專利名稱：Janus酪氨酸激酶3(JAK3)的選擇性抑制方法
背景技術：
發(fā)明領域總的來說，本發(fā)明涉及含有Janus酪氨酸激酶3(Jak3)的淋巴細胞和其他淋巴源細胞的增殖和功能的抑制。更特別地，本發(fā)明涉及采用阻斷淋巴細胞功能的化學試劑的治療和測試方法，特別是免疫活性的調(diào)節(jié)。更特別地，本發(fā)明涉及選擇性破壞Janus酪氨酸激酶3(Jak3)介導的細胞活性和細胞增殖。
相關技術描述現(xiàn)今用于對抗器官異體移植排斥的治療策略的效力由于依賴于產(chǎn)生強副作用的免疫抑制藥物，因而具有嚴重的局限性。當前的臨床免疫抑制療法主要為絲氨酸-蘇氨酸磷酸酶鈣調(diào)磷酸酶(Calcineurin)(CaN)抑制劑環(huán)孢菌素A(CsA)和他克莫司(tacrolimus)(FK506)1，它們通過從細胞循環(huán)的早期G1階段阻斷T細胞進程從而起到T細胞修飾劑的作用1，2。與這些藥物相關的不期望副作用包括腎毒性、神經(jīng)毒性、糖尿病、高血脂、高血壓、多毛癥和牙齦增生3。新近的藥物雷帕霉素(rapamycin)(RAPA)，其靶向為RAPA的哺乳動物靶標(mTOR)絲氨酸-蘇氨酸激酶，使用該藥物同樣出現(xiàn)粘膜潰瘍、淋巴增殖紊亂、血鉀過低，以及低密度脂蛋白、膽固醇和甘油三酯增加4。這些臨床批準藥物的嚴重缺點是其不能得到異體移植的永久接受性，因而需對患者持續(xù)輸藥。
近來對抗器官異體移植排斥的治療策略集中于T細胞信號傳導通道和包含所述通道的分子。Kirken和Stepkowski描述了T細胞信號傳導級聯(lián)及其在免疫抑制中的潛在作用，以及對移植耐受的潛在誘導5。T細胞的完全活化需要三個受閾值限制的順序信號6。
由結合特異性T細胞受體(TCR)的抗原傳遞的信號1后接的是由B7/CD28相互作用所傳遞的信號2。結合TCR之后數(shù)秒至數(shù)分鐘之內(nèi)，CD3ζ鏈即在Zap70，Lck，和Fyn蛋白酪氨酸激酶的自活化過程中發(fā)生酪氨酸(Tyr)磷酸化7-9。伴隨發(fā)生的是，鈣(Ca2+)移動觸發(fā)了CaN磷酸酶的催化活化，以使活化T細胞的核因子(NFAT)去磷酸化，這是使NFAT易位至胞核并結合白介素(IL)-2基因啟動子內(nèi)的不連續(xù)DNA結合元件的必要步驟10。信號1和2對于IL-2的合成和分泌是關鍵性的，IL-2和諸如IL-4，-7，-9，-13，-15和-21的其他T細胞生長因子(TCGFs)一道通過細胞因子受體傳遞信號3，這是驅動T細胞克隆擴增的必要步驟11。這些細胞因子受體具有共同的γ鏈(γc)，γ鏈與每一細胞因子的獨特α鏈結合時即經(jīng)由Janus酪氨酸(Tyr)，Jak1和Jak3傳遞胞內(nèi)信號，并且活化信號轉導子及轉錄激活子(Stat)1，Stat3，Stat5a/b和Stat611-18。
CaN酶(參與T細胞內(nèi)的信號1通道)和mTOR酶(參與T細胞內(nèi)的信號3通道)在整個身體的各種組織中普遍有表達。這極大限制了其抑制性藥物如特異性靶向T細胞的CsA，F(xiàn)K506和RAPA的效力。RAPA是迄今唯一被臨床批準有效的信號3抑制劑24。與作為治療干預的侯選靶標的其他信號傳導通道分子不同，Jak3表達顯示了組織表達的有限模式，并且劃分為T細胞，B細胞，自然殺傷(NK)細胞和單核細胞，或通常稱為免疫源細胞。
由于Jak3主要局限于淋巴型細胞，因而其有望作為消除大量免疫源疾病的唯一分子和治療靶標19-21。該酶幾乎排他性地經(jīng)由γc結合及活化，因而Jak3或γc的遺傳性破壞被證明是嚴重的結合性免疫缺陷疾病22。這種完全的免疫抑制是由于Jak3在T細胞發(fā)育以及如上所述被TCGFs家族募集中的關鍵性作用。由于Jak3與接近的受體組分和膜相聯(lián)結，因而所有源自這些受體的下游信號，包括Stat和促細胞分裂原活化的蛋白激酶(Mapk)級聯(lián)信號均可被活化。因而Jak3的破壞隨即阻斷了這些細胞內(nèi)受TCGF介導的所有信號，這些信號調(diào)節(jié)基因轉錄的能力因此也被阻斷。然而，如果能對該唯一且冗長的信號通道的抑制進行控制，則可獲得有利的免疫活性調(diào)節(jié)，如在這些基因有缺陷的患者和小鼠中所觀察到。此外，理論上靶向該通道還可抑制引起排斥對CsA無應答的激活和增殖T細胞群體。
抑制Jak3的幾種報道藥物還會抑制其他酪氨酸激酶的過多，所述其他酪氨酸激酶的過多對于許多機體組織中的日常細胞功能是必需的，鑒于這一事實，識別在淋巴細胞內(nèi)特異性靶向Jak3的抑制劑的努力受到阻礙。實際上在淋巴細胞之外的其他細胞類型中，這些蛋白酪氨酸激酶對于將胞外信號從細胞表面受體轉導至胞核，隨后調(diào)節(jié)生長、分化和功能是十分重要的。
美國專利申請公布號2002/0042513(Uckun等)描述了采用基于對胰島素受體酪氨酸激酶結構同源性的Jak3同源模型，在評測的對接(docking)親和性基礎上選擇的某些喹唑啉化合物。評價了一些喹唑啉化合物治療或預防移植并發(fā)癥、自身免疫誘導的糖尿病或延長異體移植存活率的能力。
美國專利公布號2002/0032204(Moon等)描述了某些3-(吡咯-2-基亞甲基)-2-吲哚酮衍生物的Mannich堿前藥，所述前藥可調(diào)節(jié)受體酪氨酸激酶(RTKs)、非受體蛋白酪氨酸激酶(CTKs)和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(STKs)的催化活性。據(jù)稱這些前藥可用于治療由蛋白激酶活性異常介導的許多疾病。據(jù)稱所公開的化合物可以調(diào)節(jié)RTK、CTK和/或STK介導的信號轉導通道作為治療方法，從而治療許多類型的實體腫瘤。其他的Mannich堿化合物也有描述，并評價了其細胞毒性和抗癌特性34，35。美國專利號6,017,933主題是具有抗真菌和抗腫瘤特性的某些共軛二苯乙烯酮的Mannich堿。
最近識別出對Jak3具有選擇性的兩種試劑21，24，25。表示為AG-490的一種試劑是酪氨酸激酶抑制劑(tyrphostin)家族成員并且是苯亞甲基丙二腈的衍生物，其具有如下通式 另一種試劑是PNU156804，其是毒性母化合物十一烷基靈桿菌素的同族體，具有如下通式 AG-490和PNU156804均競爭性抑制由TCGFs和Jak3自激酶活性介導的T細胞增殖，然而其對未能表達Jak3的未活化T細胞則效果有限。已發(fā)現(xiàn)這兩種試劑均不能影響包括p56Lck或Zap70酪氨酸激酶的T細胞受體活化級聯(lián)中間體23，25。
在一份研究中，AG-490治療減少了單核細胞的移植滲入(GICs)以及離體IL-2刺激的TICs的Stat5a/b DNA結合，但不能影響通過RNA酶保護分析判斷的IL2R□表達。因而可以斷定Jak3的抑制延長了異體移植的存活率并且加強了CsA的免疫抑制效果，但不加強RAPA的效果。研究還發(fā)現(xiàn)AG-490不能抑制其他的酪氨酸激酶家族成員Lck，Lyn，Btk，Syk，Src，Jak1或Tyk2激酶，但對其最緊密相關的家族成員Jak2卻可施以類似效應24。AG-490的不利副作用阻止了其作為免疫抑制治療的日常臨床應用。
另一方面，與采用Jak2的其他生長因子(催乳素)相比，PNU156804通過IL-2抑制Jak3介導的T細胞生長從而顯示出更高的特異性。激酶分析顯示，與Jak2相比，PNU156804優(yōu)先抑制Jak3的自磷酸化，并且共用諸如Stat5通道的中間體效應分子25。該研究顯示PNU156804延長了異體移植存活率并且與CsA協(xié)同作用但與RAPA加成作用。研究還確立PNU156804優(yōu)先使Jak3破壞(與Jak2自激酶活性相比)，從而選擇性抑制γc驅動的T細胞克隆擴增。當前的模型認為Jak3是mTOR的上游激活子。由于Jak3表達于免疫細胞內(nèi)，因而Jak3的抑制將阻斷mTOR的激活，而不存在當前與RAPA關聯(lián)的不利作用。此外，CsA(阻斷G0-G1過渡期)和PNU156804(阻斷G1-S進程)之間的協(xié)同通過阻斷順序活化信號提供了免疫抑制的新穎策略，從而維持有益治療效果的同時每種藥所需劑量更低25。然而PNU156804隨即被證明對人體治療應用毒性過高。
盡管現(xiàn)有的一些可用藥物均顯示有阻斷急性排斥的希望，然而如果沒有持續(xù)性免疫抑制，則慢性移植破壞和永久性異體移植接受性(如移植耐受性)的問題仍未減弱。因而仍需要充分解決上述問題的治療方法和避免不利副作用的藥物。朝著這些目標，在T細胞信號轉導的認識和設計信號傳導通路中靶向某些分子的策略上已有極大跨越。對唯一用于TCGFs激活的T和B淋巴細胞信號3通道的分子，對選擇性或特異性抑制這些分子的試劑存在迫切需求。此類試劑對于阻斷T細胞的克隆擴增而不影響其他細胞具有極大潛力。如上所述，Jak3代表了信號3通道中用于調(diào)節(jié)不期望的免疫應答的唯一分子靶標，所述不期望的免疫應答例如宿主抗移植物和移植物抗宿主的疾病。
優(yōu)選實施方案概述本發(fā)明通過提供使表達Janus酪氨酸激酶3(Jak3)的任意細胞類型的功能和/或增殖破壞或抑制的新途徑，從而尋求克服現(xiàn)有技術中固有的某些缺點，所述任意細胞類型優(yōu)選為淋巴或骨髓源細胞(“淋巴或骨髓細胞”)，包括T細胞，B細胞，自然殺傷(NK)細胞，單核細胞，巨噬細胞和樹突狀細胞。相應地，在本發(fā)明的某些實施方案中，通過以優(yōu)選為Mannich堿的某些化合物處理淋巴細胞，以完成淋巴細胞功能和/或增殖的破壞或抑制，從而達到治療性免疫抑制。在本發(fā)明的某些實施方案中，提供了采用某些Mannich堿化合物或其他化合物的體內(nèi)和體外治療和測試方法，所述化合物之前未知或未被識別出，作為能起免疫抑制劑作用優(yōu)先破壞Jak3而其他廣泛散布的蛋白酪氨酸激酶基本上則不受影響。進行治療使用時，這些試劑能夠完全或至少某種程度上避免通常與現(xiàn)今使用的常規(guī)免疫抑制劑相關的嚴重副作用。此類方法預期可臨床用于減輕器官移植排斥，促進自身免疫疾病、呼吸道過敏(如哮喘)、變態(tài)反應的緩解，及抑制Jak-3依賴性的白血病和淋巴瘤的增生，和抑制表達Jak3的淋巴或骨髓源細胞中的其他Jak-3依賴性病癥。
相應地，在本發(fā)明的一些實施方案中，提供了淋巴或骨髓細胞增殖和/或活性的體外抑制方法，其中淋巴或骨髓細胞如T淋巴細胞、單核細胞或樹突細胞含有或表達Jak3。該方法包含在存在能選擇性抑制Jak3的化合物情況下培養(yǎng)細胞。在某些實施方案中，采用具有通式(1)的化合物 其中R1是H，＝CH2，CH2N(CH3)2，CH2SC(O)CH3，CH2SC6H5，CH2SCH2-(4-C6H4OCH3)，CH2SC(O)C6H5，或CH2N(CH2CH3)2；R2是O；R3是CH2N(CH3)2，CH2N(CH2CH3)2和CH2-(N-morphyl)。在優(yōu)選實施方案中，該化合物是具有通式(1)的649641P(NC1153)，其中R1和R3各自為CH2N(CH3)2。在另一優(yōu)選實施方案中，該化合物是表示為WP938的649641P(NC1153)的立體異構形式。
在某些實施方案中，提供了抑制淋巴或骨髓細胞功能和/或增殖的方法，所述方法包含以至少一種通式(II)的化合物或其鹽與表達Jak3的淋巴或骨髓細胞接觸，所述化合物或其鹽的濃度能有效選擇性抑制所述Jak3活性 其中n是1，2，3，4或6；R1是H，＝CH2，或CH2N(CH3)2；R3是CH2N(CH3)2。
