù)合蛋白以及諸如血色素的血紅素部分等非肽抗原的抗原特異性、MHC非限制性的βT細(xì)胞。還有一些研究描述了在缺乏MHC分子時(shí)能識(shí)別抗原的胂酸鹽和熒光素特異的T細(xì)胞。還產(chǎn)生了特異于來(lái)自水皰性口炎病毒核蛋白質(zhì)的糖基化肽上的碳水化合物部分的碳水化合物特異性MHC非限制性T細(xì)胞。
有利地，為了依照本發(fā)明將表達(dá)MUC-1的細(xì)胞進(jìn)行定位，免疫原性肽展示了MUC-1的表位，其中包含含有序列(SEQ ID NO1)PDTRP(用常規(guī)的單字母密碼表示)在內(nèi)的循環(huán)排列(permutations)MUC-1序列的氨基酸序列。有利地，所述的肽具有氨基酸序列(SEQ ID NO2)GSTAPPAHGVTSAPDTRPAP。可用于本發(fā)明的其它MUC-1免疫原性肽及其衍生物可參閱別的文獻(xiàn)，例如，頒予Agrawal等人的美國(guó)專利6,600,012，包括但不局限于，產(chǎn)生抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)且包括氨基酸序列STAPPAHGVTSAPDTRAPGSTAPP(SEQ ID NO.3)的約7至約20個(gè)氨基酸的序列的MUC-1肽。
同樣有利的是，本發(fā)明方法中所用的免疫原性肽是脂質(zhì)體包裹的肽或用脂類部分共價(jià)修飾的MUC-1肽，例如，當(dāng)本發(fā)明方法使用按Agrawal等人所教導(dǎo)的包括下述步驟所產(chǎn)生的活化T細(xì)胞之時(shí)即可如此(a)將脂質(zhì)體包裹的肽抗原與眾多外周血淋巴細(xì)胞結(jié)合，產(chǎn)生負(fù)載抗原的抗原呈遞細(xì)胞；(b)將原初或無(wú)反應(yīng)性的T細(xì)胞與所述負(fù)載了抗原的抗原呈遞細(xì)胞結(jié)合；并(c)從步驟(b)的聯(lián)合中分離活化的T細(xì)胞。
用于檢測(cè)本發(fā)明的淋巴細(xì)胞的標(biāo)記物可以是本領(lǐng)域已知用于檢測(cè)哺乳動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞的任何標(biāo)記物。方便的是，標(biāo)記物選自γ輻射源、正電子輻射源、磁性材料、基于密度的反差材料及其混合物。當(dāng)所述標(biāo)記物是γ輻射源時(shí)，它可選自銦-111、锝-99m、锝-99、碘-123及其混合物。方便的情況下，該標(biāo)記物是銦-111，通常以銦-8-羥基喹啉的形式。
在本發(fā)明方法中用于定位經(jīng)標(biāo)記的淋巴細(xì)胞的成像技術(shù)可選自放射成像、磁共振成像、正電子發(fā)射斷層掃描和X-射線計(jì)算機(jī)斷層成像，當(dāng)然，這取決于標(biāo)記物的特性。此外，還可用單一掃描或系列掃描進(jìn)行成像。有利地，本發(fā)明方法中所用的成像包括哺乳動(dòng)物的整體掃描。
在某些實(shí)施方案中，成像包括至少兩次分開(kāi)的掃描，其中每次分開(kāi)的掃描選自放射成像、磁共振成像、正電子發(fā)射斷層掃描和X-射線計(jì)算機(jī)斷層成像。有利地，在所述實(shí)施方案中，可以將獲自兩個(gè)或多個(gè)獨(dú)立掃描的成像數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，例如，通過(guò)將來(lái)自多重掃描的數(shù)據(jù)融合成單一的展示圖像進(jìn)行比較。例如，于1988年4月5日頒予Goldenberg的美國(guó)專利4,735,210公布了淋巴系造影和器官成像方法和試劑盒，尤其是用于淋巴系閃爍造影或磁共振淋巴系造影術(shù)的改進(jìn)方法，它包括從特異抗體成像劑產(chǎn)生的陽(yáng)性圖像中扣除用總成像劑產(chǎn)生的陰性圖像。最近，于2002年12月3日頒予Townsend等人的美國(guó)專利6,490,476教導(dǎo)了組合的PET和X-射線CT斷層照相機(jī)以及利用它們?cè)趩我谎b置中順序獲得CT和PET圖像的方法，克服了由于內(nèi)部器官運(yùn)動(dòng)、掃描儀基線的變化和掃描患者的定位造成的比對(duì)問(wèn)題。斷層照相機(jī)攝取了精確地共同記錄的功能性和解剖學(xué)圖像，并無(wú)需使用外部標(biāo)記或內(nèi)部標(biāo)志。
發(fā)明詳述本發(fā)明的一個(gè)目的是在比目前用標(biāo)準(zhǔn)成像技術(shù)可能檢測(cè)到的更早的時(shí)間探測(cè)到更小的腫瘤，以及發(fā)現(xiàn)其中原始原發(fā)瘤不易找到的腫瘤。另一好處在于復(fù)發(fā)可以被更好的分級(jí)，以便可以為患者設(shè)計(jì)最適的治療計(jì)劃，避免進(jìn)行不必要的手術(shù)。這一技術(shù)可用于證實(shí)諸如MRI、CT、PET和實(shí)驗(yàn)室測(cè)試的結(jié)果。
因此，一方面，本發(fā)明提供了在人類等哺乳動(dòng)物中檢測(cè)和定位細(xì)胞特異性抗原的方法，包括以下步驟(a)從哺乳動(dòng)物中獲取外周血單核細(xì)胞；(b)在使外周血單核細(xì)胞中的T淋巴細(xì)胞經(jīng)歷抗原特異性活化(從而產(chǎn)生結(jié)合該細(xì)胞特異性抗原的抗原特異性T淋巴細(xì)胞)的條件下，將外周血單核細(xì)胞暴露于呈現(xiàn)細(xì)胞特異性抗原的免疫原性表位的免疫原性肽；(c)用成像可探測(cè)的標(biāo)記物標(biāo)記抗原特異性T淋巴細(xì)胞；(d)將標(biāo)記好的抗原特異性T淋巴細(xì)胞施用于哺乳動(dòng)物，并(e)通過(guò)成像測(cè)定標(biāo)記的抗原特異性T淋巴細(xì)胞在哺乳動(dòng)物中的分布，從而在哺乳動(dòng)物中檢測(cè)并定位細(xì)胞特異性抗原。這種方法特別適用于人受試者，尤其是所患疾病或癥狀涉及細(xì)胞抗原(諸如腫瘤特異性抗原)異常表達(dá)的患者。
1.被活化的抗原特異性T淋巴細(xì)胞通常可以用本領(lǐng)域已知的任何常規(guī)方法從哺乳動(dòng)物中獲取外周血單核細(xì)胞(PBMC)用于本發(fā)明中。例如，用諸如Ficoll-Hypaque梯度離心等方法從其它組分中分離外周血淋巴細(xì)胞的方法，從外周血樣中收集“淺黃色層(buffy coat)”。參閱。例如，《免疫學(xué)通用方法CURRENTPROTOCOLS IN IMMUNOLOGY》(John E.Coligan編輯，John Wiley&Sons，紐約，1991)第7.0.5頁(yè)至7.1.5頁(yè)描述的技術(shù)，該書(shū)收編于此作為參考。
本發(fā)明方法進(jìn)一步包括激活哺乳動(dòng)物PBMC中的抗原特異性T細(xì)胞，具體而言是在使外周血單核細(xì)胞中的T淋巴細(xì)胞經(jīng)歷抗原特異性活化(從而產(chǎn)生結(jié)合細(xì)胞特異性抗原的活化抗原特異性T淋巴細(xì)胞)的條件下，將外周血單核細(xì)胞暴露于呈現(xiàn)細(xì)胞特異性抗原的免疫原性表位的免疫原性肽。用于此處時(shí)，“活化的”T淋巴細(xì)胞或T細(xì)胞正在進(jìn)行有絲分裂和/或細(xì)胞分裂。活化的T淋巴細(xì)胞可以是T輔助(TH)細(xì)胞或細(xì)胞毒性T細(xì)胞(細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL或TC))。原初T細(xì)胞的激活可以通過(guò)將所述細(xì)胞暴露于抗原呈遞細(xì)胞(APC)(其中包含抗原/MHC復(fù)合體)和暴露于諸如IL-1、IL-2、IL-12、IL-13、γ-IFN和相似淋巴因子等分子而被引發(fā)?？乖?MHC復(fù)合體與T細(xì)胞表面上的受體(T細(xì)胞受體(TCR))相互作用。Golub等編輯，免疫學(xué)合成，第二章“T細(xì)胞受體The T-cell Receptor”(1991)。因此，在本發(fā)明方法的某些實(shí)施方案中，將外周血單核細(xì)胞暴露于免疫原性肽的步驟(b)是在白介素-2(IL-2)存在的條件下進(jìn)行的，以便促進(jìn)T細(xì)胞的活化。
