專利名稱：去除前激肽釋放酶的、血漿來源的白蛋白組分的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及制備前激肽釋放酶活化因子(PKA)減少的富含白蛋白的組分的方法，和可根據(jù)本發(fā)明方法獲得的前激肽釋放酶活化因子(PKA)減少的含白蛋白的組分。
含白蛋白的制劑用作需要該制劑的患者的輸注溶液。為了獲得更接近生理的環(huán)境，灌注到患者體內的液體代用材料(substitution)不僅含有生理濃度的鹽，還含有作為增容劑的白蛋白。白蛋白制劑可能會含有前激肽釋放酶活化因子(PKA)，其導致非必要的副作用，這可能是由于前激肽釋放酶活化因子干擾腎素-血管緊張素系統(tǒng)。
本發(fā)明的目的是降低血漿來源的、含白蛋白組分中的PKA含量。另一個目的是提供PKA值降低的含白蛋白的組分。
制備前激肽釋放酶活化因子(PKA)減少的富含白蛋白的組分的方法實現(xiàn)了這一目的，該方法包括以下步驟(f)重構糊狀物V(科恩分部分離)；(g)對步驟(a)中獲得的組分進行濃縮步驟；(h)在50℃-70℃對步驟(b)中獲得的組分加熱足夠的時間，以對組分進行巴氏殺菌；和(i)任選地灌注所得的組分，備用。
在本發(fā)明的一個實施方案中，在灌注后進行第二次巴氏殺菌步驟。
具體地，孵育步驟于50-70℃進行至少5小時，具體是10小時。
從重構糊狀物V和任選地加入助濾劑開始，優(yōu)選用孔徑約為0.2μm的濾器進行過濾。必要的話，必須進行pH調節(jié)。pH應在7.2-7.6的范圍內。通常超濾至8％(w/v)蛋白質含量，然后進行透濾和再一次超濾，用來濃縮蛋白質。這導致蛋白質濃度至少為20％。然后優(yōu)選用孔徑約為0.2μm的濾膜進行再一次過濾。
加入穩(wěn)定劑，例如每g白蛋白加入各為0.08mmol的N-乙酰-DL-色氨酸和辛酸鈉，然后將pH調節(jié)至6.7-7.3。調節(jié)蛋白質和鈉含量，優(yōu)選在58℃-65℃的范圍內進行整體巴氏殺菌至少9小時。該步驟之后是除菌過濾。樣品于2℃-25℃保存少于2周。將白蛋白無菌體進行進一步的最終除菌過濾和灌注。灌注后可以在如前所述的相似條件下進行第二次巴氏殺菌步驟。還可以增加另一孵育步驟。經(jīng)肉眼檢查后，制劑即可保存和施用。
本發(fā)明的方法還提供了前激肽釋放酶活化因子(PKA)減少的含白蛋白的組分。
本發(fā)明白蛋白中PKA含量小于12IU/ml，優(yōu)選小于10IU/ml，其中PKA根據(jù)歐洲藥典第四版，2.6.15，第147-148頁加以測定。
還通過下面的非限制性實施例進一步描述了本發(fā)明。
實施例實施例1于-2±2℃將糊狀物V懸浮于1.6倍重量的注射用水中＞6小時。向產(chǎn)物中加入助濾劑，并將制劑攪拌30分鐘。將深濾器(depth filter)用注射用水并隨后用10％(v/v)的乙醇預洗滌。將溶液通過深濾器和隨后的0.2μm膜濾器進行凈化。濾器再用10％的乙醇注射用水溶液洗滌。用3M氫氧化鈉溶液調節(jié)pH至7.4±0.2。
通過排阻限為10kDalton的膜進行超濾，獲得8％的蛋白質濃度。將濃縮物用≥3倍量的0.5M氯化鈉溶液進行透濾，然后用≤3倍量的注射用水進行透濾。透濾后，于≤+15℃進行超濾，將白蛋白溶液濃縮至蛋白質濃度約為22％。將溶液通過深濾器和隨后的0.2μm膜濾器進行凈化。深濾器用注射用水預洗滌。
