專利名稱：治療非缺血性心力衰竭的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療非缺血性心力衰竭的藥物組合物，其包含作為活性成分的集落刺激因子。本發(fā)明也涉及治療非缺血性心力衰竭的方法，其包含施用集落刺激因子。
背景領(lǐng)域心力衰竭是這樣的狀態(tài)，即減弱的心臟功能使其無法保證全身組織代謝所需的射血，或者此射血只在心室填充壓力升高時完成[ShinRinsho Naikagaku(New Clinical Internal Medicine)，IgakuShoinLtd.，Japan]。缺血性心力衰竭是無法接收到代謝所需的血量而引起的誘導(dǎo)缺癢的心力衰竭，而非缺血性心力衰竭指缺血性心力衰竭之外的心力衰竭。非缺血性心力衰竭包括由心肌病如特發(fā)的、繼發(fā)的或其它形式心肌病的惡化所導(dǎo)致的類型。
人粒細(xì)胞-集落刺激因子(G-CSF)是被發(fā)現(xiàn)作為粒細(xì)胞譜系造血祖細(xì)胞的分化和增殖因子的造血因子，因?yàn)槠浯龠M(jìn)體內(nèi)中性粒細(xì)胞的造血，臨床上用作治療伴隨骨髓移植或癌癥化療的中性粒細(xì)胞減少的藥劑。除上述效應(yīng)之外，人G-CSF作用于造血干細(xì)胞以刺激它們的分化和增殖。此外，本發(fā)明的發(fā)明人近來報(bào)道了G-CSF誘導(dǎo)造血干細(xì)胞從骨髓補(bǔ)充到外周血液中，促進(jìn)它們移動到心肌梗死損傷和分化成心肌細(xì)胞，以此減緩心肌梗死后的左心室重建和心力衰竭(Minatoguchi，S.等Circulation，2004(in press))。
然而，不清楚G-CSF是否也對心肌病如擴(kuò)張性心肌病導(dǎo)致的非缺血性心力衰竭有效。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目標(biāo)是提供治療由心肌病惡化引起的非缺血性心力衰竭的藥物組合物。
本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在心肌病動物模型中，長時間的施用G-CSF，改善了進(jìn)行性心肌纖維化、左心室重建(remodeling)和心力衰竭。此發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致了本發(fā)明的完成。
即，本發(fā)明提供治療非缺血性心力衰竭的藥物組合物，其包含作為活性成分的集落刺激因子。
本發(fā)明也提供治療非缺血性心力衰竭的方法，其包含對有此需要的患者以治療非缺血性心力衰竭的有效量施用作為活性成分的集落刺激因子。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及集落刺激因子在用于治療非缺血性心力衰竭的藥物組合物的制備中的應(yīng)用。
本發(fā)明進(jìn)一步提供治療非缺血性心力衰竭的試劑盒(kit)，其包含了治療非缺血性心力衰竭所需的有效劑量的集落刺激因子和使用指南。
附圖簡述

圖1顯示被Masson’s三色染劑染色的心室橫切標(biāo)本的顯微照片。(A)對照組，(B)G-CSF組。染成藍(lán)色的區(qū)域是纖維化的區(qū)域(用箭頭指出)。
圖2顯示骨髓細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞在聚焦激光掃描顯微鏡下觀察的顯微照片。(A)DiI標(biāo)記的骨髓細(xì)胞(紅色，細(xì)箭頭)，(B)核的染色(藍(lán)色，粗箭頭)，(C)被α-肌節(jié)肌動蛋白染色的心肌細(xì)胞(綠色)，(D)(A)到(C)的合并圖。標(biāo)尺是20μm。
實(shí)行本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明涉及治療非缺血性心力衰竭的藥物組合物，其包含作為活性成分的集落刺激因子。非缺血性心力衰竭包含，例如，由心肌病惡化引起的類型。心肌病的例子包括特發(fā)性心肌病如擴(kuò)張性、肥大的和限制性形式的心肌病，也包括繼發(fā)心肌病如心肌炎和結(jié)節(jié)病。本發(fā)明可用于，例如，擴(kuò)張性心肌病。
集落刺激因子的例子包括粒細(xì)胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞-單核細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF)和單核細(xì)胞-集落刺激因子(M-CSF)。例如，G-CSF可在本發(fā)明中應(yīng)用。