有利地，通過(guò)添加無(wú)細(xì)胞的肽制品至外周血單核細(xì)胞中進(jìn)行步驟(b)中所述的將外周血單核細(xì)胞(PBMC)暴露于免疫原性肽這一步，在進(jìn)行將被標(biāo)記的抗原特異性T淋巴細(xì)胞施用于哺乳動(dòng)物的步驟(d)之前不添加額外細(xì)胞至PBMC中。因此，與以前公布的T細(xì)胞活化的方法，例如在Agrawal等人的美國(guó)專利6,600,012中公布的通過(guò)用作為抗原呈遞細(xì)胞(APC)的外周血單核細(xì)胞(PBL)激活原初T細(xì)胞而在體外產(chǎn)生活化CD4+和CD8+T細(xì)胞的方法形成對(duì)照的是，本發(fā)明通過(guò)使用受試者PBMC中表達(dá)腫瘤特異性抗原的T淋巴細(xì)胞前體而有利的避免了對(duì)抗原呈遞細(xì)胞的需求。因此，不受理論所限制，發(fā)明者認(rèn)為，表達(dá)腫瘤特異抗原(尤其是MUC-1腫瘤抗原)的受試者的PBMC包含抗原特異性T淋巴細(xì)胞的前體，它可通過(guò)直接暴露于該抗原的免疫原性肽表位而被激活成可至少與該腫瘤抗原結(jié)合，而無(wú)需APC來(lái)呈遞所述的肽。例如，在表達(dá)腫瘤特異性抗原的受試者PBMC中的T淋巴細(xì)胞可能在表達(dá)腫瘤特異抗原的宿主中已經(jīng)過(guò)“觸發(fā)”。在此說(shuō)明書(shū)中，“觸發(fā)”用于指將動(dòng)物(包括人)或人工培養(yǎng)細(xì)胞暴露于抗原，導(dǎo)致其活化和/或有記憶性。針對(duì)靶抗原的CD4+和CD8+T細(xì)胞反應(yīng)的產(chǎn)生通常依賴體內(nèi)觸發(fā)，其或者通過(guò)自然感染或者通過(guò)有意的免疫接種。無(wú)論如何，下文實(shí)施例1中給出了在本發(fā)明方法的臨床試驗(yàn)中用于產(chǎn)生活化抗原特異性T淋巴細(xì)胞的詳細(xì)臨床方案。
或者，本發(fā)明方法中所用的活化的抗原特異性T淋巴細(xì)胞可以通過(guò)將從未暴露于該細(xì)胞特異性抗原的原初T細(xì)胞經(jīng)體外暴露于負(fù)載了抗原(尤其是被靶向細(xì)胞的特異性抗原的肽表位，或所述肽表位的免疫原性衍生物)的APC活化而產(chǎn)生。例如，如頒予Agrawal等人的美國(guó)專利6,600,012中所述，APC可以是事先在分開(kāi)的培養(yǎng)中負(fù)載了脂質(zhì)體封裝的肽抗原、然后加入PMC的原初T細(xì)胞培養(yǎng)物中的PBL。
本發(fā)明的另一優(yōu)勢(shì)在于使用了對(duì)于表達(dá)細(xì)胞特異性抗原的細(xì)胞具有細(xì)胞溶解性的抗原特異性T淋巴細(xì)胞。因此，細(xì)胞溶解性(或，更通常的是細(xì)胞毒性)T細(xì)胞(CTL)可以比非細(xì)胞溶解性抗原特異性T細(xì)胞更有效的結(jié)合含被靶向的細(xì)胞特異性抗原的細(xì)胞；不過(guò)，與過(guò)繼性免疫療法應(yīng)用形成對(duì)照的是，本診斷方法并非絕對(duì)需要能有效殺死攜帶抗原的靶細(xì)胞的T細(xì)胞。因此，本發(fā)明方法的活化的抗原特異性T細(xì)胞可能包含CD4+淋巴細(xì)胞或CD8+淋巴細(xì)胞或其混合物。本發(fā)明方法中被活化的抗原特異性細(xì)胞還可包括記憶型T細(xì)胞，尤其是CD45RO+記憶型T細(xì)胞。用于本說(shuō)明書(shū)中時(shí)，“記憶型T細(xì)胞”也稱“記憶表型”T細(xì)胞，用于指先前已遇到過(guò)肽抗原，但目前處于靜息狀態(tài)并能夠被激活的一類T淋巴細(xì)胞。記憶型T細(xì)胞是已暴露于抗原并隨后在無(wú)刺激性抗原存在的條件下在體內(nèi)繼續(xù)存在更長(zhǎng)時(shí)期的T細(xì)胞。不過(guò)，這些記憶型T細(xì)胞與回憶型抗原反應(yīng)。一般而言，與原初T細(xì)胞對(duì)肽抗原的反應(yīng)相比，記憶型T細(xì)胞對(duì)“回憶”抗原具有更大的反應(yīng)性。記憶細(xì)胞可被諸如CD45RO、CD58、CD11α、CD29、CD44和CD26等某些細(xì)胞表面抗原(它們是分化型T細(xì)胞的標(biāo)記物)識(shí)別。用技術(shù)熟煉人員眾所周知的技術(shù)分離記憶性T細(xì)胞。例如，簡(jiǎn)而言之，分離全部T細(xì)胞群，然后用抗CD45RO、抗CD44或抗CD26單克隆抗體進(jìn)行熒光激活細(xì)胞分揀術(shù)(FACS)。參閱，Hollsberg等，Cellular Immunology149170(1993)；Bruno等，Immunity237(1995)；和J Immunol.150(第一部分)3119(1993)。
通過(guò)將來(lái)自PBMC的T細(xì)胞暴露于無(wú)細(xì)胞抗原(諸如展示靶抗原表位的多肽或肽)而產(chǎn)生本發(fā)明的抗原特異性T淋巴細(xì)胞的本發(fā)明方法的另一優(yōu)勢(shì)在于，這樣的抗原特異性T淋巴細(xì)胞可能包含的天然殺傷(NK)細(xì)胞的量可忽略不計(jì)(如按具有CD3-、CD8-、CD56+表型的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)所顯示的，少于約10％，優(yōu)選少于約6％，更優(yōu)選少于約3％)。例如，文獻(xiàn)Wright S.E.等，J Immunother.232-10(2000)報(bào)道了在活化制品中全部細(xì)胞的3-6％展示了上述NK表型。此外，根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生的抗原特異性T細(xì)胞在激活后可凍存至少數(shù)月，從而為在同一患者內(nèi)多重抗原定位的可重現(xiàn)的標(biāo)記和成像條件提供了一致的T細(xì)胞來(lái)源，在數(shù)周或數(shù)月內(nèi)跟蹤治療的進(jìn)程。
2.活化T淋巴細(xì)胞的施用某些實(shí)施方案中，有利地，可以在進(jìn)行步驟(e)測(cè)定哺乳動(dòng)物中被標(biāo)記的抗原特異性T淋巴細(xì)胞的分布之前進(jìn)行步驟(d)的操作，即對(duì)哺乳動(dòng)物施用該標(biāo)記的抗原特異性T淋巴細(xì)胞，而無(wú)需與T淋巴細(xì)胞一起或在施用T淋巴細(xì)胞之后對(duì)哺乳動(dòng)物施用細(xì)胞因子，尤其是IL-2?；蛘?，正如在用諸如TIL、LAK或NK(但非TAK)細(xì)胞之類的在體內(nèi)需要細(xì)胞因子支持的T細(xì)胞進(jìn)行的過(guò)繼性免疫療法中一樣，可在抗原特異性淋巴細(xì)胞施用的同時(shí)和/或之后施用細(xì)胞因子，尤其是IL-2。例如，Pockaj，B.A.等(見(jiàn)上文)公布了在接受高劑量IL-2和TIL的轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者中白介素-2(IL-2)培養(yǎng)的腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞(TIL)的過(guò)繼性轉(zhuǎn)移。
可以用各種方法將標(biāo)記的淋巴細(xì)胞施用于哺乳動(dòng)物，這些方法包括，如，注射、輸注、沉積、植入、口服或局部施用。優(yōu)選的方法是通過(guò)注射施用。注射可以是如靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)或腹膜內(nèi)注射。在本發(fā)明方法的某些實(shí)施方案中，步驟(d)的對(duì)哺乳動(dòng)物施用已標(biāo)記的抗原特異性T淋巴細(xì)胞可以有利地包括腹膜內(nèi)施用淋巴細(xì)胞。因此，如Phillips，C.A.等人(見(jiàn)上文)所公布的，針對(duì)瘤粘蛋白肽刺激的過(guò)繼性轉(zhuǎn)移的CTL制品的遷移模式在靜脈內(nèi)施用和腹膜內(nèi)施用時(shí)是非常不同的。
依照本發(fā)明，靜脈內(nèi)施用的CTL制品在乳癌患者中的生物分布是銦-8-羥基喹啉白細(xì)胞掃描的特征。例如，Reynolds，C.W.等人(見(jiàn)上文)教導(dǎo)，在將標(biāo)記后的LGL或T細(xì)胞靜脈內(nèi)接種入正常受試者體內(nèi)后，數(shù)分鐘內(nèi)在肺里回收到大比率放射性(18-33％)。在肺中放射性水平的下降伴隨著在脾和肝中計(jì)數(shù)的相應(yīng)增加。類似的，Chin.Y.等(見(jiàn)上文)報(bào)告了在注入后兩小時(shí)內(nèi)觀察到111In-標(biāo)記的TIL在肺中的定位，在24小時(shí)時(shí)在肺、肝和脾中觀察到高水平的放射性。72小時(shí)后在肺中的活性減少，但在轉(zhuǎn)移位點(diǎn)未觀察到111In-標(biāo)記的TIL的特異定位。最后，Swift，R.I.等人(見(jiàn)上文)報(bào)道了111In標(biāo)記的腫瘤活化殺傷(TAK)細(xì)胞在肺中早至4小時(shí)、在腹部晚至48小時(shí)時(shí)顯示出轉(zhuǎn)移的跡象，但肝成像則產(chǎn)生了相應(yīng)于轉(zhuǎn)移損傷部位的“冷”斑點(diǎn)，據(jù)推測(cè)大概是由于在正常肝組織中細(xì)胞的高背景造成的。