在某些實施方案中，提供了抑制淋巴或骨髓細胞功能和/或增殖的方法，所述方法包括以至少一種通式(III)的化合物或其鹽與表達Jak3的淋巴或骨髓細胞接觸，所述化合物或其鹽能有效地選擇性抑制所述Jak3活性 其中n是1或2；R1是H或CH2N(CH3)2；R3是CH2N(CH3)2。
如上所述，在一些抑制淋巴細胞功能和/或增殖的方法的實施方案中，淋巴細胞是激活的T細胞，所述方法包括干擾信號3通道使得細胞分裂被阻斷。在一些實施方案中，以其濃度能有效地選擇性抑制Janus酪氨酸激酶3而對其他蛋白酪氨酸激酶的活性抑制基本不起作用的化合物與淋巴細胞接觸。在一些實施方案中，在諸如T細胞的淋巴細胞群體中，激酶分析中Jak3活性受到的抑制比Jak2活性多出至少50倍。在一些實施方案中，所述方法包括選擇一種或多種濃度足以抑制IL2激活的Jak3和Stat5a/b，但不能抑制催乳素(PRL)活化Jak2和Stat5a/b或抑制能力較弱的化合物。
在本發(fā)明其他實施方案中，提供了輔助識別可用作治療性免疫抑制劑的物質(zhì)的體外測試方法。所述方法可包含(a)從細胞培養(yǎng)基中獲得Jak3依賴性的靜止T淋巴細胞群體；(b)任選地，以細胞因子對靜止T淋巴細胞預處理，以刺激淋巴細胞增殖；(c)以如上所述具有通式(I)、(II)或(III)的任一種化合物或其鹽對步驟(a)或(b)的靜止或受激淋巴細胞進行處理；(d)在促進細胞生長條件下培養(yǎng)步驟(c)的淋巴細胞；(e)評價步驟(d)之后的細胞增殖程度；(f)任選地，評價所述化合物對Jak2依賴性的T淋巴細胞增殖的抑制效果；(g)任選地，評價所述化合物的細胞毒性；(h)從步驟(e)，以及從步驟(f)和(g)(如果存在)的評價中確定，Jak3依賴性淋巴細胞或其他表達Jak3的細胞類型的增殖的顯著抑制不歸因于化合物的細胞毒性，從而暗示該化合物具有作為T細胞介導的免疫抑制劑和/或作為T細胞增殖抑制劑的體內(nèi)治療用候選藥物的潛力；以及(i)任選地，比較步驟(e)和(f)的評價，如果步驟(f)評價的抑制效果明顯低于步驟(e)中評價的抑制效果，則從所述比較中可確定與抑制Jak2或其他激酶活性相比，所述化合物至少某種程度上對抑制Jak3活性具有選擇性。
根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，提供了哺乳動物受試者中含有Jak3的細胞的不期望功能的體內(nèi)抑制方法。所述方法包括將至少一種如上所述具有通式(I)，(II)或(III)的化合物或其代謝物或衍生物，以有效干擾胞內(nèi)信號3通道的用量與細胞接觸，從而抑制細胞功能。所述接觸包含將治療有效量的藥物組合物給藥至受試者，以抑制Jak3依賴性的細胞功能，所述藥物組合物含有可藥用載體以及至少一種這樣的化合物，或者所述化合物的成熟形式如活性代謝物，或者在受試者體內(nèi)能轉化為所述化合物的所述化合物前體，或者這些物質(zhì)任一種的可藥用鹽。在一些實施方案中，含Jak3的細胞是T細胞，藥物組合物的施用量可有效阻斷T細胞內(nèi)的細胞分裂。在某些優(yōu)選實施方案中，所述化合物、代謝物、衍生物或前體的腎毒性低于環(huán)孢菌素A的腎毒性。
根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案，提供了對哺乳動物受試者進行治療以抑制不期望免疫應答的方法，其中的受試者正經(jīng)受不期望的免疫應答或處于其危險之中。該方法包括實施上述抑制哺乳動物受試者中不期望的淋巴細胞功能的方法，其中治療有效量的藥物組合物緩和或防止了所述不期望的免疫應答。在某些實施方案中，該方法進一步包括對受試者施用治療有效量的除Jak3抑制劑之外的免疫抑制劑；例如環(huán)孢菌素A或FK506。這就通過阻斷經(jīng)由信號1通道的T細胞活化，以及通過干擾信號3通道而阻斷激活T細胞的細胞分裂，從而提供了抑制T細胞功能的優(yōu)勢。
根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案，提供了哺乳動物移植接受體內(nèi)的器官移植排斥的減輕方法，所述方法包含在哺乳動物受試者內(nèi)實施上述抑制不期望的淋巴細胞功能的方法，以有效抑制T細胞介導的對移植器官的免疫應答，從而減輕或阻止器官排斥。
根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案，提供了哺乳動物異體移植接受體內(nèi)的急性異體移植排斥的減輕方法，所述方法包括在哺乳動物受試者內(nèi)實施上述抑制不期望的淋巴細胞功能的方法，以有效抑制T細胞介導的抗異體移植免疫應答，從而減輕或防止異體移植的急性排斥。在一些實施方案中，提供了慢性異體移植排斥的預防方法，所述方法包括連續(xù)或定期施用Jak3抑制劑組合物。
根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案，提供了哺乳動物移植接受體內(nèi)移植耐受性的誘導方法。所述方法包括在哺乳動物受試者內(nèi)實施上述抑制不期望的淋巴細胞功能的方法，以有效抑制T細胞介導的移植排斥應答。
根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案，提供了在遭受自身免疫疾病的哺乳動物受試者內(nèi)促進所述疾病緩和的方法。所述方法包含在哺乳動物受試者內(nèi)實施上述抑制不期望的淋巴細胞功能的方法，以有效抑制所述受試者內(nèi)的T細胞介導的自身免疫應答，從而減少或阻止由內(nèi)源性Jak3依賴性T細胞介導的對受試者天生組織的自身免疫性攻擊。
根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案，提供了在遭受呼吸道過敏癥的哺乳動物受試者內(nèi)緩和所述過敏癥的方法。所述方法包括在哺乳動物受試者內(nèi)實施上述抑制不期望的淋巴細胞功能的方法，以有效抑制受試者內(nèi)T細胞介導的過敏反應，從而減少或阻止受試者內(nèi)的呼吸道組織過敏。
本發(fā)明的一些實施方案提供了在遭受變態(tài)反應的哺乳動物受試者內(nèi)緩和所述變態(tài)反應的方法，所述方法包括在哺乳動物受試者內(nèi)實施上述抑制不期望的淋巴細胞功能的方法，以有效抑制受試者內(nèi)T細胞介導的過敏反應，從而減少或阻止受試者內(nèi)的過敏反應。
本發(fā)明的其他實施方案提供了Jak3依賴性的白血病或淋巴瘤增生的抑制方法，所述方法包含在遭受白血病或淋巴瘤的哺乳動物受試者內(nèi)實施上述抑制不期望的淋巴細胞功能的方法。在優(yōu)選實施方案中，與其他激酶(如Jak2)的活性抑制相比較，化合物或其代謝物或衍生物能選擇性或特異性抑制Jak3活性。藥物組合物的用量可有效抑制或阻斷白血病或淋巴瘤細胞的增生。
在本發(fā)明的其他實施方案中，提供了可用于闡明與T細胞介導的免疫應答相關的生物學過程及用于識別新免疫抑制藥物的體外方法。在一些實施方案中，提供了輔助識別新免疫抑制藥物的體外方法，所述方法包含(a)通過將含Jak3的T細胞與某一范圍濃度的目的化合物接觸，并確定所述化合物是否在該范圍內(nèi)的一個或多個濃度處抑制Jak3活性，從而測試目的化合物破壞T細胞功能的活性；(b)將所述目的化合物的Jak3抑制活性與優(yōu)選為649641P(NC1153)的、已知具有Jak3抑制活性的通式(I)、(II)或(III)的化合物進行比較；以及(c)采用該測試和比較結果以確定目的化合物是否為體內(nèi)用作治療性免疫抑制劑的候選藥物。在一些實施方案中，所述方法還包括(d)測試所述目的化合物對一種或多種其他激酶(如Jak2)的抑制活性；(e)將所述目的化合物的Jak3抑制活性與其對一種或多種其他激酶的抑制活性(如有的話)進行比較；以及(f)采用該比較結果以鑒別作為選擇性Jak3抑制劑的目的化合物。
在本發(fā)明的另一實施方案中，提供了采用某些Jak3選擇性或特異性抑制劑的體內(nèi)測試方法。所述方法將用于研究動物模型中T細胞介導的免疫應答，諸如649641P(NC1153)，WP938和其他

圖14B-39B中所鑒別的化合物可用作比較候選Jak3特異性抑制劑的活性的標準。測試候選免疫抑制藥物對異體移植存活率的效果的一種此類方法包括(a)將取自合適供體動物的異體移植物植入合適的受體動物；(b)對動物保持基本的營養(yǎng)和健康促進條件；(c)將候選藥物施用至至少一個動物中的每一個，以得到治療的受體動物或組；(d)將權利要求1中定義的化合物施用至至少一個動物，以作為陽性對照組，所述化合物中R1和R3各自為CN(CH3)2且R2是O；(e)任選地，保留至少一個受體動物不受治療，以作為未治療的對照受體動物或組；(f)確定每一異體移植物在每一受體內(nèi)的異體移植存活時間；(g)在可適用范圍內(nèi)，對每一異體移植物進行組織學檢查，并評測與候選藥物相關的對每一異體移植物的結構損傷；(h)將每一異體移植物內(nèi)異體移植物存活時間與候選藥物誘導的組織學結構變化進行比較；以及(i)采用(h)的比較結果，與未治療對照受體的異體移植物或陽性對照受體的異體移植物對比，當確定移植物存活時間增加且對藥物處理的異體移植物沒有藥物誘導的結構損傷時，則表示該候選藥物作為免疫抑制劑在體內(nèi)治療使用時可能有效。在一些實施方案中，該方法還包括確定候選藥物能在體外選擇性抑制Jak3依賴性的T細胞增殖。
在某些其他實施方案中，提供了候選藥物體內(nèi)免疫抑制潛力的體內(nèi)評價方法。候選藥物優(yōu)選的是首先被識別為能在體外選擇性抑制Jak3依賴性的T細胞增殖。所述方法包括(a)將取自合適供體動物的異體移植物植入合適的受體動物；(b)對動物保持基本的營養(yǎng)和健康促進條件；(c)將候選藥物施用至至少一個動物中的每一個，以得到治療過的受體或組；(d)將649641P(NC1153)各自施用至至少一個動物，以作為標準受體或組；(e)優(yōu)選地，保留至少一個受體動物不受治療，以作為未治療的對照受體或組；(f)確定每一異體移植物在每一受體內(nèi)的異體移植存活時間；(g)在可適用范圍內(nèi)，對每一異體移植物進行組織學檢查，并評測與藥物相關的對每一異體移植物的結構損傷；以及(h)將每一異體移植物內(nèi)異體移植物存活時間與候選藥物誘導的組織學結構變化進行比較；以及(i)采用(h)的比較結果，與未治療對照受體的異體移植物或陽性對照受體的異體移植物對比，當確定移植物存活時間增加且對藥物處理的異體移植物沒有藥物誘導的結構損傷時，則表示該候選藥物作為免疫抑制劑在體內(nèi)治療使用時可能有效。參考如下說明和附圖可清楚了解本發(fā)明的這些和其他實施方案、特征及優(yōu)點。
附圖簡述圖1A所示為649641P(NC1153)對γc/Jak3依賴且PHA激活的、在不存在或存在1nM人IL-2(■)，IL-4(●)或IL-7(▲)情況下培養(yǎng)的人T細胞增殖的劑量依賴型作用，歸一化至未處理對照。
圖1B所示為649641P(NC1153)對Jak2與Jak3依賴型、在Jak2活化子(PRL[○])或Jak3活化子(IL-2[■])存在下培養(yǎng)的大鼠T細胞增殖的抑制作用。
圖2A-2C的蛋白質(zhì)印跡顯示649641P(NC1153)對磷酸化的抑制或無抑制作用。圖2A所示為人YT細胞中IL-2激活的Jak3酪氨酸磷酸化。圖2B所示為649641P(NC1153)對人YT細胞中IL-2激活的Stat5a酪氨酸磷酸化的作用。圖2C所示為649641P(NC1153)對YT細胞中IL-2激活的Stat5b酪氨酸磷酸化的作用。
圖3的蛋白質(zhì)印跡顯示649641P(NC1153)對PHA激活的T細胞中IL-2激活的p44/42ERK1/2磷酸化作用。