在G-CSF以本發(fā)明藥物組合物中的活性成分應(yīng)用的病例中，任何G-CSF都能應(yīng)用，但優(yōu)選高度純化的產(chǎn)品。具體例子包括哺乳動物G-CSF，尤其人G-CSF或基本具有相同生物活性的其等價物。其中應(yīng)用的G-CSF可以是任何來源的，包括那些自然產(chǎn)生或那些重組產(chǎn)生的。此重組產(chǎn)生的G-CSF可以具有與自然產(chǎn)生的G-CSF相同的氨基酸序列(例如，JP 2-5395B，JP 62-236488A)，或在氨基酸序列中含有一個或多個氨基酸殘基的刪除、替換和/或添加，而只要它保持了與天然產(chǎn)生的G-CSF相同的生物活性。例如，定點(diǎn)突變(Gotoh，T.等(1995)Gene 152，271-275；Zoller，M.J.和Smith，M.(1983)MethodsEnzymol.100，468-500；Kramer，W.等(1984)Nucleic Acids Res.12，9441-9456；Kramer，W.和Fritz H.J.(1987)MethodsEnzymol.154，350-367；Kunkel，T.A.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488-492；Kunkel(1988)Methods Enzymol.85，2763-2766)或其它技術(shù)能被用于在G-CSF的氨基酸序列中引入合適的突變，以此制備在功能上與G-CSF等同的多肽。同樣地，氨基酸突變也會在自然界中發(fā)生。已經(jīng)眾所周知，通過一個或多個氨基酸殘基的刪除和/或添加，和/或其它氨基酸對它們的置換，由一種氨基酸序列修飾得到的另一種氨基酸序列的多肽，保持了與原始多肽相同的生物活性(Mark，D.F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81，5662-5666；Zoller，M.L.和Smith，M.Nucleic Acids Research(1982)10，6487-6500；Wang，A.等，Science(1984)224，1431-1433；Dalbadie-McFarland，G.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79，6409-6413)。
因此，其氨基酸序列包含了G-CSF氨基酸序列一個或多個氨基酸突變而功能上與G-CSF等同的多肽也能在本發(fā)明的藥物組合物中應(yīng)用。在這樣的多肽中的突變氨基酸數(shù)目通常高達(dá)30個氨基酸，優(yōu)選高達(dá)15個氨基酸，更優(yōu)選高達(dá)5個氨基酸(例如，多達(dá)3個氨基酸)。
在替換突變體中，氨基酸替換最好以保持氨基酸側(cè)鏈的特性方式產(chǎn)生。這種氨基酸替換可利用的氨基酸實(shí)例包括疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)，親水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)，具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸(G、A、V、L、I、P)，具有含羥基側(cè)鏈的氨基酸(S、T、Y)，具有含硫側(cè)鏈的氨基酸(C、M)，具有含羧酸或氨基側(cè)鏈的氨基酸(D、N、E、Q)，具有含堿側(cè)鏈的氨基酸(R、K、H)，和具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸(H、F、Y、W)(括號中的大寫字母指單字母符號中的對應(yīng)氨基酸)。
含有在G-CSF氨基酸序列中數(shù)個氨基酸殘基的添加的多肽包括了含有G-CSF的融合多肽。融合多肽是G-CSF和其它多肽間的融合產(chǎn)物，而這些多肽也能在本發(fā)明中應(yīng)用。為制備融合多肽，例如，可將編碼G-CSF的DNA和編碼不同多肽的DNA在閱讀框中連接在一起，引入合適的表達(dá)載體，然后在合適的宿主中表達(dá)。其他與G-CSF融合的多肽沒有限制，而無論如何只要得到的融合多肽保持與G-CSF一樣的生物活性。
已有許多關(guān)于G-CSF氨基酸序列中帶有突變的G-CSF衍生物的報(bào)道，而應(yīng)用這些已知的G-CSF衍生物也有可能(例如，USP 5,581,476，USP 5,214,132，USP 5,362,853，USP 4,904,584)。
此外，應(yīng)用化學(xué)性修飾的G-CSF也有可能?；瘜W(xué)性修飾的G-CSF實(shí)例包括那些對糖鏈結(jié)構(gòu)性改變，添加和/或刪除而修飾的類型，也包括那些和化合物如聚乙二醇結(jié)合的類型(例如，USP 5,824,778，USP5,824,784，WO 96/11953，WO 95/21629，WO 94/20069，USP 5,218,092，JP 4-164098A)。