與靜脈內(nèi)施用各種淋巴細(xì)胞的一般發(fā)現(xiàn)形成對(duì)照的是，本發(fā)明的發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)腹膜內(nèi)注入的放射性標(biāo)記的CTL制品在首次成像時(shí)建立了一個(gè)可識(shí)別的模式，它在隨后數(shù)天內(nèi)自我改善并且對(duì)于每名患者而言都是獨(dú)一無(wú)二的。從腹膜內(nèi)移出來(lái)的運(yùn)動(dòng)是快速的，大約是1小時(shí)時(shí)出來(lái)10％，而98小時(shí)時(shí)出來(lái)大約30％。放射性標(biāo)記的CTL制品定位于已知的腫瘤(CT掃描所確定的)和先前未被確定為腫瘤轉(zhuǎn)移的腹膜內(nèi)和腹膜外區(qū)域。
因此，腹膜內(nèi)施用本發(fā)明的活化淋巴細(xì)胞特別可用于，但不局限于，諸如癌癥患者等受試者，尤其是卵巢癌患者，它們具有表達(dá)靶細(xì)胞抗原的腹膜內(nèi)組織塊，諸如表達(dá)腫瘤特異抗原的轉(zhuǎn)移性病灶。例如，可在進(jìn)行腹膜內(nèi)手術(shù)前使用本發(fā)明方法來(lái)鑒別可能由于太小而不能用其它非侵入性方式探測(cè)到的轉(zhuǎn)移性病灶，在術(shù)后、化療開(kāi)始之前的跟蹤評(píng)估期間，以及化療期間或之后，用來(lái)評(píng)估干預(yù)療法的效果和依據(jù)缺乏對(duì)殘余腫瘤塊的反應(yīng)指示對(duì)額外或不同治療方式的需求。
在本發(fā)明方法的其它實(shí)施方案中，將標(biāo)記的抗原特異性T淋巴細(xì)胞施用于所述哺乳動(dòng)物的步驟(d)包括靜脈內(nèi)施用淋巴細(xì)胞。有利地，在所述實(shí)施方案中，靜脈內(nèi)施用淋巴細(xì)胞還包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用糖綴合物的方法，從而使其與只施用淋巴細(xì)胞而不施用糖綴合物相比，淋巴細(xì)胞的運(yùn)輸情況有所改變。因此，國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US93/07834(在2003年3月14日公布為WO03/077864A2，在此全部收編作為參照)公布了將細(xì)胞導(dǎo)向于靶細(xì)胞的方法。
適用于本發(fā)明的糖綴合物通常可用通式P-(S)x-Gal表示，其中P是人血清糖蛋白的肽殘基，而S是人血清糖蛋白的糖殘基；x是從1至100的整數(shù)，而Gal是半乳糖殘基。糖綴合物可以部分或完全脫唾液酸化。特別有用的糖綴合物包括胎球蛋白、脫唾液酸胎球蛋白、血清類粘蛋白和脫唾液酸血清類粘蛋白。
糖綴合物可在相對(duì)于施用抗原特異細(xì)胞的任何時(shí)間點(diǎn)施用于哺乳動(dòng)物。它們可以在所述細(xì)胞施用之前、之后或同時(shí)施用。在典型的實(shí)施方案中，在施用所述細(xì)胞之前施用糖綴合物。糖綴合物可以通過(guò)任何合適的途徑施用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，它們可以非腸道施用，更優(yōu)選的是，經(jīng)靜脈內(nèi)施用于哺乳動(dòng)物。因此，在本發(fā)明方法中，在靜脈內(nèi)施用抗原特異性T淋巴細(xì)胞(具體而言是CD4+淋巴細(xì)胞)之前或同時(shí)施用諸如脫唾液酸血清類粘蛋白之類的脫唾液酸糖綴合物，防止這些淋巴細(xì)胞在正常的肺和肝組織中積聚。此外，在靜脈內(nèi)施用本發(fā)明的抗原特異性T淋巴細(xì)胞(具體而言是CD4+淋巴細(xì)胞)之前或同時(shí)施用諸如血清類粘蛋白之類的唾液酸糖綴合物，也可防止這些淋巴細(xì)胞在正常的肺組織中積聚，同時(shí)增強(qiáng)了細(xì)胞向肝和脾的遞送。
3.免疫原性表位和抗原在另一方面，本發(fā)明提供了檢測(cè)和定位細(xì)胞特異性抗原的方法，其中的細(xì)胞特異性抗原是腫瘤特異性抗原。有利地，所述抗原是腫瘤特異性粘蛋白，諸如人粘蛋白1(MUC-1)，而肽免疫原展示了MUC-1的表位。MUC-1(也稱MUC1)是在包括乳癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、結(jié)腸癌和卵巢癌在內(nèi)的所有腺癌的90％中會(huì)過(guò)表達(dá)的上皮粘糖蛋白。有利地，利用展示MUC-1表位的免疫原性肽的本發(fā)明方法提供了包含CD4+淋巴細(xì)胞的T淋巴細(xì)胞，所述CD4+淋巴細(xì)胞對(duì)攜帶MUC-1表位的細(xì)胞呈現(xiàn)出MHC非限制性細(xì)胞毒性。由此，Magarian-Blander等(見(jiàn)上文)論述了MUC-1上的腫瘤特異性肽表位的MHC非限制性TCR識(shí)別。此外，Wright S.E.等(見(jiàn)上文)公布了MUC1粘蛋白肽刺激了腺癌病人外周血單核細(xì)胞(PBMC)中的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)。因此，肽刺激的T細(xì)胞顯示出細(xì)胞毒性細(xì)胞的表達(dá)，這是不被非特異性刺激(抗CD3或IL-2)所誘導(dǎo)的。此外，這些作者報(bào)道了粘蛋白-肽刺激的細(xì)胞系的細(xì)胞毒性是非HLA限制性的(即MHC非限制性的)。利用提供了呈現(xiàn)出MHC非限制性細(xì)胞毒性的抗原特異性T淋巴細(xì)胞的免疫原的優(yōu)勢(shì)在于，單純這樣的免疫原就能用于本發(fā)明方法中以產(chǎn)生任何患者的抗原特異性T淋巴細(xì)胞，不管MHC背景如何均如此。
有利地，為了依照本發(fā)明將表達(dá)MUC-1的細(xì)胞進(jìn)行定位，免疫原性肽展示了MUC-1的表位，其中包含含有序列(SEQ ID NO1)PDTRP(用常規(guī)的單字母密碼表示)在內(nèi)的MUC-1序列循環(huán)排列的氨基酸序列。有利地，所述的免疫原性肽具有氨基酸序列(SEQ ID NO1)GSTAPPAHGVTSAPDTRPAP?？捎糜诒景l(fā)明的其它MUC-1免疫原性肽及其衍生物可參閱別的文獻(xiàn)，例如，頒予Agrawal等人的美國(guó)專利6,600,012，和于2002年2月5日頒予Sandrin等的美國(guó)專利6,344,203，其中公布了可包含于癌癥疫苗中并在本發(fā)明方法中用于癌癥患者的MUC1的肽模擬物或其它的癌癥肽。
還有文獻(xiàn)描述了抗原特異性MHC非限制性識(shí)別的其它例子，如Magarian-Blander，J.等人的文章及其中所引用文獻(xiàn)公布的。例如，已從類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的滑液中和用結(jié)核分枝桿菌免疫的小鼠中分離了特異于分枝桿菌抗原的MHC非限制性T細(xì)胞。還分離了MHC非限制性T細(xì)胞，其特異于諸如B細(xì)胞腫瘤上的Ig Ids、皰疹病毒糖蛋白和非肽異戊二烯基焦磷酸酯等抗原。還有文獻(xiàn)已描述了特異于諸如抗生物素蛋白和髓鞘堿性蛋白等復(fù)合蛋白以及諸如血紅蛋白的血紅素部分等非肽抗原的抗原特異性、MHC非限制性的βT細(xì)胞。還有一些研究描述了在缺乏MHC分子時(shí)能識(shí)別抗原的胂酸鹽和熒光素特異的T細(xì)胞。還產(chǎn)生了特異于來(lái)自水皰性口炎病毒核蛋白質(zhì)的糖基化肽上的碳水化合物部分的碳水化合物特異性MHC非限制性T細(xì)胞。
a.常用抗原抗原特異性II類和I類MHC限制型CD4+和CD8+T細(xì)胞反應(yīng)是對(duì)抗各種發(fā)病狀況的重要宿主免疫應(yīng)答。因此，尤其令人感興趣的是抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答的產(chǎn)生。用于本說(shuō)明書(shū)時(shí)，“抗原特異性”T細(xì)胞應(yīng)答是對(duì)諸如肽等給定抗原刺激物的T細(xì)胞反應(yīng)(增殖、細(xì)胞毒性、細(xì)胞因子分泌)，而對(duì)諸如具有不同氨基酸序列的肽(對(duì)照肽)等其它刺激物則無(wú)明顯的反應(yīng)。通過(guò)測(cè)定作為T(mén)細(xì)胞活化特征的細(xì)胞表面分子的出現(xiàn)來(lái)檢測(cè)T細(xì)胞的反應(yīng)性，所述的細(xì)胞表面分子包括，但不局限于CD25和CD69。所述測(cè)定法是本領(lǐng)域所已知的。