然后，將0.0106g辛酸/g蛋白質和0.0182gN-乙酰-DL-色氨酸/g蛋白質溶解于10％(w/v)的氫氧化鈉中，并緩慢攪拌加入到白蛋白溶液中。將pH調節(jié)至7.0±0.3。加入注射用水將白蛋白溶液調節(jié)至蛋白質濃度為200±10g/l。加入氯化鈉將鈉含量調節(jié)至150±7.5mmol/l。于58-65℃將溶液攪拌至少9小時。將白蛋白溶液通過標稱孔徑通常為0.2μm的除菌級濾膜進行除菌過濾。通過生產(chǎn)商說明書所推薦的合適測試方法驗證使用前后除菌濾器的完整性。將經(jīng)除菌過濾的白蛋白于+2℃-+25℃保存不超過2周。使用終端0.2μm除菌濾器在無菌條件下將無菌溶液灌注到去除致熱源(depyrogenated)的輸注瓶中，用滅菌的丁基塞封閉，并用鋁蓋密封。通過生產(chǎn)商說明書所推薦的合適測試方法驗證使用前后除菌濾器的完整性。在整個灌注過程中監(jiān)測灌注體積。根據(jù)歐洲藥典進行巴氏殺菌。根據(jù)歐洲藥典對最終的容器進行孵育。孵育后，肉眼檢查所有瓶的顆粒狀雜質、濁度、瓶和封閉物的缺陷。棄除有缺陷的制劑。將所有瓶保存于+2℃-+25℃。
實施例2于-2±2℃將糊狀物V懸浮于1.6倍重量的注射用水中＞6小時。向產(chǎn)物中加入助濾劑，并將制劑攪拌30分鐘。將深濾器用注射用水并隨后用10％的乙醇預洗滌。將溶液通過深濾器和隨后的0.2μm膜濾器進行凈化。濾器再用10％的乙醇注射用水溶液洗滌。用3M氫氧化鈉溶液調節(jié)pH至7.4±0.2。通過排阻限為10kDalton的膜進行超濾，獲得8％的蛋白質濃度。將濃縮物用≥3倍量的0.5M氯化鈉溶液進行透濾，然后用≤3倍量的注射用水進行透濾。透濾后，于＜+15℃進行超濾，將白蛋白溶液濃縮至蛋白質濃度約為26％。將溶液通過深濾器和隨后的0.2μm膜濾器進行凈化。深濾器用注射用水預洗滌。然后，將0.0106g辛酸/g蛋白質和0.0182gN-乙酰-DL-色氨酸/g蛋白質溶解于10％的氫氧化鈉中，并緩慢攪拌加入到白蛋白溶液中。將pH調節(jié)至7.0±0.3。加入注射用水將白蛋白溶液調節(jié)至蛋白質濃度為250±12g/l。加入氯化鈉將鈉含量調節(jié)至150±7.5mmol/l。于58-65℃將溶液攪拌至少9小時。將白蛋白溶液通過標稱孔徑通常為0.2μm的除菌級濾膜進行除菌過濾。通過生產(chǎn)商說明書所推薦的合適測試方法驗證使用前后除菌濾器的完整性。將經(jīng)除菌過濾的白蛋白于+2℃-+25℃保存不超過2周。使用終端0.2μm除菌濾器在無菌條件下將無菌溶液灌注到去除致熱源的輸注瓶中，用滅菌的丁基塞封閉，并用鋁蓋密封。通過生產(chǎn)商說明書所推薦的合適測試方法驗證使用前后除菌濾器的完整性。在整個灌注過程中監(jiān)測灌注體積。根據(jù)歐洲藥典進行巴氏殺菌。根據(jù)歐洲藥典對最終的容器進行孵育。孵育后，肉眼檢查所有瓶的顆粒狀雜質、濁度、瓶和封閉物的缺陷。棄除有缺陷的制劑。將所有瓶保存于+2℃-+25℃。