本發(fā)明所用的G-CSF可通過任何方式制備，例如通過培養(yǎng)人腫瘤細(xì)胞系或通過在大腸桿菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、例如中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、C127細(xì)胞、COS細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞或BHK細(xì)胞的哺乳動物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞中基因工程化的生產(chǎn)而制備。如此制備的G-CSF在使用前以多種方式被抽提、分離和純化(例如JP 1-44200B，JP 2-5395B，JP 62-129298A，JP 62-132899A，JP 62-236488A，JP 64-85098A)。
如果需要，根據(jù)施用模式和劑量形式，治療非缺血性心力衰竭的本發(fā)明藥物組合物可適當(dāng)?shù)匮a(bǔ)充加入下列試劑懸浮劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、等滲劑、防腐劑、抗吸附劑、表面活性劑、稀釋劑、賦形劑、pH調(diào)節(jié)物、光滑劑、緩沖劑、含硫的還原劑、抗氧化劑等。
懸浮劑實(shí)例包括甲基纖維素、Polysorbate 80、羥乙基纖維素、阿拉伯膠、粉末化的黃芪膠、羧甲基纖維素鈉和聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯。
增溶劑實(shí)例包括聚氧乙烯氫化蓖麻油、Polysorbate 80、煙酰胺、聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯、Magrogol和蓖麻油脂肪酸乙酯。
穩(wěn)定劑實(shí)例包括Dextran 40、甲基纖維素、明膠、亞硫酸納和焦亞硫酸納(sodium metasulfide)。
等滲劑實(shí)例包括D-甘露糖醇和山梨醇。
防腐劑實(shí)例包括對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、山梨酸、苯酚、甲酚和氯甲酚。
抗吸附劑實(shí)例包括人血清白蛋白、卵磷脂、葡聚糖、環(huán)氧乙烷環(huán)氧丙烷共聚物、羥丙基纖維素、甲基纖維素、聚氧乙烯氫化蓖麻油和聚乙二醇。
含硫的還原劑實(shí)例包括那些具有巰基基團(tuán)的化合物如N-乙酰半胱氨酸、N-乙酰同型半胱氨酸、硫辛酸、硫二甘醇、硫代乙醇胺、硫甘油、硫山梨醇、巰基乙酸和它的鹽、硫代硫酸鈉、谷胱甘肽和C1-C7的硫鏈烷酸。
抗氧化劑實(shí)例包括異抗壞血酸、二丁基羥基甲苯、丁基羥基苯甲醚、α-維生素E、維生素E乙酸酯、L-抗壞血酸和它的鹽、L-棕櫚酸抗壞血酸酯、L-硬脂酸抗壞血酸酯、亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉、焙酸三戊酯和焙酸丙酯，也包括螯合劑如乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA)、焦磷酸鈉和偏磷酸納。
此外，本發(fā)明的藥物組合物可包括其他普遍使用的成分，例如無機(jī)鹽如氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、磷酸鈉、磷酸鉀和碳酸氫鈉，也例如有機(jī)鹽如檸檬酸鈉、檸檬酸鉀和醋酸鈉。
治療非缺血性心力衰竭的本發(fā)明藥物組合物能以注射(例如皮下、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)注射)的劑型，適于經(jīng)皮、經(jīng)粘膜或經(jīng)鼻施用的任何劑型，或適于口服施用的任何劑型(例如片劑、膠囊、顆粒、溶液、懸浮液)而施予，但不限于這些形式。
在本發(fā)明的藥物組合物中，施用的劑量和頻率能被本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過考慮將要治療的疾病患者的癥狀而合理確定。G-CSF的單一劑量通常是每個成人0.1到100μg/kg，優(yōu)選每個成人1到10μg/kg，通常每周以每日一次到三次施用一到七天，但不限于此。
包含作為活性成分的集落刺激因子的治療非缺血性心力衰竭的本發(fā)明藥物組合物，對非缺血性心力衰竭的治療和/或防止有效。
本發(fā)明的試劑盒(kit)包含集落刺激因子，一種或多種藥學(xué)上可接受的適當(dāng)?shù)妮d體等(如果需要)，也包含使用指南。
本發(fā)明現(xiàn)在將在下列的實(shí)施例中進(jìn)一步闡述，其意圖不在于限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例心肌病的動物模型被用于檢查G-CSF的施用是否會防止心肌病誘導(dǎo)的心力衰竭的發(fā)展。