圖4的蛋白質(zhì)印跡表示649641P(NC1153)對YT細胞中激活的Fyn和Lck無作用。
圖5所示為一系列CsA與649641P(NC1153)之比對Lewis至ACI受體大鼠心臟異體移植存活的組合指數(shù)。
圖6A-E的顯微照片(放大200倍)表示649641P(NC1153)，RAPA和CsA對大鼠腎結構影響。圖6A為649641P(NC1153)。圖6B為RAPA。圖6C為CsA。圖6D所示為CsA與RAPA(西羅莫司sirolimus或SRL)的組合影響。圖6E所示為CsA與649641P(NC1153)的組合影響。
圖7A-D顯示649641P(NC1153)特異性抑制含Jak3的T細胞生長。圖7A是以IL-2刺激后，PHA激活的人T細胞增殖被所示NCI試劑阻斷的柱形圖。圖7B是未處理(黑線)或以50μM NC1153(淺色線)過夜處理并對IL2R-α，-β，和-γ鏈染色的PHA激活T母細胞的FACS分析。圖7C是未表達Jak3的Jurkat細胞(黑菱形)和含Jak3的PHA激活T細胞(空心框)在NC1153濃度范圍內(nèi)的細胞生長抑制圖。圖7D是在以利用Jak3和共同γ鏈的細胞因子刺激的T細胞中，NC1153濃度對細胞生長抑制圖。
圖8是基于體外分析、Jak3自激酶活性直接被649641P(NC1153)阻斷的柱形圖。以免疫純化的Jak3分析Jak3自激酶活性，在存在或不存在100□M ATP和/或藥物情況下通過磷酸酪氨酸蛋白質(zhì)印跡進行測試并與對照比較。649641P(NC1153)顯示IC50為約2.5□M，這與圖1A和B中的增殖數(shù)據(jù)相當。
圖9A-C驗證了649641P(NC1153)的選擇性。圖9A是以劑量依賴方式，在用濃度增加的649641P(NC1153)處理過的PHA激活T細胞中，649641P(NC1153)對Jak3驅使的轉錄因子-Stat5a/b抑制作用的電泳遷移率變動分析(EMSA)的放射自顯影(上圖)。在相同的處理組中，非Jak3介導的TNF-□活化Nf□B則不受影響(下圖)。圖9B的蛋白質(zhì)印跡放射自顯影證明649641P(NC1153)不能抑制密切相關的Jak2/Stat5a信號傳導通道。催乳素[PRL](+)或(-)指代是否以具有Jak2活化作用的催乳素刺激細胞。磷酸酪氨酸蛋白質(zhì)印跡檢測出Jak2-Stat5a的活化，但未檢出649641P(NC1153)的抑制作用。圖9C的柱形圖證明649641P(NC1153)對Jak3之外的多種激酶活性無影響。測試649641P(NC1153)在10μM(空心柱)或50μM(實心柱)處對底物的生長因子酪氨酸激酶(FGFR3和PDGFR□)、Src家族酪氨酸激酶(Src，F(xiàn)yn，Lck，Yes，Zap70)或絲氨酸蘇氨酸激酶(PKC和PKA)磷酸化的阻斷。對照的活性圖示為虛線。
圖10A-D例述了NC1153對異體移植存活的體內(nèi)作用。圖10A所示為對Lewis(LEW)腎異體移植的ACI大鼠受體以649641P(NC1153)治療7天的移植存活率，所述藥物通過每天靜脈內(nèi)(i.v.)注射(左圖)或口服管飼(右圖)而給藥。圖10B所示為以649641P(NC1153)治療14天的類似受體的移植存活率，所述藥物通過每天口服管飼而給藥。圖10C所示為以160mg/kg NC1153治療7天而后以3次/星期治療高達90天的類似受體的移植存活率，所述藥物通過每天口服管飼而給藥。圖10D證明了通過每日口服管飼給藥的NC1153與CsA在LEW腎異體移植的、已治療7天的ACI大鼠受體內(nèi)的協(xié)同作用。649641P(NC1153)單獨給藥(深柱)。CsA單獨給藥(空心柱)。649641P(NC1153)與CsA一道給藥(淺柱)。
圖11A-F是證明649641P(NC1153)無腎毒性且不影響脂代謝的分析結果圖，所述分析結果通過血清肌酐水平(圖11A)，血清肌酐清除率(圖11B)，血清膽固醇(圖11C)，甘油三酯(圖11D)，低密度脂蛋白(LDL)-膽固醇(圖11E)以及高密度脂蛋白(HDL)-膽固醇(圖11F)來評測。結果以mg/dL表示。組織學外觀如圖6A-E中所示。
圖12A-B與圖10A-D類似，不同之處在于其所示為測試649641P(NC1153)的內(nèi)消旋立體異構體WP938(圖18B中所示)對LEW腎異體移植的ACI受體的異體移植存活率的結果。圖12A所示為未治療、CsA單獨治療及WP938單獨治療大鼠的平均存活率。圖12B所示為一劑量的單獨CsA，一劑量的單獨WP938與相同劑量的CsA/WP938組合的比較；CI值0.44證明了協(xié)同性相互作用。
圖13A-F所示為WP938單獨或與CsA組合的毒性分析結果。圖13A指代血清肌酸水平。圖13B指代肌酐清除率。圖13C指代膽固醇水平。圖13D指代甘油三酯水平。圖13E指代高密度脂蛋白水平。圖13F指代低密度脂蛋白水平。
圖14A，B-39A，B所示為諸多化合物的化學結構式及在體外分析中所述化合物抑制Jak3依賴或Jak3不依賴的T細胞增殖的活性。(A)IL-2刺激(淺圈)；PRL刺激(深圈)。(B)對應的每一化合物的化學結構式(所示為鹽形式)。
優(yōu)選實施方案詳述在此處描述的研究中，已證實生物化學中間體—Janus酪氨酸激酶(Jak3)—對于成熟T細胞的活化、功能和異體移植排斥至關重要。此處鑒別出的選擇性抑制Jak3的某些化合物，特別是歸類為Mannich堿的化合物，可提供優(yōu)于常規(guī)免疫抑制藥物如CsA，F(xiàn)K506和RAPA的治療效果。如上面發(fā)明背景部分所述，RAPA抑制mTOR，而CsA和FK506則阻斷CaN，這兩種靶分子均顯示出遍在的表達圖譜，從而引起強毒性副作用。相反，Jak3表達則排他性地限定于淋巴區(qū)域內(nèi)，包括T和B淋巴細胞。
首先為了識別Jak3的拮抗劑并對其表征進行一系列測試，從而所述拮抗劑抑制整個TCGF家族依賴性的通道。在一系列濃度下，對一組Mannich堿和其他化合物篩選其選擇性的Jak3抑制活性。與催乳素(PRL)刺激(即Jak2依賴性)的T細胞增殖相比，證明對IL-2刺激(即Jak3依賴性)的T細胞增殖具有一定程度的選擇性抑制、且具有一定結構類似性的化合物的結構式如圖14B-39B中所示。每一化合物的對應抑制活性如圖14A-39A中所示。圖22A示出了與圖21A類似的分析結果，其化合物與圖21B相同但制備純度略微不同。除Mannich堿外，所測試化合物還包括其結構類似物(圖25B和26B)。采用了如下的材料和通用方法，除非實施例中另有陳述。對證明在體外具有相同的Jak3選擇性抑制的代表性化合物649641P和如圖18B中所示的內(nèi)消旋立體異構體(表示為WP938)，進一步測試了其單獨或與CsA組合延長異體移植存活率的能力及藥物誘導的毒性，所述化合物649641P此處也根據(jù)其NCI藥物數(shù)據(jù)庫訪問號稱為NC1153。
通用方法和材料細胞培養(yǎng)和處理將最初由Peter Gout博士(Vancouver，加拿大)開發(fā)的大鼠T細胞系Nb2-11c在37℃/5％CO2下，生長于帶有10％胎牛血清(Intergen，目錄號1020-90)，2mM L-谷氨酰胺，pH7.3的5mMHEPES以及青霉素-鏈霉素(各自為50IU/ml和50μg/ml)的RPMI-1640中。將通過isocentrifugation(Ficoll；EM Science，Gibbstown，NJ)純化的新鮮移植的正常人T淋巴細胞進行72小時的如前面所述23的植物凝集素(PHA)-活化。在與細胞因子接觸之前，通過洗滌并在含有1％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中孵育24小時從而使T淋巴細胞處于靜止期。然后，按如下附圖描述中所述以不同濃度的649641P(NC1153)處理細胞。Mannich堿649641P(NC1153)由College ofPharmacy，University of Saskatchewan，Saskatoon，Saskatchewan，Canada的Jonathan Dimmock博士饋贈。然后在37℃下，以1nM的重組人IL-2(Hoffman-LaRoche，Basel，Switzerland)，IL4或IL7(PeproTech)或者National Hormone and Pituitary Program，National Institute of Diabetes，Digestive，and Kidney Disease(Bethesda，MD)提供的羊催乳素(PRL)刺激所有細胞。細胞沉淀冷凍于-70℃下。
增殖分析。將靜止的人原代T細胞、YT或大鼠Nb2-11c T細胞(5.0×104/孔)鋪板于平底96孔微滴定板中，每孔帶有200μl靜止培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基存在有或不存在1nM的IL-2，-4，-7(PeproTech，Rock Hill，NJ)或PRL。然后，以Mannich堿藥物對細胞處理16小時，然后以[3H]-胸腺嘧啶核苷(0.5μCi/200μl)脈沖4小時，并收獲至玻璃纖維過濾器上。如前所述23，通過液體閃爍計數(shù)或者本領域眾所已知的標準技術分析[3H]-胸腺嘧啶核苷的摻入。
膜蛋白溶解、免疫沉淀和蛋白質(zhì)印跡分析如前所述16，使冷凍的細胞沉淀于冰上融化并溶解于1％TX-100裂解緩沖液(108細胞/ml)中，并通過離心澄清。對于人T細胞，以任一種5μl/ml多克隆兔抗血清與上清液在4℃下首尾疊式(end over end)旋轉孵育2小時，所述抗血清抗衍生自Jak3唯一COOH末端(氨基酸[a.a.]1101-1124)、人Stat5a羧基末端(a.a.775-794)或Stat5b羧基末端(a.a.777-787)的肽26。通過以Protein A-Sepharose珠(Pharmacia，Piscataway，NJ)孵育30分鐘，使抗體和免疫沉淀蛋白被俘獲，沉降純化，并通過在2×SDS樣品緩沖液(20％甘油，10％2-巰基乙醇，4.6％SDS，0.004％溴酚蘭的0.125M Tris緩沖液，pH 6.8)中煮沸4分鐘而洗脫。對于phosphoMapk分析，在SDS樣品緩沖液中解離出約25μg總細胞裂解物，并于還原條件下在10％(所有其他均在7.5％)SDS-PAGE上進行分離。如前所述27，將蛋白質(zhì)轉至聚雙氟乙烯(ImmobilonTM；目錄號1PVH 00010，Millipore，Bedford，MA)。以多克隆抗體，鼠抗磷酸酪氨酸單克隆抗體(單克隆抗體；UBI；4G10；目錄號05-321，UpstateBiotechnology，Inc.，Lake Placid，NY)或phospho p44/42 Mapk(NewEngland Biolabs，Beverly，Massachusetts，分類號9101)進行蛋白質(zhì)印跡分析。如前所述27或采用本領域眾所已知的標準技術，將以上述抗體、兔抗磷酸-Erk1/2和單克隆pan-Erk(Pharmingen，San Diego，CA，分類號E17120)進行的蛋白印跡以1∶1000稀釋于封閉緩沖液中并使用。如前所述27，將以兔抗磷酸-酪氨酸(□PY)和單克隆小鼠抗-Fyn或抗-Lck抗體(BD Biosciences，San Diego，CA，分類號610163[Fyn]和610097[Lck])進行的蛋白印跡以1∶1000稀釋于封閉緩沖液中。
