專利名稱：表達人cd20的轉(zhuǎn)基因小鼠的制作方法
本申請已于2003年12月11日以如下名義申報PCT國際專利申請健泰科公司，該公司是一家位于美國的美國公司(除美國之外所有國家的申請人)；安德魯.C-Y.陳，美國公民與居民(僅對美國的申請人)；龔謙，中國公民與美國居民(僅對美國的申請人)；與弗萊維厄斯·馬丁，羅馬尼亞公民與美國居民(僅對美國的申請人)；本申請指定所有國家，并要求如下優(yōu)先權(quán)美國臨時申請序列號60/434,115，于2002年12月16日提交；與美國臨時申請序列號60/476,481，于2003年6月5日提交，在此引入作為參考。
背景技術(shù)：
T與B細胞兩者包含可以被用作分化與識別標(biāo)志物的細胞表面蛋白。一個這樣的人B細胞標(biāo)志是人B淋巴細胞限制的分化抗原Bp35，又名″CD20″。CD20在早期前B細胞發(fā)育期間表達，并且保持直到漿細胞分化。人們相信CD20分子調(diào)節(jié)激活過程中對細胞周期起始和分化所必需的步驟。
CD20存在于正常的B細胞以及惡性的B細胞兩者上，惡性B細胞的強勁增殖可以導(dǎo)致B細胞淋巴瘤。因此，CD20表面抗原有作為候選物的可能性，以用特異于該抗原的抗體靶向B細胞。這些抗CD20抗體特異地與正常和惡性的B細胞的細胞表面抗原結(jié)合，導(dǎo)致B細胞的破壞與消減。具有破壞腫瘤的潛力的化學(xué)試劑或者放射性標(biāo)記可以是偶聯(lián)到抗CD20抗體的，以致于該藥劑被特異地遞送給腫瘤的B細胞。
通過利用單克隆抗體靶向CD20已經(jīng)被描述(參見，例如Weiner，Semin.Oncol，26，43-51(1999)；Gopal and Press，J.Lab.Clin.Med.，134，445-450(1999)；White et al.，Pharm.Sci.Technol.Today，2，95-101(1999))。RituxanTM是一嵌合的抗CD20單克隆抗體，已經(jīng)被廣泛地作為單個的藥劑和與化學(xué)療法一起用于具有新診斷的和復(fù)發(fā)的淋巴瘤的病人(Davis et al，J.Clin.Oncol.，17，1851-1857(1999)；Solal-Celigny et al.，Blood，94，摘要2802(1999)；Foran et al.，J.Clin.Oncol.，18，317-324(2000)。利用放射性標(biāo)記的抗體偶聯(lián)物也已經(jīng)敘述(例如，BexxarTM；Zelenetz et al.，Blood，94，摘要2806(1999))。
利用靶向CD20的抗體也已經(jīng)被敘述用于其它病癥，特別是那些涉及自體免疫的病癥。例如，抗-CD20抗體治療已經(jīng)或者正在在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡與強直性脊柱炎的治療中被評價(Protheroe et al.，Rheumatology 381150(1999))。也已經(jīng)研究用抗-CD20抗體治療，導(dǎo)致B細胞消減以治療其它的自身免疫病癥，例如自身免疫性血小板減少、中性白細胞減少與自身免疫性溶血性貧血(Trape et al.，Haematologica 88223(2003)；Arzo et a1.，Annals of Rheumatic Diseases 61922(2002))。
盡管CD20在人淋巴瘤及其它紊亂中的重要作用，但缺乏表達該人標(biāo)志物的動物模型。因此，需要有關(guān)的動物模型進行疾病研究與藥物開發(fā)。
發(fā)明概述本發(fā)明普遍涉及表達人細胞標(biāo)志物，特別地是CD20的，非自然發(fā)生的非人轉(zhuǎn)基因動物。一方面，轉(zhuǎn)基因動物提供鑒定與測試對于與CD20有關(guān)的疾病或者病癥，例如癌癥的新治療劑的系統(tǒng)。在一個實施方式中，轉(zhuǎn)基因動物對測試針對CD20的治療的效力與毒性是有用處的。
本發(fā)明提供非自然發(fā)生的轉(zhuǎn)基因動物，其基因組包含編碼異源的CD20，優(yōu)選人CD20的核苷酸序列。核苷酸序列優(yōu)選地與人內(nèi)源啟動子可操作地連接，其中人CD20在B淋巴細胞表面上表達。將抗-人CD20抗體給予該目前敘述的轉(zhuǎn)基因動物導(dǎo)致表達人CD20的B淋巴細胞的消減。在一個實施方式中，人CD20轉(zhuǎn)基因鼠特征為人CD20在細胞上的表達水平足以使與表達細胞結(jié)合的抗人CD20抗體影響細胞的殺傷，引起至少大約75％、和更優(yōu)選80％、85％、90％、95％、99％并且甚至100％外周的及/或循環(huán)B細胞的B細胞消減。
根據(jù)另一個優(yōu)選實施方式，當(dāng)動物基因組包含同源內(nèi)源CD20基因，該基因被破壞或者剔除，以致內(nèi)源的分子在細胞表面上不表達。
本發(fā)明更進一步地提供鑒定能治療B細胞淋巴瘤的藥劑的方法，其中該方法包含給予在B淋巴細胞上表達人CD20的轉(zhuǎn)基因動物的藥劑，并且確定B淋巴細胞數(shù)目是否有減少。本發(fā)明也提供鑒定能消減或者殺死表達人CD20的細胞的方法，包含給予表達人CD20的轉(zhuǎn)基因動物一種藥劑，并且確定像這樣的細胞的數(shù)目是否有減少。更進一步提供根據(jù)這樣的方法鑒定的藥劑。
本發(fā)明的動物也通過對目前敘述的轉(zhuǎn)基因動物給藥，而對評估抗-CD20治療的毒性有用。治療特異性、毒性與效力還可以通過將該藥劑的效果與在野生型動物或者未處理過的轉(zhuǎn)基因動物中的效果比較而確定。
本發(fā)明的非人轉(zhuǎn)基因動物可以更進一步提供向人給藥的具體的藥劑的安全性指示。例如，可以給予該轉(zhuǎn)基因動物人源化的抗體或者其它的藥劑，而對該動物給藥該藥劑的結(jié)果可以監(jiān)視或者鑒別任何毒性或者副作用，作為該人源化的抗體或者藥劑對于人體內(nèi)利用的安全性與耐受性的指征。那些可以在短期基礎(chǔ)上出現(xiàn)的不利情況包括頭痛、感染、發(fā)熱、寒戰(zhàn)、疼痛、惡心、無力、咽炎、腹瀉、鼻炎、灌輸反應(yīng)(infusion reaction)與肌痛。短期不利情況是處理后數(shù)天內(nèi)測量的。長期的副作用包括對某些細胞類型的細胞毒作用、由于血小板減少導(dǎo)致的出血事件、由于炎性及/或變態(tài)反應(yīng)導(dǎo)致的介質(zhì)釋放、對免疫系統(tǒng)的抑制及/或抗治療劑抗體產(chǎn)生的抑制、末端器官毒性、感染或者惡性腫瘤發(fā)生率的增加。長期的不利情況是處理后數(shù)月內(nèi)計量的。
本發(fā)明另一個方面涉及確定抗-CD20藥劑效力的方法。通過向一組具有人CD20的轉(zhuǎn)基因動物給予一系列劑量的該藥劑、確定導(dǎo)致攜帶人CD20細胞的減少的藥劑的至少一個劑量而確定效力。


圖1顯示來源于無轉(zhuǎn)基因(Tg-)、雜合的(Tg+/-)與純合的(Tg+/+)轉(zhuǎn)基因的小鼠的小鼠B220+細胞上人CD20的表達。
圖2提供在B細胞分化與成熟期間各種細胞表面標(biāo)志物(CD43、IgM、IgD)表達的示意圖。在Tg+小鼠中，hCD20在前-B(pre-B)、未成熟的B細胞與成熟B細胞上表達。
圖3顯示篩選Tg+小鼠在骨髓B細胞中人CD20表達的結(jié)果。細胞用偶聯(lián)到FITC的抗-人CD20(BD Pharmingen)染色。根據(jù)B220與CD43的存在門化(gate)細胞，以將B細胞劃分成各種群體。為進行門化，細胞用偶聯(lián)到PerCP的抗-B220抗體(BD Pharmingen)與偶聯(lián)到PE的抗-CD43抗體(熒光，BD Pharmingen)染色。
圖4顯示篩選Tg+小鼠脾B細胞人CD20表達的結(jié)果。細胞用偶聯(lián)到FITC的抗-人CD20(BD Pharmingen)染色。用B220與CD21的存在門化該細胞允許將B細胞劃分成各種的群體。為進行門化，細胞用偶聯(lián)到PerCP的抗-B220抗體(BD Pharmingen)與偶聯(lián)到PE的抗CD21抗體(熒光，BDPharmingen)染色。在T1區(qū)、邊緣區(qū)和T2/濾泡區(qū)發(fā)現(xiàn)帶有人CD20的B細胞。
圖5顯示篩選Tg+小鼠腸系膜淋巴結(jié)B細胞人CD20表達的結(jié)果。細胞用偶聯(lián)到FITC的抗-人CD20(BD Pharmingen)染色。用B220與CD21門化該細胞允許劃分成B細胞的各種的群體。為進行門化，細胞用偶聯(lián)到PerCP的抗-B220抗體(BD Pharmingen)與偶聯(lián)到PE的抗CD21抗體(熒光，BD Pharmingen)染色。
圖6顯示篩選Tg+小鼠派伊爾斑B細胞中人CD20表達的結(jié)果。細胞用偶聯(lián)到FITC的抗-人CD20(BD Pharmingen)染色。用B220與CD38門化該細胞允許劃分成B細胞的各種的群體。為進行門化，細胞用偶聯(lián)到PerCP的抗-B220抗體(BD Pharmingen)與偶聯(lián)到PE的抗CD38抗體(熒光，BDPharmingen)染色。帶有人CD20的B細胞是成熟B細胞和生發(fā)中心的細胞。
圖7是一示意圖，示意將抗-人CD20單克隆抗體給藥至Tg+小鼠，并且分析具有人CD20細胞的存在或者缺少。在第0天給予單一劑量1毫克的抗-人CD20單克隆抗體。在第-1、1、2、3、4、7、14與21天從各種組織取樣品。如同以前敘述，經(jīng)過FACS分析來自不同組織例如外周血、脾、淋巴結(jié)、骨髓、與派伊爾斑的樣品。也監(jiān)視抗-CD20單克隆抗體的血清水平。
圖8顯示在用抗-人CD20單克隆抗體m2H7(BD Pharmingen)處理的轉(zhuǎn)基因小鼠中外周B細胞的消減。如同在圖7簡圖中的概括，以總計1mg的劑量將抗體給予轉(zhuǎn)基因小鼠。如前述進行門化，對外周血、脾、淋巴結(jié)、骨髓、與派伊爾斑做FACS分析。
圖9顯示用抗-人CD20單克隆抗體m2H7處理過的轉(zhuǎn)基因小鼠中外周淋巴結(jié)成熟B細胞的消減。如同在圖7簡圖中的概括的，以總計1mg的劑量將抗體給予轉(zhuǎn)基因小鼠。如同以前敘述的進行門化，對外周血、脾、淋巴結(jié)、骨髓、與派伊爾斑做FACS分析。
圖10顯示用抗-人CD20單克隆抗體m2H7處理的轉(zhuǎn)基因小鼠中脾T2與濾泡的B細胞(follicular B cell)的消減。如同在圖7簡圖中的概括的，以總計1mg的劑量將抗體給予轉(zhuǎn)基因小鼠。如同以前敘述的進行門化，對外周血、脾、淋巴結(jié)、骨髓、與派伊爾斑做FACS分析。
圖11顯示用抗-人CD20單克隆抗體m2H7處理過的轉(zhuǎn)基因小鼠中再循環(huán)成熟B細胞的消減。如同在圖7簡圖中的概括，以總計1mg的劑量將抗體給予轉(zhuǎn)基因小鼠。如同以前敘述地進行門化，對外周血、脾、淋巴結(jié)、骨髓、與派伊爾斑做FACS分析。
圖12顯示在用抗人CD20單克隆抗體m2H7處理過的轉(zhuǎn)基因小鼠中成熟B細胞的消減與派伊爾斑生發(fā)中心B細胞對消減的抵抗。如同在圖7簡圖中的概括，以總計1mg的劑量將抗體給予轉(zhuǎn)基因小鼠。如同以前敘述的進行門化，對外周血、脾、淋巴結(jié)、骨髓、與派伊爾斑做FACS分析。
