專利名稱：菱角提取物及其使用方法
技術領域：
本發(fā)明涉及菱角(Trapa natans)提取物及其應用，菱角(Trapa natans)提取物具有抗血管新生之性能，可用于防止和/或治療癌細胞轉移及與病理性血管新生和新血管形成相關的健康類疾病。因此本發(fā)明涉及到新血管及癌細胞轉移病理形成的新奇干預治療法。
背景技術：
菱角是一種水生植物，屬菱科(Trapaceae)，即水堅果族。菱角的果實是菱肉子，常稱之為水蒺藜、歐洲水栗子、水栗子、公牛堅果和耶酥堅果。菱角有兩個品種雙角菱即二角菱或野菱，和四角菱，即四角格菱。
血管新生是一個新血管生成的過程，即原先已有血管的派生物。在這一過程中，當?shù)鞍姿饷高M行降解作用時，內(nèi)皮細胞逐漸與基底膜產(chǎn)生分離。然后，這些內(nèi)皮細胞游離于母體血管之外，分裂并形成一種新的變異血管組織(Risau，(1997)《自然》386671-674；Wilting等，(1995)《細胞分子生物學》，參考41(4)219-232)。目前發(fā)現(xiàn)，多種不同的生物因子都對控制血管的形成產(chǎn)生作用(Bussolino等，(1997)“生物化學的發(fā)展趨勢”，《科學》，22(7)251-256；Folkman和D’Amore，(1996)細胞871153-1155)，這些生物因子包括具有不同功能的蛋白質，如生長因子、細胞表面受體、蛋白酶、蛋白酶抑制物和細胞外母體蛋白質(Achen和Stacker，(1998)Int.J.Exp.Pathol.79255-265；Devalaraja和Richmond，(1999)藥理學發(fā)展趨勢；《科學》，20(4)151-156；Hanahan，(1997)《科學》27748-50；Maisonpierre等，(1997)《科學》27755-60；Suri等，(1996)細胞871171-1180；Sato等，(1995)《自然》37670-74；Mignatti和Rifkin，(1996)酶蛋白49117-137；Pintucci等，(1996)Semin Thromb Hemost 22(6)517-524；Vernon和Sage，(1995)《美國藥理學期刊》147(4)873-883；Brooks等，(1994)《科學》264569-571；Koch等，(1995)《自然》376517-519)。
血管新生參與了許多基本的生理活動，如發(fā)育、繁殖及傷口愈合等。在正常的條件下，血管新生都是在嚴格控制及高度調節(jié)的方式發(fā)生的，一般是在胚胎發(fā)育期間、成長期間以及一些特殊的情形下，如傷口愈合及女性生殖周期中(Wilting和Christ，(1996)《自然科學》83153-164；Goodger和Rogers，(1995)《微循環(huán)》2329-343；Augustin等，(1995)《美國藥理學期刊》147(2)339-351)。
然而，許多疾病或健康失調，如癌細胞轉移、糖尿病視網(wǎng)膜病變、風濕性關節(jié)炎和其它諸如牛皮癬之類的感染疾病等，都是由長期沒有規(guī)律的血管新生引起的(Folkman，(1995)《自然醫(yī)學》1(1)27-31；Polverini，(1995)《風濕病學》38(2)103-112；Healy等，(1998)《人類生殖新知》4(5)736-396)。例如，在風濕性關節(jié)炎中，新的毛細血管侵襲關節(jié)并破壞了軟骨組織。在糖尿病視網(wǎng)膜病變中，視網(wǎng)膜中的新毛細血管入侵玻璃狀體，造成出血并引起失明。因此，對病理性血管新生進行有效的治療干預、控制和/或抑制可以減輕許多重要的疾病。
這一血管新生的過程為控制體內(nèi)血管形成的干預性治療提供了節(jié)點。在實驗模式中，我們發(fā)現(xiàn)了控制血管形成的血管新生蛋白質抑制劑如血管阻斷素(O’Reilly等，(1994)《細胞》79(2)315-328)內(nèi)皮抑素(O’Reilly等，(1997)《細胞》88(2))，不過，這類蛋白質療法生產(chǎn)起來非常昂貴，且發(fā)現(xiàn)它們很難配制，很難注射到患者體內(nèi)。目前，蛋白質血管新生抑制劑并沒有發(fā)展成為治療患者疾病的藥物。因此，我們?nèi)匀恍枰环N可以安全地投入到患者體內(nèi)并可以有效地抑制、干預、修改和/或控制血管內(nèi)皮細胞病理性生長的治療物質。我們本發(fā)明提供了適用于這一目的的組合物及方法。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明，我們發(fā)現(xiàn)，菱角提取物可以抑制癌細胞轉移、內(nèi)皮細胞的生長及增生以及血管生成的過程。本發(fā)明提供了一種抑制、修改和/或控制內(nèi)皮細胞病理性增生的方法，包括將有效量的菱角提取物送到內(nèi)皮細胞中的方法。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，我們提供的是一種抑制一個細胞組織內(nèi)新血管形成的方法，包括將有效量的菱角提取物送到內(nèi)皮細胞中的方法。