本發(fā)明的方法大體上可應(yīng)用于許多抗原。這些抗原幾乎可以具有任何化學(xué)組成，只要它們能引起T細(xì)胞特異性免疫應(yīng)答即可；它們可包含至少一個(gè)T細(xì)胞特異性表位。典型的抗原可以來(lái)自肽、碳水化合物、脂類，尤其是它們的組合。特別重要的抗原是肽、脂肽和糖肽。特別包括獨(dú)特型和抗獨(dú)特型抗原。
可用本發(fā)明方法非常方便的針對(duì)的抗原包括腫瘤抗原。腫瘤抗原通常是與腫瘤的存在相關(guān)的天然或外源抗原。由于腫瘤抗原可用于將異常組織與正常組織區(qū)分開(kāi)來(lái)，它們不僅可用于診斷中，還可用作治療性干預(yù)的目標(biāo)。因此，利用本發(fā)明方法產(chǎn)生針對(duì)腫瘤抗原的T細(xì)胞特異性免疫反應(yīng)是本發(fā)明的一個(gè)重要方面。
腫瘤抗原是本領(lǐng)域眾所周知的。事實(shí)上，已有數(shù)個(gè)例子被很好的表征，并且目前成為腫瘤特異性療法產(chǎn)生中尤其令人感興趣的焦點(diǎn)。除了上述的諸如MUC-1等粘蛋白之外，腫瘤抗原的非限制性例子是癌胚抗原(CEA)、前列腺特異性抗原(PSA)、黑素瘤抗原(MAGE、BAGE、GAGE)。
MUC-1粘蛋白抗原已被認(rèn)為是潛在的免疫治療靶目標(biāo)，用于產(chǎn)生針對(duì)許多腺癌的免疫力。因此，本發(fā)明的某一實(shí)施方案涉及在本發(fā)明方法中應(yīng)用能結(jié)合APC表面上的類型I和類型II分子之一或二者的“MUC-1衍生物”?！癕UC-1衍生物”通常是肽或以肽為基礎(chǔ)的，包括，但不局限于上述MUC-1肽。MUC-1衍生物可以是MUC-1蛋白的片段。這樣的片段可以被糖基化或非糖基化。依照本發(fā)明，本發(fā)明中的片段可獲自純化的MUC-1或重組DNA方法產(chǎn)生的MUC-1，所用方法包括用諸如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶等蛋白酶進(jìn)行消化。當(dāng)然，也可用重組方法直接制備MUC-1片段。此外，本發(fā)明所涵蓋的MUC-1片段可用自動(dòng)肽合成儀合成，所述合成儀例如可購(gòu)自Applid Biosystems、Multiple Peptide Systems及其它公司，或者可以用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)人工制備所述片段。參閱，Geysen等，J.Immunol.Methods 102259(1978)。適用于本發(fā)明方法中的其它MUC-1衍生物參閱Agrawal等人的文章，見(jiàn)上文。此外，核心序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸可被改變，優(yōu)選以本領(lǐng)域已知的保守方式，從而使必需的T細(xì)胞活化活性得以保持。典型的替代可以在以下氨基酸組中進(jìn)行(a)G、A、V、L和I；(b)G和P；(c)S、C、T、M；(d)F、Y和W；(e)H、K和R；和(f)D、E、N和Q。某些優(yōu)選的替代可以在以下組中進(jìn)行(i)S和T；(ii)P和G；和(iii)A、V、L和I。
如上所述，這些優(yōu)選MUC-1衍生物可以按照本領(lǐng)域已知方法糖基化或部分糖基化。此外，還預(yù)期MUC-1和MUC-1衍生物可以用大分子量聚合物修飾，諸如聚乙二醇。此外，優(yōu)選脂類修飾，因?yàn)檫@樣可促進(jìn)脂質(zhì)體對(duì)衍生物的包裹或與其相互作用?？捎糜诖四康牡拇硇灾惏?，但不局限于棕櫚酰、肉豆蔻酰、硬脂酰和癸酰基團(tuán)，或更通常的是，任何C2至C30飽和、單一不飽和或多不飽和的脂?；?。同樣適用于本發(fā)明的例證性MUC-1衍生物是非肽“模擬物”，即模擬MUC-1蛋白的一種或多種功能特性的化合物。模擬物一般是水溶性的、抗蛋白水解和非免疫原性的。可依照已知方法產(chǎn)生模擬MUC-1的構(gòu)象限制性環(huán)式有機(jī)肽，參閱，例如，Saragovi等，Science 253792(1991)。“MUC-1碳水化合物衍生物”也是預(yù)期的。這樣的衍生物用于此處時(shí)，指保持MUC-1衍生物的免疫刺激特性的糖肽。這樣的碳水化合物衍生物可以包括附著于MUC-1蛋白的所有或部分碳水化合物。還可使用模擬MUC-1碳水化合物的至少一種特性的模擬物。
技術(shù)熟練人員將認(rèn)識(shí)到，其它抗原也可用于產(chǎn)生活化的T細(xì)胞。所述抗原的例子包括，但不局限于非自我(外源)肽抗原和來(lái)自病毒、腫瘤、細(xì)菌或其它寄生蟲(chóng)的肽抗原。
b.其它有用抗原的鑒定盡管可用已知檢測(cè)各種T細(xì)胞反應(yīng)的方法鑒定可用于本發(fā)明方法中的整個(gè)抗原，但令人感興趣的還是產(chǎn)生與具體表位相關(guān)的更特異的反應(yīng)。這種方法可以使用小得多、因此也能更經(jīng)濟(jì)地產(chǎn)生的抗原性刺激。因此，優(yōu)選的抗原是小分子，一般是肽或肽衍生物，小于約100個(gè)氨基酸，常常小于約60個(gè)氨基酸。
依照本領(lǐng)域已知的方法，一旦天然的(大的)抗原已被鑒定出來(lái)，它的抗原性可被進(jìn)一步精確至一個(gè)或幾個(gè)特異表位。一種典型的方法涉及將大抗原經(jīng)蛋白水解處理后得到較小的抗原。此外，蛋白質(zhì)抗原的片段可通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生，并經(jīng)檢測(cè)而確定具體的表位。此外，小肽可用體外合成方法產(chǎn)生并加以檢測(cè)。制備完整抗原的一部分并對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)的隨機(jī)方案中的一種可選擇方法可以是應(yīng)用與生物學(xué)更有關(guān)系的方法。具體地，因?yàn)榻Y(jié)合MHCI類和/或II類分子的抗原性片段特別重要，一個(gè)典型的方法是分離MHC分子自身，然后分離與它們相關(guān)的肽。一般而言，這種方法對(duì)于進(jìn)一步確定腫瘤抗原中特別有用的表位非常有效。
在典型的方法中，提供了表達(dá)目的抗原的原發(fā)性腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞系。此外，還可認(rèn)識(shí)到，諸如巨噬細(xì)胞等吞噬性抗原呈遞細(xì)胞(或任何APC)可被供給大抗原(或其一部分)并因此用作這些方法的起始材料。可用已知方法從這些起始細(xì)胞中分離MHCI類和II類分子，諸如抗體親和(MHC-特異性抗體)和色譜技術(shù)。然后對(duì)分離得到的MHC分子進(jìn)行處理，釋放被結(jié)合的肽。這可以通過(guò)用破壞結(jié)合肽與MHC分子間相互作用的試劑處理來(lái)完成，例如去污劑、脲、鹽酸胍、二價(jià)陽(yáng)離子、各種鹽和極端pH。所釋放的肽可用常規(guī)的色譜和抗體親和(用抗原特異性抗體)方法進(jìn)行進(jìn)一步的純化。然后可以用例如肽測(cè)序、氣相色譜和/或質(zhì)譜對(duì)純化后的肽進(jìn)行測(cè)序和結(jié)構(gòu)測(cè)定。以此方式可以確定最普遍的與I類和/或II類分子相關(guān)的肽表位的序列/結(jié)構(gòu)。通過(guò)提供這種序列/結(jié)構(gòu)信息，可以如上所述對(duì)確定的序列進(jìn)行置換以及用已知的T細(xì)胞檢測(cè)法進(jìn)行檢測(cè)。