實施例3于-2±2℃將糊狀物V懸浮于1.6倍重量的注射用水中6小時。向產(chǎn)物中加入助濾劑，并將制劑攪拌30分鐘。將深濾器用注射用水并隨后用10％的乙醇預洗滌。將溶液通過深濾器和隨后的0.2μm膜濾器進行凈化。濾器再用10％的乙醇注射用水溶液洗滌。用3M氫氧化鈉溶液調節(jié)pH至7.4±0.2。通過排阻限為10kDalton的膜進行超濾，獲得8％的蛋白質濃度。將濃縮物用≥3倍量的0.5M氯化鈉溶液進行透濾，然后用≤3倍量的注射用水進行透濾。透濾后，于低于+15℃進行超濾，將白蛋白溶液濃縮至蛋白質濃度約為22％。將溶液通過深濾器和隨后的0.2μm膜濾器進行凈化。深濾器用注射用水預洗滌。然后，將0.0106g辛酸/g蛋白質和0.0182g N-乙酰-DL-色氨酸/g蛋白質溶解于10％的氫氧化鈉中，并緩慢攪拌加入到白蛋白溶液中。將pH調節(jié)至7.0±0.3。加入注射用水將白蛋白溶液調節(jié)至蛋白質濃度為200±10g/l。加入氯化鈉將鈉含量調節(jié)至150±7.5mmol/l。于58-65℃將溶液攪拌至少10小時。將白蛋白溶液通過標稱孔徑通常為0.2μm的除菌級濾膜進行除菌過濾。通過生產(chǎn)商說明書所推薦的合適測試方法驗證使用前后除菌濾器的完整性。將經(jīng)除菌過濾的白蛋白于+2℃-+25℃保存不超過2周。加入注射用水將白蛋白溶液調節(jié)至蛋白質濃度為50±2.5g/l。將pH調節(jié)至7.0±0.3。加入氯化鈉將鈉含量調節(jié)至150±7.5mmol/l。將白蛋白溶液于+2℃-+25℃保存不超過24小時，直至灌注。使用終端0.2μm除菌濾器在無菌條件下將無菌溶液灌注到去除致熱源的輸注瓶中，用滅菌的丁基塞封閉，并用鋁蓋密封。通過生產(chǎn)商說明書所推薦的合適測試方法驗證使用前后除菌濾器的完整性。在整個灌注過程中監(jiān)測灌注體積。根據(jù)歐洲藥典進行巴氏殺菌。根據(jù)歐洲藥典對最終的容器進行孵育。孵育后，肉眼檢查所有瓶的顆粒狀雜質、濁度、瓶和封閉物的缺陷。棄除有缺陷的制劑。將所有瓶保存于+2℃-+25℃。
前激肽釋放酶活化因子前激肽釋放酶活化因子(PKA)將前激肽釋放酶活化為激肽釋放酶，可以通過其從合成的肽底物切割生色團的能力來進行分析，通過分光光度法測定切割速率，通過和以國際單位校準的參照制劑相比較來計算PKA的濃度。
國際單位是由凍干的前激肽釋放酶活化因子組成的規(guī)定量國際標準品的活性。國際標準品的國際單位當量由世界衛(wèi)生組織規(guī)定。
制備前激肽釋放酶底物為了避免凝血激活，用來制備前激肽釋放酶的血液或血漿必須只和塑料或硅氧烷處理的玻璃表面接觸。取9倍體積的人血液到1倍體積的、預先加有1mg/ml海地美溴銨的抗凝溶液(ACD、CPD或38g/l檸檬酸鈉)中。將混合物于3600g離心5min。分離血漿，并再于6000g離心20min，以沉降血小板。分離貧血小板血漿，用10倍體積的緩沖液A透析20h。將透析后的血漿加到含瓊脂糖-DEAE的層析柱上進行離子交換層析，所述的瓊脂糖-DEAE事先用緩沖液A平衡，其等于血漿體積的兩倍。用緩沖液A以20ml/cm2/h的速率從柱上洗脫。收集級分中的洗脫物，并記錄280nm處的吸光度(2.2.25)。合并含第一蛋白峰的組分，從而使合并物的體積約為貧血小板血漿的1.2倍。
通過將1份和用于分析的20份預溫生色底物溶液混合并于37℃孵育2min，驗證底物合并物不存在激肽釋放酶活性。如果吸光度的增加小于0.001/分鐘，則底物是合適的。向每升合并的溶液加入7g氯化鈉，并使用膜濾器(孔徑0.45μm)過濾。將濾液分裝(in portions)冷凍，并于-25℃保存；底物可以在保存之前凍干。