通過投入有效量的菱角提取物到一個患者體內(nèi)，我們可以實踐抑制、修改和/或控制內(nèi)皮細胞病理性增生的方法及抑制細胞組織內(nèi)新血管形成的方法。其中每種方法可以進一步地包括一種針對患者的抗血管生成、抗新血管生成或抗腫瘤療法的應用，其中，菱角提取物可以增強抗血管生成、抗新血管生成或抗腫瘤療法的治療效果?？寡苌伞⒖剐卵苌苫蚩鼓[瘤療法包括a)投入一種菱角提取物以外的抗血管生成劑或抗新血管生成劑(例如，鯊魚軟骨的硫酸胺沉淀物、鯊魚軟骨提取物、Shimeji DEAE alpha、ShimejiMono-Q alpha、3-氨基苯甲酰胺和順鉑-cisplatin)給患者；b)投入一種抗腫瘤化療劑給患者；或c)為患者采用放射性療法。
通過給患者投入有效量的菱角提取物，本發(fā)明還提供了治療與內(nèi)皮細胞病理性增生和/或新血管生成相關的疾病之方法。同時，這一方法還進一步地包括了為患者采用一種抗腫瘤、抗血管生成或抗新血管生成的療法，這一療法可以包括化學療法、放射性療法或投入一種菱角提取物以外的抗血管生成或抗新血管生成劑等方法。菱角提取物可以提高抗腫瘤、抗血管生成或抗新血管生成療法的效果。
本發(fā)明還提供了一種防止及抑制癌細胞轉移的方法，包括為癌癥患者投入有效量的菱角提取物。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，我們還提供了包括有效量菱角提取物及在治療中使用這種提取物的說明書的藥盒。這些藥盒對治療那些患有與內(nèi)皮細胞和/或新血管生成過度增生相關的疾病非常有用。
本發(fā)明進一步提供的是一種篩選識別新治療藥劑的方法以確認它們與菱角提取物具有相同的、類似的或更好的治療效果。這種篩選方法包括把這一藥劑對內(nèi)皮細胞增生的效果與菱角提取物的抗增生效果進行比較。


圖1通過在內(nèi)皮細胞測定試驗中的菱角的水提物或透析菱角水溶性提取物，顯示了內(nèi)皮細胞增生基于濃度的抑制效果。在圖1中，每一濃度下的三條條形圖標從左到右分別表示菱角的水提物(初提物)、采用截止分子量為1000M.W的透析管進行透析后的菱角水提物(1K管內(nèi))和透析管外的液體(1K管外)。
本發(fā)明之詳細描述在本專利說明書及權利要求中，除非文中另行說明，否則所有單數(shù)形式如”a”、”an”和”the”等均包含復數(shù)含義。例如，“某個細胞”雖然為單數(shù)形式，但同樣包含該細胞的復數(shù)含義以及單數(shù)和復數(shù)混合使用的含義。
本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明菱角提取物的產(chǎn)品，本發(fā)明的方法在操作時可以使用這一產(chǎn)品而不是提取物。其中，當過渡詞“包含”指的是一種方法、物質或本發(fā)明的組合物時，則該方法、該物質或該組合物既包括了詳細列舉的各個要素，但也并沒有將其他未詳細列舉的要素排除在外。
本發(fā)明還提供了基本上由本發(fā)明的菱角提取物組成的一種產(chǎn)品，本發(fā)明的方法在操作時可以使用這一產(chǎn)品而不是提取物。這里的過渡短語“基本上由......組成”當用來定義本發(fā)明的一種組合物、物質或方法時，它表示既包含了詳細列舉的各個要素，也沒有將實質上沒有對本發(fā)明基本及新穎特性產(chǎn)生影響的那些未詳細列舉的要素排除在外。因此，一種基本上由菱角提取物或醫(yī)學上可以接受的載體組成的專利申請組合物不應將來自提取物或本質上不影響該組合物之病理性血管形成抑制性能的物質如磷酸緩沖液、防腐劑和氯化鈉的制備步驟中，如分離和提純方法中產(chǎn)生的微量污染物排除在外。
術語“分離”在指稱一種天然物質時，其含義指這一自然物質從組成物、細胞及其他與化合物天然結合的成分中單獨分離。
“受試者”或“宿主”為脊椎動物，最好是哺乳動物或人類，人類患者最佳。哺乳動物包括(但不僅限于)鼠類、猿猴類、馬、牛、豬、羊、畜類、競技類動物、寵物及人類，如人類患者。
術語“腫瘤”及“贅生物”可交換使用，既可用作單數(shù)也可用作復數(shù)形式，它是指細胞的異常生長，通常產(chǎn)生一種細胞組織堆積塊，既可能是良性的，也可能是惡性的。
術語“癌癥”既可用作單數(shù)也可用作復數(shù)形式，它是指經(jīng)歷了惡性病變的一個細胞聚合體。在本發(fā)明中，一個癌癥細胞的定義不僅包括原代癌細胞，而且指源自癌細胞原種的任何細胞。因此，術語“癌細胞”包括轉移的癌細胞、體外培養(yǎng)及源自癌細胞的細胞株。
