專利名稱：促紅細(xì)胞生成素在心臟病中的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及促紅細(xì)胞生成素的新用途，特別是心臟病中鐵分布紊亂的治療。
已知多種疾病中存在鐵代謝異常。在貧血癥中，體內(nèi)整體性缺鐵導(dǎo)致無法生成足量的血液。另一與鐵相關(guān)的代謝疾病是血色病，其中體內(nèi)鐵的總濃度高于正常，從而導(dǎo)致多種疾病，例如器官被破壞。
鐵分布紊亂有別于上述的貧血癥及血色病，因?yàn)轶w內(nèi)鐵的總體濃度正常。一方面，鐵聚積于多種器官并可造成這些器官的損傷甚至是破壞；另一方面，以正常量存在的鐵在造血中的用途受損，導(dǎo)致相當(dāng)于與貧血癥相關(guān)疾病的次級(jí)作用。
直到現(xiàn)在才清楚心臟病患者受鐵分布紊亂影響的可能性很大?？赏ㄟ^多種通常用于診斷鐵狀態(tài)的參數(shù)來診斷鐵分布紊亂?；跍y(cè)量鐵蛋白及可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，可以評(píng)估一個(gè)心臟病患者體內(nèi)的總鐵濃度是否正常。如果濃度異常，則網(wǎng)織紅細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白濃度降低是鐵分布紊亂的指征。另一指征為，在體內(nèi)總鐵濃度正常的心臟病患者中，C反應(yīng)蛋白(CRP)濃度的持續(xù)/長期升高。P.Lehmann，M.Volkmann，J.Lotz，A.Baldauf及R.Roeddiger曾在2001年7月29日至8月2日Chicago，IllinoisAACC/CSCC年會(huì)報(bào)告中描述了診斷鐵分布紊亂的方法。
到目前為止，還沒有針對(duì)患鐵分布紊亂的心臟病患者的治療。因此本發(fā)明的基本問題是為心臟病中的鐵分布紊亂提供治療，從而最大程度地減小或抑制上述不利影響。已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)促紅細(xì)胞生成素對(duì)于心臟病中的鐵分布紊亂具有有利的作用。因此根據(jù)本發(fā)明，將促紅細(xì)胞生成素用于治療心臟病中鐵分布紊亂，使該問題得以解決。
除非另有說明，列出以下定義以說明和限定在此描述本發(fā)明時(shí)所使用的各術(shù)語的意義及范圍。
此處所用的術(shù)語“低級(jí)烷基”指具有一至六個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基。低級(jí)烷基的實(shí)例包括甲基、乙基及異丙基，優(yōu)選甲基。
此處所用的術(shù)語“低級(jí)烷氧基”指R’-O-基團(tuán)，其中R’為上面描述的低級(jí)烷基。
術(shù)語“心臟病鐵分布紊亂”指發(fā)生在心臟病患者中的鐵分布紊亂。此鐵分布紊亂可以例如具有如上所述的特征。具體而言，鐵分布紊亂具有以下參數(shù)特征可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的濃度[mg/L]除以log(鐵蛋白濃度[μg/L])小于3.5，同時(shí)C反應(yīng)蛋白濃度高于5mg/L。
術(shù)語“促紅細(xì)胞生成素”或“促紅細(xì)胞生成素蛋白”指這樣的蛋白質(zhì)，其在體內(nèi)具有引起骨髓細(xì)胞增加產(chǎn)生網(wǎng)織紅細(xì)胞和紅細(xì)胞的生物活性并選自人促紅細(xì)胞生成素及其以下定義的類似物。
術(shù)語“聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素(Peg-EPO或PEG-EPO)”指與一至三個(gè)如下定義的聚乙烯衍生物共價(jià)連接的促紅細(xì)胞生成素蛋白。
附圖描述

圖1人EPO的一級(jí)結(jié)構(gòu)(165個(gè)氨基酸)(SEQ ID NO1)。
圖2人EPO的一級(jí)結(jié)構(gòu)(166個(gè)氨基酸)(SEQ ID NO2)。
更具體而言，本發(fā)明涉及促紅細(xì)胞生成素在制備治療心臟病中鐵分布紊亂的藥物中的用途。心臟病的實(shí)例如冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、急性冠狀動(dòng)脈綜合征、心力衰竭、充血性心力衰竭和/或心功能不全。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及如上定義的用途，其中心臟病指心功能不全。
本發(fā)明對(duì)于制備含促紅細(xì)胞生成素作為藥物活性成分的藥物組合物特別有用。所用術(shù)語“促紅細(xì)胞生成素”或“促紅細(xì)胞生成素蛋白”或“EPO”定義如下這些術(shù)語具體指一種糖蛋白，如人促紅細(xì)胞生成素，如具有列于(SEQ ID NO1)或(SEQ ID NO2)的氨基酸序列或基本上與之同源的氨基酸序列，其生物特性涉及刺激紅細(xì)胞的產(chǎn)生以及刺激骨髓中定向紅系祖細(xì)胞的分裂和分化。如這里所用的，這些術(shù)語包括經(jīng)過特意修飾的此類蛋白質(zhì)，例如經(jīng)定點(diǎn)誘變法或隨機(jī)突變法修飾。這些術(shù)語還包括具有一至六個(gè)附加糖基化位點(diǎn)的類似物、在糖蛋白的羧基端具有至少一個(gè)附加氨基酸的類似物(其中附加氨基酸含有至少一個(gè)糖基化位點(diǎn))，以及具有如下氨基酸序列的類似物，即氨基酸序列含有至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的重排。這些術(shù)語包括天然和重組產(chǎn)生的人促紅細(xì)胞生成素。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，促紅細(xì)胞生成素蛋白為人促紅細(xì)胞生成素。