4.細(xì)胞標(biāo)記和成像用于檢測(cè)本發(fā)明的淋巴細(xì)胞的標(biāo)記物可以是本領(lǐng)域已知用于檢測(cè)哺乳動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞的任何標(biāo)記物。方便的，銦-11，通常是以銦-8-羥基喹啉的形式，可用于通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知且此處引用文獻(xiàn)所描述的常規(guī)方法直接標(biāo)記淋巴細(xì)胞。不過(guò)，還可使用已知用于哺乳動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞成像的各種其它放射性標(biāo)記為基礎(chǔ)的方法，諸如Anders，G.T.等人所述(見(jiàn)上文)的通過(guò)SPECT進(jìn)行鎵-67檢測(cè)；Korf，J.等人所述(見(jiàn)上文)的用PET或SPECT進(jìn)行二價(jià)鈷檢測(cè)；或用(氨基苯乙烯基)吡啶鎓化合物對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行放射性標(biāo)記，例如放射性同位素碘，即123I、125I或131I；或如Lambert等人所述(見(jiàn)上文)所述含諸如111In或99mTc等金屬放射性同位素一個(gè)當(dāng)量的螯合基團(tuán)，通過(guò)多聚羧酸螯合。
或者，如Rubin等人所述(見(jiàn)上文)，用于本發(fā)明方法的活化T細(xì)胞可以通過(guò)用特異結(jié)合該活化T細(xì)胞的標(biāo)記配體進(jìn)行間接標(biāo)記，其中或者被標(biāo)記的配體能特異地與施用于哺乳動(dòng)物的淋巴細(xì)胞相互作用，以便被標(biāo)記的配體在體內(nèi)與淋巴細(xì)胞相互作用，產(chǎn)生標(biāo)記的淋巴細(xì)胞，或者使被標(biāo)記的配體在體外與淋巴細(xì)胞接觸并將產(chǎn)生的標(biāo)記淋巴細(xì)胞施用于哺乳動(dòng)物。在被標(biāo)記配體上的標(biāo)記物可以是，例如，γ輻射源，如銦-111、锝-99m、锝-99或碘-123；正電子放射體，如氟-18、碳-11或碘-124；磁性材料，如釓、超順磁性物質(zhì)或水合氧化鐵顆?；蛞悦芏葹榛A(chǔ)的反差材料。
用成像技術(shù)測(cè)定體內(nèi)被標(biāo)記淋巴細(xì)胞的分布。成像技術(shù)是指用非侵入性的方式檢測(cè)體內(nèi)標(biāo)記物的分布。用于本發(fā)明方法中的成像技術(shù)可選自放射成像、磁共振成像、正電子發(fā)射斷層掃描和X-射線計(jì)算機(jī)斷層成像，當(dāng)然，這取決于標(biāo)記物的特性。此外，成像由單一掃描或系列掃描組成，可以是哺乳動(dòng)物的整體或部分掃描。有利地，本發(fā)明方法中所用的成像包括哺乳動(dòng)物的整體掃描，尤其是111In標(biāo)記的淋巴細(xì)胞的SPECT成像。
優(yōu)選的，施用于哺乳動(dòng)物的已標(biāo)記淋巴細(xì)胞的劑量大約相當(dāng)于約50-75立方厘米受試者全血中存在的淋巴細(xì)胞量，從而施用合適量的放射性。放射性的量取決于所用同位素并且可由本領(lǐng)域技術(shù)人員無(wú)需過(guò)多的試驗(yàn)即可測(cè)定。例如，通常優(yōu)選使用約1.5至約3.0mCi/劑的銦-111，約10至約30mCi/劑的锝-99，約5至約10mCi/劑的碘-123，約5至約10mCi/劑的碘-124，約10至約20mCi/劑的氟-18和約20至約30mCi/劑的碳-11。在某些實(shí)施方案中，可以多次施用標(biāo)記好的淋巴細(xì)胞。
在某些實(shí)施方案中，成像包括至少兩次分開(kāi)的掃描，其中每一次獨(dú)立的掃描可選自放射成像、磁共振成像(MRI)、正電子發(fā)射斷層掃描(PET)和X-射線計(jì)算機(jī)斷層(CT)成像。有利地，在所述實(shí)施方案中可以將獲自兩個(gè)或多個(gè)分開(kāi)掃描的成像數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，例如，通過(guò)將來(lái)自多重掃描的數(shù)據(jù)融合成單一的展示圖像而比較。例如，于1988年4月5日頒予Goldenberg的美國(guó)專利申請(qǐng)4,735,210公布了淋巴系造影和器官成像方法和試劑盒，尤其是用于淋巴系閃爍造影或磁共振淋巴系造影術(shù)的改進(jìn)方法，它包括從特異性抗體成像劑產(chǎn)生的陽(yáng)性圖像中扣除用總成像劑產(chǎn)生的陰性圖像。
最近，于2002年12月3日頒予Townsend等人的美國(guó)專利6,490,476闡述了組合的PET和X-射線CT斷層照相機(jī)以及利用它們?cè)趩我谎b置中順序獲得CT和PET圖像的方法，克服了由于內(nèi)部器官運(yùn)動(dòng)、掃描儀基線的變化和掃描患者的定位所造成的比對(duì)問(wèn)題。X線體層照相機(jī)攝取了精確地共同記錄的實(shí)用解剖學(xué)圖像，無(wú)需使用外部標(biāo)記或內(nèi)部標(biāo)志。
施用標(biāo)記好的淋巴細(xì)胞后進(jìn)行掃描的時(shí)間選擇可以是數(shù)分鐘、數(shù)小時(shí)、數(shù)天、數(shù)周或數(shù)月。具體的時(shí)間選擇取決于許多因素，包括，如標(biāo)記物的類型、標(biāo)記物的量、淋巴細(xì)胞的狀態(tài)及疾病狀況。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)用這些因素以及常規(guī)的實(shí)驗(yàn)就可確定掃描時(shí)間。
5.本發(fā)明方法的應(yīng)用除了上述的特殊應(yīng)用之外，本發(fā)明方法可用于診斷哺乳動(dòng)物中疾病的發(fā)展程度，其中疾病的發(fā)展可以通過(guò)細(xì)胞或病原體特異性抗原分布的改變來(lái)確定。例如，所述疾病可以是病毒感染，如HIV感染，或其它傳染??；自體免疫疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、炎性腸疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡或牛皮癬；惡性腫瘤，如骨髓瘤、淋巴瘤、白血病或?qū)嶓w瘤，包括上述腫瘤。所述方法可以用于如下哺乳動(dòng)物，所述哺乳動(dòng)物具有可被這種疾病中表達(dá)的所涉及細(xì)胞或病原體特異性抗原的免疫原性肽表位激活的淋巴細(xì)胞。將已標(biāo)記淋巴細(xì)胞的分布或運(yùn)輸模式與不同時(shí)間產(chǎn)生于同一哺乳動(dòng)物中或產(chǎn)生于未患病哺乳動(dòng)物中的標(biāo)準(zhǔn)情況相比，從而診斷疾病的發(fā)展情況。本發(fā)明對(duì)免疫調(diào)控療法可能有用的疾病特別有效，包括用本發(fā)明方法的活化T淋巴細(xì)胞進(jìn)行的過(guò)繼性免疫療法。
本發(fā)明的另一方面是監(jiān)測(cè)患病哺乳動(dòng)物中對(duì)治療方法的反應(yīng)的方法。通過(guò)成像技術(shù)測(cè)定所述療法是否改變了活化的抗原特異性淋巴細(xì)胞的分布或運(yùn)輸模式來(lái)監(jiān)測(cè)哺乳動(dòng)物對(duì)治療步驟的反應(yīng)。
本發(fā)明的另一發(fā)明是用于鑒定可用于治療患病哺乳動(dòng)物的試劑的方法，如HIV感染、自身免疫疾病、傳染病或惡性腫瘤，這可通過(guò)成像測(cè)定所述試劑是否改變了活化的抗原特異性淋巴細(xì)胞的分布或運(yùn)輸模式來(lái)實(shí)現(xiàn)。
實(shí)施例1激活并收獲活化T淋巴細(xì)胞的臨床步驟產(chǎn)生CTL的標(biāo)準(zhǔn)操作步驟第0天從Coffee血液中心接收患者的單采袋(aphoresis bag)和名字標(biāo)簽以及特大片標(biāo)簽密封的管中包含的樣品。將它釋放到旋鈕帽小瓶中用于在HCC上進(jìn)行CBC(完全細(xì)胞計(jì)數(shù))。單采袋的體積被注明。將患者的標(biāo)簽貼到培養(yǎng)袋上并標(biāo)記為試驗(yàn)編號(hào)-患者編號(hào)-單采袋4。各個(gè)患者的記錄本以第一次單采(aphoresis)開(kāi)始。實(shí)驗(yàn)室中得到的所有有關(guān)數(shù)據(jù)、信息和結(jié)果都記錄在此本上。
將足夠的AIM-V培養(yǎng)基保溫于37℃2-3升水浴中。使用otily新鮮未開(kāi)啟的瓶子。一旦打開(kāi)，那個(gè)瓶子就指定只給那名患者用。為了方便從單采袋中取出單采產(chǎn)物，從1000ml中減去單采袋的體積，并將如此體積的AIM-V轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)袋中。