在本文中，“抑制”內(nèi)皮細胞生長或一個細胞組織的血管形成指的是阻止、推遲或延緩內(nèi)皮細胞的生長、增殖或細胞分裂、或細胞組織中血管的形成。監(jiān)測抑制的方法包括(但不限于)內(nèi)皮細胞增殖化驗、通過測定血液含量測量血管床體積、以及定量測定血管結構的密度。當培養(yǎng)物質為細胞混合體時，監(jiān)測新血管形成的過程需要通過定量測量能夠體現(xiàn)內(nèi)皮細胞特定指標的細胞加以完成，這些指標包括血管新生因子、蛋白水解酶、以及內(nèi)皮細胞的特定細胞粘附分子等。
本發(fā)明還提供了一種“藥劑組合物”，目的是為了包括至少還含有其它物質的菱角提取物的組合物質，如一種載體、穩(wěn)定劑、防腐劑或另一種有效成分，如另一種治療性藥劑，從而使該組合物適合在體內(nèi)、體外進行診斷性或治療性用途?！傲硪环N治療性有效成分”的范例包括類固醇，如強的松、脫氫皮質(甾)醇、甲基強的松龍、氫化可的松、皮質酮和地塞米松，以及非甾族抗炎藥物，如硫代蘋果酸鈉、硫代葡萄金、右旋青霉胺、氯喹、羥化氯喹、硫氮磺吡啶、咪唑硫嘌呤，和抗腫瘤制劑，如α-干擾素、β-干擾素、γ-干擾素、2號白介素、阿地白介素、惠而血添(重組人粒細胞集落刺激因子)、沙格司亭(重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子)、左咪唑、BCG疫苗、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟脫氧尿苷、阿糖胞苷、5-氮雜胞苷、巰基嘌呤、硫鳥嘌呤、pentastatin、阿氟酸、克拉屈賓、二氟胞嘧啶、二氯甲基二乙胺、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、左旋溶肉瘤素、洛莫司汀、亞硝(基)脲氮芥、司莫司汀、鏈佐星、氮烯咪胺、白消安、三胺硫磷、六甲蜜胺、異環(huán)磷酰胺、順鉑、碳鉑、甲基芐肼、放線菌素D、普卡霉素、博來霉素、亞德里亞霉素、道諾霉素、去甲柔紅霉素、mitoxanthrone、絲裂霉素、長春新堿、長春堿、長春瑞賓、依托泊甙、替尼泊甙、太平洋紫杉醇、鹽酸拓撲替康、天(門)冬酰胺酶、羥基脲、氯苯二氯乙烷、地塞米松、氨格魯米特、雌二酮、乙烯雌酚、羥孕酮、甲孕酮、甲地孕酮、睪丸激素、氟羚甲基睪丸素、它莫西芬、亮丙瑞林和氟他胺片。
在本文中，術語“藥物學上可接受載體”的含義包含磷酸緩沖溶液、水(最好是消毒水)、乳化劑及各種濕潤劑等任何標準的藥物學載體。藥物學載體、穩(wěn)定劑和防腐劑的實例請參閱馬丁·雷明頓1975年《藥物學標準》第15版(麥克米倫出版公司，伊斯頓市，1975年)。
“有效量”是指能夠對有利或預期效果產(chǎn)生影響的充足數(shù)量。例如，治療量指能夠獲得預期療效的量。預防性有效量是指能夠防止疾病發(fā)作或疾病癥狀的必要量。
通過把一定量的菱角提取物生長抑制劑送入到細胞之中，本發(fā)明提供了一種對內(nèi)皮細胞的病理性生長進行抑制的方法。本發(fā)明還提供了一種通過把一定量抗血管形成的菱角提取物送到細胞組織內(nèi)而對組織內(nèi)的血管形成進行抑制的方法。這些方法既可以在體內(nèi)操作，也可以在體外操作。當在體外操作時，內(nèi)皮細胞或血管化組織在業(yè)內(nèi)專業(yè)人士熟知的條件下進行培養(yǎng)，具體如下所述。這些細胞和/或組織既可以從現(xiàn)存的細胞株中進行培養(yǎng)，也可以從受試者即患者身上得到的活組織切片檢查樣本中進行培養(yǎng)。然后，這些細胞和/或組織被投入菱角提取物中，例如，可以把菱角提取物加入到細胞和/或組織的培養(yǎng)基中。
根據(jù)本發(fā)明，菱角提取物的制備方法如下將菱角或其中部分如果實、葉子、莖干、分枝、軀干、皮或根(最好是篩選過的、壓碎的或碾碎的)投入到一種有機溶劑中或最好是含水介質中，從而把得到的液體與至少一些、或全部、最好是全部菱角的固體部分分離開來，以獲得一種液體形式的提取物，這一液體提取物還可以通過溶劑蒸發(fā)或凍干法在除去有機溶劑或水之后將之還原成一種固體形態(tài)，從而獲得固體形態(tài)的提取物。有機溶劑最好是一種極性有機溶劑，如某種醇，如甲醇、乙醇、N-丙醇、異丙醇、N-丁醇、異丁醇和叔丁醇，最好是甲醇和乙醇。更理想的是在制備本發(fā)明菱角提取物時，菱角的果實或部分果實被用作原料，如此，果實(鮮活的或干燥的二角果實、四角果實或兩種的混合)或果實的部分被放進含水介質或有機溶劑之中，然后采用離心過濾或過濾的方法將得到的液體物質與菱角果實的固體部分分離開來，以獲得提取物。更理想的是，將菱角果實的皮殼與其果肉分離開，然后，在投放到水介質或有機溶劑之前，把皮殼或其中的任何部分進行篩選、粉碎或磨碎。