在一個工作日內進行從開始層析到分裝冷凍的所有過程。
分析優(yōu)選使用自動酶分析儀于37℃進行分析，調整底物的體積、濃度和孵育時間，使反應速率至少到35IU/ml時是線性的。必要的話，使用緩沖液B稀釋標準品、樣品和前激肽釋放酶底物。
將稀釋的標準品或樣品與前激肽釋放酶底物孵育10min，使未稀釋樣品的體積不超過孵育混合物總體積的1/10，以避免孵育混合物中離子強度和pH變化所導致的誤差。將混合物或其一部分和至少等體積的、合適的、合成的、溶解于緩沖液B中的顯色底物溶液一起孵育，所述的顯色底物已知對激肽釋放酶是特異的(例如N-苯甲酰-L-脯氨酰-L-苯丙氨酰-L-精氨酸4-硝基苯胺醋酸鹽R或D-脯氨酰-L-苯丙氨酰-L-精氨酸4-硝基苯胺-二鹽酸鹽R)。記錄所用底物特異的波長處每分鐘的吸光度變化速率，記錄2min-10min。使用緩沖液B而非前激肽釋放酶底物制備每個樣品或標準品混合物的空白對照。減去相應空白對照獲得的值來校正ΔA/min。使用參照制劑和各濃度獲得的值繪制標準曲線；使用該曲線確定待驗證制劑的PKA活性。
緩沖液A三羥甲基氨基甲烷 6.055g氯化鈉 1.17g海地美溴銨 50mg疊氮鈉 0.100g
將這些成分溶解于水中，用2M鹽酸調節(jié)至pH8.0，并用水稀釋至1000ml。
緩沖液B三羥甲基氨基甲烷 6.055g氯化鈉 8.77g將這些成分溶解于水中，用2M鹽酸調節(jié)至pH8.0，并用水稀釋至1000ml。

*IPBP大規(guī)模巴氏殺菌工藝中(in process bulk pasteurization)**n.a.不適用(not applicable)
權利要求
1.制備前激肽釋放酶活化因子(PKA)含量降低的富含白蛋白的組分的方法，包括下述步驟(a)重構糊狀物V(科恩分部分離)；(b)對步驟(a)中獲得的組分進行濃縮步驟；(c)在50℃-70℃對步驟(b)中獲得的組分加熱足夠的時間，以對組分進行巴氏殺菌；和(d)任選地灌注所得的組分，備用。
2.權利要求1的方法，其中灌注后進行第二次巴氏殺菌步驟。
3.權利要求1和/或2的方法，其中進行孵育步驟。
4.權利要求3的方法，其中在下列條件下進行孵育步驟30-32℃10天或20-25℃4周。
5.權利要求1-4中任意一項的方法，其中巴氏殺菌在58-65℃溫度下進行至少9h的時間。
6.根據(jù)權利要求1-5中任意一項的方法獲得的前激肽釋放酶活化因子(PKA)減少的含白蛋白的組分。
7.權利要求6的白蛋白，PKA含量小于12IU/ml，優(yōu)選小于10IU/ml，其中PKA根據(jù)歐洲藥典第四版加以測定。
全文摘要
前激肽釋放酶活化因子(PKA)含量降低的含白蛋白的組分，和包括下列步驟的其制備方法(a)重構糊狀物V(科恩分部分離)；(b)對步驟(a)中獲得的組分進行濃縮步驟；(c)在50℃－70℃對步驟(b)中獲得的組分加熱足夠的時間，以對組分進行巴氏殺菌；和(d)任選地灌注所得的組分，備用。
文檔編號A61K38/38GK1717249SQ200380104131
公開日2006年1月4日 申請日期2003年11月25日 優(yōu)先權日2002年11月25日
發(fā)明者維爾納·格林格, 卡塔琳娜·波克 申請人:奧克塔法馬股份有限公司