通過(guò)固定具Luer鎖緊接口的60ml注射器至培養(yǎng)袋的適當(dāng)端口，將AIM-V培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)袋中。所有其它的端口都被關(guān)閉。然后用轉(zhuǎn)移管刺入單采袋和培養(yǎng)袋中將單采袋的溶液倒空入培養(yǎng)袋中。用SEBRA熱密封儀將最接近培養(yǎng)袋的管密封4次。在第三次密封條內(nèi)將管從培養(yǎng)袋上切下。
用來(lái)自CRC的WBC計(jì)數(shù)作為細(xì)胞/mi的數(shù)目并乘以單采袋的體積，確定單采袋中的總細(xì)胞數(shù)。將此數(shù)目除以1000ml得到(培養(yǎng)袋中的細(xì)胞濃度)。培養(yǎng)袋的最大體積是2000ml。因?yàn)榧?xì)胞的預(yù)期起始數(shù)目是2×10^個(gè)細(xì)胞/ml，所以所需細(xì)胞的最大數(shù)目是4000×10(4×10^09)。如果袋中的細(xì)胞總數(shù)不超過(guò)4×109，那么就不用去掉任何細(xì)胞，如果袋中的細(xì)胞總數(shù)超過(guò)4×10^9，那么就需要去掉適當(dāng)體積(去掉(袋中細(xì)胞總數(shù)-4×109個(gè)細(xì)胞)的細(xì)胞)。用(待去除的細(xì)胞數(shù))除以(培養(yǎng)袋中的細(xì)胞濃度)以確定待丟棄的體積。
如果開(kāi)始時(shí)無(wú)需去掉細(xì)胞用60ml的Luer鎖緊接口注射器將AM培養(yǎng)基放到培養(yǎng)袋中，將其柱塞拿走并輕輕的置換一個(gè)柱塞，系到合適的袋端口上。如果待加入的體積超過(guò)1升，可以將整瓶AIM-V灌注入注射器(這時(shí)用作漏斗)，小心操作以免溢出。如果待加入體積小于1升，可以用無(wú)菌的單獨(dú)包裝的50ml移液管將培養(yǎng)基從瓶中轉(zhuǎn)移至注射器/漏斗中。從一側(cè)到另一側(cè)，從前向后輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)袋，周期性的混合內(nèi)含物。
將一60ml Luer鎖緊接口注射器附著到合適的端口上，它的柱塞處于原位。從一側(cè)到另一側(cè)，從前向后輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)袋，混合內(nèi)含物。將注射器柱塞拉起從而將細(xì)胞懸浮液抽到注射器里，然后再推下去，混合細(xì)胞。重復(fù)1-2次使其在注射器中充分混合。在第二或第三次解凍后，使液體水平到達(dá)注射器上45ml標(biāo)線處。將端口從注射器上拔下，提到高于袋的水平并關(guān)緊。將注射器中的懸浮液放置入50ml的管中，將管口關(guān)上。將培養(yǎng)袋端口再附著于注射器上，重復(fù)上述過(guò)程，直至所需體積被放掉。需要的50ml管的數(shù)目取決于待放掉的體積。這些細(xì)胞將凍存在小管中或散裝供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，用于將來(lái)的培養(yǎng)袋中。
這時(shí)，樣品必須從培養(yǎng)袋中取出，得到0天的細(xì)胞和上清液樣品，供稍后的細(xì)胞毒性和細(xì)胞因子測(cè)定。通常，取出40×106個(gè)細(xì)胞。若濃度為2×106個(gè)細(xì)胞/ml，這就大約有20ml。當(dāng)過(guò)量的細(xì)胞被去掉后，可以以同樣的方式取出此樣品，包括輕輕的搖動(dòng)袋子使其混合。用30ml的注射器替代60ml注射器。將取出的細(xì)胞放到50ml管中。將它們?cè)?00g(1200rpm)旋轉(zhuǎn)10分鐘。保留6ml上清液并等分至1ml無(wú)菌的標(biāo)記小管中，凍存于-20℃。丟棄殘余的上清液。將細(xì)胞以10×106個(gè)細(xì)胞/ml的終濃度重懸于4ml冷凍培養(yǎng)基(胎牛血清+10％二甲亞砜)中。在3個(gè)無(wú)菌的被標(biāo)記細(xì)胞凍存管中各加入1ml此溶液。將1ml冷凍培養(yǎng)基加入殘余的1ml細(xì)胞懸浮液中達(dá)到5×106個(gè)細(xì)胞/ml的濃度，在2個(gè)無(wú)菌的被標(biāo)記細(xì)胞凍存管中各加入1ml此溶液。每次都將內(nèi)有泡沫聚苯乙烯架子的泡沫聚苯乙烯盒保存在-85℃冷柜中。所有細(xì)胞凍存管都將放入此容器中直至第二天被放置到-135℃的冰箱中。將這些小管的位置(冷柜的架子、盒子和位置)以試驗(yàn)編號(hào)-患者編號(hào)-單采編號(hào).日期、保溫的天、細(xì)胞編號(hào)、體積和帽子顏色(如果需要)的形式寫(xiě)在3×5的卡片上。這些卡片保存在臨床試驗(yàn)詳細(xì)目錄盒中。
這時(shí)將“粘蛋白”肽和白介素-2(IL-2)加入此袋中因?yàn)樗鼈兊募尤肓慷既Q于袋的體積，所以要在患者的記錄本中仔細(xì)記下放掉或加入的ml數(shù)。袋中“粘蛋白”濃度是1μg/ml。“粘蛋白”貯液是1μg/μl，因此加入袋中的微升數(shù)等于袋中的毫升數(shù)。袋中的1-2細(xì)胞因子濃度是100IU/ml。因?yàn)镮L-2的貯液濃度可以變化，所以所需IU的總數(shù)必須通過(guò)乘以袋體積(毫升數(shù))×100IU/ml來(lái)確定。然后將這一總IU數(shù)除以貯液濃度得到需要的微升數(shù)。二者都可用注射器作為漏斗以相同的方式加入?？梢允褂?.5或10ml的注射器。在附著于袋口上之前先去掉柱塞，用分開(kāi)的獨(dú)立包裝的無(wú)菌微型移液頭在注射器中盡可能深的加入“粘蛋白”和IL-2。用2ml新鮮AIM-V培養(yǎng)基漂洗注射器和管袋。將這2ml加入袋體積總數(shù)中。
如前所述，通過(guò)從一側(cè)到另一側(cè)和從前向后的搖動(dòng)輕輕混合袋中溶液。然后放入37℃的5％CO2培養(yǎng)箱中。
第三天在將樣品從袋中取出之前，輕輕搖動(dòng)袋子使其混勻。用10ml的注射器，在吸推數(shù)次后使注射器的水平達(dá)到1ml標(biāo)線處。提高袋口并關(guān)緊后，可將樣品放入未消毒小管中進(jìn)行CBC測(cè)定，然后丟棄。如果濃度高于2×106個(gè)細(xì)胞/ml，應(yīng)加入培養(yǎng)基使?jié)舛认陆怠Ｈ缓髴?yīng)象第0天一樣，移出40×106個(gè)細(xì)胞并凍存以供稍后的測(cè)定。象第0天一樣，將6ml上清液等分成1ml/小管并凍存于-20℃中。應(yīng)記錄添加或移走的體積。以前述的相同方式加入IL-2，確定需要的總IU并除以貯液濃度。
第7天象第3天一樣，從袋中放出1ml供CRC。測(cè)定細(xì)胞濃度并加入任何培養(yǎng)基。在這一天移走無(wú)菌樣品(13ml)。如第0天一樣添加“粘蛋白”肽和IL-2，包括袋體積的任何添加/減少。
無(wú)菌性將13ml分成兩部分，8ml和5ml。將5ml細(xì)胞和上清液放入Micro Test，Inc.M4-RT管(Multi Micro Media)中。標(biāo)上試驗(yàn)編號(hào)-患者編號(hào)-單采編號(hào)和日期。放入提供的生物危害袋的拉鏈口袋中，黃色的部分放入后面的口袋中。將此袋子拿到HCC處，通過(guò)快遞連夜運(yùn)到專業(yè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行PCR支原體檢測(cè)。結(jié)果記在患者的記錄本中。
將8ml等分試樣在400g(1200rpm)旋轉(zhuǎn)10分鐘。將上清液輕輕倒入標(biāo)記了試驗(yàn)編號(hào)-患者編號(hào)-單采編號(hào)的無(wú)菌管中。移去2ml至獨(dú)立的無(wú)菌管中(用HARDY Diagnostics TSB和Fluid Thioglycollate管)。將管中的殘余物冷包裝后放入泡沫聚苯乙烯盒子中。復(fù)印必要的表格，放入塑料拉鏈袋中并與樣品一起密封。將盒子連夜空運(yùn)至Biowittaker進(jìn)行內(nèi)毒素水平的LAL測(cè)定。結(jié)果記錄在患者的記錄本上。
在2ml事先移走的上清液中，將1ml無(wú)氧接種至標(biāo)記的TSB和FluidThioglycollate管各一個(gè)中。通過(guò)將充滿了1ml樣品的移液管小心地置于每一管的底部來(lái)完成此項(xiàng)工作。將移液管內(nèi)的樣品輕輕的推出到管底。小心的抽出移液管以防止在流體中引入任何氣泡，將管關(guān)緊。在每一組中都將一個(gè)未接種管象其它管一樣標(biāo)記。然后將FluidThioglycollate管放入34℃培養(yǎng)箱中，將帽子松開(kāi)。將TSB管放入保持于室溫的盒子中。保溫3、7和14天后檢查所述的小管?；鞚岬嫩E象表明細(xì)菌生長(zhǎng)。結(jié)果記錄在患者的記錄本上。