同時，本發(fā)明的菱角提取物還可以通過將菱角或其中的任何部分如果實皮殼(最好是經(jīng)過篩選、粉碎或磨碎)投入到有機溶劑或優(yōu)選含水介質之中進行制備，從而把得到的液體與菱角的固體部分分離開來，形成一種液體物質，并把其中的某些分子量的化合物通過透析法、超濾法或層析法從液體物質中除去，以獲得液體形式的提取物，所要除去的化合物分子量為約150到3500、優(yōu)選約150到2000、更優(yōu)選約150到1000、進一步優(yōu)選約170到600、約170到400、約170到300、最優(yōu)選約170到200。這一液體提取物還可以在除去有機溶劑或水之后將之還原成固體形態(tài)，從而獲得固體形態(tài)的提取物。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，我們的菱角提取物實施方案，不包含任何五倍子酸成份。
本發(fā)明還提供了一種抑制腫瘤細胞(最好是癌細胞)生長的方法，包括向腫瘤細胞投放一定有效量的菱角提取物，但在提取物中不包含a)一定分子量的化合物，所述分子量為約150到3500、優(yōu)選約150到2000、更優(yōu)選約150到1000、進一步優(yōu)選約170到600、約170到400、約170到300、最優(yōu)選約170到200；或b)不包含任何五倍子酸成份和/或五倍子酸衍生物，如烷基或羥基五倍子酸。
并不是每一種療法對每一個體都有效，因此，采用試管化驗的方法檢測出每一個受試者(即患者)的施藥功效是有益的。本發(fā)明提供了測定菱角提取物是否能治療某一受試者(即患者)與內(nèi)皮細胞病理性增生相關的特定疾病的一種方法。例如，從受試者體內(nèi)分離出某一細胞活組織切片，然后與有效量的菱角提取物或含有該提取物的藥物組合物進行接觸。使用傳統(tǒng)程序(如以下要描述的CPAE化驗)測定內(nèi)皮細胞病理性生長的抑制表明菱角提取物或含有該提取物的藥物組合物是否能有效地治療該受試者(即患者)的疾病。
通過向受試者(即患者)體內(nèi)投入有效藥量的菱角提取物或含有該提取物的藥物組合物，本發(fā)明還提供了一種治療與患者病理性新血管形成相關的失調癥之方法。在本文的上下文中，進行“治療”意味著減緩與病理性新血管形成相關的癥狀或減輕新血管形成。這類失調癥包括(但不限于)關節(jié)炎癥狀、基于新血管形成的皮膚病癥狀、糖尿病視網(wǎng)膜病變、再狹癥、卡波西氏肉瘤、老年黃斑病變、毛細血管擴張、青光眼、瘢痕瘤、角膜移植排斥、創(chuàng)傷性肉芽、血管纖維瘤、遺傳性出血性毛細血管擴張癥、心肌血管新生、牛皮癬、硬皮病及一些與病理性血管形成或新血管形成相關或造成的炎癥，如痔瘡等。典型的關節(jié)炎癥狀為風濕性關節(jié)炎和骨關節(jié)炎。
本發(fā)明還提供了一種預防或抑制(如阻止、減少、減緩或推遲)癌細胞轉移的方法，包括將菱角提取物投入到某個癌癥患者體內(nèi)的方法；其中，該患者確實非常需要加以預防或抑制癌細胞。投入菱角提取物以治療關節(jié)炎癥狀會減輕軟骨(特別是關節(jié))中的血管形成，從而增強這些區(qū)域的機動性和適應性。就治療牛皮癬而言，投入菱角提取物會減少一些皮膚病的癥狀，如結疤、片狀剝落和皮膚表體下的可見血管。就治療糖尿病視網(wǎng)膜病變而言，投入菱角提取物會減少視網(wǎng)膜中新異血管的形成，從而使視覺不受阻礙。就治療卡波西氏肉瘤而言，投入菱角提取物會抑制血管的生長或更進一步的形成，從而抑制住傷害的形成。
菱角提取物投送的方式可以是口入式、口腔式、鼻入式、直腸式、靜脈注射式、腹膜腔引流式、肌肉注射式、或局部性方法，如經(jīng)過皮膚或眼部、陰道或吸入式。當菱角提取物被投入到受試者(如人類，人類患者，或其它哺乳動物，如老鼠、家鼠、馬、豬、羊和牛等)體內(nèi)時，這些提取物可以與醫(yī)學上可以接受的載體混合在一起，然后投入到患者體內(nèi)。菱角提取物的藥劑量可以根據(jù)熟悉這一技藝的人士之經(jīng)驗加以確定，并隨接受治療的癥狀、關聯(lián)的病理、瞄準的細胞類型以及接受治療的患者而加以變化。菱角提取物的藥劑量可以在每天0.1毫克及每天1克之間變化，優(yōu)選為每天1到500毫克、更優(yōu)選10到100毫克。在整個治療過程中，體內(nèi)投入可以采取一個劑量、持續(xù)性或間歇性方式的進行。
藥劑組合物可以采取片劑、錠劑、顆粒、膠囊、丸劑、針劑、栓劑或氣霧劑的形式。它們還可以形成活性成分在含水或非水稀釋劑中的懸浮液、溶液或乳液、形成糖漿、顆?；蚍勰?br> 雖然菱角提取物可以采取單獨投入的方式，但它還可以以藥物制劑的形式出現(xiàn)，制劑的內(nèi)容包含菱角提取物連同一種或多種醫(yī)學上可以接受的載體及可選的其它治療劑。每一載體必須是“可接受的”并與制劑中其它成分相容，且對受試者如人類患者無害。
藥物制劑可方便地以單位劑量形式出現(xiàn)，也可以采用加入菱角提取物液態(tài)載體或細分的固態(tài)載體或兩者的方法進行制備，然后，如果必要，將之制備成型。