如下文詳細(xì)描述，EPO的制備和純化為本領(lǐng)域所熟知。促紅細(xì)胞生成素指的是天然或重組蛋白質(zhì)，優(yōu)選人源，例如來自任何常規(guī)來源(如組織、蛋白質(zhì)合成、用天然或重組細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng))的阿法依泊汀(epoetin alfa)或倍他依泊汀(epoetin beta)。包括任何具有促紅細(xì)胞生成素活性的蛋白質(zhì)，如突變蛋白或經(jīng)修飾蛋白質(zhì)。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，促紅細(xì)胞生成素蛋白為阿法依泊汀或倍他依泊汀。可通過重組DNA技術(shù)或內(nèi)源性的基因活化途徑，經(jīng)CHO-、BHK-或HeLa細(xì)胞系表達(dá)制備重組促紅細(xì)胞生成素。蛋白質(zhì)的表達(dá)，包括經(jīng)內(nèi)源基因活化，是本領(lǐng)域眾所周知的，并已公開于如美國專利號(hào)5,733,761、5,641,670和5,733,746，國際專利公開號(hào)WO93/09222、WO94/12650、WO95/31560、WO90/11354、WO91/06667和WO91/09955，其各自內(nèi)容均在此處引入作為參考。如上描述的用途，其中優(yōu)選通過內(nèi)源基因活化表達(dá)促紅細(xì)胞生成素蛋白。優(yōu)選的制備促紅細(xì)胞生成素糖蛋白產(chǎn)品的EPO種類為人EPO種類。更為優(yōu)選的EPO種類為具有如SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所列出的氨基酸序列的人EPO，其中尤其優(yōu)選氨基酸序列SEQ ID NO1。因此，本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案涉及如上描述的用途，其中促紅細(xì)胞生成素蛋白具有SEQ ID NO1或SEQID NO2的氨基酸序列。
另外，促紅細(xì)胞生成素還可以是具有一至六個(gè)附加糖基化位點(diǎn)的糖蛋白類似物。因此，本發(fā)明也涉及前述用途，其中促紅細(xì)胞生成素蛋白具有經(jīng)加入一至六個(gè)糖基化位點(diǎn)而修飾的人促紅細(xì)胞生成素序列。加入一個(gè)或多個(gè)寡糖的蛋白質(zhì)糖基化發(fā)生在多肽主鏈的特定位置，且極大地影響了蛋白質(zhì)的物理性質(zhì)，如蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、分泌、亞細(xì)胞定位以及生物學(xué)活性。糖基化通常有兩種類型。O-連接的寡糖附著于絲氨酸或蘇氨酸殘基，而N-連接的寡糖則附著于精氨酸殘基。在O-連接及N-連接的寡糖鏈中均存在的寡糖之一為N-乙酰神經(jīng)氨酸(唾液酸)，它是含有9個(gè)或更多碳原子的氨基糖家族。唾液酸常為N-連接及O-連接寡糖的末端殘基，且由于它帶有負(fù)電荷，賦予該糖蛋白酸性特征。人促紅細(xì)胞生成素具有165個(gè)氨基酸，含有三條N-連接和一條O-連接的寡糖鏈，這些寡糖鏈約占該糖蛋白總分子量的40％。N-連接的糖基化發(fā)生于第24位、38位及83位的精氨酸殘基，O-連接的糖基化則發(fā)生于第126位的絲氨酸殘基。這些寡糖鏈經(jīng)由末端唾液酸殘基修飾。酶去除糖基化促紅細(xì)胞生成素的所有唾液酸殘基，會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)活性而不是體外活性的喪失，因?yàn)榇偌t細(xì)胞生成素的唾液酸化阻止了其與肝臟結(jié)合蛋白的結(jié)合及結(jié)合后的清除。
術(shù)語“促紅細(xì)胞生成素”包括人促紅細(xì)胞生成素的類似物，所述類似物可具有一處或多處人促紅細(xì)胞生成素氨基酸序列的改變，從而增加了唾液酸附著位點(diǎn)的數(shù)目。這些糖蛋白類似物可通過包括添加、缺失或替換氨基酸的定點(diǎn)誘變形成，所述誘變?cè)黾踊蚋淖兛晒┨腔奈稽c(diǎn)。唾液酸含量水平高于人促紅細(xì)胞生成素的糖蛋白類似物是通過增加不影響生物學(xué)活性所需的二級(jí)或三級(jí)構(gòu)象的糖基化位點(diǎn)而產(chǎn)生。本發(fā)明中的糖蛋白也包括糖基化位點(diǎn)處糖類附著水平增加的類似物，所述類似物通常涉及緊鄰N-連接或O-連接位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換。本發(fā)明中的糖蛋白也包括從紅細(xì)胞生成素羧基端延伸一個(gè)或多個(gè)氨基酸并提供至少一個(gè)額外的糖基位點(diǎn)的類似物。本組合物中的促紅細(xì)胞生成素蛋白也包括其氨基酸序列包含至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的重排的類似物。此種糖基化位點(diǎn)重排涉及在人促紅細(xì)胞生成素中缺失一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)和加入一個(gè)或多個(gè)非天然產(chǎn)生的糖基化位點(diǎn)。通過增加促紅細(xì)胞生成素上的糖鏈數(shù)目，并由此增加每個(gè)紅細(xì)胞生成素分子中的唾液酸數(shù)目，可能會(huì)賦予有利的性質(zhì)，如增強(qiáng)的溶解性、更高的蛋白水解抗性、降低的免疫原性、增長的血清半衰期，以及增加的生物活性。具有附加糖基化位點(diǎn)的促紅細(xì)胞生成素類似物的詳細(xì)情況公開于Elliot在1995年3月1日發(fā)表的歐洲專利申請(qǐng)640619。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物含有其氨基酸序列包含至少一個(gè)附加糖基化位點(diǎn)的促紅細(xì)胞生成素蛋白。例如但不僅限于含有選自下列修飾的人促紅細(xì)胞生成素序列的促紅細(xì)胞生成素Asn30Thr32；Asn51Thr53；Asn57Thr59；Asn69；Asn69Thr71；Ser68Asn69Thr71；Val87Asn88Thr90；Ser87Asn88Thr90；Ser87Asn88Gly89Thr90；Ser87Asn88Thr90Thr92；Ser87Asn88Thr90Ala162；Asn69Thr71Ser87Asn88Thr90；Asn30Thr32Val87Asn88Thr90；Asn89Ile90Thr91；Ser87Asn89Ile90Thr91；Asn136Thr138；Asn138Thr140；Thr125；和Pro124Thr125。