第8天在袋中混合后，如第0天一樣，取出足夠的體積，從而提供足夠的細(xì)胞和上清液用于細(xì)胞毒性和細(xì)胞因子測(cè)定以及凍存樣品(40×106)。同樣將1ml放入無(wú)菌管中，拿到BSA中進(jìn)行革蘭氏染色，通過(guò)患者標(biāo)簽進(jìn)行標(biāo)識(shí)。前一天(第7天)的細(xì)胞計(jì)數(shù)可用于確定需放出的總細(xì)胞數(shù)和體積。通常需要1×106個(gè)細(xì)胞進(jìn)行XTT和Almar Blue細(xì)胞毒性測(cè)定。通常將細(xì)胞在400g(1200rpm)離心10分鐘，并將至少6ml上清液等分入6個(gè)小管中，1ml/管。盡早開(kāi)始細(xì)胞毒性測(cè)定。(參閱XTT和Alamar Blue步驟)。盡早進(jìn)行細(xì)胞因子檢測(cè)(通常是g-IFN和IL-10)。(參閱細(xì)胞因子步驟)。細(xì)胞因子的測(cè)定結(jié)果應(yīng)在6小時(shí)內(nèi)獲得，從而可以確定輸注標(biāo)準(zhǔn)。
輸注校準(zhǔn)第8天的樣品比第0天的樣品在統(tǒng)計(jì)學(xué)上每一輪細(xì)胞因子測(cè)定的結(jié)果都有顯著的增加，這足以證明，只要革蘭氏染色的結(jié)果是陰性的，就可以產(chǎn)生和輸注CTL。如果各細(xì)胞因子測(cè)定結(jié)果都沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的增長(zhǎng)，那么注射將延遲至次日編輯XTT的結(jié)果。將測(cè)定數(shù)據(jù)提供給Stephen Wright博士鑒定/核準(zhǔn)。盡快接觸Nancy Blade以確定輸注的時(shí)間。收獲和制備細(xì)胞(見(jiàn)收獲步驟)需要2-3小時(shí)。
收獲CTL的標(biāo)準(zhǔn)操作步驟一旦開(kāi)始收獲，全部時(shí)間內(nèi)實(shí)驗(yàn)室中都要留一個(gè)人。
1)在收獲表格上記錄所有溶液的批號(hào)和過(guò)期日期。除非另外說(shuō)明，否則所有步驟都在層流凈化罩內(nèi)進(jìn)行。所有用過(guò)的物品都丟棄至生物危害廢料袋中。
2)在支持夾中放一5ml注射器。從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)袋并從左右前后輕輕搖動(dòng)混合。用酒精棉擦拭袋口/帽。將帽取下放在酒精棉上，將端口與注射器連接。松開(kāi)管夾并調(diào)整管道使由夾子造成的壓力減輕。
a)緩慢拉動(dòng)柱塞將細(xì)胞懸浮液抽到注射器中直至抽滿注射器的體積。緩慢壓柱塞使懸浮液回到袋中。重復(fù)兩次。
b)將柱塞再輕輕拉起，放到2ml刻度處。
c)使袋子與注射器分離；提起袋口使液體回流入袋，然后重新蓋上袋口。擰緊管道夾。
d)用注射器將1ml樣品放入無(wú)菌小管中，拿到BSA微生物實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行革蘭氏染色。在將細(xì)胞重新輸入患者體內(nèi)之前，必須通過(guò)口頭得到革蘭氏染色“未觀察到生物體”的結(jié)果。雙方都會(huì)聽(tīng)到并理解這一信息，然后記錄在收獲表格上。
e)將剩余的1ml樣品分配入微量離心管中準(zhǔn)備拿到Harrington癌癥中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行CBC測(cè)定。
f)從支持夾上取下5ml的注射器并丟棄到廢物袋中。
3)通過(guò)患者身體表面積確定待收獲細(xì)胞的數(shù)目1-4×108個(gè)細(xì)胞/m2。通過(guò)以下方法從袋中取出需要數(shù)目的細(xì)胞a)確定需要從袋中取出的體積(用所需細(xì)胞數(shù)除以袋中每ml的細(xì)胞數(shù)(獲自CBC測(cè)定))。
b)將60ml注射器放到支持夾中。如前所述，輕輕混勻袋子并用一低架子或盒子使標(biāo)簽向上。
c)用酒精棉擦拭袋帽/部分。如前所述，取下帽子并將端口附著于注射器上。松開(kāi)管道夾，調(diào)節(jié)管道以減輕壓力。每次在管道的不同部分固定夾子使管道得以“恢復(fù)”。
d)如前所述，將細(xì)胞懸浮液抽到注射器中(3次)。最后一次抽上來(lái)后再下降到45ml刻度處。
e)袋口分離、提起并蓋帽。關(guān)閉管道夾。
f)將細(xì)胞懸浮液分配到無(wú)菌50ml管中并蓋緊管帽。
g)按需要重復(fù)步驟“c)”，以吸出適當(dāng)量的細(xì)胞懸浮液。
4)將培養(yǎng)袋放回培養(yǎng)箱中。
5)在離心機(jī)臺(tái)上平衡所有的管。如果需要可以用一平衡管。1200rpm(400xg)旋轉(zhuǎn)11分鐘。開(kāi)啟制動(dòng)器。
6)當(dāng)細(xì)胞進(jìn)行離心時(shí)a)用注射器/針頭將25ml 25％的v/v清蛋白轉(zhuǎn)移到輸注袋中，保證在注射前后用酒精擦拭所有的連接處。
b)用注射器/針頭或“管道”裝置將約250ml 0.9％的NaCl轉(zhuǎn)移入無(wú)菌瓶或搖瓶中，保證在注射前后擦拭所有的連接處。用注射器/針頭將50ml NaCl轉(zhuǎn)移到注射袋中，保證在注射前后用酒精擦拭所有的連接處。
7)離心停止后，小心的從機(jī)器中取出離心管并放回層流凈化罩中。
8)用真空/抽氣系統(tǒng)吸出上清液。真空搖瓶中放入了100ml“漂白劑”。
a)將一無(wú)菌玻璃巴斯德移液管附著到抽氣搖瓶管上。
b)小心操作，因?yàn)槌恋硎侨彳浀?。保持管道豎立，吸出上清液放到管子的錐形底中，在底部留下數(shù)毫升。
c)吸完所有的管后，將漂白劑從一分開(kāi)的小瓶中抽到移液器中，以便清潔移液器和管道，9)每個(gè)管中都有細(xì)胞沉淀，且所有這些沉淀都必須放到一個(gè)管中。
a)將25ml AIM-V培養(yǎng)基加入第一個(gè)管中，并通過(guò)將培養(yǎng)基放到沉淀頂端而將沉淀輕輕的重懸起來(lái)。分完所有的培養(yǎng)基后，吸入移液管中然后再釋放。重復(fù)此操作直至沉淀完全打開(kāi)。
b)細(xì)胞沉淀被破壞后，吸上25ml細(xì)胞懸浮液并加入下一個(gè)管中。用這25ml在所有的管中重復(fù)重懸過(guò)程。
c)用10ml新鮮AIM-V培養(yǎng)基漂洗所有的管并將洗下的溶液加到先前的25ml細(xì)胞懸浮液中。
10)平衡離心管并在1200rpm(400g)離心11分鐘。打開(kāi)制動(dòng)器。
11)離心停止后，吸出上清液。
12)通過(guò)在25ml 0.9％NaCl中重懸細(xì)胞沉淀而將細(xì)胞漂洗一次。
13)平衡離心管并在1200rpm(400g)離心11分鐘。打開(kāi)制動(dòng)器。
14)吸出上清。重懸細(xì)胞沉淀在25ml 0.9％NaCl中。將細(xì)胞懸浮液吸入30ml注射器/針頭中并注入注射袋中，保證在之前和之后用酒精擦拭所有的連接處。
15)將另一25ml 0.9％NaCl加入管中漂洗側(cè)壁和底部。一旦小管漂洗好后，用30ml的注射器/針頭抽去漂洗液并注射入灌注袋中，保證在之前和之后用酒精擦拭所有的連接處。
16)通過(guò)傾斜灌注袋輕輕混合內(nèi)含物。
17)貼上標(biāo)簽，上面標(biāo)示了患者姓名、細(xì)胞數(shù)目、袋中的液體量和針對(duì)患者的方案以及單采數(shù)目。
18)然后將灌注袋送到Harrington癌癥中心交給負(fù)責(zé)我們的患者的護(hù)士。實(shí)驗(yàn)員和護(hù)士都要簽署追蹤表。將一份拷貝提供給Nancy Blades，原件放在患者的實(shí)驗(yàn)室記錄本中。
本說(shuō)明書(shū)中所提及的所有出版物、專利、專利申請(qǐng)和其它文件都指示了本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員的技術(shù)水平。出于所有目的，在此全文收編所有出版物、專利、專利申請(qǐng)和其它文件作為參考，其中各單獨(dú)的出版物、專利、專利申請(qǐng)或其它文件均具體地并個(gè)別地全文引入本文作為出于所有目的的參考。使用副標(biāo)題只是為了方便回顧所述的文件，而并非以任何方式限制了這些文件的內(nèi)容。