本發(fā)明適宜口服的制劑可以采用散劑的方式，如膠囊、扁膠劑或片劑，每一種都含有預定量的菱角提取物；還可呈粉狀或顆粒狀；或呈一種水狀或非水狀液態(tài)中的溶液或懸浮液狀；或水包油液體乳劑或油包水液體乳劑。菱角提取物也可以為大丸藥、干藥糖劑或醬狀物。
片劑可以通過菱角提取物的壓縮和成型進行制作，可根據(jù)需要添加一種或多種附屬成分。壓縮的片劑可以通過適當?shù)臋C器壓縮松散形式中的有機成分(如粉末或顆粒)而制備，如果需要，還可以與粘合劑(如聚乙烯吡咯酮、凝膠、羥丙基甲基纖維素)、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(如羥基乙酸淀粉鈉、交聯(lián)聚乙烯吡咯酮、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉)和表面活性劑或分散劑。模制片劑可以采用適當?shù)臋C器將粉末狀的化合物混合物用惰性液體稀釋劑濕化后經(jīng)模制加工而成。如果需要，片劑還可以包衣或刻痕，可以配制成使那些有效成分緩慢而加以控制地釋放的形式，例如采用不同比例的羥丙基甲基纖維素，就可以達到所期望的釋放形式。根據(jù)需要，片劑還可以提供腸溶包衣，使其在部分腸內(nèi)釋放而不是在胃部釋放。
適用于口腔局部投藥的制劑包括將有效成分風味化的錠劑，風味劑通常為蔗糖和阿拉伯樹膠或黃蓍膠；包括惰性基質的菱角提取物的芳香熏劑，所述惰性基質如凝膠和甘油，或蔗糖和阿拉伯樹膠；包括菱角提取物在適當?shù)囊簯B(tài)載體中的漱劑。
根據(jù)本發(fā)明，適用于局部投藥的藥劑組合物可以配制成一種藥膏、乳霜、懸浮液、洗劑、粉末、溶液、軟膏、凝膠、噴劑、氣霧劑或油狀物。此外，一種制劑可能包含一種貼片劑或敷料，如浸含菱角提取物的繃帶或粘合膏藥，同時根據(jù)需要還可以含有一種或多種賦形劑或稀釋劑。
有些藥物制劑實施方案可以體現(xiàn)為一種局部性含有菱角提取物的藥膏或乳霜。當配制成一種藥膏時，提取物既可以與石蠟也可以與水混溶式藥膏基質一起使用。此外，藥物成分可與水包油乳霜基質配制成一種乳霜。
如果需要，乳霜基質的水相可包括，例如，至少約30％w/w的多元醇，即具有兩個或多個羥基的醇，如丙二醇、丁烷-1、3-二醇、甘露醇、山梨糖醇、丙三醇和聚乙二醇及以上之混合物。局部制劑可根據(jù)需要包括可促進菱角提取物經(jīng)由皮膚或其它感染區(qū)域吸收或穿透之化合物。這類真皮穿透增強劑的實際范例包括二甲亞砜和及相關的類似物。
本發(fā)明乳狀液之油相可用現(xiàn)有技術的成分以任何現(xiàn)有技術的方式構成。雖然此油相可能僅僅包含一種乳化劑(即為熟知的利泄劑)，但它還可以根據(jù)需要包括至少一種乳化劑與脂肪或油或脂肪與油之混合物。較理想的是，親水的乳化劑還與用作穩(wěn)定劑的親脂乳化劑一起包括在內(nèi)。既把油又把脂肪包括在內(nèi)也非常理想?？傊谢虿缓蟹€(wěn)定劑的乳化劑組成了所謂的乳化蠟，蠟與油一起和/或脂肪組成了所謂的乳化藥膏，從而形成了乳霜制劑的油性分散內(nèi)相。
適用于本發(fā)明制劑的利泄劑和乳化穩(wěn)定劑包括Tween 60、Span 80、十六醇和十八醇混合物、肉豆寇醇、單硬脂酸甘油酯和十二烷基硫酸鈉。
由于活性化合物在大多數(shù)用于醫(yī)藥學乳劑制劑的油中其溶解度都非常低，所以可根據(jù)所需求的化妝品特性選擇適當?shù)挠皖惢蛑具M行配制。因此，乳霜最好應是非油脂的、非染色的以及可清洗的產(chǎn)物，具有適當?shù)膱杂捕纫员苊鈴脑嚬芑蚱渌萜髦新┏觥？梢允褂弥辨湹幕蛑ф湣位蚨榛耐榛ヮ?，如二異己二酸酯、硬脂酸異十六烷基酯、椰子脂肪酸丙二醇二酯、異丙基肉豆蔻酸酯、油酸癸酯、異丙基棕櫚酸酯、硬脂酸丁酯?-乙基己基棕櫚酸酯或名為Crodamol CAP的支鏈酯類摻合物，后三者為較理想的酯類。這些可以單獨使用，也可以根據(jù)所要求的特性結合使用。此外，可使用高熔點的脂質，如白色軟石蠟和/或液體石蠟或其它礦物油。
適用于眼睛局部投藥的制劑還包括眼藥水，其中之有效成分可溶解于或懸浮于適當?shù)妮d體內(nèi)，特別是一種這種有效成分的含水溶劑。直腸投藥的制劑表現(xiàn)為具有適當基質的栓劑，包括，例如可可油和水楊酸鹽。
適用于陰道投藥的制劑可以是陰道栓劑、止血塞、乳霜、凝膠、軟膏、泡沫膠或噴霧劑等，這些制劑都含有菱角提取物及一種或多種適宜的載體。
適用于鼻腔投藥的制劑(其載體為一種固態(tài)物質)包括顆粒大小的粗粉末，其大小從20微米到500微米左右，投藥的方式為鼻吸入式，即通過鼻腔從靠近鼻孔的容器內(nèi)快速吸入粉末。而適用于投藥的液體載體制劑表現(xiàn)為鼻噴液、鼻腔滴液或采用噴霧器進行氣霧劑投藥，這些制劑包括菱角提取物之含水溶液或油溶液。