此處使用的用于氨基酸序列修飾的表示指在未經(jīng)修飾的相應(yīng)蛋白質(zhì)(如SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的hEPO)中上標(biāo)數(shù)字所代表的位置處變?yōu)楦魃蠘?biāo)數(shù)字前緊鄰的氨基酸。
促紅細(xì)胞生成素蛋白也可以是在糖蛋白的羧基端具有至少一個(gè)附加氨基酸的類似物，其中該附加氨基酸含有至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)。該附加氨基酸可以含有來自人絨毛膜促性腺激素羧基端的肽片段。優(yōu)選該糖蛋白為選自如下的類似物(a)具有自羧基端延伸的Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro ProPro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile LeuPro Gln氨基酸序列的人紅細(xì)胞生成素；(b)進(jìn)一步包含Ser87Asn88Thr90EPO的(a)的類似物；以及(c)進(jìn)一步包含Asn30Thr32Val87Asn88Thr90EPO的(a)的類似物。
促紅細(xì)胞生成素蛋白也可以是其氨基酸序列含有至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的重排的類似物。所述重排可以包括人促紅細(xì)胞生成素中任一N-連接的糖基位點(diǎn)的缺失，以及在人促紅細(xì)胞生成素氨基酸序列中的第88位添加N-連接的糖基位點(diǎn)。優(yōu)選該糖蛋白為選自Gln24Ser87Asn88Thr90EPO、Gln38Ser87Asn88Thr90EPO、和Gln83Ser87Asn88Thr90EPO的類似物。還有一種類似物為阿法達(dá)貝泊汀(darbepoetin alfa)，在前述用途中優(yōu)選的促紅細(xì)胞生成素蛋白為阿法達(dá)貝泊汀。
更具體而言，如上所述的本發(fā)明藥物組合物中的促紅細(xì)胞生成素蛋白也可以包括其聚乙二醇化衍生物。促紅細(xì)胞生成素的聚乙二醇化衍生物及其制備為本領(lǐng)域公知，并描述于如WO01/02017、EP-A-1064951、EP-A-539,167、EP-A-605,963、WO93/25212、WO94/20069、WO95/11924，美國專利號(hào)5,56、EP-A-584,876、WO92/16555、WO94/28024、WO97/04796，美國專利號(hào)5,359,030及5,681,811，美國專利號(hào)4,179,337，日本專利號(hào)，WO98/32466，美國專利號(hào)5,324,650。在上述用途中優(yōu)選的促紅細(xì)胞生成素為聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素。聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素種類的優(yōu)選實(shí)施方案參見下文描述的衍生物。
因此，本發(fā)明也涉及以上描述的用途，其中促紅細(xì)胞生成素蛋白為綴合物，該綴合物含有如上描述的促紅細(xì)胞生成素蛋白，其具有至少一個(gè)游離氨基，在體內(nèi)具有促使骨髓細(xì)胞增加產(chǎn)生網(wǎng)織紅細(xì)胞和紅細(xì)胞的生物活性，且選自人促紅細(xì)胞生成素及其類似物，該類似物含有經(jīng)添加一至六個(gè)糖基化位點(diǎn)或重排至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)而修飾的人促紅細(xì)胞生成素序列；該促紅細(xì)胞生成素與n個(gè)式-CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR的聚(乙二醇)基團(tuán)共價(jià)連接，其中每個(gè)聚(乙二醇)基團(tuán)的-CO(即羰基)與所述的氨基之一形成酰胺鍵；其中R為低級(jí)烷基，x為2或3；m為約450至約900；n為1至3；且選擇n與m使該綴合物減去促紅細(xì)胞生成素蛋白后的分子量為20至100千道爾頓。本發(fā)明還提供了含此處所述綴合物的藥物組合物，其中n為1的綴合物的百分比至少為百分之九十，優(yōu)選至少百分之九十二，或優(yōu)選為組合物中所有綴合物的百分之九十六。
更具體而言，上述綴合物可以用式(I)表示P-[NHCO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR]n(I)其中，P為此處所述的促紅細(xì)胞生成素蛋白的殘基(即，不含有氨基或與式I中羧基形成酰胺鍵的氨基)，在體內(nèi)具有促使骨髓細(xì)胞增加產(chǎn)生網(wǎng)織紅細(xì)胞和紅細(xì)胞的生物活性；其中，R為低級(jí)烷基；x為2或3；m為約450至約900；n為1至3；且選擇n與m使該綴合物減去促紅細(xì)胞生成素蛋白后的分子量為20至100千道爾頓。根據(jù)本發(fā)明，R為任一低級(jí)烷基。優(yōu)選R為甲基的綴合物。