(1)實(shí)驗(yàn)程序心力衰竭的動物模型UM-X7.1心肌病倉鼠缺乏δ-sarcoglycan基因(Sakamoto A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1997，9413873-13878)，在出生后四周齡時開始失去心肌細(xì)胞(Jasmin G.等，Muscle Nerve 1982，520-25)。隨后，該動物經(jīng)歷伴隨心肌細(xì)胞丟失的的多重?fù)p傷的進(jìn)行性形成，并發(fā)展為明顯的纖維化，這導(dǎo)致心臟擴(kuò)大和/或心力不足，最后引起心力衰竭的死亡。在自然過程中，30周齡的存活率是大約50％。
G-CSF施用的程序?qū)嶒?yàn)1對16只雄性UM-X7.1心肌病倉鼠(出生后15周齡)根據(jù)施用時間表進(jìn)行處理，在時間表中，以10μg/kg/天連續(xù)5天皮下注射G-CSF，然后停藥2天。該處理一直持續(xù)15周，直到30周齡時為止。作為對照組，相同年齡的15只雄性UM-X7.1倉鼠也以同樣方式皮下注射蒸餾水。在30周齡時，比較兩個組的存活率，和進(jìn)行血液動力學(xué)、組織學(xué)、生物化學(xué)評估。
實(shí)驗(yàn)2根據(jù)上述施用時間表施用G-CSF或蒸餾水2周后(每組中n＝6)，對動物進(jìn)行Evans藍(lán)染液的腹膜內(nèi)注射，以檢查此染液到心肌細(xì)胞的吸收。
實(shí)驗(yàn)3進(jìn)一步完成隨后的實(shí)驗(yàn)以檢測骨髓細(xì)胞補(bǔ)充到心肌和它們分化成心肌細(xì)胞現(xiàn)象的存在或缺乏。骨髓細(xì)胞從每一雄性UM-X7.1倉鼠(出生后15周齡)的股骨中收集，用DiI染料標(biāo)記，然后再植入動物的髓腔中。根據(jù)上面的施藥時間表施用G-CSF或蒸餾水(每組中n＝6)之后，來自每一動物的心肌兩周后進(jìn)行組織學(xué)檢測。
血液動力學(xué)評估采用超聲診斷設(shè)備SSD-2000(Aloka)通過超聲心動描記術(shù)完成此評估。
組織學(xué)評估在實(shí)驗(yàn)1中，10％福爾馬林固定和石蠟包埋的心室橫切片(4μm)用Masson’s三色染劑染色以鑒別心肌纖維化的區(qū)域，隨后用圖像分析儀Luzex-F(NIRECO)進(jìn)行定量分析。每一心臟的又一部分也被進(jìn)行電鏡固定和在電鏡下觀察。
實(shí)驗(yàn)2和3中的心臟被制備成冰凍樣本。
生物化學(xué)評估明膠酶譜法被用于檢測基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)在心肌組織中的活性。
激光聚焦掃描顯微鏡從得到DiI標(biāo)記骨髓細(xì)胞再植的動物制得的心肌冰凍切片(6μm)被用α-肌節(jié)肌動蛋白免疫熒光染色，然后在激光聚焦掃描顯微鏡(Zweiss)下觀察。
免疫組織化學(xué)心肌組織的石蠟切片(4μm)以抗δ-sarcoglycan的抗體用ABC試劑盒(Vector Laboratories)免疫染色。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)字性數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示。用Student’s T-檢驗(yàn)進(jìn)行兩組的比較，而用Kaplan-Meier方法進(jìn)行存活率的比較。P＜0.05被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著。
(2)結(jié)果存活率30周齡的存活率在G-CSF組中是100％，在對照組中是53％，說明G-CSF的施用對存活率提供顯著的改善(p＜0.0001)。
血液動力學(xué)和左心室重建超聲心動描記評估證明，因?yàn)镚-CSF組的左心室射血部分(EF)和左心室的部分縮減(fraction shortening，％FS)都有顯著改善，G-CSF組表現(xiàn)出改善的左心室收縮功能。此外，評估也證明，因?yàn)镚-CSF組顯示出左心室舒張末期直徑(LVEDD)和左心室收縮末期直徑(LVESD)相對于對照組都有顯著減少(表1)，所以在G-CSF組中防止了左心室的重建。
當(dāng)解剖尸體測量器官重量時，雖然兩組間的體重沒有差異，G-CSF組中的心臟重量/體重和肺重量/體重的比率明顯小于對照組(表1)。
表1 血液動力學(xué)和左心室重建的參數(shù)比較

左心室纖維化相對于對照組(20.2±6.5％)，G-CSF組中的左心室纖維化區(qū)域的百分比顯著降低(8.6±4.0％)(p＜0.0001)(圖1)。
明膠酶譜法證明相對于對照組(數(shù)據(jù)未顯示)，G-CSF組顯示出心肌組織中MMP-2和MMP-9活性的增加。
心肌細(xì)胞的超微形態(tài)學(xué)對照組中30周大的倉鼠被發(fā)現(xiàn)在其心臟中存在大量含有退化線粒體和顯現(xiàn)出自體吞噬性退化的心肌細(xì)胞，而此 在G-CSF組中的頻率減小。