適用于腸胃外投藥的制劑包括含水或非水的等滲消毒注射溶液，它們可含有抗氧化劑、緩沖溶液、細菌抑制劑和使制劑與預期受體的血液等張的溶質；它還包括含水或非水的消毒懸浮液，可含懸浮劑、增稠劑和脂質體或其它用來使菱角提取物導向血成分或者一個或多個器官的微顆粒系統(tǒng)。這些制劑可存在于單位劑量或多劑量密封容器之中，如安瓿和玻璃瓶，并可以存放于冷凍干燥(凍干的)條件下，在使用之前僅需加入消毒的液體載體，如注射用水。即用的注射溶液和懸浮液可以從先前描述的消毒粉末、顆粒和片劑中進行制備。
除了以上特別提到的成分外，本發(fā)明的制劑可包括其它業(yè)內(nèi)常規(guī)的、與討論中制劑類型相關的試劑，例如，那些適用于口腔投藥的制劑可能進一步包括諸如甜味劑、增稠劑和風味劑等之類的試劑。
菱角提取物及包含一種或多種該提取物的組合物也可能作為獸醫(yī)制劑的形式使用，可以采用業(yè)內(nèi)常規(guī)的方法進行制備。
本發(fā)明進一步提供了一種醫(yī)療藥劑的篩選方法，以抑制新血管形成或內(nèi)皮細胞的增長。其篩選要求如下(a)將一種試驗藥劑與適當?shù)募毎蚪M織樣本接觸；(b)將適當細胞或組織樣本的分離樣本與有效治療量的菱角提取物接觸，然后，(c)比較步驟a)樣本中的內(nèi)皮細胞增長和步驟b)樣本中的內(nèi)皮細胞增長，其中，步驟a)中用以抑制內(nèi)皮細胞增長的任何試驗藥劑與步驟b)中的幾乎一樣，都可以用做抑制新血管形成或內(nèi)皮細胞病理性增長的藥劑。
實施例1采用菱角提取物抑制內(nèi)皮細胞增生菱角提取物的制備將二角和四角菱角果實的皮殼與其果肉分離開來。分離出來的皮殼在使用液體氮冷凍后，使用研缽和乳缽槌將之搗碎，它們被磨碎成大小為約2毫米的片。將一份20克搗碎的皮殼投入到二次蒸餾水中，蒸餾水的體積為皮殼的5倍到10倍，然后讓其在80°或100℃的溫度下駐留2到4個小時(根據(jù)需要，也可以低于80℃，如4℃或20°到25℃，但駐留的時間為4到12個小時)，加以攪拌，獲得一種混合物。然后，采用Miracloth之雙層膜對這種混合物進行過濾，除去固態(tài)的殘留物質。其混濁的濾出液通過離心法在室溫下以每分鐘約1，500的轉數(shù)加以澄清。上清液從沉淀物中輕輕倒出，獲得一種清澈的棕色溶液，可被用做本發(fā)明中的菱角提取物。而在本實驗中，這種清澈的棕色溶液被凍干，成為一種為儲藏凍干的粗提取物，它也可以用做本發(fā)明試驗的菱角提取物。然后，將這種凍干的粗提取物在10毫升的二次蒸餾水中進行溶解，并采用截止分子量為1000MW的透析管進行透析過夜，以每次250毫升二次蒸餾水換水三次。保留在透析管內(nèi)的液體為菱角提取物的一種形式，然后按照以下描述的方法進行生物學化驗。
內(nèi)皮細胞化驗以上制備的菱角提取物之固體形式被用于內(nèi)皮細胞化驗之中(即CAPE)，可根據(jù)Connally等人的《模擬生物化學》(1986年)152136-140及修改稿中介紹的程序進行(Liang和Wong(2000)，《血管新生從分子到綜合的藥理學》，由Maragoudakis、Kluwer Academic/Plenum出版社編輯出版，紐約pp209-223)。在100ug/ml的濃度下，菱角提取物的固體形式抑制內(nèi)皮細胞增生的成功率達到了86.75％。
實施例2采用菱角提取物抑制癌細胞增生實施例1中制備的菱角提取物固體形式被用于癌細胞增生化驗，以檢測提取物對三類癌細胞增生的效果(Lncap，前列腺癌細胞；SW 480，直腸癌細胞；和HTB 72，黑素瘤細胞)，其方法是將菱角提取物固體形式以100ug/ml之量在體外與癌細胞接觸，然后測量出癌細胞的增生情況。為了比較之目的，將兩種抗癌藥物即cisplatin和太平洋紫杉醇針對三類癌細胞增生的藥效也在體外進行了檢測。生物檢定的結果如表1中所示，其結果表明將菱角提取物加入到癌細胞培養(yǎng)基中可以有效地抑制癌細胞的增長。
抑制率，％

*每毫升細胞介質加100ug**1毫升細胞介質加50ul飽和溶液實施例3菱角不同濃度的凍干粗提物、菱角的透析提取物，即實施例1中獲得的截止分子量為1000MW的透析管內(nèi)的液體和透析管外的水被分別用于內(nèi)皮細胞化驗。其結果如圖1所示，表明菱角的凍干粗提物、菱角的透析提取物依據(jù)濃度大小抑制內(nèi)皮細胞的增長情況。相比之下，透析管外的水不能顯著地抑制內(nèi)皮細胞增生。這些數(shù)據(jù)證明，菱角的提取物是內(nèi)皮細胞增長極端有效的抑制劑。既然菱角提取物的抗血管形成組合物被保留在透析管內(nèi)，這些組合物就不是一種低分子重量的物質。
實施例4實施例1中制備的菱角凍干粗提取物在二次蒸餾水中進行溶解，并采用截止分子量為3500MW的透析管進行透析過夜，以每次250毫升二次蒸餾水換水三次。這一液體即透析管內(nèi)的透析提取物在內(nèi)皮細胞化驗中顯示能夠抑制內(nèi)皮細胞之增生。這一實驗表明，這些菱角提取物的抗血管形成成分的分子重量至少在約3500。