圖13顯示用抗-CD20單克隆抗體給藥后B細胞的消減與恢復(fù)。在第1天將抗體給藥小鼠。在抗體處理后第6天，表達人CD20的B細胞在外周血液中檢測不到。在第6周，抗體剛一清除，hCD20+細胞開始被檢測到。到第l4周，B細胞似乎已經(jīng)恢復(fù)到正常水平?；謴?fù)來自前體B細胞，該細胞不表達CD20，隨后其發(fā)展成為具有人CD20+的成熟B細胞。
圖14顯示FACS圖，指示脾生發(fā)中心B細胞對短期抗-CD20單克隆抗體治療的抵抗。不對小鼠進行免疫，或在第1天由腹膜內(nèi)注射綿羊紅細胞(SRBC)對小鼠進行免疫以在脾中誘導(dǎo)生發(fā)中心。生發(fā)中心在第7天出現(xiàn)。在第8天，一組小鼠用抗CD20抗體m2H7處理。對照組的小鼠用mIgG2a同種型對照抗體處理。在第12天對來自小鼠的脾細胞進行分析。使用對生發(fā)中心染色的PNA(花生凝集素(peanut agglutinin)。在未用SRBC免疫的小鼠脾中沒有見到可檢測的生發(fā)中心細胞，而免疫小鼠脾顯示0.3％的PNA染色細胞。盡管T2/濾泡的B細胞被用抗-CD20抗體消減，脾中邊緣中心的B細胞對抗體是有抗力的。
圖15顯示在用抗-CD20單克隆抗體處理過的小鼠與對照中不依賴T細胞的反應(yīng)。在第0天，小鼠用m2H7或同種型對照抗體mlgG2a處理。在第3-7天，B細胞消減已經(jīng)發(fā)生。在第7天，小鼠用肺炎鏈球菌IV靜脈注射以誘導(dǎo)對多糖的反應(yīng)。在第11天建立不依賴T細胞的反應(yīng)。結(jié)果顯示，用抗-人CD20 m2H7處理不影響來自邊緣區(qū)與B1細胞的B細胞反應(yīng)，即非消減的MZ與B1B細胞賦予對T-非依賴性抗原的抗御作用。
圖16顯示BR3與2H7抗體處理在Tg+小鼠效應(yīng)上的比較。表達細菌人工染色體編碼的人CD20的人CD20轉(zhuǎn)基因小鼠(命名為hCD20+小鼠)用抗CD20單克隆抗體(在第9天單次注射(single injection)100微克)、BR3-Fc(從第1天至第12天，100微克每隔一天注射)、或者抗-CD20單克隆抗體與BR3-Fc聯(lián)合進行腹膜內(nèi)注射處理。每組包括4只小鼠。最后一次注射后兩天，將小鼠殺死，分析hCD20+B細胞。針對B細胞標(biāo)志物(CD21+CD23+)對脾、血、淋巴結(jié)與派伊爾斑進行FACS分析?？?CD20單克隆抗體治療消減T2與濾泡的B細胞，而非脾中的邊緣區(qū)B細胞；BR3-Fc處理在脾中降低T2/濾泡的B細胞與邊緣區(qū)B細胞。
圖17顯示抗-CD20單克隆抗體處理對派伊爾斑沒有影響。表達細菌人工染色體編碼的人CD20的人CD20轉(zhuǎn)基因小鼠(命名為hCD20+小鼠)用抗CD20單克隆抗體(在第9天單次注射)、BR3-Fc(從第1天至第12天，100微克每隔一天注射)、或者抗-CD20與BR3-Fc單克隆抗體聯(lián)合進行腹膜內(nèi)注射。每組包括4只小鼠。最后一次注射后兩天，將小鼠殺死，分析hCD20+B細胞。針對B細胞標(biāo)志物(CD21+CD23+)對脾、血、淋巴結(jié)與派伊爾斑進行FACS分析。BR3-Fc、2H7以及兩者的組合對派伊爾斑中的生發(fā)中心B細胞都沒有影響。
圖18顯示長期抗-CD20單克隆抗體處理后漿細胞未被消減。人CD20陽性的轉(zhuǎn)基因Tg+小鼠用抗-人CD20 mH27抗體如同以前敘述地進行處理。通過檢測骨髓與脾中細胞對于syndican(CD-138漿細胞標(biāo)志物)陽性的細胞，分析小鼠中漿細胞的存在或者缺乏。在抗-人CD20處理之后也監(jiān)視IgA或者IgM陽性的漿細胞的數(shù)目。結(jié)果表明在Tg+小鼠中，漿細胞不受抗-人CD20抗體處理的影響，指示Tg+小鼠仍然具有產(chǎn)生抗體的能力。
圖19顯示用PK-136單克隆抗體導(dǎo)致在Tg+小鼠中NK細胞的消減。產(chǎn)生PK-136單克隆抗體(特異于小鼠NK1.1)的雜交瘤克隆獲得自ATCC。分別用對照單克隆抗體、PK-136、抗-CD20單克隆抗體與PK-136/抗-CD20的聯(lián)合腹膜內(nèi)注射給四組人CD20轉(zhuǎn)基因小鼠。給予的劑量如下對照單克隆抗體200μg/ip，3ip/周，共1周PK-136200μg/ip，3ip/周，共1周抗-CD20單克隆抗體10μg/ip，單次劑量(single dose)來自外周血液、肝臟與脾的NK細胞在抗體處理后進行分析。數(shù)據(jù)用平均數(shù)+/-標(biāo)準(zhǔn)誤差來表示，n＝8。
圖20表明自然殺傷細胞在Tg+小鼠的2H7介導(dǎo)的B細胞消減中起作用。產(chǎn)生PK-136單克隆抗體(特異于小鼠NK1.1)的雜交瘤克隆是獲得自ATCC。分別用對照單克隆抗體，PK-136，抗-CD20單克隆抗體與PK-136/抗-CD20的聯(lián)合腹膜內(nèi)注射給四組人CD20轉(zhuǎn)基因小鼠。腹膜內(nèi)給予的劑量如下
對照單克隆抗體200μg/ip，3ip/周，共1周PK-136200μg/ip，3ip/周，共1周抗-CD20單克隆抗體10μg/ip，單次劑量在抗-CD20單克隆抗體腹膜內(nèi)注射之后第3天分析來自外周血、淋巴結(jié)與脾的淋巴細胞。數(shù)據(jù)用平均數(shù)+/-標(biāo)準(zhǔn)誤差來表示，n＝8。
圖21A顯示人CD20的氨基酸序列(SEQ ID NO1)(GenBank登記號碼BC002807)，人CD20 cDNA序列(圖21B)(SEQ ID NO2)(GenBank登記號碼BC002807)與人CD20的基因組序列(GenBank登記號碼AH005353)(圖21C)。圖21D顯示小鼠CD20cDNA序列(SEQ ID NO4)(GenBank登記號碼M62541)。
圖22顯示與人外周血細胞上CD20表達比較在來自人CD20轉(zhuǎn)基因小鼠的外周血細胞上人CD20表達水平的代表性比較。外周血細胞獲自人供體和來自hCD20Tg+小鼠，并且用標(biāo)記的抗-人CD20抗體(mH27)染色。細胞用FACS分析，對人CD19+與B220+群體門化。在圖上的數(shù)字表示平均熒光強度。
發(fā)明詳述以下術(shù)語除非另外規(guī)定具有在下面對其所賦予的含義。
術(shù)語“構(gòu)建物”或者“靶向構(gòu)建物(targeting construct)”指包含靶向區(qū)的多核苷酸分子。靶向區(qū)包含實質(zhì)上和在靶組織，細胞或者動物中的內(nèi)源序列同源的序列，提供該靶向構(gòu)建物向靶組織、細胞或動物基因組的整合。典型的，靶向構(gòu)建物也包括具有特定目的的基因或者核酸序列、標(biāo)記基因與合適的控制序列。
術(shù)語“CD20”指在免疫系統(tǒng)的某些細胞上表達的細胞表面蛋白，特定地是B淋巴細胞-限制的分化抗原Bp35?！白匀话l(fā)生的CD20”具有獲得自自然的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，并且包括自然發(fā)生的變體例如等位基因變體、同種型與截短的形式。更特別地，“CD20”包括人CD20(AH003353；GenBank登記號數(shù)M27395，J03574)。代表性的人與鼠CD20的氨基酸序列、cDNA序列和基因組序列示于圖21。本發(fā)明也考慮CD20變體。利用一般已知的技術(shù)，與源序列相比，所述變體已經(jīng)發(fā)生了改變，并且優(yōu)選保留有自然發(fā)生的人CD20的生物活性。優(yōu)選該變體不是在自然發(fā)生的人CD20氨基酸位置170與172改變，因為這些位置已經(jīng)被證明是如Polyak et al.描述的被幾個不同抗-人CD20單克隆抗體所識別的表位的一部分，Blood993256(2002)。
當(dāng)一DNA片段定位于內(nèi)源的同源序列并且與其重組時發(fā)生基因的“破壞(disruption)”。這些序列破壞或者修飾可以包括DNA序列的插入、錯義、移碼、刪除、或者置換或者替換，或者它們的任何組合。插入包括插入整個的基因，其可能是動物、植物、真菌、昆蟲、原核、或者病毒來源的。破壞，例如，可以經(jīng)過部分地或者完全地抑制正?；虍a(chǎn)物的生產(chǎn)，或者經(jīng)過增強正?；虍a(chǎn)物的活性來改變正常的基因產(chǎn)物。在一優(yōu)選方案中，該破壞是一種無效性破壞(null disruption)，即該破壞使該基因不顯著表達。
術(shù)語“內(nèi)源的位點”意味著包括在將變成轉(zhuǎn)基因的宿主動物中發(fā)現(xiàn)的自然發(fā)生的基因位點。
術(shù)語“異源的”當(dāng)與多肽或者基因聯(lián)合使用時指一多肽，具有編碼在轉(zhuǎn)基因非人宿主動物中未找到的多肽的氨基酸序列或者DNA。因此，具有人CD20基因的轉(zhuǎn)基因小鼠可以被稱作具有異源的CD20基因?？梢岳梅N種的方法包括PCR、蛋白質(zhì)印跡、或者Southern印跡檢測轉(zhuǎn)基因。術(shù)語“人內(nèi)源的啟動子”指與將被引入動物以形成轉(zhuǎn)基因動物的編碼人蛋白質(zhì)的多核苷酸序列有自然聯(lián)系的啟動子。
術(shù)語“非-人動物”意圖包括任何脊椎動物例如哺乳動物、鳥類、爬行動物與兩棲動物。合適的哺乳動物包括嚙齒類動物、非-人靈長類動物、羊、狗與母牛。合適的鳥類包括雞、鵝與火雞。優(yōu)選的非-人動物是從包括大鼠和小鼠的嚙齒科中選出來的，最優(yōu)選小鼠。
術(shù)語“自然發(fā)生”或者“自然相關(guān)的”如同在這里應(yīng)用于一對象時所使用的，指一對象可以在自然中被發(fā)現(xiàn)這一事實。例如，存在于一可以從自然來源分離的有機體(包括病毒)、并且沒有被人在實驗室中有意地修飾的一多肽或者多核苷酸序列是自然發(fā)生的。
對于核酸，術(shù)語“基本上同源”指兩個核酸或者其中指定的序列，當(dāng)最佳地比對并且與合適的核苷酸插入或者刪除相比較時彼此具有至少大約80％序列同一性，更優(yōu)選大約81％序列同一性，更優(yōu)選大約82％序列同一性，更優(yōu)選大約83％序列同一性，更優(yōu)選大約84％序列同一性，更優(yōu)選大約85％序列同一性，更優(yōu)選大約86％序列同一性，更優(yōu)選大約87％序列同一性，更優(yōu)選大約88％序列同一性，更優(yōu)選大約89％序列同一性，更優(yōu)選大約90％序列同一性，更優(yōu)選大約91％序列同一性，更優(yōu)選大約92％序列同一性，更優(yōu)選大約93序列同一性，更優(yōu)選大約94％序列同一性，更優(yōu)選大約95％序列同一性，更優(yōu)選大約96％序列同一性，更優(yōu)選大約97％序列同一性，更優(yōu)選大約98％序列同一性，以及更加優(yōu)選大約99％序列同一性。或者，當(dāng)該片段在選擇性雜交條件下與所述鏈的互補體雜交時存在基本的同源(substantial homology)。比對兩序列并且鑒定同一性的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。幾個計算機程序可用于確定同一性％。為了確定核酸序列同一性百分比而進行的比對可以本領(lǐng)域范圍內(nèi)的多種方式取得，例如，利用公眾可以得到的計算機軟件例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或者Megalign(DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以判定用來測量比對的合適的參數(shù)，包括任何對所比較的序列全長達最大比對所需要的算法。
″轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列″指多核苷酸序列，例如起始信號、增強子與啟動子，其誘導(dǎo)或者控制與其可操作連接的蛋白質(zhì)編碼序列的轉(zhuǎn)錄。在最優(yōu)方案中，重組轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄在啟動子序列(或者其它的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列)的控制之下，所述基因在預(yù)定表達的細胞類型中控制重組基因表達。也應(yīng)該理解，重組基因可以在與那些控制自然發(fā)生的形式的CD20轉(zhuǎn)錄的序列相同或者不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列控制之下。
如同在這里使用的，術(shù)語″轉(zhuǎn)基因″指一個核酸序列(編碼，例如，CD20)，該序列已經(jīng)經(jīng)由人的干預(yù)例如經(jīng)由在這里敘述的方法被引入細胞。所述轉(zhuǎn)基因?qū)ζ鋵⒁灰氲霓D(zhuǎn)基因動物或者細胞是部分地或者完全地異源的，即外來的。一轉(zhuǎn)基因可以包括一個或多個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列與任何其它的可能是為所選擇的核酸最佳的表達所需的核酸，例如內(nèi)含子。
轉(zhuǎn)基因動物″或″Tg+″可互換地使用，并且意圖包括任何非-自然發(fā)生的非-人動物，其中該動物的一個或多個細胞包含已經(jīng)經(jīng)由人的干預(yù)例如經(jīng)過本領(lǐng)域已熟知的轉(zhuǎn)基因技術(shù)被引入的、編碼人CD20的異源核酸。經(jīng)由有意的遺傳操縱，例如經(jīng)過顯微注射或者用感染，將重組病毒引入該細胞的前體，使核酸被直接地或者間接地引入該細胞。
術(shù)語遺傳操縱不包括經(jīng)典的雜交育種，而是針對重組DNA分子的引入。這個分子可能被整合入染色體，或者可以是染色體外復(fù)制的DNA。術(shù)語″Tg+″包括對于人CD20而言雜合的及/或純合的動物。
″CD20相關(guān)的疾病″指那些已經(jīng)與CD20在細胞上表達、B細胞的異常增殖或者活化有聯(lián)系、或者已經(jīng)用抗-CD20抗體處理過的疾病或者紊亂。例如，嵌合的抗-CD20抗體已經(jīng)被用于治療淋巴瘤病人。已經(jīng)用抗-CD20治療處理過的其它的疾病或者癥狀包括例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、和強直性脊柱炎等自身免疫癥狀或者疾病。其它的病癥包括血或者骨髓移植后的EB病毒有關(guān)的疾病、卡波濟氏肉瘤有關(guān)的皰疹病毒相關(guān)的多中心性Castlemen疾病(Karposi Sarcoma associated herpes virus relatedmulticentric Castlemen disease)、丙型肝炎有關(guān)的冷球蛋白血癥性血管炎、具有自體免疫性溶血性貧血的淋巴增生性疾病、與ANCA相關(guān)的血管炎。
A.本發(fā)明的方式本發(fā)明提供表達異源CD20標(biāo)志物的轉(zhuǎn)基因動物。在一個實施方式中，本發(fā)明的人CD20轉(zhuǎn)基因動物在與人相同類型的B細胞上表達CD20。由于缺乏有效轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域向轉(zhuǎn)基因的摻入，先前制備表達人CD20轉(zhuǎn)基因小鼠的嘗試未能取得人CD20在合適的B細胞亞群中、或以足夠的水平的表達。
本發(fā)明提供具有以類似于人受試者的方式反應(yīng)的細胞的轉(zhuǎn)基因動物。將抗-人CD20抗體給予該目前敘述的轉(zhuǎn)基因動物，導(dǎo)致表達人CD20的B淋巴細胞的消減。在一個實施方式中，人CD20轉(zhuǎn)基因鼠特征為人CD20在細胞上的表達水平足以使與該表達細胞結(jié)合的抗人CD20抗體影響細胞的殺傷，引起至少大約75％、和更優(yōu)選80％、85％、90％、95％、99％并且甚至100％外周的及/或循環(huán)B細胞的消減。一個類似的反應(yīng)在人中觀察到。這些動物模型能被用于篩選藥劑，包括然而并非限于抗CD20標(biāo)志物的單克隆抗體。另外，該轉(zhuǎn)基因動物可能用來測試抗-CD20指向的治療的效力與毒性。
B.DNA構(gòu)建物典型的，編碼本發(fā)明的異源蛋白質(zhì)的多核苷酸分子被插入載體中，優(yōu)選DNA載體，以在合適的寄主細胞中復(fù)制該多核苷酸分子。DNA構(gòu)建物也可以對制備用于敲除動物的靶向載體有用處。
為了分離、克隆與轉(zhuǎn)移CD20基因座，可以使用酵母人工染色體(YAC)。整個基因座可以被克隆，并被包含在一個或者幾個YAC克隆中。如果使用許多的YAC克隆，并且包含重疊同源的區(qū)域，它們可以在酵母宿主株內(nèi)部重組，以產(chǎn)生代表整個基因座的單一構(gòu)建物。YAC臂可以另外用哺乳動物選擇盒通過改型(retrofitting)來進行修飾，以幫助構(gòu)建物經(jīng)過以前概括的方法引入胚胎干細胞或者胚胎。
由于其高穩(wěn)定性與可以插入相對大的插入物、操作容易、以及可以鳥槍法測序，細菌人工染色體(BAC)文庫可以提供目的基因的人源序列。BAC文庫包含100-150bp大小的平均插入物。BAC克隆能夠攜帶高達300,000bp的插入物。Shizuya，et al.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 898794-8797；Kim，et al.，(1996)Genomics 34 213-218；Swiatek，et al.，(1993)Genes andDevelopment 72071-2084。人與小鼠的基因組BAC文庫已經(jīng)被構(gòu)建，并且市場上可買到(Invitrogen，Carlsbad CA)?；蚪MBAC文庫還可以作為人與鼠CD20基因序列以及轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域的來源。
編碼人CD20的核酸為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。圖21顯示人CD20代表性cDNA(SEQ ID NO2)、基因組(SEQ ID NO3)與氨基酸序列(SEQ ID NO1)。其它的序列也可以在GenBank中找到，例如登記號碼AH003353。鼠CD20代表性cDNA(SEQ ID NO4)如圖21D所示。
異源的轉(zhuǎn)基因優(yōu)選包含與將要在轉(zhuǎn)基因非-人動物中表達的目的基因可操作連接的種系調(diào)節(jié)DNA序列。術(shù)語″可操作地連接″指一遺傳片段在操作上(即功能上)與一核酸片段、或一給定片段或者序列的上游(5′)或者下游(3′)序列連接。那些附近的序列經(jīng)常影響在一所需的細胞類型中核酸片段或者序列的加工及/或表達。
優(yōu)選，這些調(diào)節(jié)序列是基因組來源的，并且包括一個或者多個內(nèi)含子。例如，轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物可以包括位于編碼CD20 5′-旁側(cè)區(qū)的調(diào)節(jié)區(qū)，該調(diào)節(jié)區(qū)可操作地以能在寄主細胞中復(fù)制與表達的方式與編碼序列連接。在一個實施方式中，調(diào)節(jié)序列包含與CD20有自然聯(lián)系的內(nèi)源的啟動子序列。在一些實施方式中，啟動子提供與在該序列所來源的動物中的表達水平類似的水平的組織特異性的表達。如果額外的旁側(cè)序列在最佳化表達中有用，可以利用目前的序列作為探針克隆這樣的序列。為轉(zhuǎn)基因的最大加工或者表達所需的附加序列可以源自于基因組序列。
或者，啟動子可以是那些與在該轉(zhuǎn)基因宿主動物中相應(yīng)的內(nèi)源的基因有聯(lián)系的啟動子。例如，如果通過與相應(yīng)的人基因整合而破壞鼠基因CD20基因，相應(yīng)的人基因優(yōu)選是整合的，以致于與內(nèi)源鼠CD20的鼠轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域可操作地連接。
優(yōu)選，調(diào)節(jié)序列在合適的細胞中并以一定的水平提供該轉(zhuǎn)基因的表達以致可以利用標(biāo)準(zhǔn)方法例如用抗體檢測來檢測表達。在一個實施方式中，調(diào)節(jié)序列以在人細胞上CD20表達的至少40％的水平提供該人CD20轉(zhuǎn)基因的表達。
編碼如同在這里敘述的轉(zhuǎn)基因的表達系統(tǒng)或者構(gòu)建物還可以包括DNA序列下游3′非翻譯區(qū)。像這樣的區(qū)域可以使該表達系統(tǒng)的RNA轉(zhuǎn)錄物穩(wěn)定，并因此增加來自該表達系統(tǒng)的想要的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。對這個發(fā)明的構(gòu)建物有用的3′非翻譯區(qū)之一是那些提供多聚腺苷酸化信號的序列。像這樣的序列可以源自，例如SV40小t抗原、CD20非翻譯區(qū)或者其它本領(lǐng)域熟知的3′非翻譯序列。
選擇性地，該表達系統(tǒng)或者構(gòu)建物包括在啟動子與編碼該信號序列的DNA序列之間的5′非翻譯區(qū)。
像這樣的非翻譯區(qū)可以來自于從中獲取啟動子的相同的控制區(qū)域，或者可以來自于不同基因，例如它們可能是來源于其它的人造的、半-人造的或者天然來源。
另外，可以利用非自然地與該轉(zhuǎn)基因有聯(lián)系的其它啟動子或者其它轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列。例如，異源的啟動子可以提供增強水平的表達或者組織特異性的表達。具有不同強度的各種啟動子可以被利用，只要該啟動子在該非-人動物或者在該所需的組織類型中起作用。許多啟動子為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知。
表達系統(tǒng)可以利用本領(lǐng)域已知的方法制備。例如，表達系統(tǒng)可以作為較大質(zhì)粒的一部分被制備。像這樣的制備允許以本領(lǐng)域已知的有效方式克隆與選擇正確構(gòu)建物。表達系統(tǒng)可以位于質(zhì)粒上適宜限制性位點之間，以致它們可以容易地從摻入該想要的哺乳動物的其余質(zhì)粒序列中分離。
優(yōu)選，編碼人CD20的DNA構(gòu)建物包含細菌人工染色體以提供組織特異性的表達，所述細菌人工染色體包括自然相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列。
在質(zhì)粒制備與宿主有機體的轉(zhuǎn)化中使用的各種的方法在本領(lǐng)域是已知的。對于其它的對于原核的與真核細胞合適的表達系統(tǒng)，以及一般的重組操作，參見“Molecular CloningA Laboratory Manual”，第二版，Sambrook、Fritsch與Maniatis編輯，(冷泉港實驗室出版社1989)第16與17章。