盡管已通過(guò)例證和實(shí)施例的方式對(duì)前述發(fā)明進(jìn)行了相當(dāng)詳細(xì)的描述以達(dá)到透徹理解的目的，顯而易見(jiàn)可以在所附權(quán)利要求范圍內(nèi)進(jìn)行某些改變和修飾。
權(quán)利要求
1.在哺乳動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)和定位細(xì)胞特異性抗原的方法，包括以下步驟a)從所述哺乳動(dòng)物獲取外周血單核細(xì)胞，b)在使所述外周血單核細(xì)胞中的T淋巴細(xì)胞經(jīng)歷抗原特異性活化的條件下，將外周血單核細(xì)胞暴露于呈現(xiàn)所述細(xì)胞特異性抗原之免疫原性表位的肽的肽，從而產(chǎn)生結(jié)合所述細(xì)胞特異性抗原的抗原特異性T淋巴細(xì)胞；c)用成像可探測(cè)的標(biāo)記物標(biāo)記所述抗原特異性T淋巴細(xì)胞，從而產(chǎn)生標(biāo)記的抗原特異性T淋巴細(xì)胞；d)將所述標(biāo)記的抗原特異性T淋巴細(xì)胞施用于哺乳動(dòng)物，并e)通過(guò)成像測(cè)定所述標(biāo)記的抗原特異性T淋巴細(xì)胞在所述哺乳動(dòng)物中的分布，從而在哺乳動(dòng)物中檢測(cè)并定位該細(xì)胞特異性抗原。
2.權(quán)利要求1的方法，其中將所述外周血單核細(xì)胞暴露于所述肽的步驟(b)是在白介素-2(IL-2)存在的條件下進(jìn)行的。
3.權(quán)利要求1的方法，其中將所述外周血單核細(xì)胞暴露于所述肽的步驟(b)是在進(jìn)行將所述標(biāo)記的抗原特異性T淋巴細(xì)胞施用于所述哺乳動(dòng)物的步驟(d)之前將所述肽的無(wú)細(xì)胞制劑添加至所述外周血單核細(xì)胞中、而不添加額外細(xì)胞至所述外周血單核細(xì)胞中的情況下進(jìn)行的。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗原特異性T淋巴細(xì)胞對(duì)表達(dá)所述細(xì)胞特異性抗原的細(xì)胞具有溶細(xì)胞性。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗原特異性T淋巴細(xì)胞包括CD4+淋巴細(xì)胞。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗原特異性T淋巴細(xì)胞包括CD8+淋巴細(xì)胞。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗原特異性T淋巴細(xì)胞包括CD45RO+記憶型T細(xì)胞。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗原特異性T淋巴細(xì)胞包括可忽略量的天然殺傷(NK)細(xì)胞。
9.權(quán)利要求1的方法，其中對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用所述標(biāo)記的抗原特異性T淋巴細(xì)胞的步驟(d)是在測(cè)定哺乳動(dòng)物中所述被標(biāo)記的抗原特異性T淋巴細(xì)胞的分布的步驟(e)之前，不與所述T淋巴細(xì)胞一起或施用所述T淋巴細(xì)胞之后對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用IL-2的情況下進(jìn)行的。
10.權(quán)利要求1的方法，其中施用所述標(biāo)記的抗原特異性T淋巴細(xì)胞至所述哺乳動(dòng)物的步驟(d)包括腹膜內(nèi)施用所述淋巴細(xì)胞。
11.權(quán)利要求1的方法，其中施用所述標(biāo)記的抗原特異性T淋巴細(xì)胞至所述哺乳動(dòng)物的步驟(d)包括靜脈內(nèi)施用所述淋巴細(xì)胞。
12.權(quán)利要求11的方法，其中靜脈內(nèi)施用所述淋巴細(xì)胞包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用糖綴合物，從而使所述淋巴細(xì)胞的所述運(yùn)輸情況與對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用所述淋巴細(xì)胞、但不施用所述糖綴合物時(shí)產(chǎn)生的淋巴細(xì)胞運(yùn)輸情況相比有所改變。
13.權(quán)利要求11的方法，其中施用糖綴合物包括施用脫唾液酸血清類粘蛋白。
14.權(quán)利要求11的方法，其中施用糖綴合物包括施用血清類粘蛋白。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞特異性抗原是腫瘤特異性抗原。
16.權(quán)利要求10的方法，其中所述肽展示人粘蛋白1(MUC-1)的表位。
17.權(quán)利要求11的方法，其中所述抗原特異性T淋巴細(xì)胞包括對(duì)攜帶所述MUC-1的表位的細(xì)胞呈現(xiàn)出MHC非限制性細(xì)胞毒性的CD4+淋巴細(xì)胞。
18.權(quán)利要求12的方法，其中所述展示MUC-1表位的肽包含包括序列PDTRP的MUC-1序列循環(huán)排列(permutations)的氨基酸序列。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述肽具有氨基酸序列GSTAPPAHGVTSAPDTRPAP。
20.權(quán)利要求1的方法，其中所述標(biāo)記選自由γ輻射源、正電子輻射源、磁性材料、基于密度的反差材料及其混合物組成的組。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述標(biāo)記是選自下組的γ輻射源銦-111、锝-99m、锝-99、碘-123及其混合物。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述標(biāo)記是銦-111。
23.權(quán)利要求1的方法，其中所述成像選自由放射成像、磁共振成像、正電子發(fā)射斷層攝影成像和X-射線計(jì)算機(jī)斷層攝影成像組成的組。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述成像選自單次掃描和系列掃描。
25.權(quán)利要求23的方法，其中所述成像包括所述哺乳動(dòng)物的整體掃描。
26.權(quán)利要求23的方法，其中所述成像包括至少兩次分開(kāi)的掃描，其中每次所述分開(kāi)掃描選自由正電子發(fā)射斷層攝影成像和X-射線計(jì)算機(jī)斷層攝影成像組成的組。
27.權(quán)利要求26的方法，其中對(duì)獲自兩次或多次分開(kāi)掃描的成像資料進(jìn)行比較。
28.權(quán)利要求26的方法，其中將獲自兩次或多次分開(kāi)掃描的成像資料匯合成單個(gè)的顯示圖像。
全文摘要
本文公布了在人等哺乳動(dòng)物中檢測(cè)和定位細(xì)胞特異性抗原的方法，包括在PBMC中T淋巴細(xì)胞抗原特異性激活的條件下將哺乳動(dòng)物的外周血單核細(xì)胞(PBMC)暴露于抗原的免疫原性肽表位，從而產(chǎn)生至少與該細(xì)胞特異性抗原結(jié)合的抗原特異性T淋巴細(xì)胞。將已標(biāo)記的抗原特異性T淋巴細(xì)胞經(jīng)腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)施用于哺乳動(dòng)物，通常不含IL－2。通過(guò)成像確定這些細(xì)胞在哺乳動(dòng)物中的分布，從而對(duì)哺乳動(dòng)物中的細(xì)胞特異性表位進(jìn)行檢測(cè)和定位。將PBMC暴露于免疫原性肽中通常涉及不含細(xì)胞的肽制品和白介素－2(IL－2)，但不涉及諸如抗原呈遞細(xì)胞(APC)等被抗原獨(dú)立激活的其它細(xì)胞?？乖禺愋訲淋巴細(xì)胞通?？梢匀芙獗磉_(dá)所述細(xì)胞特異性抗原的細(xì)胞，且可能包括CD4+、CD8+和/或CD45RO+記憶型T細(xì)胞。
文檔編號(hào)A61K51/12GK1711475SQ200380103261
公開(kāi)日2005年12月21日 申請(qǐng)日期2003年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月10日
發(fā)明者C·A·菲利普斯, S·E·賴特 申請(qǐng)人:退伍軍人事務(wù)部