符號(hào)“m”代表聚(環(huán)氧乙烷)基團(tuán)中環(huán)氧乙烷殘基(OCH2CH2)的數(shù)目。環(huán)氧乙烷的一個(gè)PEG(聚乙二醇)亞單位的分子量為約44道爾頓。因此，該綴合物的分子量(EPO的分子量除外)取決于數(shù)字“m”。在本發(fā)明的綴合物中，“m”為約450至約900(對(duì)應(yīng)的分子量為約20kDa至約40kDa)，優(yōu)選為約650至約750(對(duì)應(yīng)的分子量為約30kDa)。選擇數(shù)字m，從而使產(chǎn)生的本發(fā)明綴合物具有與未經(jīng)修飾的EPO相當(dāng)?shù)纳砘钚?，該活性可能表現(xiàn)為等于、高于未經(jīng)修飾EPO的相應(yīng)活性或?yàn)槠湟徊糠帧７肿恿俊凹s”為某一數(shù)值是指該分子量位于通過如常規(guī)分析技術(shù)測(cè)定的該數(shù)值的一個(gè)合理范圍內(nèi)。數(shù)字m的選擇為使得每個(gè)與促紅細(xì)胞生成素糖蛋白共價(jià)連接的每一聚(乙二醇)基團(tuán)的分子量都在約20kDa至約40kDa之間，優(yōu)選約30kDa。
在本發(fā)明的綴合物中，數(shù)字“n”為與促紅細(xì)胞生成素蛋白中的游離氨基(包括賴氨酸殘基的ε-氨基和/或氨基端氨基)經(jīng)由酰胺鍵共價(jià)連接的聚(乙二醇)基團(tuán)的數(shù)目。本發(fā)明的綴合物中每分子EPO可以具有一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)PEG基團(tuán)?！皀”為1至3的整數(shù)，優(yōu)選“n”為1或2，更為優(yōu)選“n”為1。上述綴合物中的優(yōu)選綴合物含有這樣的化合物，其中x為2，m為650至750，n為1，且R為甲基。
式(I)的化合物可制備自以下已知的聚合物材料 其中R和m如上所述，通過將式II的化合物與促紅細(xì)胞生成素糖蛋白縮合而成。x為3的式II化合物為α-低級(jí)烷氧基，聚(乙二醇)的丁酸琥珀酰亞胺酯(低級(jí)烷氧基-PEG-SBA)。X為2的式II化合物為α-低級(jí)烷氧基，聚(乙二醇)的丙酸琥珀酰亞胺酯(低級(jí)烷氧基-PEG-SPA)?？梢岳萌魏慰墒够钚怎ヅc胺反應(yīng)生成酰胺的常規(guī)方法。在上述反應(yīng)中，例舉的琥珀酰亞胺酯是造成酰胺形成的離去基團(tuán)。如式II化合物的琥珀酰亞胺酯在產(chǎn)生攜帶蛋白質(zhì)的綴合物中的用途公開于1997年9月30日發(fā)行的美國專利號(hào)5,672,662中(Harris等人)。
人EPO含有9個(gè)游離氨基，它們是氨基末端的氨基和8個(gè)賴氨酸殘基的ε-氨基。已發(fā)現(xiàn)在pH7.5、蛋白質(zhì)∶PEG比例為1∶3、反應(yīng)溫度為20-25℃的條件下，聚乙二醇化試劑與式II的SBA化合物結(jié)合可以產(chǎn)生單、雙以及痕量的三聚乙二醇化物的混合物。當(dāng)聚乙二醇化試劑是式II的SPA化合物時(shí)，在相似條件下(除蛋白質(zhì)∶PEG的比例為1∶2外)主要產(chǎn)生單聚乙二醇化物?？梢圆捎没旌衔锏男问?，或采用經(jīng)陽離子交換層析分離的不同聚乙二醇化物的形式施用聚乙二醇化EPO。通過控制反應(yīng)條件(如反應(yīng)物的比例、pH、溫度、蛋白質(zhì)濃度、反應(yīng)時(shí)間等)，可以改變不同聚乙二醇化物的相對(duì)量。
本發(fā)明進(jìn)一步的優(yōu)選實(shí)施方案涉及以上描述的用途，其中促紅細(xì)胞生成素蛋白為綴合物，該綴合物含有如上描述的選自人促紅細(xì)胞生成素及其類似物，具有至少一個(gè)游離氨基，并在體內(nèi)具有促使骨髓細(xì)胞增加產(chǎn)生網(wǎng)織紅細(xì)胞和紅細(xì)胞的生物活性的促紅細(xì)胞生成素蛋白，所述促紅細(xì)胞生成素類似物中具有經(jīng)過添加一至六個(gè)糖基化位點(diǎn)而修飾的人促紅細(xì)胞生成素蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)；該促紅細(xì)胞生成素蛋白與一至三個(gè)低級(jí)烷氧基聚(乙二醇)基團(tuán)共價(jià)連接，其中每一聚(乙二醇)基團(tuán)均借助式-C(O)-X-S-Y-的銜接物共價(jià)連接，以銜接物的C(O)與所述的氨基之一形成酰胺鍵，從而與促紅細(xì)胞生成素蛋白共價(jià)相連，銜接物中X為-(CH2)k-或-CH2(O-CH2-CH2)k-，k為1至10，Y為 或 每個(gè)聚(乙二醇)部分的平均分子量為約20千道爾頓至約40千道爾頓，而該綴合物的分子量為約51千道爾頓至約175千道爾頓。
該類促紅細(xì)胞生成素也可以由式(III)表示P-[NH-CO-X-S-Y-(OCH2CH2)m-OR]n(III)其中R可以為任一低級(jí)烷基。優(yōu)選的低級(jí)烷基為甲基。X可以為-(CH2)k-或-CH2(O-CH2-CH2)k-，其中k為1至約10。優(yōu)選的k為1至約4，更為優(yōu)選的k為1或2。最優(yōu)選的X為-(CH2)。
在式1中，Y為 或 優(yōu)選
或 更優(yōu)選 在式(III)中，選擇數(shù)字m使產(chǎn)生的式(III)綴合物與未經(jīng)修飾的EPO具有相當(dāng)?shù)纳砘钚?，該活性可表示為等于、高于未?jīng)修飾EPO的相應(yīng)活性或?yàn)槠湟徊糠?。m表示的是PEG單元中環(huán)氧乙烷殘基的數(shù)目。-(OCH2CH2)-的一個(gè)PEG亞單位的分子量為約44道爾頓。因此，該綴合物的分子量(EPO的分子量除外)取決于數(shù)字m。分子量“約”為某一數(shù)值是指，該分子量位于由常規(guī)分析技術(shù)測(cè)定的該數(shù)值的一個(gè)合理范圍內(nèi)。m為約450至約900范圍內(nèi)的整數(shù)(對(duì)應(yīng)的分子量為20至40kDa)，優(yōu)選的m為約550至約800(約24至35kDa)，而最為優(yōu)選的m是約650至約700(約29至約31kDa)。
在式(III)中，數(shù)字n是通過酰胺鍵與PEG單元共價(jià)連接的促紅細(xì)胞生成素蛋白中賴氨酸ε-氨基的數(shù)目。本發(fā)明綴合物中每分子的EPO可具有一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)PEG單元。n為介于1至3的整數(shù)，優(yōu)選的n為1或2，更為優(yōu)選的n為1。