C.轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)生產(chǎn)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物的方法，包括敲除(knock-out)與“敲入”(knock-in)法，在本領(lǐng)域是熟知的(參見，一般地，“基因打靶一個實用的方法”，Joyner編輯，牛津大學(xué)出版社有限公司(2000))。在一個實施方式中，轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生可以選擇性地涉及鼠標(biāo)志物基因座位的破壞與將編碼人標(biāo)志物的該基因引入該鼠基因組，優(yōu)選與內(nèi)源基因在相同的位置。
根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)人CD20已經(jīng)被引入該鼠基因組時，生產(chǎn)出轉(zhuǎn)基因小鼠模型(huCD20+；或者稱為huCD20Tg+)。內(nèi)源的鼠CD20多肽存在于鼠淋巴細胞上，但是已知的抗-人CD20單克隆抗體不與鼠B細胞結(jié)合。內(nèi)源的鼠CD20基因因此無須、但是如果想要可以被破壞。當(dāng)內(nèi)源的鼠CD20未被破壞，則編碼人CD20的基因優(yōu)選插入在編碼鼠CD20的基因的位置之外的位置。
內(nèi)源性基因座的滅活在一個優(yōu)選實施方案中，內(nèi)源基因座的滅活是經(jīng)過通過胚胎干細胞內(nèi)的同源重組造成的靶向性破壞取得的。在一個實施方式中，DNA被引入寄主細胞并且在該內(nèi)源位點重組以破壞內(nèi)源CD20的生產(chǎn)。利用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法可以生產(chǎn)該靶向構(gòu)建物，(參見，例如Sambrook et al.，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York；E.N.Glover(eds.)，1985，DNA CloningA Practical Approach，Volumes I and II；M.J.Gait(ed.)，1984，Oligonucleotide Synthesis；B.D.Hames & S.J.Higgins(eds.)，1985，NucleicAcid Hybridization；B.D.Hames & S.J.Higgins(eds.)，1984，Transcription andTranslation；R.I.Freshney(ed.)，1986，Animal Cell Culture；Immobilized Cellsand Enzymes，IRL Press，1986；B.Perbal，1984，A Practical Guide ToMolecularCloning；F.M.Ausubel et al.，1994，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，Inc.)。例如，該靶向構(gòu)建體可以依照常規(guī)的方式制備，其中序列可以被合成、從天然來源分離、操縱、克隆、連接、接受體外誘變、引物修補，等等。在各個階段，連接的序列可以被克隆，經(jīng)過限制性內(nèi)切酶酶切分析進行分析，測序等等。
靶向DNA可以利用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)獲得。例如，靶向DNA可以通過寡核苷酸化學(xué)合成、雙鏈DNA模板的切口翻譯、序列的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增(或者連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增)、攜帶目的序列的原核的或者靶克隆載體的純化(例如克隆的cDNA或者基因組DNA，合成DNA或者來自任何前面提到過的組合的DNA)而產(chǎn)生，例如質(zhì)粒、噬菌粒、YACs、粘粒、BACs、噬菌體DNA、其它的病毒DNA或者復(fù)制中間產(chǎn)品、或者其純化的限制性片斷、以及具有所需核苷酸序列的單與雙鏈多核苷酸的其它來源。此外，可利用本領(lǐng)域已知方法選擇同源性的長度。例如選擇可能是以預(yù)先確定的內(nèi)源的靶DNA序列的序列組成與復(fù)雜性為基礎(chǔ)。
在一個實施方式中，本發(fā)明的靶向構(gòu)建物包含靶向區(qū)，其包含與要被破壞的CD20基因的一部分或者區(qū)域同源的第一序列(或者臂)和與該基因的第二部分或者區(qū)域同源的第二序列。該靶向構(gòu)建物可以更進一步地包含正選擇標(biāo)記，其優(yōu)選位于第一與第二DNA序列之間。該正選擇標(biāo)記可以可操作地與啟動子和聚腺苷酸化信號連接。
在另一個實施方式中，該靶向構(gòu)建物可以包含超過一個可選擇的標(biāo)記基因，包括負的選擇性標(biāo)記，例如單純皰疹病毒tk(HSV-tk)基因，其優(yōu)選位于該靶向構(gòu)建物的一或二個同源臂之外。負的可選擇的標(biāo)記可以與啟動子和聚腺苷酸化信號可操作地連接(參見，例如，美國專利號5,464,764；5,487,992；5,627,059及5,631,153)。
一旦合適的靶向構(gòu)建物已經(jīng)被制備，該靶向構(gòu)建物可能利用任何本領(lǐng)域已知方法被引入一合適的寄主細胞。各種的技術(shù)可被用于本發(fā)明，包括，例如原核顯微注射；逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移入種系；在胚胎干細胞中的基因靶向；胚胎的電穿孔；精液介導(dǎo)的基因靶向；與磷酸鈣/DNA共沉淀；顯微注射DNA入核；細菌的原生質(zhì)體與完整細胞融合；轉(zhuǎn)染；聚陽離子例如l，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物、聚鳥氨酸等等。(參見，例如美國專利號4,873,191；Van der Putten et a1.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 826148-6152；Thompson et al.，1989，Cell 56313-321；Lo，1983，Mol Cell.Biol.31803-1814；Lavitrano et al.，1989，Cell，57717-723)。轉(zhuǎn)化哺乳動物細胞的各種技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的(參見，例如Gordon，1989，Intl.Rev.Cytol.，115171-229；Keown et al.，1989，Methods in Enzymology；Keown et al.，1990，Methods and Enzymology，Vol.185，pp.527-537；Mansour et al.，1988，Nature，336348-352)。
能同源重組的任何細胞類型可被用于本發(fā)明的操作。像這樣的靶細胞的例子包括來源于脊椎動物的細胞包括哺乳動物例如人、牛的物種、羊的物種、鼠的物種、猿的物種、與任何真核生物例如絲狀真菌、和高等的多細胞有機體例如植物。
優(yōu)選的細胞類型包括胚胎干(ES)細胞，其典型的獲得自體外培養(yǎng)的移植前胚胎(參見，例如，Evans，M.J.et al.，1981，Nature 292154-156；Bradley，M.O.et al.，1984，Nature 309255-258；Gossler et al.，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 839065-9069；和Robertson et al.，1986，Nature 322445-448)。利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法培養(yǎng)與制備ES細胞用于該靶向構(gòu)建物的導(dǎo)入。(參見，例如，Robertson，E.J.ed.″Teratocarcinomas and Embryonic StemCells，a Practical Approach″，IRL Press，Washington D.C.，1987；Bradley et al.，1986，Current Topics in Devel.Biol.20357-371；Hogan et al.，在″Manipulatingthe Mouse EmbryoA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor N.Y.，1986中；Thomas et al.，1987，Cell 51503；Koller et al.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8810730；Dorin et al.，1992，Transgenic Res.1101；and Veis et al.，1993，Cell 75229)。將要用該靶向構(gòu)建物插入的ES細胞源自于與它們將被引入的發(fā)育胚胎相同物種的胚胎或者胚泡。ES細胞典型的針對它們的整合入內(nèi)部細胞團的能力被選擇，并且當(dāng)在發(fā)育的胚泡階段被引入該哺乳動物胚胎時成為個體的種系的一部分。因此，任何具有這一能力的ES細胞系適于在本發(fā)明的操作中應(yīng)用。
在該靶向構(gòu)建物已經(jīng)被引入細胞之后，鑒別其中已經(jīng)發(fā)生成功的基因靶向的細胞。該靶向構(gòu)建物插入靶基因典型的是經(jīng)過鑒定表達該標(biāo)記基因的細胞而檢測。在一優(yōu)選實施方案中，用本發(fā)明的靶向構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的細胞用選擇未表達該選擇性標(biāo)記的細胞的合適的藥劑處理。只有那些表達選擇性標(biāo)記基因的細胞在一定條件下成活及/或生長。例如，那些表達引入的新霉素抗性基因的細胞抗化合物G418，而那些不表達neo基因標(biāo)記的細胞被G418殺死。如果該靶向構(gòu)建物也包含篩選標(biāo)記例如GFP，同源重組可以通過在熒光下篩選細胞菌落而鑒別。那些已經(jīng)進行同源重組的細胞將已經(jīng)刪除該GFP基因，并且不會發(fā)熒光。
或者，正-負選擇技術(shù)可能用來選擇同源的重組體。這個技術(shù)涉及一種方法，其中第一藥物，例如新霉素樣藥物被加入該細胞群體，來選擇轉(zhuǎn)染細胞的生長，即正選擇。第二藥物，例如FIAU隨后被加入以殺死那些表達負選擇標(biāo)記的細胞，即負選擇。那些包含與表達負選擇標(biāo)記的細胞被選擇藥劑殺死，而那些沒有包含并表達該負選擇標(biāo)記的細胞存活。例如，用構(gòu)建物非-同源插入的細胞表達HSV胸苷激酶，并因此對治療皰疹藥物例如更昔洛韋(GANC)或者FIAU(1-(2-脫氧2-氟代-B-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘代尿嘧啶)敏感。(參見，例如，Mansour et al.，Nature 336348-352(1988)；Capecchi，Science 2441288-1292，(1989)；Capecchi，Trends in Genet.570-76(1989))。其它的方法包括受調(diào)節(jié)的正選擇(參見U.S.20030032175A1)，其中要求加入單一選擇劑。