大鼠腎移植根據(jù)動物福利委員會(Animal Welfare Committee)的指南對獲自Harlan Sprague-Dawley(Indianapolis，IN)的成年雄性ACI(RT1a)和Lewis(LEW；RT11)大鼠(160-200g)進行照料。將大鼠安置于對光照和溫度進行控制的住處，并隨意給予食物和水。采用Ono和Lindsey標準顯微手術28將腎從LEW供體異位移植至ACI受體。單獨以Mannich堿化合物通過每日靜脈內(nèi)(i.v.)注射或口服管飼(p.o.)，或者與CsA或RAPA每日口服管飼相結合，對移植受體進行治療用以評價免疫抑制藥物。受體對照組仍維持未治療。一些受體單獨以CsA或RAPA進行治療。移植存活時間定義為能耐受腎移植的動物存活時間。對表示為平均存活時間(MST)±標準偏差(SD)的結果，通過Gehan氏存活測試評估其統(tǒng)計學意義。另外，通過中值效應分析29，30評價Mannich堿與CsA或RAPA之間的相互作用。采用計算機軟件計算組合指數(shù)(CI)值CI＜1表示協(xié)同性相互作用，CI＞1表示拮抗性相互作用，或者CI＝1表示相加性相互作用30。
病理組織學評價。如后面實施例中所述，對LEW(RT11)腎異體移植的ACI(RT1a)受體進行治療處理。移植后第7天，將腎異體移植物置于Bouin’s Fixative(Poly Scientific R&D Corp.，Bay Shore，NY)中。以相同方式對每一腎進行切片，先進行單次水平切割然后是三次連續(xù)的切口以產(chǎn)生出載物片。然后，制作另一切片，接著再進行三次連續(xù)切口并產(chǎn)生出載物片。如前所述31，以蘇木精-曙紅(H&E)或采用本領域已知的標準方法，對每一腎的總共12個載物片進行染色。根據(jù)心肺移植學會(Society of Heart and Lung Transplantation)所建標準32對排斥程度進行評級。特別地，將腎固定于緩沖的10％福爾馬林內(nèi)并進行過夜處理；以漸進性的蘇木精-曙紅(H&E)試劑對3-□組織學切片進行染色。由兩個獨立病理學家采用光學顯微鏡標準的半定量尺度來評價多個腎切片中的血管病變、腎小球變化和腎小管-間質(zhì)損傷的程度。腎小管和腎小球變化分別分級為0＝無變化；1+＝＜5％；2+＝5-25％；3+＝26-50％；且4+＝＞50％有病變。類似的血管尺度包括0＝無病變；1+＝極??；2+＝輕度；3+＝中度；而4+＝嚴重。
EMSA電泳遷移率變動分析(EMSA)。通過離心(20,000×g，1分鐘，4℃)使以藥物或媒介物對照(DMSO)處理的細胞沉積，隨后以5個體積的10mM HEPES，pH 7.9，10mM KCl，1.5mM MgCl2，0.5mM DTT，100mM PMSF，5□g/ml抑肽酶，1□g/ml胃蛋白酶抑制劑A和2μg/ml亮抑酶肽洗滌，離心，然后裂解于補充有1％NP-40的相同緩沖液中并在冰上孵育20分鐘。將含有核的細胞沉淀重懸浮于相同體積的低鹽緩沖液(10mM HEPES，25％甘油，1.5mM MgCl2，20mM KCl，0.5mM DTT，0.2mM EDTA和蛋白酶抑制劑)和高鹽緩沖液(含有800mM KCl的低鹽緩沖液)中。然后通過4℃下離心10分鐘分離該組分，上清液作為核蛋白提取物貯存于-70℃下。采用對應于□-酪蛋白基因啟動子(5’-AGATTTCTAGGAATTCAATCC-3’)或NF-kB結合元件(5’-AGTTGAGGGGACTTTCCAGGC-3’)的Stat5 DNA結合序列，進行凝膠遷移率變動分析以檢測Stat5a/b DNA的結合活性。兩個探針均以[32P]dATP進行末端標記。然后在4℃下，以5g核提取蛋白的15□1結合混合物(cocktail)(50mM Tris-Cl，pH 7.4，25mM MgCl2，5mM DTT，50％甘油)與標記寡核苷酸孵育2小時。對于超遷移率變動分析，則需在4℃下以1μg正常兔血清或對Stat5a，Stat5b，或p50/p65 NF□B特異性的抗血清(Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA；分類號各自為sc-1190X和sc-372X)與核提取物預孵育1小時，如圖例中所指代，然后在室溫下以[32P]-標記的DNA寡核苷酸孵育15分鐘。使DNA-蛋白復合物在含0.25×TBE的5％聚丙烯酰胺凝膠上分離，所述凝膠于100V下在0.25×TBE緩沖液中預運行1小時。載入樣品并使凝膠在室溫及150V下運行約2小時，然后通過真空下加熱進行干燥，并于-70℃曝光于X-射線膠片(X-Omat，Kodak)。
Mannich堿和其他化合物初始研究中采用的化合物649641P(NC1153)由University of Saskatchewan，Saskatoon，Canada的Jonathan R.Dimmock博士提供。649641P(NC1153)和包括圖14B-39B中所識別出的其他化合物，則由M.D.Anderson Cancer Center，University of Texas System，Houston，Texas的Waldemar Priebe博士制備。此處描述的化合物可采用可購自諸如Aldrich Chemical Co.，(Milwaukee，Wis.)和Sigma(St.Louis，Mo.)的市售原料和試劑，通過任意合適方法而制備得到?？刹捎萌鐓⒖嘉墨I中所述的標準化學合成技術和操作步驟，所述參考文獻例如Fieser和Fieser′s REAGENTS FORORGANIC SYNTHESIS，1-17卷(John Wiley and Sons，1991)；Rodd′sCHEMISTRY OF CARBON COMPOUNDS，1-5卷及增刊(Elsevier SciencePublishers，1989)；ORGANIC REACTIONS，1-40卷(John Wiley and Sons，1991)，March′s ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY，(John Wiley and Sons，第4版)以及Larock′s COMPREHENSIVE ORGANIC TRANSFORMATIONS(VCH Publishers Inc.，1989)?；衔锖铣傻钠渌笇Э梢娪谄诳墨I，例如Dimmock的出版物34，35，以及如后面所述。
如下非限制性實例是代表性的Jak3選擇性抑制劑化合物的特性及應用的例述，并無以任何方式限制本發(fā)明的意圖。
實施例1.Mannich堿649641P(NC1153)的體外作用如上所述，將表示為649641P(C18H38C12N2O；分子量369.41)(也稱為NC1153)并具有如下通式的Mannich堿， 以立體異構體的混合物形式加入至正經(jīng)受Jak3對Jak2依賴性增殖的T細胞中，以測試其選擇性抑制Jak3的能力。圖1A所示為649641P(NC1153)對γc/Jak3依賴性PHA激活的人T細胞增殖的效應。在存在或不存在1nM人IL-2(■)，IL-4(●)或IL-7(▲)情況下，以濃度增加的649641P(NC1153)(縱坐標)于37℃下對靜止期的PHA激活人T細胞(5.0×104細胞/孔)培養(yǎng)16小時。然后以[3H]-胸腺嘧啶核苷(0.5μCi/200μl)對細胞脈沖4小時，繪制于橫坐標上的摻入放射標記性探針表示為與DMSO處理樣品組(n＝6)相比的總每分鐘計數(shù)的抑制百分比。
圖1B所示為在Jak2活化子(催乳素；PRL[○])或Jak3活化子(白介素-2；IL-2[■])存在下，649641P(NC1153)對培養(yǎng)于其中的T細胞增殖的效應。選擇大鼠T細胞系(Nb2-11c)，因為其對PRL/Jak2或IL-2/Jak3刺激均有應答。在Jak2活化子(1nM的PRL[○])或Jak3活化子(1nM的IL-2[■])存在下，于37℃以濃度增加的649641P(NC1153)(縱坐標；0-100μM)對靜止期大鼠T細胞(5.0×104細胞/孔)培養(yǎng)16小時。在分析的最后4小時過程里以[3H]-胸腺嘧啶核苷(0.5μCi/200μl)對細胞進行脈沖，然后將摻入DNA的放射標記性探針繪制于橫坐標上，并表示為與DMSO處理樣品組(n＝4)相比的總每分鐘計數(shù)的抑制百分比。如圖1A-B中所示，649641P(NC1153)選擇性地抑制了γc/Jak3依賴性的細胞增殖但對PRL/Jak2依賴性的細胞增殖則無抑制。特別地，在IL-2，IL-4和IL-7的反應中，盡管649641P(NC1153)已證明對Nb2-11c細胞增殖具有相同的抑制效應，但該化合物對抑制Jak3依賴性的增殖比抑制Jak2依賴性的增殖效力要高出3倍。
圖2A-C中示出了649641P(NC1153)對Jak3/Stat5信號通道的作用。在不存在(a-b)或存在(c-i)濃度遞增(1-100μM)的649641P(NC1153)情況下對人YT細胞培養(yǎng)2小時，并以(+)或不以(-)100nM的IL-2重攻擊10分鐘。以抗-Jak3多克隆抗體對細胞進行免疫沉淀，并以抗磷酸酪氨酸單克隆抗體進行蛋白質(zhì)印跡，如圖2A上圖中所示，然后剝離并以抗-Jak3進行重印跡(圖2A下圖)。這些蛋白質(zhì)印跡實驗結果與圖1A中所示相互關聯(lián)，其中人YT細胞中Jak3的酪氨酸磷酸化以劑量依賴性方式被649641P(NC1153)抑制(1-100μM)。參照圖2B，同樣在不存在(a和b)或存在(c至i)濃度遞增(1-100μM)的649641P(NC1153)情況下對人YT細胞培養(yǎng)2小時，并以(+)或不以(-)100nM的IL-2重攻擊10分鐘。以抗-Stat5a多克隆抗體對細胞進行免疫沉淀，并以抗磷酸酪氨酸單克隆抗體進行蛋白質(zhì)印跡(圖2B上圖)，然后剝離并以Stat5a進行重印跡(圖2B下圖)。在結果示于圖2C的第三個測試中，在不存在(a-b)或存在(c-i)濃度遞增(1-100μM)的649641P(NC1153)情況下對人YT細胞培養(yǎng)16小時，并以(+)或不以(-)100nM的IL-2重攻擊10分鐘。以抗-Stat5b多克隆抗體對細胞進行免疫沉淀，并以抗磷酸酪氨酸單克隆抗體進行蛋白質(zhì)印跡(圖2C上圖)，然后剝離并以抗-Stat5b進行重印跡(圖2C下圖)。
IL-2還經(jīng)由接頭蛋白Shc而強烈活化Shc/Ras/Raf/Erk通道，所述Shc結合至IL-2Rβ鏈的Tyr338從而最終驅動T細胞增殖。圖3示出了與上述類似實驗的結果，其中研究了濃度遞增的649641P(NC1153)對IL-2介導的p44/42 Erk1/2磷酸化的效應。以DMSO(對照；a-b道)或濃度增加(c-i道)的649641P(NC1153)對靜止期的PHA活化T細胞處理2小時，然后于37℃及1μg存在下對細胞刺激10分鐘。將細胞進行溶胞并將全部溶胞物在10％SDS-PAGE上進行分離，轉移至PVDF膜以抗磷酸-p44/42 Erk1/2進行蛋白質(zhì)印跡(上圖)，然后剝離并以panErk抗體重新進行探針檢測(下圖)。箭頭表示p44/42 Erk1/2的位置。該結果揭示出649641P(NC1153)阻斷了人T細胞中IL-2介導的Erk1/2活化。