實施例5作為測定菱角提取物藥劑量的一個動物模型實施例，我們選擇了幾組裸鼠(Balb/c NCR nu/nu雌性，Simonsen，Gilroy加拿大)，每組都采用皮下注射的方式嫁接約105到109高增生狀態(tài)的細胞，其定義如本文所述。當嫁接完成后，通過在嫁接的周圍采用皮下注射的方式投入提取物。測定嫁接尺寸減少的大小可以采用維內(nèi)爾測徑器每周檢查兩次。
實施例6這里，我們提供了測定本發(fā)明中提取物在治療關節(jié)炎癥時藥效之動物模式范例。受試者為美國緬因州杰克遜實驗室的MRL/lpr老鼠(MRL/MpJ-Faslpr)，對試驗或監(jiān)測采用本發(fā)明的菱角提取物治療關節(jié)炎癥的功效非常有用。老鼠在投入了提取物后，在X光線的監(jiān)控下，動物的關節(jié)和后腿的腫脹明顯減少，軟骨退化也有所下降，這都充分表明了這一提取物對治療關節(jié)炎癥的積極效果。
實施例7這里，我們還提供了采用動物模型測定本發(fā)明提取物在治療關節(jié)炎癥時的藥效的另外一個例子。受試者為幾組Lewis老鼠(年齡8周；重30-150g，來自美國緬因州杰克遜實驗室)，采用二類(BII)牛骨膠原進行免疫處理誘發(fā)關節(jié)炎癥狀。BII在400ug/ml的條件下在0.1M的乙酸中溶解。每只老鼠都在尾巴的底部皮內(nèi)注射了20ug(100ul)的乳劑，其中BII和ICFA(不完全Freund之佐劑)的量相等。當確定患了關節(jié)炎癥狀時，將本發(fā)明的菱角提取物投入到老鼠體內(nèi)，然后以四級評分法對多種誘導性鼠體疾病進行為期28天的觀察，結果顯示，這種提取物對治療關節(jié)炎癥有效。
權利要求
1.一種含有菱角提取物的產(chǎn)品。
2.權利要求1的產(chǎn)品，其中，這種提取物是通過將菱角果實投入到極性有機溶劑中制備的。
3.權利要求2的產(chǎn)品，其中，這種提取物是通過將菱角果實的皮殼投入到這種極性有機溶劑中制備的。
4.權利要求1中的產(chǎn)品，其中，這種提取物是通過將菱角果實投入到含水介質之中制備的。
5.權利要求4中的產(chǎn)品，其中，這種提取物是通過將菱角果實之皮殼投入到這種含水介質之中制備的。
6.權利要求5中的產(chǎn)品，其中，含水介質是二次蒸餾水。
7.權利要求1中的產(chǎn)品，不包含分子重量為170到200的任何化合物。
8.權利要求1中的產(chǎn)品，不包含任何五倍子酸。
9.抑制內(nèi)皮細胞病理性生長的方法，包括將權利要求1中一定量的生長抑制劑產(chǎn)品投入到內(nèi)皮細胞之中。
10.權利要求9中的方法，其中，內(nèi)皮細胞在組織和器官內(nèi)，可以取得抑制組織或器官中新血管形成的效果。
11.權利要求9中的方法，其中，該產(chǎn)品被投入到體外的內(nèi)皮細胞之中。
12.權利要求9中的方法，其中，該產(chǎn)品被投入到體內(nèi)的內(nèi)皮細胞之中。
13.權利要求12中的方法，其中，通過把有效量的產(chǎn)品給患者施用，而將該產(chǎn)品投入到內(nèi)皮細胞之中。
14.權利要求13中的方法，其中，患者需要抑制其病理性血管形成。
15.權利要求14中的方法，其中，對患者治療有效的病癥選自關節(jié)炎、基于新血管形成的皮膚病癥狀、糖尿病視網(wǎng)膜病變、老年黃斑病變、再狹癥、毛細血管擴張、青光眼、瘢痕瘤、角膜移植排斥、創(chuàng)傷性肉芽、血管纖維瘤、遺傳性出血性毛細血管擴張癥、心肌血管新生、牛皮癬、硬皮病及與病理性血管形成或新血管形成相關的炎癥。
16.權利要求14中的方法，其中，關節(jié)炎是指風濕性關節(jié)炎或骨關節(jié)炎，與病理性血管新生或新血管形成有關的炎癥指牛皮癬或痔瘡。
17.權利要求13中的方法，其中，接受治療者為哺乳動物。
18.權利要求17中的方法，其中，哺乳動物為寵物、家畜或人類患者。
19.權利要求13中的方法，其中，接受治療者患有癌癥，且癌細胞轉移得到了預防、阻止、減少、減緩或推遲。
20.一種用來抑制新血管形成或內(nèi)皮細胞生長的藥劑之篩選方法包括以下步驟a.將試驗藥劑與細胞或組織樣本接觸；b.將分離的細胞或組織樣本與藥用有效劑量的權利要求1中產(chǎn)品接觸；以及c.比較步驟a)樣本中的內(nèi)皮細胞增長和步驟b)樣本中的內(nèi)皮細胞增長，其中，步驟a)中用以抑制內(nèi)皮細胞增長的任何試驗藥劑與步驟b)中的幾乎一樣，都可以用做抑制新血管形成或內(nèi)皮細胞病理性增長的藥劑。
21.治療患者病理性新血管形成相關疾病的藥盒，包括有效藥用劑量的權利要求1中產(chǎn)品以及治療用途之說明書。
22.一種制備權利要求1中產(chǎn)品的方法，包括以下步驟把菱角或其部分投入到溶劑中，形成液體部分和固態(tài)部分，然后把液體部分與至少一些固態(tài)部分分離開來，以獲得作為產(chǎn)品的液體物質。