可經(jīng)過分析被選擇細胞的DNA鑒別成功的重組以印證同源重組。各種的技術(shù)在本領(lǐng)域已知，例如PCR及/或Southern分析可用來印證同源重組事件。
被選細胞然后被注射入動物(例如小鼠)的胚泡(或者其它的適于創(chuàng)造能生存的動物的用途的發(fā)育階段，例如，桑椹胚)，以形成嵌合體(參見，例如Bradley.A.，在“Teratocarcinomas and Embryonic Stem CellsA PracticalApproach”中，J.Robertson編輯，IRL，Oxford，pp.113-152(1987))?；蛘撸贿x的ES細胞可以被允許與離解的小鼠胚胎細胞聚集以形成集合體嵌合體。嵌合胚能因此被移植入合適的假孕雌性代孕動物并且該胚胎被撫育至足月。在其性細胞中攜帶同源重組DNA的嵌合后代可用于繁殖動物，其中該動物的所有的細胞包含同源重組的DNA。在一個實施方式中，嵌合后代小鼠被用來產(chǎn)生在CD20基因具有雜合破壞的小鼠。雜合轉(zhuǎn)基因小鼠可隨后交配。本領(lǐng)域已熟知，典型的，這種交配的后代中1/4將在CD20基因中有純合破壞。
除以上所述滅活內(nèi)源基因座的方法之外，有其它的優(yōu)選滅活方法，并且可以包括例如利用tet轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)來利用特異目的基因的時序控制(Proc.Natl.Acad.Sci.919302-9306(1994)或者引入脫氧細胞周期蛋白(deoxycycline)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)控制進行組織特定的控制(Proc.Natl.Acad.Sci.9310933-10938(1996)。
用于功能性滅活的另外優(yōu)選的方法包括使用cre-lox刪除，用于基因位點的靶向敲除的位點特異性重組系統(tǒng)，其中l(wèi)oxP位點被插入目的基因的側(cè)翼，并且cre重組酶被激活以刪除基因(Curr.Opin.Biotechnol.521-527(1994))。
或者，反義或RNAi方法可能被利用以抑制該目的基因座的轉(zhuǎn)錄，因此導(dǎo)致內(nèi)源位點的功能性破壞(khock-down方法)。在這樣的情形中，生產(chǎn)靶向指定的目的位點的特定序列的寡核苷酸，其中成功靶向?qū)е略摴δ艿鞍椎纳a(chǎn)抑制。
對于內(nèi)源CD20的喪失而言純合的敲除小鼠可以如WO02/062946中描述制備。簡要地，在一個實施方式中，CD20-缺陷的小鼠可以經(jīng)過利用同源重組靶向破壞在胚胎干(ES)細胞中鼠CD20基因而生產(chǎn)。靶向載體可以生產(chǎn)，其用新霉素抗性基因替換編碼第二個細胞外環(huán)的一部分的外顯子，第四跨膜結(jié)構(gòu)域，及鼠CD20大的羧基末端胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。鼠CD20的核苷酸序列為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。(GenBank登記號碼M62541；WO02/062946)。在一個實施方式中，合適的基因?qū)ぐ猩a(chǎn)在氨基酸位置157截斷、并且與Neo基因序列編碼的88個氨基酸的蛋白質(zhì)融合的異常的CD20蛋白質(zhì)。
在DNA轉(zhuǎn)染之后，攜帶靶向等位基因的neo-抗性的ES細胞克隆經(jīng)過Southern印跡分析加以測定。一個ES細胞克隆的細胞可以被注射入可以被轉(zhuǎn)移入代孕母親的那些胚泡。高度嵌合的雄性后代(根據(jù)毛色80-100％)可以用C57BL/6(B6)雌性繁殖，以將突變傳遞給它們的后代。對于CD20基因的破壞純合的小鼠可以經(jīng)過雜交雜合的后代以預(yù)期的孟德爾頻率獲得。
CD20的合適的靶向可以更進一步地用來自純合的后代的基因組DNA進行PCR分析來證實。野生型CD20 mRNA在CD20-/-小鼠中存在或者缺少可以用來自CD20-/-小鼠脾細胞生產(chǎn)的cDNA的PCR擴增證實。CD20-/-小鼠中細胞表面CD20蛋白質(zhì)的缺乏可以更進一步地通過用鼠抗-CD20單克隆抗體染色B220+脾細胞證實。CD20基因的靶向突變消除了細胞表面CD20蛋白質(zhì)的表達。
將轉(zhuǎn)基因引入非-人動物本發(fā)明的非-人轉(zhuǎn)基因動物優(yōu)選經(jīng)過將轉(zhuǎn)基因引入該動物的種系加以生產(chǎn)。在各種的發(fā)育階段的胚胎的靶細胞可用于引入轉(zhuǎn)基因。依賴于胚胎的靶細胞的發(fā)育階段使用不同的方法。以一般健康、良好胚胎產(chǎn)量、胚胎中良好原核能見度與良好生殖適應(yīng)度為標(biāo)準(zhǔn)，選擇任何被用來實施本發(fā)明的動物的特定的譜系。當(dāng)將生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠時，株例如C57BL/6或者C57BL/6xDBA/2F1、或者FVB系是經(jīng)常使用的(商業(yè)上獲得自Charles RiverLabs，Boston，Mass，The Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME，或TaconicLabs.)。優(yōu)選的株是具有H-2b、H2d或者H-2q單倍體的株例如C57BL/6或者DBA/1。此外，裸鼠可以被利用以允許人腫瘤細胞的引入。裸鼠的繁殖與維持更困難，因為其對感染與疾病敏感。用來實行本發(fā)明的系可以本身是轉(zhuǎn)基因的，和/或可以是敲除的。優(yōu)選相同的系被用來制備初始敲除哺乳動物與轉(zhuǎn)基因哺乳動物。這會使以后的繁殖與回交更有效。
轉(zhuǎn)基因引入胚胎可以通過任何本領(lǐng)域已知的方式完成，例如，顯微注射、電穿孔法、或者脂轉(zhuǎn)染。例如，該轉(zhuǎn)基因可以經(jīng)過將構(gòu)建物顯微注射入已受精的哺乳動物卵的原核而被引入哺乳動物，使得一或多拷貝的該構(gòu)建物保留在發(fā)育哺乳動物的細胞中。轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物被引入受精卵后，該卵可以體外孵化一可變的時間，或者再植入代理宿主內(nèi)，或者兩者都有。活體外孵化至成熟在本發(fā)明范圍之內(nèi)。一個常見的方法是活體外孵化該胚胎大約1-7天(取決于物種)，然后將其再植入代理宿主。
再植入術(shù)利用標(biāo)準(zhǔn)方法完成。通常，代理宿主是被麻醉的，并且胚胎被插入輸卵管中。移植入特定宿主的胚胎數(shù)目將隨物種改變，但是將通常與該物種自然生產(chǎn)的后代數(shù)目同等。
還可以使用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染將轉(zhuǎn)基因引入非-人動物。發(fā)育的非-人胚胎可以體外培養(yǎng)至胚泡階段。在這一時期，可以針對卵裂球進行逆轉(zhuǎn)錄病毒感染(Jaenich，R.(1976)PNAS 731260-1264)。經(jīng)過酶處理除去透明帶，以獲得卵裂球的有效感染(Manipulating the Mouse Embryo，Hogan eds.(ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，1986)。用來引入轉(zhuǎn)基因的病毒載體系統(tǒng)典型的是攜帶該轉(zhuǎn)基因的復(fù)制缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒(Jahner et al.et al.(1985)PNAS 826927-6931；Van der Putten et al.(1985)PNAS 826148-6152)。經(jīng)過在單層生成病毒的細胞上培養(yǎng)卵裂球容易與有效地獲得轉(zhuǎn)染(Van der Putten，supra；Stewart et al.(1987)EMBO J.6383-388)。或者，感染可以在以后階段進行。病毒或者生產(chǎn)病毒的細胞可以被注射入囊胚腔(Jahneret al.(1982)Nature 298623-628)。大多數(shù)建立考對于該轉(zhuǎn)基因是嵌合體，因為摻入僅僅發(fā)生在形成該轉(zhuǎn)基因非-人動物的細胞亞群。更進一步地，建立者可以在基因組不同位置包含轉(zhuǎn)基因的各種逆轉(zhuǎn)錄病毒插入物，其通常將分散在后代中。另外，可能經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄病毒子宮內(nèi)感染妊娠中期胚胎來將轉(zhuǎn)基因引入種系(Jahner et al.(1982)supra)。
轉(zhuǎn)基因引入的第三種類型的靶細胞是胚胎干細胞。轉(zhuǎn)基因可以通過DNA轉(zhuǎn)染或者通過逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)有效地被引入ES細胞。這樣轉(zhuǎn)化的ES細胞可以此后與來自非-人動物的胚泡結(jié)合。ES細胞此后加入胚胎，并且構(gòu)成所得到的嵌合的動物的種系的一部分。
在一個實施方式中，例如圖21所示編碼人CD20的cDNA或者基因組克隆可以利用顯微注射或轉(zhuǎn)染被引入FVB小鼠受精卵或者ES細胞。胚胎體外孵化大約1-7天，然后移植入代理宿主。ES細胞與來自自然交配的宿主動物的胚泡結(jié)合，并且胚泡被再植入代理母親。
在本發(fā)明的一個實施方式中，在非人宿主中的內(nèi)源CD20基因經(jīng)過異源的CD20的同源的整合作用被功能上破壞，以致于異源的CD20基因?qū)嵸|(zhì)上替換內(nèi)源的CD20，并且優(yōu)選完全替換內(nèi)源的CD20基因的編碼序列。優(yōu)選，作為同源的整合作用的結(jié)果，異源的CD20基因分別地連接于該內(nèi)源的CD20基因的調(diào)節(jié)序列(例如增強子啟動子)，以致該異源基因在來自內(nèi)源的CD20基因位點的調(diào)控元件的轉(zhuǎn)錄控制之下被表達。對于象這樣的替換等位基因是純合的非人類的宿主可以根據(jù)在這里敘述的方法生產(chǎn)。象這樣的純合的非人類的宿主一般地將表達異源的CD20，但是不表達內(nèi)源的CD20蛋白質(zhì)。通常，異源的CD20基因的表達模式實質(zhì)上模仿在自然發(fā)生的(非轉(zhuǎn)基因)非人類宿主中內(nèi)源的CD20基因的表達模式。
例如，可以生產(chǎn)人CD20基因序列已經(jīng)代替內(nèi)源的鼠CD20基因序列、并且轉(zhuǎn)錄上受內(nèi)源鼠調(diào)節(jié)序列控制的轉(zhuǎn)基因小鼠。人CD20一般地類似于在自然發(fā)生的非轉(zhuǎn)基因小鼠中鼠CD20的方式加以表達。