YT細胞組成型表達活化的Fyn和Lck激酶，所述激酶可通過測試其酪氨酸磷酸化狀態(tài)而顯示出。以不同濃度的649641P(NC1153)(1-100□M)將YT細胞培養(yǎng)2小時。以抗-Fyn或抗-Lck抗體對細胞提取物進行免疫沉淀，并以抗-磷酸酪氨酸抗體(□PY)進行蛋白質(zhì)印跡，然后剝離并以抗-Fyn或抗-Lck抗體進行重印跡。圖4示出了上述實驗的結果。以抗-Fyn對YT細胞提取物進行免疫沉淀并以抗-磷酸酪氨酸抗體(□PY)進行蛋白質(zhì)印跡(第一排)，然后剝離并以抗-Fyn進行重印跡(第二排)；以抗-Lck抗體對YT細胞提取物進行免疫沉淀(IP)并以抗-磷酸酪氨酸抗體(□PY)進行蛋白質(zhì)印跡(第三排)，然后剝離并以抗-Lck抗體進行重印跡(第四排)。YT細胞僅以媒介物(a和b道)或以濃度增加(1-100□M)的649641P(NC1153)(c-i道)進行培養(yǎng)。該結果顯示649641P(NC1153)沒有阻斷Fyn或Lck激酶的活性。
前述結果顯示出，盡管其他抑制劑可抑制Jak3和Jak2應答的細胞生長(IC50約10-25μM)，而649641P(NC1153)則以約2.5μM的IC50通過破壞細胞生長而更有效。此外，649641P(NC1153)在相同濃度處(IC50約2.5□□)有效抑制了IL4或IL7驅使的細胞生長。如磷酸-蛋白質(zhì)印跡所測，該試劑抑制了Jak3及其底物Stat5a/b，接頭蛋白Shc和Erk1/2的酪氨酸磷酸化。較之前述顯示IC50約10□□的PNU156804 Jak3抑制劑，649641P(NC1153)更有效。此外，盡管Stat5a/b對寡核苷酸探針的DNA結合受到649641P(NC1153)的極大削弱，但由于對TNF-□誘導的NF-kB的DNA結合無作用，因而該化合物對該轉錄因子具有特異性。該649641P(NC1153)化合物不抑制未表達Jak3的人Jurkat T細胞的DNA合成，也不抑制TCR信號傳導中間體Lck或Fyn酪氨酸激酶的活化。
實施例2.Mannich堿649641P(NC1153)對異體移植物存活率的效應為測試體內(nèi)效應，對腎異體移植物受體在移植后立即以649641P(NC1153)治療7天。單獨以2.5，5.0，10.0或20.0mg/kg的649641P(NC1153)每日靜脈內(nèi)注射，或者與2.5，5.0，10.0或20.0mg/kg CsA每日口服管飼相結合，對LEW(RT1l)腎異體移植物的ACI(RT1a)受體治療7天。如表1中所示，通過靜脈內(nèi)注射或口腔管飼單獨施用的649641P(NC1153)以劑量依賴方式延長了大鼠腎異體移植物的存活率。由于80mg/kg 649641P(NC1153)口腔管飼所產(chǎn)生的存活率與10mg/kg 649641P(NC1153)靜脈內(nèi)注射類似，因而估測口服的生物可利用率為約12.5％。對每組的5-6個實驗計算平均存活時間(MST)和SD。通過中值效應分析計算組合指數(shù)(CI)值(CI＜1顯示協(xié)同性相互作用，CI＞1為拮抗性相互作用，而CI＝1則為相加性相互作用)29，30。
表1腎異體移植物存活率(649641P(NC1153)靜脈內(nèi)給藥)
649641P(NC1153)通過口腔管飼單獨給藥，或者與CsA相結合對腎異體移植物存活率的效應如表2中所示。單獨以40，80或160mg/kg/天的649641P(NC1153)口腔管飼或者與2.5，5.0，10.0或20.0mg/kg/天的CsA口腔管飼相結合，對LEW(RT11)腎異體移植物的ACI(RT1a)受體每天一次治療7天。對每組的5-6個實驗計算MST和SD。計算組合指數(shù)(CI)值。
表2腎異體移植物存活率(649641P(NC1153)口腔管飼)
通過Gehan氏的存活率測試，對表2中所示MST±SD結果評測統(tǒng)計學意義。
對表1中的結果計算組合指數(shù)(CI)值對CsA/649641P(NC1153)比例，并作圖，如圖5中所示。考慮到CsA口服生物可利用率為90％，因而相比較于1∶1，1∶2或1∶4(CI＝0.38-0.60)的CsA/649641P(NC1153)比例，CsA/649641P(NC1153)比例為4∶1，3∶1，2∶1和1.5∶1時顯示出更好的協(xié)同性(CI＝0.1-0.27)。采用中值效應分析和組合指數(shù)(CI)值來計算649641P(NC1153)和CsA之間相互作用的質(zhì)量。如CI值所證實(0.6-0.1；圖5)，649641P(NC1153)和CsA的組合是協(xié)同性的；649641P(NC1153)/CsA比例為1∶2至1∶4時最有效(CI＝0.1-0.27；表1)。
總結該結果，顯示出649641P(NC1153)劑量依賴性地延長了腎異體移植物的存活率20mg/kg/天649641P(NC1153)、持續(xù)7天靜脈內(nèi)給藥的劑量所產(chǎn)生的MST為24.8±6.6天(p＝0.00003vs.未治療對照；MST＝8.8±0.5天)，240mg/kg/天649641P(NC1153)、持續(xù)7或14天口服給藥的劑量所產(chǎn)生的MST為47.8±19.59或＞60天(兩種情況下均為p＜0.00001)。單獨以CsA治療(2.5，5，10或20mg/kg/天，持續(xù)3天)產(chǎn)生出劑量依賴性效應，在最高劑量處獲得的MST為24.50±4.58天(p＜0.0001)。與各試劑單一治療相比，結合治療在移植物存活率中顯示出強有力的協(xié)同性相互作用。例如，雖然7天單獨i.v.施用2.5mg/kg/天649641P(NC1153)產(chǎn)生出的MST為9.5±1.4天，3天單獨施用10mg/kg/day CsA產(chǎn)生出的MST為21.2±5.3天，但兩種藥物的組合可將存活延長至41.4±9.8天(p＝0.00002)。在649641P∶CsA劑量比例為4∶1和2∶1處觀察到最優(yōu)結果，所獲得的CI值各自為0.11和0.27。由此可以作出結論，已識別出在腎異體移植模型中具有體內(nèi)免疫抑制作用并且與CsA組合可產(chǎn)生顯著協(xié)同性效應的新型選擇性Jak3抑制劑649641P(NC1153)。
實施例3.649641P(NC1153)的腎毒性評價從已進行如下處理的LEW(RT11)腎異體移植物的ACI(RT1a)受體獲取組織供組織學檢查對低鹽進食7天的受體以如下藥物治療14天10mg/kg 649641P(NC1153)靜脈內(nèi)給藥；0.16mg/kg RAPA靜脈內(nèi)給藥；10mg/kg CsA口服給藥；10mg/kg CsA口服給藥與0.16mg/kgRAPA靜脈給藥相結合；或者10mg/kg CsA口服給藥與10mg/kg649641P(NC1153)靜脈給藥相結合。在第14天殺死大鼠，并根據(jù)標準方法采用H&E染色對腎進行組織學檢查。圖6A-E中的顯微照片顯示出649641P(NC1153)單獨或與CsA相結合對腎結構的作用。所有提供的照片均為放大200倍。在每一組5只大鼠中均觀察到類似結果。單獨的649641P(NC1153)(圖6A)或RAPA(圖6B)給藥在腎中均未顯示出明顯變化。相反，單獨的CsA(圖6C)給藥則引起腎小管30％受損，可見為空泡形成和萎縮。CsA/RAPA(SRL)組在90％腎小管中顯示有廣泛的空泡形成并伴有萎縮和致密核(圖6D)。與CsA/RAPA組截然不同，以CsA/649641P(NC1153)組合治療的大鼠的腎顯示出與CsA單獨組中所觀察到相類似的變化(圖6E)。簡單的說，649641或RAPA單獨均不引起腎毒性。而CsA單獨則具有腎毒性，RAPA可增強這種腎毒性作用，而649641P(NC1153)則不能增強。
除上述組織學研究外，還對649641P(NC1153)治療的動物評價通常與SRL相關聯(lián)的毒性類型。在該研究中，動物治療包括649641P(NC1153)單獨治療或與CsA組合治療。對Wistar-Furth大鼠給予649641P(NC1153)(10mg/kg/天靜脈內(nèi)注射或40/mg/kg/天管飼)或SRL(1.6mg/kg/天管飼)單獨治療或與CsA(10mg/kg/天管飼)相結合。通過少鹽(0.05％NaCl)來評測慢性腎毒性或者通過補充脂肪(17.7％甘油三酯，5.02％膽固醇)，經(jīng)7天的進食預調(diào)理以之后，對各組大鼠進行7，14或28天的治療過程(n＝6/藥物/持續(xù)時間)。通過Fishers t檢驗評測肌酐清除率(CrCL)；全、低和高密度(HDL)膽固醇(CHOL)組分；甘油三酯(TG)；骨髓細胞構成；外周血液計數(shù)(PBC)；以及血液化學的差別。
該研究結果顯示，649641P(NC1153)引起體重增加(p＝0.0002)，而沒有加強CsA或SRL所產(chǎn)生的體重減少。未治療的CrCL值(2.00.1mL/min)和649641P(NC1153)單獨治療的CrCL值(1.90.1mL/min)類似，而SRL單獨治療時CrCL值則減少(1.70.1mL/min；p＜0.02)，CsA單獨治療時也減少(1.3 0.1mL/min；p＜0.001)。與CsA單獨治療相比，增加648641P并沒有進一步減少CrCL值(1.380.2mL/min；p＝0.68)；而增加SRL則顯著減少了CrCL值(0.90.2mL/min；p＝0.03)。與低鹽進食的未治療大鼠相比，649641P(NC1153)減少了血清CHOL(82.0 5.0對65.5 9.4mg/dL；p＝0.03)而增加了HDL(p＝0.004)，TG或LDL水平則無改變。648641P沒有增加CsA的高膽固醇血癥作用(77.5 7.0單獨給藥對64.1 12.7mg/dL組合給藥)，這與SRL+CsA形成對照(107.88.4mg/dL；p＝0.0005)。對于高脂肪進食大鼠，SRL對未治療動物中的CHOL(689.567.4；p＝0.00001)和其他脂類組分產(chǎn)生出顯著作用；CsA作用略小(545.795.7mg/dL；p＝0.0002)，而649641P(NC1153)僅產(chǎn)生中度變化(323.851.1mg/dL；p＝0.01對237.5 31.4mg/dL)。649641P(NC1153)對HDL，LDL，或TG水平均無影響。與未治療大鼠相比，648641P和CsA均不減少PBC，這與SRL形成對比(p＜0.04)。盡管SRL/CsA宿主顯示出低細胞髓(30-40％被脂肪組織所取代)，649641P/CsA組合則顯示與未治療大鼠無明顯變化。鑒于這些結果，可斷定649641P(NC1153)無腎毒性和骨髓毒性作用，對高脂肪攻擊則具有中度脂毒性。由于649641P(NC1153)不會以掩蓋SRL那樣的方式加劇CsA的不利作用，因而其對淋巴成分似乎具有選擇性作用。
從前述研究可以下結論認為，649641P(NC1153)阻斷了Jak3活性，單獨延長了異體移植存活率，并且與CsA協(xié)同作用。與Jak2依賴性的T細胞增殖相比，優(yōu)選化合物649641P(NC1153)對Jak3依賴性的T細胞增殖顯示出體外選擇性抑制，并且體內(nèi)延長了器官異體移植物的存活率而未引起任何的腎毒性副作用。較有利的是，649641P(NC1153)與環(huán)孢菌素顯示出強有力的協(xié)同性相互作用，從而延長了器官異體移植物的存活率而不會增加環(huán)孢菌素誘導的腎毒性。此外，較之之前所述的化合物AG490和PNU156804，649641P(NC1153)對阻斷Jak3介導的細胞活性顯示出更強的特異性，而對Jak2介導的細胞活性則無特異性。盡管目前還不清楚與施用649641P(NC1153)相關聯(lián)的上述理想藥理學特性是否完全歸因于649641P(NC1153)化合物與Jak3的直接相互作用，或者，例如Jak3的抑制在體內(nèi)是否被649641P(NC1153)的代謝物或衍生物形式介導至任意程度。在后一情況下，如果有醫(yī)療指示的話，設想可以任一這種活性代謝物或衍生物直接給藥對649641P(NC1153)進行替代治療。同樣地，如果個體顯示出特別需求的話，可將在體內(nèi)作用產(chǎn)生出此處所述的一種選擇性Jak3抑制劑化合物的前體化合物進行治療性給藥。