優(yōu)選的式(III)的促紅細(xì)胞生成素蛋白可由下式表示 和 在本發(fā)明最優(yōu)選的實(shí)施方案中，促紅細(xì)胞生成素綴合物可由下式表示
在上式中，n為1至3的整數(shù)；m為450至900的整數(shù)；R為低級(jí)烷基；X為-(CH2)k-或-CH2(O-CH2-CH2)k-，而P則為不具有氨基或與X形成酰胺鍵的基團(tuán)的促紅細(xì)胞生成素蛋白殘基。
其他優(yōu)選的促紅細(xì)胞生成素糖蛋白產(chǎn)物由下式表示 和 更為優(yōu)選的促紅細(xì)胞生成素糖蛋白產(chǎn)物可由下式表示 這些促紅細(xì)胞生成素蛋白可以經(jīng)下列途徑制備(a)將促紅細(xì)胞生成素蛋白(以式P-[NH2]n表示)中賴氨酸的ε-氨基與雙功能試劑(以式Z-CO-X-S-Q表示)進(jìn)行共價(jià)反應(yīng)，形成下式表示的具有酰胺鍵的中間體P-[NH-CO-X-S-Q]n其中P為缺少形成酰胺鍵的氨基的促紅細(xì)胞生成素蛋白；n為1至3的整數(shù)；Z為反應(yīng)基，例如羧酸NHS酯；X為-(CH2)k-或-CH2(O-CH2-CH2)k-，其中k為1至約10；而Q則為保護(hù)性基團(tuán)，如烷酰基，例如乙酰基。
(b)將步驟(a)中得到的具有酰胺鍵的中間體與活化的、以式W-[OCH2CH2]m-OR表示的聚(乙二醇)衍生物進(jìn)行共價(jià)反應(yīng)，形成下式表示的促紅細(xì)胞生成素糖蛋白產(chǎn)物 其中W為Y的巰基化活性形式；m為約450至約900范圍的整數(shù)；R為低級(jí)烷基；而Y則如上所定義。
在該實(shí)施方案中，雙功能試劑優(yōu)選N-琥珀酰亞胺基-S-乙酰硫基丙酸酯，或N-琥珀酰亞胺基-S-乙酰硫基乙酸酯，Z優(yōu)選N-羥基-琥珀酰亞胺，而活化的聚(乙二醇)衍生物W-[OCH2CH2]m-OR優(yōu)選選自碘代-乙?；?甲氧基-PEG、甲氧基-PEG-乙烯砜，以及甲氧基-PEG-馬來酰亞胺。
更具體而言，式(III)的促紅細(xì)胞生成素蛋白可以如下制備將巰基與EPO共價(jià)連接(“活化”)，并將產(chǎn)生的活化EPO與聚(乙二醇)(PEG)衍生物偶聯(lián)。根據(jù)本發(fā)明，用于制備聚乙二醇化EPO的第一步包括巰基與EPO的-NH2基團(tuán)的共價(jià)連接。EPO的此步活化通過雙功能試劑完成，該雙功能試劑帶有保護(hù)性巰基和額外的反應(yīng)基，反應(yīng)基如活性酯(如琥珀酰亞胺酯)、酐、硫酸酯、羧酸及硫酸的鹵化物。該巰基由本領(lǐng)域已知的基團(tuán)(如乙?；?所保護(hù)。這些雙功能試劑能夠與賴氨酸的ε-氨基反應(yīng)形成酰胺鍵。該反應(yīng)的第一步列于如下 EPO，n及X如上描述，Z為本領(lǐng)域已知的反應(yīng)基，例如下式的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)取代物 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，賴氨酸ε-氨基的活化是通過與具有琥珀酰亞胺基部分的雙功能試劑反應(yīng)形成的。該雙功能試劑可攜帶不同種類的間隔臂，例如-(CH2)k-或-CH2(O-CH2-CH2)k-，其中k為1至約10，優(yōu)選為1至約4，更為優(yōu)選為1或2，最優(yōu)選為1。這類試劑的實(shí)例如N-琥珀酰亞胺基-S-乙酰硫基丙酸酯(SATP)和N-琥珀酰亞胺基-S-乙酰硫基乙酸酯(SATA) 乙酰硫基烷基-羧酸-NHS-酯，如 或 2-(乙酰硫基)-(乙氧基)K-乙酸-NHS-酯其中k定義如上。
雙功能試劑的制備為本領(lǐng)域已知。2-(乙酰硫基)-(乙氧基)k-乙酸-NHS-酯的前體描述于DE-3924705，而其乙酰硫基化合物的衍生則由March，J.在《Advanced Organic Chemistry》，McGraw-Hill，1977，375-376中描述。SATA可經(jīng)商業(yè)途徑獲取(Molecular Probes，Eugene，OR，USAand Pierce，Rockford，IL)。
可以通過調(diào)整反應(yīng)參數(shù)而選擇添加到EPO分子上的巰基數(shù)目，即調(diào)整蛋白質(zhì)(EPO)濃度和蛋白質(zhì)/雙功能試劑的比例。優(yōu)選情況下，通過每EPO分子共價(jià)連接1至5個(gè)巰基來激活EPO，更為優(yōu)選的是每EPO分子連接1.5至3個(gè)巰基來激活EPO。該范圍為參照覆蓋EPO蛋白群體的巰基統(tǒng)計(jì)分布而定。
該反應(yīng)可在如pH為6.5-8.0的緩沖水溶液(如10mM磷酸鉀、50mMNaCl，pH為7.3)中進(jìn)行。雙功能試劑可在DMSO中加入。反應(yīng)完成之后(優(yōu)選30分鐘后)，通過加入賴氨酸終止反應(yīng)。過量的雙功能試劑可以經(jīng)過本領(lǐng)域已知的方法分離，如透析或柱過濾法。添加到EPO上的平均巰基數(shù)目可以通過如Grasetti，D.R.和Murray，J.F.在J.Appl.Biochem.Biotechnol.119，41-49(1967)中描述的光度法測(cè)定。
上述反應(yīng)后，進(jìn)行活化的聚(乙二醇)(PEG)衍生物的共價(jià)偶聯(lián)。合適的PEG衍生物為平均分子量為約20至約40kDa，更為優(yōu)選的是約24至約35kDa，最優(yōu)選為分子量約30kDa的活化PEG分子。
活化的PEG衍生物為本領(lǐng)域已知，如Morpurgo，M.等人在J.Bioconj.Chem.(1996)7第363頁中對(duì)PEG-乙烯砜進(jìn)行了描述。直鏈及支鏈PEG種類適于制備式1的化合物?；钚訮EG試劑的實(shí)例有碘代-乙酰-甲氧基-PEG和甲氧基-PEG-乙烯砜 或 這些碘-活性物質(zhì)的用途為本領(lǐng)域已知，如Hermanson，G.T.在《Bioconjugate Techniques》，Academic Press，San Diego(1996)147-148頁中進(jìn)行了描述。