一般地，使用替換類型的靶向構(gòu)建物進行同源基因替換。在靶向構(gòu)建物的內(nèi)源CD20基因序列之間雙交叉同源重組，導(dǎo)致異源的CD20基因片段的靶向整合作用。通常，該轉(zhuǎn)基因的同源靶向區(qū)域包含內(nèi)源的CD20基因片段側(cè)翼的序列，以致同源重組導(dǎo)致內(nèi)源的CD20基因片段的伴隨的刪除，和異源基因片段的同源整合作用。實質(zhì)上整個的內(nèi)源的CD20基因可以由單一靶向事件或者由多重靶向事件用異源的CD20替換(例如，單個外顯子的依序替換)。一或多個選擇性標(biāo)記通常可以正的或者負的選擇表達盒形式被置于靶向構(gòu)建物中。通常優(yōu)選選擇性標(biāo)記位于異源替換區(qū)域的內(nèi)含子區(qū)域。
轉(zhuǎn)基因小鼠的雜交包含轉(zhuǎn)基因人CD20的轉(zhuǎn)基因小鼠可以與缺乏鼠CD20的轉(zhuǎn)基因小鼠雜交。在一個實施方式中，轉(zhuǎn)基因小鼠包含人CD20，并且缺乏鼠CD20。制備方式將產(chǎn)生一系列哺乳動物，每個包含該想要的敲除構(gòu)建物或者轉(zhuǎn)基因中的一個。像這樣的哺乳動物通過一系列雜交、回交與選擇共同繁殖，最終產(chǎn)生包含所有的想要的敲除構(gòu)建物及/或轉(zhuǎn)基因的單一哺乳動物，其中該哺乳動物除了對該敲除構(gòu)建物及/或轉(zhuǎn)基因的存在之外對野生型是同類系的(遺傳上同一的)。
典型地，取決于增殖過程中每個特定步驟的目標(biāo)通過交配同胞兄弟姐妹或者用后代交配親本株完成雜交與回交。在某些情況下，也許必需產(chǎn)生許多后代，以產(chǎn)生在適當(dāng)?shù)娜旧w位置包含每一敲除構(gòu)建物及/或轉(zhuǎn)基因的單一后代。另外，也許必需雜交或者回交幾代，以最終獲得想要的基因型。
一旦該人位點已經(jīng)或者由同源重組或者由隨機的整合作用被引入宿主基因組，并且內(nèi)源CD20基因座已被滅活的宿主動物已經(jīng)用經(jīng)過各種轉(zhuǎn)基因或者突變的動物的適當(dāng)繁殖而產(chǎn)生，可以產(chǎn)生缺乏產(chǎn)生內(nèi)源CD20的天然能力、但是具有產(chǎn)生人CD20的能力的宿主。
D.轉(zhuǎn)基因的存在的證實可經(jīng)過任何合適的方法以在所需組織、細胞或者動物中該轉(zhuǎn)基因的存在及/或表達篩選代理宿主的轉(zhuǎn)基因后代。篩選經(jīng)常利用對該轉(zhuǎn)基因的至少一部分互補的探針經(jīng)過Southern印跡或者Northern印跡分析完成?？梢允褂美每褂稍撧D(zhuǎn)基因編碼的蛋白質(zhì)的抗體進行的蛋白質(zhì)印跡分析，作為篩選轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的存在的替代或者補充的方法。典型地，DNA制備自尾組織，并且經(jīng)過Southern分析或者PCR分析該轉(zhuǎn)基因?；蛘?，雖然任何組織或者細胞類型可被用來進行這一分析，利用Southern分析或者PCR測試被認為以最高水平表達該轉(zhuǎn)基因的組織或者細胞該轉(zhuǎn)基因的存在與表達。
評價轉(zhuǎn)基因存在的其它或者附加方法包括，但不限于，合適的生物化學(xué)的試驗例如酶及/或免疫學(xué)測定，對于特定的標(biāo)記或者酶活性的組織學(xué)染色、流式細胞計分析，等等。對血液的分析也可以對檢測血中該轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的存在，以及評定該轉(zhuǎn)基因在各種類型血細胞及其它血液組分水平的效應(yīng)有用處。在一個實施方式中，人CD20的表達可以利用對人CD20的可檢測的標(biāo)記抗體在來自脾、骨髓、外周血、淋巴結(jié)與派伊爾斑的免疫細胞上檢測，并且利用FACS分析標(biāo)記的細胞。
對在本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因小鼠中表達模式的檢驗揭示對在人B系譜細胞中發(fā)現(xiàn)的正常人CD20表達的反映。以細胞的百分數(shù)與表型特征考察的其它免疫學(xué)參數(shù)，包括T細胞、B細胞、NK細胞、巨噬細胞、樹狀細胞與嗜中性白細胞的百分數(shù)與表型特征，揭示在轉(zhuǎn)基因負的與正的同窩出生仔畜之間的相似性。
E.轉(zhuǎn)基因動物的運用本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物代表在人中CD20表達與作用的模型。相應(yīng)地，這些動物在研究其起作用與相關(guān)的事件后的機制、并且生成及測試對治療與診斷CD20有關(guān)的人類疾病包括癌癥與自身免疫病癥有用的產(chǎn)物(例如，抗體，雙特異性，多特異性等等)中有用。
在有些實施方案中，轉(zhuǎn)基因表達的人CD20保有與在人細胞中所顯示出的類似功能特性。例如，表達人CD20的B淋巴細胞被抗-人CD20抗體所識別，并且如同在人中一樣，響應(yīng)人CD20抗體給藥而類似地從該轉(zhuǎn)基因動物中消減。如在實施例中更進一步詳細描述的，在本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因小鼠中的B淋巴細胞響應(yīng)用抗-人CD20抗體例如Rituxan處理而被消減。在一個實施方式中，人CD20轉(zhuǎn)基因鼠特征為人CD20在細胞上的表達水平足以使與該表達細胞結(jié)合的抗人CD20抗體影響細胞的殺傷，引起的至少大約75％、和更優(yōu)選80％、85％、90％、95％、99％并且甚至100％外周的及/或循環(huán)B細胞的消減。一個類似的反應(yīng)在人中觀察到。
相應(yīng)地，在一個實施方式中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物被用于測試藥劑例如抗體、多或者雙特異性分子、免疫粘附素(例如對人體的安全性與效力)與靶表位，例如人CD20的區(qū)域的結(jié)合。其它藥劑可以包括有或者沒有Fc區(qū)域的抗體的抗原結(jié)合片段、單鏈抗體、微抗體(minibody)(僅有重鏈的抗體)、具有多聚體之一抗-人CD20抗原結(jié)合區(qū)域的異源多聚免疫粘附素。其它的藥劑可以包括抑制或者導(dǎo)致CD20-B細胞消減的小分子，可以包括與CD20結(jié)合、但是不激活CD20的CD20配體的變體。例如，像這樣的藥劑消減CD20表達細胞例如惡性的B細胞的效力可以經(jīng)過測量測試藥劑給藥前后轉(zhuǎn)基因動物中B淋巴細胞水平來測定。
相應(yīng)地，本發(fā)明經(jīng)過給予表達人CD20的轉(zhuǎn)基因動物一種藥劑與確定B淋巴細胞數(shù)目是否有減少，提供鑒定能治療B細胞淋巴瘤的藥劑，以及能消減或者殺死表達人CD20的B淋巴細胞的藥劑的方法。如同在這里使用的，“B細胞消減(depletion)”指在藥物或者抗體處理之后同像這樣的處理以前的水平比較起來，在動物或者人中B細胞水平的減少。B細胞水平利用如同在這里敘述的已知方法是可度量的。B細胞消減可以是部分的或者完全的。
優(yōu)選，該藥劑誘導(dǎo)的B細胞消減的水平是與疾病或紊亂癥狀的降低或者改善相關(guān)的數(shù)量。該推定的藥劑的效力(即它的消耗表達CD20的B淋巴細胞的能力)可以經(jīng)過測量在表達CD20的轉(zhuǎn)基因動物中循環(huán)B淋巴細胞基線水平、并與相同的動物中給藥之后水平相比較而評估。B細胞消減效力的比較可以針對已知治療劑例如抗-人CD20抗體(例如Rituxan)進行，以計量該推定的藥劑對于CD20有關(guān)癥狀治療的效力?；蛘撸珺淋巴細胞的基線水平可以在表達人CD20的第一轉(zhuǎn)基因動物的各種的組織(例如脾、骨髓、外周血、淋巴結(jié)、派伊爾斑)中測量。
該推定的藥劑能隨后被給予表達人CD20的第二轉(zhuǎn)基因動物。動物然后被殺死，并且分析B淋巴細胞的水平。在表達人CD20的轉(zhuǎn)基因動物中B淋巴細胞數(shù)目減少指示該藥劑在減低與B細胞淋巴瘤有聯(lián)系的癌細胞及/或在人受試者中治療B細胞淋巴瘤的效力。也可以測試聯(lián)合治療來判定消耗該想要的細胞類型的效力。例如，抗-人CD20抗體可以與另一個藥劑例如Br3-Fc結(jié)合以引起任何可能是對抗-人CD20殺傷有抗力的攜帶CD20的B細胞消減。
B淋巴細胞恢復(fù)還可以通過隨著時間測量在一系列轉(zhuǎn)基因動物中細胞水平來評估。該藥劑對于人CD20的特異性可以經(jīng)過比較該藥劑對表達人CD20轉(zhuǎn)基因小鼠的影響與對野生型小鼠(不表達CD20標(biāo)志物)的影響而評估。該藥劑的效力還可以與安慰劑或者對照物質(zhì)例如非特異性抗體或者其它的對照劑的效應(yīng)比較。優(yōu)選，該藥劑靶向大多數(shù)或者所有攜帶人CD20的細胞但是不影響提供對刺激T非依賴性免疫反應(yīng)的抗原的免疫反應(yīng)性的細胞。
另外，這些動物對于評估在人中免疫反應(yīng)的潛力是有用的模型，因為在轉(zhuǎn)基因動物中給藥像這樣的藥劑后免疫反應(yīng)的起始指示該藥劑將在人中產(chǎn)生相同的效應(yīng)。在像這樣的轉(zhuǎn)基因動物中對免疫反應(yīng)的影響可以例如經(jīng)過細胞因子水平的改變，抗體的生產(chǎn)或者T細胞反應(yīng)來檢測。另外，轉(zhuǎn)基因動物可以在多或者雙特異性分子給藥之前被改造以包含靶細胞(例如腫瘤，病毒)。
為了在抗-CD20抗體或者雙或多特異性分子給藥至轉(zhuǎn)基因動物后檢測抗體結(jié)合，能使用任何合適的分析。例如，可以取動物血樣品并且利用本領(lǐng)域已知的篩選試驗，例如酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，放射免疫測定(RIA)，或者蛋白質(zhì)印跡試驗分析抗CD抗體-CD復(fù)合體的存在。這些分析中的每一個通常經(jīng)過使用特異于目的復(fù)合物的標(biāo)志物的試劑(例如抗體)檢測特定目的蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合體的存在。相應(yīng)地，在本發(fā)明中，這些試驗被用于檢測包含在動物血清中的免疫球蛋白(例如IgG、IgA等等)與在該動物的特定細胞表面上包含的人CD標(biāo)志物之間形成的CD-抗體復(fù)合物。
利用例如識別并特異地與抗體-CD標(biāo)志物復(fù)合物結(jié)合的酶聯(lián)抗體或者抗體片段可以檢測該CD標(biāo)志物-抗體復(fù)合物。或者，可以利用各種各樣的其它的免疫測定中任何一種檢測該復(fù)合體。例如，抗體可以是放射性標(biāo)記的，并且被用于放射免疫測定(RIA)。放射性同位素可以經(jīng)過像利用γ粒子計數(shù)管或者閃爍計數(shù)器或者經(jīng)過放射自顯影術(shù)這樣的方式檢測。
為了在抗體或者雙或者多特異性分子或者其它的藥劑給藥到轉(zhuǎn)基因動物后檢測免疫反應(yīng)，可以使用測量動物血漿或者血清中例如細胞因子、抗體或者T細胞群體濃度方面改變的任何合適的程序。例如，體內(nèi)細胞因子濃度改變可以通過各種各樣的免疫測定檢測，例如酶免疫測定(EIA)，放射免疫測定(RIA)或者ELISPOT化驗?？梢员环治龅氖痉缎缘募毎蜃影＜毎?巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、白細胞介素1-12(IL-1至IL-12)。