實施例4.治療應用649641P(NC1153)化合物被認為是此處所述用于免疫抑制治療及治療含有或表達Jak3的淋巴、骨髓或其他細胞的病理學的化合物組的醫(yī)學用途的代表。這些化合物被認為對人體中T細胞相關的疾病，以及對獸醫(yī)實踐中的應用，對于理想地需抑制Jak-3依賴性的淋巴或骨髓細胞功能而不影響其他蛋白激酶的活性，或者影響此類激酶至較少或治療可接受程度的應用特別有用。治療包括施用有效量的化合物，以干擾淋巴細胞或者淋巴或骨髓源的表達Jak3的其他細胞的信號3通道，從而抑制其功能。例如，阻斷細胞分裂。所述施用可采用化合物的酸形式或其可藥用的鹽，或可以是具生物學活性的化合物代謝物形式?；蛘?，可施用能在受試者體內(nèi)代謝至化合物的一種或多種活性形式的前體化合物，從而破壞Jak-3依賴性的淋巴細胞功能，優(yōu)選為阻斷細胞分裂。施用可以是連續(xù)或間歇性的。
在某些醫(yī)療情況下，需抑制個體的不期望免疫應答，在這些情況下施用有效量的含649641P(NC1153)或前體或活性代謝物的藥物組合物可緩解或預防不期望的免疫應答。通過共同施用治療有效量的不經(jīng)由Jak3抑制而顯效的不同免疫抑制劑，例如環(huán)霉菌素A或FK506，可得到更好結果而對個體產(chǎn)生的毒性則更小。此類應用的實例包括緩解哺乳動物移植或異體移植受體中的器官移植排斥或異體移植物排斥，或者誘導移植耐受性。在其他情況下，治療目標可以是促進由內(nèi)源性Jak3依賴性的T細胞介導的自身免疫疾病的緩解，從而減少或阻止對受試者天生組織的自身免疫攻擊。其他應用途徑包括施用649641P(NC1153)藥物制劑，從而通過抑制T細胞介導的超敏反應來緩解哺乳動物受試者中的呼吸道過敏癥。類似地，可治療變態(tài)反應性患者，以抑制T細胞介導的變應性應答從而減少或阻止變應性反應。還可預期通過施用含有649641P(NC1153)的藥物組合物來抑制Jak3依賴性的白血病或淋巴瘤的增生。以649641P(NC1153)治療性處理的一個顯著的潛在性優(yōu)點是，其通過選擇性抑制僅限于淋巴室細胞(及表達Jak3的骨髓細胞)的Jak3活性，對Jak2及全身許多組織中可見的其他蛋白激酶活性作用極小或無作用，因而預計其副作用更小。
藥物組合物。適于治療應用的藥物組合物含有酸形式的649641P(NC1153)化合物或其可藥用的鹽或水合物，并結合有合適的載體?？伤幱玫柠}或水合物指對藥物化學家顯而易見的化合物的鹽或水合形式，即可有利影響化合物的物理或藥代動力學特性的形式，所述特性例如溶解度、適口性、吸收性、分散性、新陳代謝和排泄性。在化合物形式的選擇中也很重要，且實際上更為實用的其他因素包括原料的成本、所得原料藥的結晶容易度、收率、穩(wěn)定性、溶解性、吸水性和可流動性。當化合物帶負電荷時，通過平衡離子例如諸如鈉或鉀的堿金屬陽離子對其進行平衡。其他合適的平衡離子包括鈣、鎂、鋅、銨，或者烷基銨陽離子如四甲銨、四乙銨、膽堿、三乙氫銨、葡甲胺、三乙醇氫銨等。平衡離子的合適數(shù)量與維持總電荷中性的分子相關。同樣，當化合物帶正電荷時，例如質(zhì)子化，則提供合適數(shù)量的負電荷平衡離子以維持總電荷中性。
可藥用的鹽還包括酸加成鹽。因而該化合物可以衍生自無機或有機酸或堿的鹽形式使用。其實例包括醋酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、環(huán)戊烷丙酸鹽、二葡萄糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙烷磺酸鹽、延胡索酸鹽、葡糖庚酸鹽、甘油磷酸鹽、偏硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙烷磺酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、甲烷磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、煙酸鹽、草酸鹽、雙羥萘酸鹽、pectinate、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽和十一烷酸鹽。堿鹽包括銨鹽，諸如鈉和鉀鹽的堿金屬鹽，諸如鈣鹽和鎂鹽的堿土金屬鹽，帶有有機堿的鹽如二環(huán)己基胺鹽、N-甲基-D-葡糖胺，以及帶有氨基酸的鹽如精氨酸、賴氨酸等?？梢匀缦略噭獕A性基團進行季銨化低級烷基鹵例如甲基、乙基、丙基和丁基氯、溴和碘；二烷基硫酸酯如二甲基、二乙基、二丁基及二戊基硫酸酯，長鏈鹵化物如癸基、月桂基、豆蔻基和硬脂酰基氯、溴和碘；芳烷基鹵如苯甲基和苯乙基溴及其他。其他可藥用的鹽包括乙醇硫酸鹽和硫酸鹽。
此處描述的Jak3抑制劑化合物，可通過將該化合物與可藥用的載體相結合而配制于藥物組合物中，正如本領域所已知?；衔锏牟捎眯问娇梢詾榉勰┗蚪Y晶形式，溶液或懸浮體形式?？赏ㄟ^口服、腸胃外(靜脈內(nèi)或肌內(nèi))、局部、經(jīng)皮或通過吸入而給藥。所采用的載體可視情況而為固體或液體。固相載體的實例包括乳糖、白土、蔗糖、滑石、明膠、瓊脂、果膠、阿拉伯膠、硬脂酸鎂、硬脂酸等。液相載體的實例包括糖漿、花生油、橄欖油、水等?？诜褂玫妮d體包括本領域眾所已知的延時材料，如單獨的一硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，或者帶有石蠟。局部施用可在諸如疏水或親水性堿的載體中配制以形成軟膏、乳油、洗劑，在水性、油性或醇類液體中配制以形成涂劑，或者在無水稀釋劑中配制以形成粉末?？诜腆w劑型的實例包括片劑、膠囊、片劑(troches)、錠劑(lozenges)等。劑型尺寸可廣泛改變，但優(yōu)選為從約25mg至約500mg?？诜后w劑型的實例包括溶液、懸浮體、糖漿、乳液、軟明膠膠囊等?？勺⑸鋭┬偷膶嵗o菌注射液體，例如溶液、乳液和懸浮體?？勺⑸涔腆w的實例包括注射前在液體中復溶、溶解或懸浮的粉劑。在可注射組合物中，載體典型地含有供肌內(nèi)注射的無菌水、鹽水或諸如花生油的其他可注射液體。還可包括各種可藥用的緩沖劑，防腐劑等。
劑量用于實施此處所述Jak3選擇性抑制劑化合物的治療應用的藥物組合物包括含有有效量活性成分的組合物，以實現(xiàn)預期目的，即Jak3活性的選擇性破壞或抑制，或者Jak3相關病癥的治療或預防。起初可從此處描述的細胞增殖分析估測治療有效的用量或劑量。然后可對劑量進行配制供動物模型中使用，以得到循環(huán)濃度范圍，包括細胞培養(yǎng)中所確定的IC50(即達到對IL2依賴性增殖最大抑制的一半，而對PRL依賴性增殖抑制極小或無抑制時的化合物濃度)，同樣如此處所例證。然后利用這些信息，根據(jù)標準藥理學實驗，更精確地確定人體和其他哺乳動物中的有用劑量范圍。劑量可依賴于所采用的劑型和所采用的給藥途徑而改變。例如，可按個體而調(diào)整劑量和間隔時間，以得到足以啟動和/或維持所期望的Jak3抑制效應的活性成分的血漿水平。該血漿水平通常稱為最小有效濃度(MECs)。不同化合物的MEC可有所變化，但可從如上指出的體外數(shù)據(jù)而估測出。例如，可采用此處所述的分析法確定必需達到T細胞群體中Jak3自激酶活性的50-90％抑制時的濃度?？刹捎肏PLC分析或生物分析以確定血漿濃度。劑量的間隔時間也可由MEC值而確定出。優(yōu)選地，采用使血漿水平在MEC之上維持期望時間段的方案，而施用化合物。在包括局部施用或選擇性攝入的治療中，化合物或其活性代謝物或衍生物的有效局部濃度可能不被血漿濃度充分反映出來。在此情況下，可采用本領域已知的其他操作流程以確定適當?shù)膭┝亢烷g隔時間。成人口服的合適劑量范圍的實例為每天約0.1至約80mg/kg，以單次或分開給藥。腸胃外給藥的合適劑量范圍的實例為每天約0.1至約80mg/kg，以單次或分開給藥，通過靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射而施用。局部施用的劑量范圍的實例為約0.1mg至約150mg，外部施用每天大約1至4次。吸入的劑量范圍的實例為每天約0.01mg/kg至約1mg/kg。確切的配方、給藥途徑和劑量可由各個醫(yī)生根據(jù)患者狀況、待治療疾病的性質(zhì)和其他因素而選擇。
實施例5.另外的Jak3選擇性抑制劑化合物在前面的實施例中，已證明649641P(NC1153)能選擇性或特異性抑制含Jak3的T細胞的增殖和功能，延長了異體移植存活率，并證明具有低毒性。鑒于這些評價，很明顯649641P(NC1153)對于治療具有免疫相關病癥的個體很可能具有治療價值。在體外分析或體內(nèi)研究中評價其他候選藥物化合物抑制或破壞Jak3的選擇性方面，該化合物也可用作比較的標準而成為有價值的試劑。
如上指出，在本研究過程中，檢索了NCI藥物發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(DrugDiscovery Database)，以查找可用作Janus激酶3(Jak3)選擇性抑制劑的其他候選化合物。評測了對“種子”化合物AG490顯示類似相關系數(shù)的化合物，所述“種子”化合物是具有Jak3抑制潛力的酪氨酸抑制激酶。
比較(COMPARE)算法NCI藥物數(shù)據(jù)庫含有成千上萬個從世界各地收集來的化合物。其包括從大型藥物公司至小型私人實驗室的饋贈物。許多情況下化合物的加入是為了測試及提升該數(shù)據(jù)庫。然而，許多化合物由于對其初始提出的功能無效而被制造者放棄，并且有些情況下提交化合物的公司已經(jīng)不再經(jīng)營。不管藥物的狀態(tài)如何，其結構和所產(chǎn)生的活性仍被加入每周更新的數(shù)據(jù)庫。
數(shù)據(jù)庫是通過測試特定藥物對60種不同人細胞系(例如上皮、肺、結腸、單核/巨噬細胞、T-B細胞、乳腺細胞-前列腺細胞(prostrate)等)的劑量應答而產(chǎn)生的。測量三個參數(shù)，包括細胞生長的抑制(IC50)，細胞毒性(LC50)，及靜胞效應(TGI)。三個參數(shù)合在一起構成對每一化合物的平均圖表“標志”。顯示正值的藥物(向右突出)反映超出平均的細胞敏感度。負值(向左突出)表示細胞系對測試試劑的敏感度低于平均值。COMPARE是基于每一化合物的體外活性進行排序以預先確定“種子”的算法，如本情況中為AG-490。采用Pearson氏相關系數(shù)(PCC)，對每一藥物將平均圖表轉換成標量指數(shù)等級。最后，具有最類似效應的藥物將顯示出高等級相關性(接近1)，并可能具有類似于種子化合物的作用機制。
COMPARE已成功用于具有類似作用機制的化合物的鑒別。這是一個假想模型，其基于的前提是例如阻斷細胞生長的類似藥物將靶向類似細胞類型中的相同關鍵性靶通道。極大依賴于特定通道的細胞(例如表達JAK3/Stat5的細胞)將對該通道的抑制具有敏感性，而對不能表達此類分子或對該通道依賴性較小的細胞，則相同的藥物僅具有極小或不具有作用。這就使COMPARE能將對一組細胞具有類似作用機制的藥物集合到一起。