心肌細(xì)胞的細(xì)胞膜滲透性(脆弱性)在實(shí)驗(yàn)2中，對照組被發(fā)現(xiàn)存在 Evans藍(lán)染料的心肌細(xì)胞，即，其細(xì)胞膜滲透性增加(0.75±0. )，而G-CSF組中的此類細(xì)胞頻率減小(0.071±0.004％)。
骨髓細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化當(dāng)在激光聚焦掃描顯微鏡下觀察時，DiI-陽性和α-肌節(jié)肌動蛋白陽性細(xì)胞，即，骨髓細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞在G-CSF組的心肌組織中被發(fā)現(xiàn)(圖2)。
δ-sarcoglycan兩組中任一組都未觀察到δ-sarcoglycan在心肌組織中的表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。
(3)討論如上述所證明的，G-CSF的長期施用改善了心肌病動物模型中的進(jìn)行性心肌纖維化，左心室重建和心力衰竭。G-CSF這種效用的機(jī)理可由至少以下4種可能來解釋1)骨髓細(xì)胞補(bǔ)充到心肌組織和分化成心肌細(xì)胞所引起的心肌再生效應(yīng)；2)對心肌細(xì)胞丟失的抑制效應(yīng)；3)對心肌纖維化的抑制效應(yīng)；和4)抗細(xì)胞因子效應(yīng)1)當(dāng)在激光聚焦掃描顯微鏡下觀察時，骨髓細(xì)胞來源的DiI染料標(biāo)記和α-肌節(jié)肌動蛋白陽性細(xì)胞(即心肌細(xì)胞)在G-CSF組的心肌組織中被發(fā)現(xiàn)的事實(shí)支持了通過G-CSF的心肌再生的可能性。
2)超微形態(tài)學(xué)觀察和Evans藍(lán)染支持了G-CSF對心肌細(xì)胞的抗自體吞噬性退化/死亡效應(yīng)的可能性。對心肌細(xì)胞丟失的抑制效應(yīng)(即對心肌細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng))可由以下事實(shí)所充分推斷，即伴隨心肌細(xì)胞丟失的損傷在G-CSF組中較小，正如左心室纖維化區(qū)域的百分比降低所指明的一樣。
3)根據(jù)圖1，G-CSF的抗纖維化效應(yīng)明顯。正如G-CSF組心肌中MMP活性增加所指明的，存在另外的可能性即G-CSF也通過增加MMP活性而促進(jìn)了膠原纖維的降解，因此產(chǎn)生抗纖維化的效應(yīng)。
4)已知心力衰竭導(dǎo)致血液中細(xì)胞因子水平的提高，包括腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白介素6(IL-6)?？傊?，TNF-α顯示出對心臟功能具有抑制效應(yīng)(Meldrum DR.，Am.J.Physiol.1998，274R577-R595)。因此估計(jì)G-CSF將抑制這些細(xì)胞因子，由此而改善心臟功能。
這說明G-CSF對人擴(kuò)張性心肌病有效。
產(chǎn)業(yè)適用性集落刺激因子的長期施用使針對由心肌病惡化引起的非缺血性心力衰竭的治療成為可能。
權(quán)利要求
1.治療非缺血性心力衰竭的藥物組合物，其包含作為活性成分的集落刺激因子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其中非缺血性心力衰竭由心肌病惡化引起。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的藥物組合物，其中心肌病是特發(fā)性心肌病。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的藥物組合物，其中特發(fā)性心肌病是擴(kuò)張性心肌病。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到4中的任一項(xiàng)的藥物組合物，其中集落刺激因子是粒細(xì)胞集落刺激因子。
6.治療非缺血性心力衰竭的方法，其包含對有此需要的患者以治療非缺血性心力衰竭的有效量施用作為活性成分的集落刺激因子。
7.集落刺激因子在用于治療非缺血性心力衰竭的藥物組合物的制備中的應(yīng)用。
8.治療非缺血性心力衰竭的試劑盒，其包含了治療非缺血性心力衰竭所需的有效劑量的集落刺激因子和使用指南。
全文摘要
本發(fā)明的目標(biāo)是提供治療由心肌癥惡化引起的非缺血性心力衰竭的藥物組合物。集落刺激因子的長期施用改善進(jìn)行性心肌纖維化，左心室重塑和心力衰竭。
文檔編號A61P9/00GK1738638SQ200380108979
公開日2006年2月22日 申請日期2003年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月13日
發(fā)明者藤原久義, 竹村元三 申請人:藤原久義