例如可以從已經(jīng)進行抗體、雙特異性或者多特異性分子或者其它的藥劑給藥的轉(zhuǎn)基因動物獲得。可以利用EIA經(jīng)過檢測細胞因子與同酶偶聯(lián)的抗體的交互作用測量細胞因子的濃度。用合適的底物一優(yōu)選顯色底物一進行反應(yīng)，借助于產(chǎn)生可以被檢測的化學(xué)部分的方法，例如，經(jīng)過分光光度法、熒光的或者經(jīng)過視覺的方法，來檢測酶活性(Voller，“The Enzyme LinkedImmunosorbent Assay(ELISA)”，Diagnostic Horizons 21-7，1978，MicrobiologicalAssociates Quarterly Publication，Walkersville，MD；Voller，et al.，J.Clin.Pathol.31507-520(1978)；Butler，Meth.Enzymol.73482-523(1981)；Maggio，(ed.)Enzyme Immunoassay，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L，1980；Ishikawa，et al.，(eds.)EnzymeImmunoassay，Kgaku Shoin，Tokyo，1981)?？捎糜跈z測性地標(biāo)記該抗體的酶包括，但是不局限于，蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、Δ-5-甾體異構(gòu)酶、酵母乙醇脫氫酶、α-甘油磷酸鹽脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、辣根過氧化酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、尿素酶、過氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡糖淀粉酶與乙酰膽堿酯酶。檢測可以通過使用對該酶的顯色底物的比色法進行。檢測也可以通過視覺上將底物的酶促反應(yīng)程度同類似制備的標(biāo)準(zhǔn)比較或者利用RIA進行。
也可能用熒光的化合物標(biāo)記抗-細胞因子抗體或者抗CD20藥劑。當(dāng)熒光標(biāo)記的抗體暴露于適當(dāng)?shù)牟ㄩL的光時，可隨后檢測它的存在。最通常使用的熒光標(biāo)記化合物是異硫氰酸熒光素、若丹明、藻紅蛋白、藻青蛋白、別藻藍蛋白，o-苯二甲醛與熒光胺?？贵w還可以利用發(fā)熒光金屬例如152銪或者其它的鑭系進行可檢測地標(biāo)記。這些金屬可以利用像金屬螯合基團例如二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或者乙二胺四乙酸(EDTA)來附于抗體。抗體也可以經(jīng)過偶聯(lián)其至化學(xué)發(fā)光的化合物而可檢測地標(biāo)記。然后經(jīng)過檢測在化學(xué)反應(yīng)期間產(chǎn)生的熒光確定化學(xué)發(fā)光示蹤的抗體的存在。特別有幫助的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物的例子是發(fā)光氨、異氨基苯二酰肼、theromatic吖啶酯、咪唑、吖啶鹽與乙二酸酯。同樣地，生物發(fā)光的化合物可能用來標(biāo)記抗體。生物發(fā)光是一類在生物系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的化學(xué)熒光，其中催化蛋白質(zhì)提高化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的效率。生物發(fā)光的蛋白質(zhì)的存在經(jīng)過檢測熒光的存在而測定。用于標(biāo)記的重要的生物發(fā)光的化合物是熒光素，熒光素酶與水母蛋白。
本發(fā)明的非人轉(zhuǎn)基因動物可以更進一步提供向人給藥的具體的藥劑的安全性指示。例如，可以將人源化的抗體或者其它的藥劑給予該轉(zhuǎn)基因動物，并且作為該人源化抗體或者藥劑的人體內(nèi)利用的安全性與耐受性的指示、監(jiān)視作為將該藥劑投藥給該動物的結(jié)果的任何毒性或者副作用。那些可以在短期基礎(chǔ)上出現(xiàn)的不利情況包括頭痛、感染、發(fā)熱、寒戰(zhàn)、疼痛、惡心、無力、咽炎、腹瀉、鼻炎、灌輸反應(yīng)、與肌痛。短期不利情況是處理后數(shù)天內(nèi)計量的。長期的副作用包括某些細胞類型的細胞毒、血小板減少導(dǎo)致的出血、由于炎性及/或變態(tài)反應(yīng)導(dǎo)致的介質(zhì)釋放、對免疫系統(tǒng)的抑制和/或抗治療劑抗體產(chǎn)生的抑制、終端器官毒性、感染或者惡性腫瘤發(fā)生率增加。長期的不利情況是處理后數(shù)月內(nèi)計量的。
本發(fā)明的另一方面涉及測定抗CD20藥劑的效力的方法。通過向一系列具有人CD20的轉(zhuǎn)基因動物給予一系列劑量的該藥劑、確定導(dǎo)致攜帶人CD20細胞的減少的藥劑的至少一個劑量而確定效力。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物，包括細胞、組織、或者從其中衍生的其它的材料，可以作為疾病模型，特別是與攜帶CD20細胞有關(guān)的或者其介導(dǎo)的疾病模型被使用。任何物種的動物，包括然而并非限于，小鼠、大鼠、兔、豚鼠、豬、微型豬(micro-pig)、山羊，與非-人靈長目、例如狒狒，猴子，與黑猩猩可能用來產(chǎn)生疾病動物模型。這些系統(tǒng)可能用于各種各樣的應(yīng)用。像這樣的試驗可以作為篩選策略的一部分來設(shè)計鑒別藥劑，例如能改善病癥的化合物。因此，以動物與細胞為基礎(chǔ)的模型可能用來鑒別可能在治療疾病中有效的藥物、藥品、治療與介入。
以細胞為基礎(chǔ)的系統(tǒng)可以用來鑒別可以對改善病癥起作用的化合物。例如，可以將這樣的細胞系統(tǒng)以足夠的濃度，足以引發(fā)被暴露的細胞中病癥的所述改善的時間，暴露于懷疑具有改善病癥能力的化合物。暴露后，檢查細胞以判定疾病細胞的表現(xiàn)型中一個或多個是否已經(jīng)轉(zhuǎn)變，以與更正常的或更野生型，非-疾病表現(xiàn)型相似。
其它用途對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。
以下非-限制性實施例舉例說明本發(fā)明。
實施例實施例1本實施例敘述人CD20BAC轉(zhuǎn)基因(Tg+)小鼠的產(chǎn)生，并且研究了抗-人CD20抗體處理在hCD20+小鼠中的效果。
利用來自Invitrogen(Invitrogen，Carlsbad，CA)的CITB人BAC-D-克隆No.117H19生產(chǎn)人CD20轉(zhuǎn)基因小鼠。編碼人CD20的DNA從人淋巴細胞中分離，并且送至Invitrogen。Invitrogen用來自人BAC文庫的克隆用濾紙(against the filters)測試DNA，并且鑒定克隆117H19。先前的產(chǎn)生表達人CD20的轉(zhuǎn)基因小鼠的嘗試不成功，也許部分由于沒有將足夠的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域包括入轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物。經(jīng)過用克隆117H19制備的人CD20BAC構(gòu)建物顯微注射入小鼠FVB近交系的受精卵，生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠。受精卵孵化1-7天，然后移植入代用小鼠。基于人CD20表達的FACS分析篩選小鼠。如同可以從在圖1的FACS圖中看到的，用于轉(zhuǎn)基因的雜合的(Tg+/-)與純合的(Tg+/+)小鼠，在它們的B220+B細胞上表達人CD20。小鼠CD20基因沒有被有意破壞。
圖2提供在B細胞分化與成熟期間各種細胞表面標(biāo)志物(CD43，IgM，IgD)表達的示意圖。在Tg+小鼠中，hCD20在前-B、未成熟的B細胞與成熟B細胞上表達。人CD20在與人相同的細胞類型中發(fā)現(xiàn)，并且以與人B細胞相比，以相同的水平或稍低的水平在這些細胞類型上表達。
利用偶聯(lián)至FITC的抗-人CD20抗體(BD Pharmingen)篩選Tg+小鼠在骨髓、脾、腸系膜LN與派伊爾斑(Peyer′s patches)B細胞上對于人CD20的表達(結(jié)果示于圖3-6)。以B220與CD43、CD21、或者CD38對細胞門化，從而允許對來自不同組織的各種的B細胞群體進行劃分。為了進行門化，細胞用偶聯(lián)至PerCP的抗-B220抗體(BD Biosciences)染色，并且用偶聯(lián)至PE的抗CD43抗體，抗-CD21抗體或者抗-CD38抗體(fluorescence，BectonDickinson)染色。
將在轉(zhuǎn)基因小鼠外周血細胞上人CD20的表達水平與在人外周血細胞上人CD20表達水平相比較。外周血細胞獲自人供體和來自hCD20Tg+小鼠，并且用標(biāo)記的抗-人CD20抗體(mH27)染色。細胞用FACS分析，分別根據(jù)人CD19與B220的表達門化。圖22顯示代表性作圖。在圖上的數(shù)字表示平均熒光強度。圖上的數(shù)字顯示，基于平均熒光強度的比較，人CD20在轉(zhuǎn)基因細胞上以在人細胞上人CD20的大約40％的水平表達。
這些結(jié)果表明獲自轉(zhuǎn)基因小鼠中許多不同組織的B細胞表達人CD20標(biāo)志物。人CD20標(biāo)志物主要地在成熟B細胞上發(fā)現(xiàn)，但也可以以類似于在人中觀察到的模式在前-B與未成熟的B細胞中發(fā)現(xiàn)。
該轉(zhuǎn)基因小鼠然后用抗-人CD20單克隆抗體m2H7處理，以判定該抗體處理是否將導(dǎo)致B細胞消減?？贵wm2H7可以獲得自BD PharMingen(SanDiego，CA)，eBioscience，或者Calbiochem。在體外試驗中將m2H7的抗-人CD20活性與Rituxan相比較，并且具有可比擬的活性。人源化的抗體，例如Rituxan，也在細胞殺傷研究中利用，因為體內(nèi)細胞殺死發(fā)生在足夠短的時間，以致不用考慮對該人源化的抗體的免疫反應(yīng)。
如同在圖7中示意性概括的，以總計1毫克劑量給予該轉(zhuǎn)基因小鼠抗體m2H7，相當(dāng)于對于70公斤人而言3.5毫克。在箭頭指示的日子在外周血、脾、淋巴結(jié)、骨髓、與派伊爾斑上進行FACS分析。監(jiān)視抗-CD20單克隆抗體的血清水平。
單獨用抗-CD20單克隆抗體(m2H7)處理Tg+小鼠導(dǎo)致在外周血、成熟的外周淋巴結(jié)B細胞、脾中T2與濾泡的B細胞中B細胞的消減(參見圖8-11)。然而，盡管在細胞表面上有非常高，很可能是飽和水平的抗體，也觀察到某些B細胞亞群對抗抗-CD20抗體殺傷。這些抗性B細胞是脾邊緣區(qū)B細胞(圖10)，與在派伊爾斑(圖12)與脾(圖14)兩者的生發(fā)中心B細胞。在圖14中，小鼠用第一劑量的抗-CD20單克隆抗體以100μg在第1天注射，繼之以在第3天上以第二個100μg劑量注射(可能50μg單一劑量就足夠飽和B細胞)。T2/濾泡的B細胞被消減，但是來自派伊爾斑生發(fā)中心的B細胞被顯示與抗-CD20單克隆抗體結(jié)合但是對殺傷具抗性。