迄今完成的許多不同研究已顯示，該方法已成功用于鑒別對相同分子靶標起選擇性作用的新試劑，從而得到獨特的平均圖表模式(meangraph pattern)。COMPARE算法可鑒別出與種子相比具有不同結構，但具有相同作用機制的化合物的相似平均模式。實驗室研究需證實特定讀出之中的匹配(JAK3 Stat5磷酸化)。COMPARE依賴于相似的藥物作用機制而無需依賴于化學結構。這就可鑒別出之前從未識別到的新穎結構類別的化合物，作為給定靶標的特定抑制劑。該方法的有效性已通過鑒別p53、Raf、拓撲異構酶及微管蛋白結合蛋白的抑制劑而得以證實。一旦發(fā)現(xiàn)已知作用機制的某一結構類別，則可采用可用類似物的另外篩選及新型類似物的合成，以明確并優(yōu)化相關藥物。
在上面提及的NCI藥物數(shù)據(jù)庫篩選中鑒別出的化合物是649641P(NC1153)及數(shù)個649641P的同類物或結構類似物。評測了化合物637712，640674，643423，655906，673137，683332和693812(根據(jù)其NCI數(shù)據(jù)庫訪問號表示)對T細胞增殖的效應并與AG490，PNU 156804和649641P(NC1153)的效應比較。這些對比分析的結果以條形圖方式示于圖7A中。可以看出PHA活化的人T細胞以IL-2刺激后，其增殖被這些NCI試劑阻斷。NC1153的結構式示于插圖中。NC1153對IL2受體表達不起作用。
同樣還示有(圖7B)未以(粗線)或以50μM NC1153(淺線)過夜處理并對IL2R-α，-β，和-γ鏈染色的PHA活化T母細胞的FACS分析。虛線表示以NC1153預處理的細胞。這些結果表明，所存在的IL-2受體未受NC1153的影響。該發(fā)現(xiàn)證明IL2信號的喪失并非由于受體表達的改變，由此發(fā)生于IL2受體的遠側，因而是Jak3。如圖7C中所示，NC1153化合物并未阻斷不表達Jak3的細胞的細胞生長。與含Jak3的PHA活化T細胞(空心框)相反，不能表達Jak3的Jurkat細胞(黑菱形)在以NC1153處理之后并未顯示細胞生長的顯著變化。將數(shù)據(jù)歸一為媒介物對照的百分比。NC1153通過利用Jak3和共同γ鏈的細胞因子抑制了細胞生長(圖7D)。同樣如圖1中所示，將649641P(NC1153)處理的T細胞的T細胞增殖抑制IL2、IL4或IL7驅使的生長，以劑量依賴方式歸一化至未處理對照。由此，NC1153的抑制效應并不限于僅受IL-2刺激的細胞。相反，采用Jak3的整個細胞因子家族均被NC1153所阻斷。
參照圖8，提供了649641P(NC1153)抑制Jak3信號傳導通道的直接證據(jù)。基于體外分析，Jak3自激酶活性被NC1153直接阻斷。標識為“PY-Jak3”的條帶僅表示在指示劑量的NC1153處的活性Jak3，帶有或不帶有IL-2和ATP。標識為“Jak3”的條帶表示存在的總(活性加無活性)Jak3蛋白。為了顯示出Jak3的抑制阻斷了下游通道，對免疫純化的Jak3分析其自激酶活性，并在存在或不存在100μM ATP和/或藥物情況下通過磷酸酪氨酸蛋白質(zhì)印跡進行測試并與對照比較，如圖2A-C中所示。還觀察到649641P(NC1153)顯示的IC50約為2.5μM，與增殖數(shù)據(jù)相當，如圖7A和7D中所示。
圖9A-C顯示出NC1153未抑制非Jak3信號傳導通道。在圖9A中，可以看到在以濃度增加的NC1153處理的PHA活化T細胞中，NC1153以劑量依賴方式抑制了Jak3驅使的轉錄因子—Stat5a/b，如EMSA分析所檢測(上圖)。標識為“冷競爭”的泳道含有未標記的探針。然而，在相同的處理組中，非Jak3介導的TNF-□活化Nf□B(下圖)則未受影響。圖9B中所示結果證實NC1153不能抑制密切相關的Jak2/Stat5a信號傳導通道。以濃度增加的NC1153處理大鼠Nb2細胞，然后以催乳素刺激細胞。磷酸酪氨酸蛋白質(zhì)印跡檢測出活化但未檢測出受NC1153抑制?；隗w外分析，在Stat5a/b活化中，Jak3介導的Jak3自激酶活性被NC1153直接阻斷。NC1153對多種激酶的活性不起作用。在圖9B和圖8所示的激酶分析中，Jak3的抑制比Jak2的抑制高出至少50倍。如圖9C中所示，在10或50μM處測試NC1153以阻斷底物的生長因子酪氨酸激酶(FGFR3及PDGFR□)，Src家族酪氨酸激酶(Src，F(xiàn)yn，Lck，Yes，Zap70)或絲氨酸蘇氨酸激酶(PKC和PKA)磷酸化。對照的活性以虛線作于圖中。
圖10A-D總結了649641P(NC1153)對異體移植存活率(表1中所示)的體內(nèi)效應。對Lewis(LEW)腎異體移植物的ACI大鼠受體連續(xù)7天通過每日靜脈內(nèi)注射或口腔管飼而施以NC1153。不同藥物劑量時的異體移植物存活時間(天數(shù))如圖10A中所示，個體存活如表1中所示。對LEW腎異體移植物的ACI大鼠受體連續(xù)14天通過每日口腔管飼而施以NC1153。不同劑量時移植物的存活比率(天數(shù))如圖10B中所示。以160mg/kg NC1153通過每日口服管飼，對LEW腎異體移植物的ACI大鼠受體治療7天，然后以3×/星期治療高達90天。如圖10C中所示，75％的治療受體均存活至90天的治療之后，存活時間超出200天。通過由長期存活受體接受LEW供體(＞100天；n＝3)而非第三方BUF(7.0±1.0天；n＝3)的心臟異體移植物，證實誘導出了移植耐受性。將30×106純化的T細胞從耐受性受體過繼性地轉移至輻射(400rads)后的LEW心臟異體移植物的ACI受體，以檢測耐受機制。轉移有耐受性T細胞的受體顯示出明顯遲緩的對LEW心臟異體移植物的排斥(40.0±15.0天；n＝6對15±1.0天；n＝5輻射對照)，兩個心臟均持續(xù)＞100天起搏良好，但排斥第三方的心臟異體移植物(12±1.0天；n＝2)。該結果表明移植耐受性至少部分是由T細胞調(diào)節(jié)的細胞所介導的(未示出)。圖10D示出了上述表2中所提供結果的總結，所述表2是關于單獨以NC1153、單獨以CsA及以兩種藥物結合，通過每日口腔管飼給藥治療7天的LEW腎異體移植物的ACI大鼠受體。示出了每一劑量水平下每一治療組的MST，下圖顯示低CI值，表明NC1153-CsA組合是協(xié)同性的。
如圖11A-F中所示，649641P(NC1153)無腎毒性，不影響脂代謝。通過以160mg/kg NC1153單獨口腔管飼或與5mg/kg CsA組合，對低鹽進食的大鼠(治療前7天及治療過程中的14天)進行治療；對一些動物通過單獨以0.8mg/kg雷帕霉素(RAPA)口腔管飼或與5mg/kg CsA相結合而治療。通過血清肌酐水平和血清肌酐清除率評價腎功能，結果各自如圖11A和11B中所示。脂代謝由檢測血清膽固醇(圖11C)，甘油三酯(圖11D)，低密度脂蛋白-膽固醇(圖11E)以及高密度脂蛋白-膽固醇(圖11F)來評價。確定NC1153單獨或與CsA相結合對腎結構的作用。對連續(xù)7天低鹽進食的大鼠按如下持續(xù)治療14天10mg/kgNC1153靜脈內(nèi)給藥；0.16mg/kg RAPA靜脈內(nèi)給藥；10mg/kg CsA口服給藥；10mg/kg CsA口服給藥與0.16mg/kg RAPA靜脈內(nèi)給藥相結合；或者10mg/kg CsA口服給藥與10mg/kg 641P靜脈內(nèi)給藥相結合。在第14天殺死大鼠，并采用H&E染色對腎進行組織學檢查。在每一組的5只大鼠中均觀察到類似結果。如圖6A-E中所示，649641P(NC1153)單獨或RAPA單獨給藥在腎之中均未顯示明顯變化。相反，單獨的CsA給藥則引起腎小管30％受損，帶有空泡形成和萎縮。CsA/RAPA組在90％腎小管中顯示有廣泛的空泡形成并伴有萎縮和致密核。與CsA/RAPA組截然不同，以CsA/NC1153組合治療的大鼠的腎顯示出與CsA單獨組中所觀察到相類似的變化。
采用包括如下步驟的操作流程，合成命名為WP938(圖18B中所示)的649641P(NC1153)的內(nèi)消旋立體異構體向溶解于400mL乙腈的0.1mmol cycloalkanoneone和0.21M N，N，N′，N′-四甲基二氨基甲烷中，40分鐘內(nèi)滴加入16.5g(0.21mol)乙酰氯。反應完成后，使粗產(chǎn)物沉淀，過濾，以醚洗滌并干燥。隨后結晶得到純產(chǎn)物。
測試所得WP938單獨給藥或與CsA組合給藥時，對異體移植物存活率的效應及其毒性。結果示于圖12A，B和13A-F中。結果發(fā)現(xiàn)以20-160mg/kg劑量通過口腔管飼持續(xù)7天單獨給藥的WP938以劑量依賴方式延長了LEW腎異體移植物的ACI受體的存活(圖12A)。1.25mg/kg CsA與160mg/kg WP938相結合持續(xù)7天口服給藥則對腎異體移植物的存活產(chǎn)生協(xié)同性相互作用，如CI值0.44所證明(圖12B)。如圖13A-F所示，以160mg/kg WP938口服治療14天對化學和血液成分計數(shù)不產(chǎn)生變化，從而證明其無毒性。血清肌酐和肌酐清除率顯示W(wǎng)P938不具有腎毒性且對CsA誘導的腎毒性無作用(圖13A，B)。圖13C表示膽固醇水平。圖13D表示甘油三酯水平。圖13E表示高密度脂蛋白水平。圖13F表示低密度脂蛋白水平。
圖14B至圖39B所示為各種Mannich堿化合物和其他(顯示為鹽形式)篩選出具有抑制催乳素或IL2刺激的T細胞的增殖能力的化合物的化學結構式。圖14A至39A所示為指定濃度范圍的分析結果。基本上如上面通用方法中所述實施篩選分析。對于在足以抑制由IL2激活(淺色方形)的Jak3和Stat5a/b濃度處，明顯具有不阻斷催乳素(PRL)活化Jak2和Stat5a/b(深色方形)的特性的化合物，將其識別出供進一步評測。優(yōu)選的649641P(NC1153)化合物及其選擇性抑制活性如實施例1和圖1A，B中所示。對于已證明在指定濃度處對PRL或IL2刺激的T細胞至少具有一定量的選擇性抑制活性的其他候選藥物，即圖14B-17B和19B-39B中所示化合物，則是與采用代表性化合物649641P(NC1153)的前述實施例中所述相同的方式正在研究的主旨。為了此處所公開的目的，如果合適的話，這些化合物可具有非對稱中心體且可以消旋體、消旋體混合物形式存在，及以單個非對映異構體形式存在，或者作為包括所有同分異構形式的對映異構體。例如，對于通式(I)，C-2和C-12處的構型可以為(R)或(S)。經(jīng)確定完全無毒性且能顯著延長如此處649641P(NC1153)所證明的異體移植物存活率的這些化合物，包括所有立體異構體，對于人體及對于免疫抑制治療中的獸醫(yī)應用也很可能具有治療價值。預期這些化合物對于與表達Jak3的淋巴或骨髓源細胞相關病癥的治療也具有治療價值。如649641P(NC1153)和WP938所證明，可以相信這些候選藥物化合物的一些與CsA或通過Jak3相關通道之外的其他通道施加免疫抑制作用的其他免疫抑制劑一同給藥時，還證明具有協(xié)同活性。
定義除具有習慣和通常的意義之外，如下定義適用于本說明書和權利要求所允許的情況下“選擇性抑制”是指某種化學類化合物優(yōu)先阻斷一種蛋白的功能而對一種或多種已知蛋白質(zhì)的功能阻斷程度較低。
“特異性抑制”是指某種化學類化合物僅阻斷給定蛋白質(zhì)的功能，而對其他蛋白質(zhì)不起作用。
“免疫抑制潛力”是指某種化學類化合物可能會減少或緩解免疫應答(例如，阻斷移植的器官異體移植物的排斥的藥物)。
“藥物組合物”是指一種或多種化學物或其可藥用的鹽與與合適載體的混合物，供作為藥物施用于哺乳動物。
“淋巴細胞”是指免疫源細胞，或者更特別地，是指源自淋巴譜系干細胞的細胞，包括大小淋巴細胞及漿細胞。淋巴細胞的實例有T細胞、B細胞和自然殺傷(NK)細胞。