23.權利要求22的方法，其中，步驟b后，溶劑被除去，從而獲得固態(tài)產(chǎn)品。
24.權利要求22中的方法，其中，溶劑指極性有機溶劑或含水介質。
25.權利要求24中的方法，其中，溶劑是一種醇。
26.權利要求25中的方法，其中，溶劑是甲醇或乙醇。
27.權利要求24中的方法，其中，溶劑指含水介質。
28.權利要求27中的方法，其中，溶劑是一種含水緩沖液。
29.權利要求27中的方法，其中，溶劑是水。
30.權利要求29中的方法，其中，溶劑是二次蒸餾水。
31.權利要求22中的方法，其中，步驟a)是通過將菱角果實投入到溶劑之中完成的，以形成液體部分及固態(tài)部分。
32.權利要求31中的方法，其中，步驟a)是通過將菱角果實之皮殼投入到溶劑之中完成的，以形成液體部分及固態(tài)部分。
33.權利要求32中的方法，其中，皮殼在投入到溶劑之前被壓碎、過篩或磨碎。
34.權利要求22中的方法，其中，步驟b是通過把液體部分與幾乎所有的固態(tài)部分分離開來而完成的，以獲得液體產(chǎn)品。
35.權利要求22中的方法，其中，步驟a是通過把菱角果實皮殼與果肉分離，將果實皮殼被壓碎、磨碎或篩選成片狀，再把這些片狀物投入到二次蒸餾水中而完成的，形成一種包括液體和固態(tài)殘留物的混合物；步驟b是通過把液體與固體殘留物分離來完成的，以獲得液體產(chǎn)品。
36.權利要求35中的方法，其中，采用離心法，把步驟b中的液體與固態(tài)殘留物分離，然后傾析出得到的上清液作為產(chǎn)品。
37.權利要求36中的方法，其中，在步驟b傾析后，將分子量約170到200的化合物從上清液中除去，得到液體產(chǎn)品。
38.權利要求37中的方法，其中，采用透析法，將分子量約170到200的化合物從上清液中除去。
39.權利要求37中的方法，其中，將水從傾析后的上清液中除去，得到固體產(chǎn)品。
40.一種藥用組合物，包括權利要求1中的產(chǎn)品和醫(yī)學上可以接受的藥物載體。
41.權利要求40中的藥用組合物，進一步包括至少一種其它治療活性劑。
42.權利要求41中的藥用組合物，其中，至少一種其它治療活性劑是至少一種類固醇、非類固醇抗炎藥物、硫代蘋果酸鈉、金硫葡糖、D-青霉胺、氯喹、羥基氯喹、硫氮磺吡啶、咪唑硫嘌呤、或抗腫瘤藥劑。
43.權利要求42中的藥用化合物，其中，至少一種其它治療劑選自下列至少一種藥劑，如α-干擾素、β-干擾素、γ-干擾素、2號白介素、阿地白介素、惠而血添(重組人粒細胞集落刺激因子)、沙格司亭(重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子)、左咪唑、BCG疫苗、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟脫氧尿苷、阿糖胞苷、5-氮雜胞苷、巰基嘌呤、硫鳥嘌呤、pentastatin、阿氟酸、克拉屈賓、二氟胞嘧啶、二氯甲基二乙胺、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、左旋溶肉瘤素、洛莫司汀、亞硝(基)脲氮芥、司莫司汀、鏈佐星、氮烯咪胺、白消安、三胺硫磷、六甲蜜胺、異環(huán)磷酰胺、順鉑、碳鉑、甲基芐肼、放線菌素D、普卡霉素、博來霉素、亞德里亞霉素、道諾霉素、去甲柔紅霉素、mitoxanthrone、絲裂霉素、長春新堿、長春堿、長春瑞賓、依托泊甙、替尼泊甙、太平洋紫杉醇、鹽酸拓撲替康、天(門)冬酰胺酶、羥基脲、氯苯二氯乙烷、地塞米松、氨格魯米特、雌二酮、乙烯雌酚、羥孕酮、甲孕酮、甲地孕酮、睪丸激素、氟羚甲基睪丸素、它莫西芬、亮丙瑞林和氟他胺片。
44.權利要求12中的方法，進一步包括向接受治療者施用一種抗癌療法或另一種抗血管新生或新血管形成療法。
45.權利要求44中的方法，其中，抗癌癥療法為放射性療法。
46.權利要求14中的方法，其中，接受治療者所患有的卡波西氏肉瘤或血管纖維瘤的治療取得了實效。
47.一種抑制腫瘤細胞生長的方法，包括使腫瘤細胞與有效量的菱角提取物接觸，該菱角提取物不包含a)分子量約為170到200的化合物；b)不包含任何五倍子酸和/或烷基或羥基五倍子酸。
全文摘要
本發(fā)明提供菱角提取物及其用于抑制、干擾和/或控制細胞組織的病理性血管新生或新血管形成的方法。通過把有效量的菱角提取物送入到細胞或組織中，本發(fā)明還提供了一種抑制組織中新血管形成的方法。還提供一種通過向受試者投入有效量的菱角提取物而治療內(nèi)皮細胞高增生和/或新血管形成相關的一種疾病之方法。
文檔編號A61K36/185GK1735419SQ200380108523
公開日2006年2月15日 申請日期2003年11月10日 優(yōu)先權日2002年11月8日
發(fā)明者汪建平, 汪明中 申請人:汪建平, 汪明中