研究了抗-人CD20抗體處理后B細胞的恢復(fù)。在第1天給予小鼠抗體。圖13表明抗體處理后第6天，沒有檢測到外周血中B細胞。在第6周，剛一清除抗體，hCD20+細胞就開始被檢測，并且到第14周，B細胞似乎回升至正常水平?；謴?fù)來自前體B細胞，該細胞不表達CD20而且然后隨后發(fā)展成為具有人CD20+的成熟B細胞。
圖14顯示FACS圖，指示脾生發(fā)中心B細胞對短期(單次注射)抗-CD20單克隆抗體治療的抵抗。小鼠是沒有用綿羊紅細胞免疫的，或者是在第1天由腹膜注射綿羊紅細胞(SRBC)進行免疫以在脾中誘導(dǎo)生發(fā)中心的。生發(fā)中心在第7天出現(xiàn)。在第8天，一組小鼠用m2H7處理。對照組的小鼠用mIgG2a同種型對照抗體處理。在第12天對來自小鼠的脾細胞進行分析。使用對生發(fā)中心染色的PNA(花生凝集素)。在未用SRBC免疫的小鼠脾中沒有可檢測到生發(fā)中心細胞，而免疫小鼠的脾顯示0.3％的PNA染色細胞。盡管T2/濾泡的B細胞被用抗-CD20抗體消減，脾中邊緣的中心B細胞對該抗體是有抗力的。
然后，測定是否B細胞剛一消減，小鼠就能發(fā)育不依賴于T的免疫反應(yīng)。在第0天，小鼠用m2H7或同種型對照抗體mIgG2a處理。在第3-7天，B細胞消減已經(jīng)發(fā)生。在第7天，小鼠用肺炎鏈球菌IV靜脈注射以誘導(dǎo)對多糖的反應(yīng)。在第11天建立T細胞不依賴的反應(yīng)。圖15中顯示的結(jié)果表明，用抗-人CD2 m2H7處理不影響來自邊緣區(qū)與B1細胞的B細胞反應(yīng)，即非消減的邊緣區(qū)(MZ)與B1 B細胞給予對T-非依賴的抗原的保護。這個數(shù)據(jù)顯示，體液免疫的一些方面，特別是T-非依賴的B細胞反應(yīng)(在這種情況下)，盡管用抗-CD20單克隆抗體處理，仍是保留的。
總之，人CD20轉(zhuǎn)基因動物在血液、骨髓、脾、淋巴結(jié)與派伊爾斑的成熟B細胞、前-B細胞與未成熟的B細胞上表達人CD20。如用FACS所測量的，人CD20在轉(zhuǎn)基因細胞上以相當(dāng)于人細胞上CD20的約40％的水平表達。用抗人CD20抗體處理小鼠，除了脾邊緣區(qū)B細胞(圖10)，和派伊爾斑(圖12)與脾(圖14)兩者的生發(fā)中心B細胞之外，在處理3-4天之內(nèi)導(dǎo)致B細胞的消減。不受任何學(xué)說束縛，B細胞死亡看來是由ADCC、依賴于補體的細胞毒性(CDC)或者細胞程序死亡或者該三者的組合所介導(dǎo)。在用抗-人CD20處理過的小鼠中觀察到對T非依賴性抗原的反應(yīng)，其與脾邊緣區(qū)B細胞對抗-人CD20抗體導(dǎo)致的消減的對抗相一致。對用抗-人CD20抗體的殺傷作用有抗力的B細胞提供T-非依賴性免疫反應(yīng)的保留，和/或提示如果想要消減所有的B細胞的話，可能需要聯(lián)合治療。在用抗-人CD20抗體處理后14周觀察到表達人CD20的B細胞的恢復(fù)，很可能由于前體B細胞的成熟。這些結(jié)果類似于在用Rituxan處理過的人中觀察到的。
實施例2這個實施例顯示在抗-CD20單克隆抗體與BR3拮抗劑治療對于B細胞調(diào)節(jié)/消減之間的協(xié)同作用。BR3-Fc是免疫粘附素，其中人BR3的三個細胞外結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白序列——在這種情況下是人IgG1——的恒定結(jié)構(gòu)域融合。
表達細菌人工染色體編碼的人CD20的人CD20轉(zhuǎn)基因小鼠(指定為hCD20+小鼠)用抗CD20單克隆抗體(在第9天單次注射100微克)，BR3-Fc(從第1天至第12天，100微克每隔一天注射)，或者抗-CD20與BR3-Fc單克隆抗體的聯(lián)合進行腹膜內(nèi)注射進行處理。每組包括4只小鼠。最后一次注射后兩天，殺死小鼠，并且分析hCD20+B細胞。針對B細胞標(biāo)志物(CD21+CD23+)對脾、血、淋巴結(jié)與派伊爾斑進行FACS分析。
結(jié)果表示抗-CD20單克隆抗體治療消減多于99％的血液與淋巴結(jié)成熟循環(huán)B細胞，并且BR3-Fc處理在血與淋巴結(jié)中降低成熟循環(huán)B細胞(圖16)?？?CD20單克隆抗體治療消減T2與濾泡的B細胞，然而并非脾中的邊緣區(qū)B細胞，而BR3-Fc處理在脾中降低T2/濾泡的B細胞與邊緣區(qū)B細胞。
抗-CD20單克隆抗體與BR3-Fc的聯(lián)合協(xié)同消減脾中所有的B細胞群體?？?CD20單克隆抗體消減不發(fā)生于大部分邊緣區(qū)B細胞與一些濾泡的/T2脾B細胞，而BR3-Fc消減主要發(fā)生在邊緣區(qū)B細胞與一些濾泡的/T2B細胞(圖16)。因此，這兩試劑的組合完全消減脾的B系譜的細胞。BR3-Fc、2H7以及兩者的組合對派伊爾斑中的生發(fā)中心B細胞都沒有影響(圖17)。用抗-CD20單克隆抗體處理后漿細胞沒有明顯地受到影響(圖18)，指示免疫反應(yīng)性的一些方面在用抗-CD20抗體處理過的小鼠中仍保持著。
這些結(jié)果表明聯(lián)合治療對消減大多數(shù)B細胞是有效的。類似于人，一些轉(zhuǎn)基因小鼠B細胞對用抗-CD20抗體的殺傷作用有抗性。聯(lián)合治療導(dǎo)致脾中對抗-CD20抗體有抗力的B細胞的消減。由此可見，該轉(zhuǎn)基因小鼠還對鑒定藥物的組合有用處，所述藥物組合可能在那些已經(jīng)具有抗-CD20抗性的細胞，或者很有侵襲性的腫瘤的情況下可能更有效。
實施例3在這個實驗中，NK細胞證實在抗-CD20單克隆抗體介導(dǎo)的B細胞消減中起作用。
產(chǎn)生PK-136單克隆抗體(特異性針對小鼠NK1.1)的雜交瘤克隆從ATCC獲得。分別用對照單克隆抗體、PK-136、抗-CD20單克隆抗體與PK-136/抗-CD20的聯(lián)合腹膜內(nèi)注射給四組人CD20轉(zhuǎn)基因小鼠。給予的劑量如下對照單克隆抗體200μg/ip，3次腹膜內(nèi)注射/周，共1周PK-136200μg/ip，3次腹膜內(nèi)注射/周，共1周抗-CD20單克隆抗體10μg/ip，單一劑量在抗-CD20單克隆抗體ip之后第3天分析來自外周血的，淋巴結(jié)與脾的淋巴細胞。數(shù)據(jù)用平均數(shù)+/-標(biāo)準(zhǔn)誤差來表示，n＝8。
該結(jié)果指示，在已檢查過的組織之中(肝臟，脾與血液)用PK-136處理導(dǎo)致NK細胞群體大約80％至90％的減少(圖19)。在多數(shù)NK細胞缺乏時，2H7介導(dǎo)的B細胞消減的效力降低(圖20)。因此，NK細胞在抗-CD20單克隆抗體介導(dǎo)的B細胞消減中起作用。
在此所引用的所有出版物(包括專利與專利申請)在此全文引用作為參考。
權(quán)利要求
1.一種非-人轉(zhuǎn)基因動物，其基因組包含編碼人CD20的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述核苷酸序列可操作地與人內(nèi)源啟動子連接。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的轉(zhuǎn)基因動物，所述轉(zhuǎn)基因動物的細胞表達人CD20。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的轉(zhuǎn)基因動物，其中人CD20在B淋巴細胞的表面上表達。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的轉(zhuǎn)基因動物，其中人CD20在B淋巴細胞上以一種水平表達，該水平足以使得與表達細胞結(jié)合的抗人CD20抗體影響細胞的殺傷，導(dǎo)致B細胞的消減。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述動物的基因組在編碼實質(zhì)上和人CD20同源的CD20分子的內(nèi)源基因上包含破壞。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的轉(zhuǎn)基因動物，其中內(nèi)源基因編碼小鼠CD20。
8.鑒定能治療B細胞淋巴瘤的藥劑的方法，包含a)測量在根據(jù)權(quán)利要求1或者6的動物中表達人CD20的B淋巴細胞的水平；b)給予根據(jù)權(quán)利要求1或者6的動物所述藥劑；并且c)測量在該動物中表達人CD20的B淋巴細胞的水平；如果用該藥劑處理后，表達人CD20的B淋巴細胞數(shù)目減少，則該藥劑被鑒定為能治療B細胞淋巴瘤的藥劑。
9.用根據(jù)權(quán)利要求8的方法鑒定的藥劑。
10.鑒定能消減或者殺傷表達人CD20的細胞的藥劑的方法，包含a)測量在根據(jù)權(quán)利要求1或者6的動物中表達人CD20的B淋巴細胞的水平；b)給予根據(jù)權(quán)利要求1或者6的動物所述藥劑；并且c)測量在該動物中表達人CD20的B淋巴細胞的水平；如果在該動物中表達人CD20的B淋巴細胞數(shù)目減少，則鑒定該藥劑為能消減或者殺傷表達CD20的細胞的藥劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述細胞是癌細胞。
12.用根據(jù)權(quán)利要求11的方法鑒定的藥劑。
13.來源于根據(jù)權(quán)利要求1或者6的轉(zhuǎn)基因動物的細胞或者組織。
14.根據(jù)權(quán)利要求1或者6的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述動物是嚙齒類動物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述嚙齒類動物是小鼠。
16.測試抗-人CD20治療的安全性的方法，所述方法包含a)測量在根據(jù)權(quán)利要求1或者6的動物中表達人CD20的B淋巴細胞的水平；b)給予根據(jù)權(quán)利要求1或者6的動物所述藥劑；并且c)測量在該動物中表達人CD20的B淋巴細胞的水平；如果在該動物中表達人CD20的B淋巴細胞數(shù)目減少，則鑒定該藥劑為能消減或者殺死表達CD20的細胞的藥劑；d)監(jiān)視該動物短期或者長期的副作用。
17.測試抗-人CD20治療效力的方法，所述方法包含a)測量在根據(jù)權(quán)利要求1或者6的一組動物中表達人CD20的B淋巴細胞的水平；b)給予該組的每個動物不同劑量的一種藥劑；并且c)測量在每個劑量之后在該動物中表達人CD20的B淋巴細胞的水平；與d)確定導(dǎo)致最大量B細胞消減的該藥劑的至少一個劑量。
全文摘要
本發(fā)明在通常意義上涉及表達包括CD20的人細胞標(biāo)志物的非－人轉(zhuǎn)基因動物，以及使用該動物鑒定有效消減攜帶人CD20的細胞的藥劑。轉(zhuǎn)基因動物也對測試抗CD20治療的安全性和效力有用。
文檔編號A61KGK1751236SQ200380106303
公開日2006年3月22日 申請日期2003年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月16日
發(fā)明者安德魯·C－Y·陳, 龔謙, 弗萊維厄斯·馬丁 申請人:健泰科生物技術(shù)公司