“骨髓細胞”是指骨髓源細胞，即源自骨髓譜系干細胞的細胞，包括單核細胞、巨噬細胞和樹突細胞。
“藥物”是指適于醫(yī)療用途的化學類化合物。
“同類物”是指在組成上與另一化合物密切相關、并產(chǎn)生類似或拮抗性作用的化學類化合物(例如結構類似物)。
“治療有效量“是指化合物施用的用量至少某種程度上能緩解待治病癥的一種或多種癥狀。例如，能有效預防、緩解或改善疾病癥狀或延長待治療受試者的存活率的化合物用量。
對于疾病或病癥，術語“治療“是指預防、制止疾病或病癥的發(fā)生，阻止、消退或提供疾病或病癥的癥狀或副作用的緩解，和/或延長待治療受試者的存活率。
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盡管已示出并描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但本領域人員可對優(yōu)選實施方案作修正而不會偏離本發(fā)明的主旨和教導。此處描述的實施方案是例述性和代表性的，不應認為是限制性的?？蓪Υ颂幩龅谋景l(fā)明作許多改變和修正，并且仍處于本發(fā)明范圍之內(nèi)。雖然前面的討論著重于源自T細胞的移植物對宿主的疾病，但可容易理解此處所述的方法、化合物和組合物也可在其他T細胞依賴性疾病或病癥中具有用途。例如，這些方法、化合物和組合物可用于治療諸如狼瘡、關節(jié)炎和多發(fā)性硬化的自身免疫疾病，或用于治療變態(tài)反應、哮喘、牛皮癬、潰瘍性結膜炎、淋巴瘤和白血病。選擇性靶向Jak3的抑制作用在其他許多免疫源性病癥、或者在表達Jak3的骨髓細胞源病癥中預計也具有用途，包括源自超敏反應或不期望的樹突細胞、B細胞、單核細胞、巨噬細胞或自然殺傷細胞的超敏反應系統(tǒng)應答狀況。因而，本發(fā)明的范圍并不由上面的陳述所限制，而僅由后面的權利要求所限定，其范圍包括權利要求主旨的所有同等物。因而此處引述的所有專利、專利申請和出版物均以其提供的材料、方法和解釋性細節(jié)能補充此處所述內(nèi)容的參考程度于此處引作參考。上述相關技術說明書中某些參考文獻的討論并非等于承認其就是本發(fā)明的現(xiàn)有技術。
權利要求
1.表達Janus酪氨酸激酶3的細胞的功能和/或增殖的抑制方法，包含將有效濃度的至少一種通式(I)的化合物或其鹽與細胞接觸，以選擇性抑制Janus酪氨酸激酶3活性， 其中R1是H，＝CH2，CH2N(CH3)2，CH2SC(O)CH3，CH2SC6H5，CH2SCH2-(4-C6H4OCH3)，CH2SC(O)C6H5，或CH2N(CH2CH3)2；R2是O；R3是CH2N(CH3)2，CH2N(CH2CH3)2或CH2-(N-morphyl)。
2.權利要求1的方法，其中R1是CH2N(CH3)2且R3是CH2N(CH3)2。
3.權利要求2的方法，其中所述化合物是內(nèi)消旋立體異構體。
4.權利要求1的方法，其中細胞為淋巴源或骨髓源。
5.權利要求1的方法，包含干擾所述細胞中的信號3通道從而使細胞分裂被阻斷。
6.權利要求1的方法，其中在選擇性抑制所述Janus酪氨酸激酶3的有效濃度處，所述至少一種化合物基本不抑制除Janus酪氨酸激酶3活性之外的蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性。
7.權利要求1的方法，其中所述細胞是T細胞，該方法包含對所述T細胞內(nèi)Jak3活性的抑制比Jak2活性的抑制高出至少3倍。
8.權利要求1的方法，包含選擇至少一種在足以抑制IL2激活的Jak3和Stat5a/b的濃度處，對催乳素(PRL)活化Jak2和Stat5a/b的抑制能力較弱的所述化合物。
9.輔助識別能用作治療性免疫抑制劑的物質(zhì)的體外測試方法，所述方法包含(a)從細胞培養(yǎng)基中獲取Jak3依賴性的靜止T淋巴細胞群體；(b)任選地，以細胞因子對靜止T淋巴細胞預處理，以刺激所述淋巴細胞增殖；(c)以權利要求1中定義的化合物或其鹽對步驟(a)或(b)的靜止或刺激淋巴細胞進行處理；(d)在促進細胞生長條件下培養(yǎng)步驟(c)的淋巴細胞；(e)評測步驟(d)之后的細胞增殖程度；(f)任選地，評測所述化合物對Jak2依賴性的T淋巴細胞增殖的抑制效應；(g)任選地，評測所述化合物的細胞毒性；(h)從步驟(e)，以及從如果存在的步驟(f)和(g)的評測中確定Jak3依賴性淋巴細胞增殖的顯著抑制，所述抑制不歸因于化合物的細胞毒性，從而暗示該化合物具有作為T細胞介導的免疫抑制劑和/或作為T細胞增殖抑制劑的體內(nèi)治療用候選藥物的潛力；以及(i)任選地，比較步驟(e)和(f)的評測，如果步驟(f)評測的抑制效果明顯低于步驟(e)中評測的抑制效果，則從所述比較中確定與抑制Jak2活性相比，所述化合物至少某種程度上對抑制Jak3活性具有選擇性。
10.在需要的哺乳動物受試者中對表達Janus酪氨酸激酶3的細胞的不期望功能的體內(nèi)抑制方法，包含將所述細胞與有效量的至少一種如權利要求1中定義的化合物或其代謝物或衍生物接觸，以干擾細胞內(nèi)的信號3通道從而抑制細胞功能，所述接觸包含將治療有效量的藥物組合物施用至所述受試者以抑制Jak3依賴性的細胞功能，所述藥物組合物含有可藥用的載體以及如權利要求1中定義的至少一種所述化合物或其可藥用的鹽或所述化合物的代謝物，或者能夠在受試者體內(nèi)轉化成所述化合物的所述化合物前體。
11.權利要求10的方法，其中所述細胞是T細胞，所述藥物組合物的所述用量能有效阻斷所述T細胞的細胞分裂。
12.權利要求10的方法，包含連續(xù)性或間歇性施用所述藥物組合物至受試者。
13.對哺乳動物受試者的治療性處理以抑制不期望的免疫應答的方法，包含實施權利要求10的方法，其中所述受試者正經(jīng)受不期望的免疫應答或處于其危險之中，并且所述治療有效量的所述藥物組合物減輕或預防了所述不期望的免疫應答。
14.權利要求13的方法，進一步包含將治療有效量的除Jak3抑制劑之外的免疫抑制劑施用至所述受試者。
15.權利要求14的方法，其中所述其他免疫抑制劑是環(huán)孢菌素A或FK506。
16.哺乳動物移植受體中器官移植排斥的減輕方法，包含實施權利要求10的方法以抑制T細胞介導的對移植器官的免疫應答，從而減輕或阻止器官的排斥。
17.哺乳動物異體移植受體中急性異體移植排斥的減輕方法，包含實施權利要求10的方法以抑制T細胞介導的對所述異體移植物的抗異體移植物免疫應答，從而減輕或預防異體移植的急性排斥。
18.哺乳動物移植受體中移植耐受性的誘導方法，包含實施權利要求10的方法以抑制T細胞介導的移植排斥應答。
19.遭受自身免疫疾病的哺乳動物受試者中促進所述疾病減輕的方法，包含實施權利要求10的方法以抑制所述受試者中T細胞介導的自身免疫應答，從而減少或阻止由內(nèi)源性Jak3依賴性T細胞介導的對受試者天生組織的自身免疫攻擊。
20.遭受呼吸道過敏癥的哺乳動物受試者中減輕所述過敏癥的方法，包含實施權利要求10的方法以抑制所述受試者中T細胞介導的過敏性應答，從而減少或阻止所述受試者中呼吸道組織的過敏癥。
21.患有變態(tài)反應的哺乳動物受試者中減輕所述變態(tài)反應的方法，包含實施權利要求10的方法，以抑制所述受試者中T細胞介導的變態(tài)反應應答，從而減少或阻止所述受試者中的變應性反應。
22.Jak3依賴性白血病或淋巴瘤增生的抑制方法，包含實施權利要求10的方法，其中所述受試者患有白血病或淋巴瘤，其中與其他激酶活性相比，所述化合物或所述代謝物能選擇性抑制Jak3活性，從而抑制或阻斷白血病或淋巴瘤細胞的增生。
23.權利要求10的方法，其中所述化合物的腎毒性低于環(huán)孢菌素A的腎毒性。
24.權利要求10的方法，進一步包含施用另一種免疫抑制劑。
25.輔助識別新免疫抑制藥物的體外方法，包含通過將含Jak3的T細胞與某一范圍濃度的目的化合物接觸，并確定所述化合物在所述范圍內(nèi)的一個或多個濃度處能否抑制Jak3活性，從而測試目的化合物對破壞T細胞功能的活性；將所述目的化合物的Jak3抑制活性與權利要求2中定義的已知具有Jak3抑制活性的化合物進行比較；以及采用所述測試和比較結果以確定所述目的化合物是否為體內(nèi)用作治療性免疫抑制劑的候選藥物。
26.權利要求25的方法，進一步包含測試所述目的化合物的Jak2抑制活性；如有Jak2抑制活性，則將所述目的化合物的Jak3抑制活性與其Jak2抑制活性進行比較；以及采用所述比較以鑒別出作為選擇性Jak3抑制劑的所述目的化合物。
27.候選免疫抑制藥物對異體移植物存活率的效應的體內(nèi)測試方法，包含(a)將取自合適供體動物的異體移植物植入合適的受體動物；(b)對動物維持基本的營養(yǎng)和健康促進條件；(c)將候選藥物施用至至少一個動物中的每一個，以得到治療的受體或組；(d)將權利要求1中定義的化合物施用至至少一個動物，以作為陽性對照組，所述化合物中R1和R3各自為CN(CH3)2且R2是O；(e)任選地，保留至少一個受體動物不受治療，以作為未治療的對照受體或組；(f)確定每一異體移植物在每一受體內(nèi)的異體移植存活時間；(g)在可適用范圍內(nèi)，對每一異體移植物進行組織學檢查，并對每一異體移植物評測與候選藥物相關的結構損傷；(h)將每一異體移植物內(nèi)異體移植物存活時間與候選藥物誘導的組織學結構變化進行比較；以及(i)采用(h)的比較結果，與未治療對照受體的異體移植物或陽性對照受體的異體移植物對比，當確定移植物存活時間增加且對藥物治療的異體移植物沒有藥物誘導的結構損傷時，則表示該候選藥物作為免疫抑制劑在體內(nèi)治療使用時可能有效。
28.權利要求27的方法，包含確定所述候選藥物能在體外選擇性抑制Jak3依賴性的T細胞增殖。
29.表達Janus酪氨酸激酶3的細胞的功能和/或增殖的抑制方法，包含將有效濃度的至少一種通式(II)的化合物或其鹽與細胞接觸，以選擇性抑制所述Janus酪氨酸激酶3的活性， 其中n是1，2，3，4或6；R1是H，CH2，或CH2N(CH3)2；R3是CH2N(CH3)2。
30.表達Janus酪氨酸激酶3的細胞的功能和/或增殖的抑制方法，包含將有效濃度的至少一種通式(III)的化合物或其鹽與細胞接觸，以選擇性抑制所述Janus酪氨酸激酶3的活性， 其中n是1或2；R1是H或CH2N(CH3)2；R3是CH2N(CH3)2。
31.表達Janus酪氨酸激酶3的細胞的功能和/或增殖的抑制方法，包含將有效濃度的至少一種如下通式的化合物或其鹽與細胞接觸， 以選擇性抑制所述Janus酪氨酸激酶3的活性。
32.一種具有如下通式的分離或純化的化學類化合物 或者其鹽。
33.載體中含有權利要求32的化合物或其可藥用的鹽的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明公開的方法用于抑制或破壞淋巴或骨髓源細胞中Janus酪氨酸激酶3(Jak3)依賴性功能，尤其用于阻斷淋巴細胞(如T細胞，B細胞)的增殖和功能。采用能選擇性抑制Jak3而對其他蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性作用程度較小或者根本不起作用的Mannich堿化合物或衍生物或改性化合物，從而得到有益效果，例如減輕移植排斥，緩和變應性應答，且其副作用比常規(guī)免疫抑制劑更小。
文檔編號A61K31/13GK1747729SQ200380105468
公開日2006年3月15日 申請日期2003年12月9日 優(yōu)先權日2002年12月9日
發(fā)明者羅伯特·A·柯肯, 巴里·D·卡漢, 斯坦尼斯瓦夫·M·斯特普科夫斯基, 沃爾德馬·普里貝, 伊莎貝拉·?？颂? 希蒙·科辛斯基 申請人:得克薩斯系統(tǒng)大學董事會