最優(yōu)選的是，使用(低級(jí)烷氧基-PEG-馬來酰亞胺)如甲氧基-PEG-馬來酰亞胺(分子量30000；Shearwater Polymers，Inc.)，通過馬來酰亞胺活化PEG類。低級(jí)烷氧基-PEG-馬來酰亞胺的結(jié)構(gòu)如下 或 其中R和m如上所描述，優(yōu)選
與低級(jí)烷氧基-PEG-馬來酰亞胺的偶聯(lián)反應(yīng)是在緩沖水溶液(如10mM磷酸鉀、50mM NaCl，2mMEDTA，pH為6.2)中原位切割保護(hù)性巰基后進(jìn)行的。保護(hù)性基團(tuán)的切割可以在如25℃、pH為6.2的DSMO中與羥胺反應(yīng)約90分鐘進(jìn)行。為了進(jìn)行PEG修飾，活化的EPO/低級(jí)烷氧基-PEG-馬來酰亞胺的摩爾比應(yīng)在約1∶3至約1∶6，優(yōu)選1∶4。可以通過加入半胱氨酸，以及將剩余巰基(-SH)與N-甲基馬來酰亞胺或其他能夠形成二硫鍵的恰當(dāng)化合物的反應(yīng)來終止反應(yīng)。由于任何剩余的活性巰基與諸如N-甲基馬來酰亞胺或其他適宜的保護(hù)性基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，本發(fā)明的綴合物內(nèi)的EPO糖蛋白可能含有此類保護(hù)性基團(tuán)。通常此處描述的方法將會(huì)產(chǎn)生不同分子的混合物，這些分子帶有由不同數(shù)目的保護(hù)性基團(tuán)保護(hù)的數(shù)目各異的巰基，被保護(hù)巰基的數(shù)目取決于該糖蛋白上未與PEG-馬來酰亞胺綴合的活化巰基的數(shù)目。
當(dāng)用N-甲基馬來酰亞胺封閉聚乙二醇化蛋白質(zhì)上剩余巰基時(shí)，其形成的是相同類型的共價(jià)鍵，而二硫化物將會(huì)在分子內(nèi)硫化物/二硫化物交換反應(yīng)中導(dǎo)致以二硫鍵與封閉試劑偶聯(lián)。用于該類封閉反應(yīng)的優(yōu)選封閉試劑為氧化型谷胱甘肽(GSSG)、半胱氨酸和胱氨。盡管使用半胱氨酸不會(huì)在聚乙二醇化蛋白質(zhì)上引入額外的凈電荷，使用封閉試劑GSSG或胱氨會(huì)導(dǎo)致額外的負(fù)電荷或正電荷。
式(III)的化合物的進(jìn)一步純化，包括單-、雙-以及三-聚乙二醇化EPO類物質(zhì)的分離，可以經(jīng)本領(lǐng)域已知的方法(例如柱層析法)進(jìn)行。
優(yōu)選聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素蛋白衍生物含有至少百分之九十的單PEG綴合物。通常需要促紅細(xì)胞生成素糖蛋白的單-PEG綴合物，因?yàn)樗鼈兺入p-PEG綴合物具有更高的活性。單-PEG綴合物的百分比，以及單-、雙-PEG類物質(zhì)的比例可以通過如下控制收集洗脫峰附近較大范圍的級(jí)分以降低單-PEG綴合物的百分比，或收集較窄范圍的級(jí)分以提高組合物中單-PEG綴合物的百分比。單-PEG綴合物占約百分之九十可使產(chǎn)量和活性間達(dá)良好平衡。有時(shí)也需要這樣的組合物，例如，其中單-PEG綴合物(n等于1)至少占綴合物總量的百分之九十二或至少百分之九十六。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，n等于1的綴合物的百分比為百分之九十至百分之九十六。
含有聚乙二醇化促紅細(xì)胞生成素的藥物組合物為本領(lǐng)域所公知，且已有所描述(如國際專利申請(qǐng)?zhí)朩O01/87329中)。組合物中可以含有10至10000μg如上所述的促紅細(xì)胞生成素蛋白/ml。優(yōu)選情況下，該組合物含有10至1000μg促紅細(xì)胞生成素蛋白/ml，如10、50、100、400、800或2500μg/ml。此外，組合物中可以含有每ml 10至10000μg促紅細(xì)胞生成素蛋白、10-200mmol/l硫酸鹽、10至50mmol/l磷酸鹽，pH為6.0至6.5。該組合物還可以含有高達(dá)20mM的甲硫氨酸，1-5％的多元醇(w/v)，高達(dá)0.1％的pluronic F68(w/v)，以及任選地高達(dá)1mM CaCl2。這類組合物的實(shí)例之一含有每ml 10至10000μg促紅細(xì)胞生成素蛋白、40mmol/l硫酸鹽、10mmol/l磷酸鹽、3％甘露醇(w/v)、10mM甲硫氨酸、0.01％pluronic F68(w/v)，pH為6.2。該組合物的另一選擇可含有每ml 10至10000μg促紅細(xì)胞生成素蛋白、10至100mmol/l NaCl、10至50mmol/l磷酸鹽，pH為6.0至7.0，任選地1-5％(w/v)的多元醇。此外，該組合物可以含有高達(dá)20mM的甲硫氨酸、高達(dá)0.1％的pluronic F68(w/v)，以及任選地7.5μmol/l CaCl2。具體地，該組合物中可以含有每ml 10至10000μg促紅細(xì)胞生成素蛋白、100mmol/l NaCl、10mM甲硫氨酸、0.01％pluronic F68(w/v)，以及10mmol/l磷酸鹽，pH為7.0。
本發(fā)明也涉及含有每ml 10至10000μg促紅細(xì)胞生成素蛋白、10-50mmol/l精氨酸、pH6.0至pH6.5、10-100mmol/l硫酸鈉的上述組合物。另外，該組合物可以含有高達(dá)20mM的甲硫氨酸、高達(dá)0.1％的pluronicF68(w/v)，任選地高達(dá)1mmol/l的CaCl2，及任選地1-5％(w/v)的多元醇。具體地，該組合物中可以含有每ml 10至10000μg促紅細(xì)胞生成素蛋白、40mmol/l精氨酸、pH為6.2、30mmol/l硫酸鈉、3％甘露醇(w/v)、10mM甲硫氨酸、0.01％pluronic F68(w/v)，以及任選地1mmol/l的CaCl2。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案涉及到如下組合物，其含有10-10000μg/ml促紅細(xì)胞生成素，優(yōu)選25-2500μg/ml促紅細(xì)胞生成素，以及a)10mM磷酸鈉/鉀、100mM NaCl，pH為7.0或b)10mM磷酸鈉、120mM硫酸鈉，pH為6.2或c)10mM磷酸鈉、40mM硫酸鈉、3％甘露醇(w/v)，pH為6.2或d)10mM磷酸鈉、40mM硫酸鈉、3％甘露醇(w/v)、10mM甲硫氨酸、0.01％pluronic F68(w/v)，pH為6.2或e)40mM精氨酸、30mM硫酸鈉、3％甘露醇(w/v)，pH為6.2或f)40mM精氨酸、30mM硫酸鈉、3％甘露醇(w/v)、10mM甲硫氨酸、0.01％pluronic F68(w/v)，pH為6.2。
在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物中含有促紅細(xì)胞生成素蛋白量為50、100、400、800或2500μg/ml。最優(yōu)選的組合物含有10mM磷酸鈉、40mM硫酸鈉、3％甘露醇(w/v)、10mM甲硫氨酸、0.01％pluronic F68(w/v)，pH為6.2，或40mM精氨酸、30mM硫酸鈉、3％甘露醇(w/v)、10mM甲硫氨酸、0.01％pluronic F68(w/v)，pH為6.2。此類組合物的其它細(xì)節(jié)可從WO01/87329中得知。
本發(fā)明還涉及治療心臟病中鐵分布紊亂的方法，包括施用有效量的如上描述的促紅細(xì)胞生成素蛋白。本發(fā)明還涉及治療心臟病中鐵分布紊亂的藥物，其特征在于該藥物含有有效量的促紅細(xì)胞生成素蛋白。心臟病的實(shí)例，如冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、急性冠狀動(dòng)脈綜合癥、心力衰竭、充血性心力衰竭和/或心功能不全。聯(lián)系上文提及的方法和藥物，優(yōu)選的心臟病形式為心功能不全。如上描述的優(yōu)選方法和藥物中，促紅細(xì)胞生成素蛋白為如上所定義的。
在心臟病中鐵分布紊亂的治療中，可以按如每周兩次150單位/kg體重的劑量施用EPO。劑量可以根據(jù)病人的個(gè)體需要進(jìn)行調(diào)整，也可以處于一定的范圍(如100-200單位/kg)。依據(jù)所用EPO衍生物的半衰期，施用量可以如介于每周1或3次。根據(jù)病人的個(gè)體需要，醫(yī)師也可以選擇不同的劑量。
本發(fā)明中EPO或EPO綴合物的比活性，可以通過多種本領(lǐng)域已知的多種試驗(yàn)測(cè)定。本發(fā)明中經(jīng)純化EPO蛋白的生物活性為與未注射或?qū)φ战M的被試者相比，通過注射向病人施用EPO蛋白能夠使骨髓細(xì)胞增加產(chǎn)生網(wǎng)織紅細(xì)胞以及紅細(xì)胞。可以根據(jù)Annable等人在Bull.Wld.Hlth.Org.(1972)4799-112，以及Pharm.Europa Spec.Issue ErythropoietinBRP Bio 1997(2)中介紹的方法測(cè)試在本發(fā)明中獲取及純化的EPO蛋白或其片段的生物學(xué)活性。本領(lǐng)域中(如Pharm.Europa Spec.IssueErythropoietin BRP Bio 1997(2)，以及the monography of erythropoietinof Ph.Eur.BRP)描述了另一個(gè)用于測(cè)定EPO蛋白活性的生物試驗(yàn)—正常紅細(xì)胞(normocythaemic)小鼠實(shí)驗(yàn)。
通過下面的實(shí)施例可以更好地理解本發(fā)明，這些實(shí)施例說明了此處描述的發(fā)明，但并不對(duì)其進(jìn)行限制。
實(shí)施例如P.Lehmann，M.Volkmann，J.Lotz，A.Baldauf和R.Roeddiger在2001年7月29日至8月2日Chicago，Illinois召開的AACC/CSCC年會(huì)報(bào)告中描述的，在心臟插管后，通過測(cè)定CRP(C反應(yīng)蛋白)、鐵蛋白和可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體參數(shù)，檢查患有心臟病的中年男性的鐵分布紊亂情況。結(jié)果顯示存在鐵分布紊亂。以每周兩次皮下使用150單位/kg的RceormonTM(可商業(yè)獲得的促紅細(xì)胞生成素蛋白)治療病人，最長治療時(shí)間為12周。隨后對(duì)上述參數(shù)的測(cè)定顯示鐵缺乏的紊亂有所改善。
序列表<110>弗·哈夫曼-拉羅切有限公司<120>促紅細(xì)胞生成素在心臟病中的新用途<170>PatentIn版本2.0<210>1<211>165<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1 5 10 15Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His20 25 30Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe35 40 45Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp50 55 60Gln Glv Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65 70 75 80Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp85 90 95Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu100 105 110Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala115 120 125Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val130 135 140Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160Cys Arg Thr Gly Asp165<210>2<211>166<212>PRT<213>人<400>2
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1 5 10 15Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His20 25 30Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe35 40 45Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp50 55 60Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65 70 75 80Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp85 90 95Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu100 105 110Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala115 120 125Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val130 135 140ryr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160Cys Arg Thr Gly Asp Arg16權(quán)利要求
1.促紅細(xì)胞生成素蛋白的用途，用于制備治療心臟病中鐵分布紊亂的藥物。
2.權(quán)利要求1的用途，其中心臟病是心功能不全。
3.權(quán)利要求1或2的用途，其中促紅細(xì)胞生成素蛋白為人促紅細(xì)胞生成素。
4.權(quán)利要求3的用途，其中促紅細(xì)胞生成素蛋白為阿法依泊汀或倍他依泊汀。
5.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的用途，其中促紅細(xì)胞生成素蛋白通過內(nèi)源基因活化而表達(dá)。
6.權(quán)利要求1或2的用途，其中促紅細(xì)胞生成素蛋白具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求1或2的用途，其中促紅細(xì)胞生成素蛋白具有經(jīng)過添加1至6個(gè)糖基化位點(diǎn)而修飾的人促紅細(xì)胞生成素的序列。
8.權(quán)利要求1或2的用途，其中促紅細(xì)胞生成素蛋白為阿法達(dá)貝泊汀。
9.權(quán)利要求1或2的用途，其中如權(quán)利要求3至8中任一項(xiàng)所定義的促紅細(xì)胞生成素蛋白為聚乙二醇化的。
10.權(quán)利要求9的用途，其中促紅細(xì)胞生成素蛋白為綴合物，所述綴合物包含這樣的促紅細(xì)胞生成素，其具有至少一個(gè)游離氨基，并在體內(nèi)具有引起骨髓細(xì)胞增加產(chǎn)生網(wǎng)織紅細(xì)胞和紅細(xì)胞的生物活性，且其選自人促紅細(xì)胞生成素及其類似物，所述人促紅細(xì)胞生成素類似物具有經(jīng)過添加一至六個(gè)糖基化位點(diǎn)或重排至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)而修飾的人促紅細(xì)胞生成素的序列；所述促紅細(xì)胞生成素蛋白與n個(gè)式-CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR的聚(乙二醇)基團(tuán)共價(jià)連接，其中每一聚(乙二醇)基團(tuán)的-CO與所述的氨基之一形成酰胺鍵；其中R為低級(jí)烷基，x為2或3；m為約450至約900；n為1至3；且選擇n與m，從而使該綴合物減去促紅細(xì)胞生成素蛋白后的分子量為20至100千道爾頓。
11.權(quán)利要求10的用途，其中x為2，m為650至750，n為1，且R為甲基。
12.權(quán)利要求9的用途，其中促紅細(xì)胞生成素蛋白為綴合物，所述綴合物包含這樣的促紅細(xì)胞生成素，其具有至少一個(gè)游離氨基，并在體內(nèi)具有引起骨髓細(xì)胞增加產(chǎn)生網(wǎng)織紅細(xì)胞和紅細(xì)胞的生物活性，且其選自人促紅細(xì)胞生成素及其類似物，所述紅細(xì)胞生成素類似物具有經(jīng)過添加一至六個(gè)糖基化位點(diǎn)而修飾的人促紅細(xì)胞生成素蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)；該促紅細(xì)胞生成素蛋白與一至三個(gè)低級(jí)烷氧基聚(乙二醇)基團(tuán)共價(jià)連接，其中每一聚(乙二醇)基團(tuán)均借助式-C(O)-X-S-Y-的銜接物與促紅細(xì)胞生成素蛋白共價(jià)連接，所述銜接物中的C(O)與所述的氨基之一形成酰胺鍵，其中X為-(CH2)k-或-CH2(O-CH2-CH2)k-，k為1至10，Y為 或 每一聚(乙二醇)部分的平均分子量為約20千道爾頓至約40千道爾頓，而該綴合物的分子量為約51千道爾頓至約175千道爾頓。
13.權(quán)利要求12的用途，使用下式的促紅細(xì)胞生成素綴合物 其中n為1至3的整數(shù)；m為450至900的整數(shù)；R為低級(jí)烷基；X為-(CH2)k-或-CH2(O-CH2-CH2)k-，k為1至10且P為不帶有與X形成酰胺鍵的n個(gè)氨基的促紅細(xì)胞生成素蛋白殘基。
14.治療心臟病中鐵分布紊亂的方法，其包括施用有效量的促紅細(xì)胞生成素蛋白。
15.治療心臟病中鐵分布紊亂的藥物，其特征在于含有有效量的促紅細(xì)胞生成素蛋白。
16.如上所定義的本發(fā)明。
全文摘要
本發(fā)明涉及促紅細(xì)胞生成素治療心臟病中鐵分布紊亂的用途。
文檔編號(hào)A61K38/18GK1713919SQ200380103877
公開日2005年12月28日 申請(qǐng)日期2003年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月22日
發(fā)明者P·萊曼, R·羅迪格爾, R·瓦爾特-馬特蘇伊 申請(qǐng)人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司