專利名稱：制備富含羥基積雪草苷和特米諾苷的積雪草酸提取物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備包含羥基積雪草苷(madecassoside)和特米諾苷(terminoloside)的混和物的提取物，并在適當?shù)那闆r下還含有積雪草皂苷(asiaticoside)，還涉及制備包含超過相對于提取物總重量的75wt％的羥基積雪草苷、特米諾苷和積雪草皂苷的混和物的積雪草酸提取物的方法，以及制備包含超過相對于提取物總重量的95wt％的羥基積雪草苷、特米諾苷的混和物的積雪草酸提取物的方法，本發(fā)明還涉及它們在調(diào)節(jié)炎性機制方面的應用。
積雪草酸(centella asiatical)，又稱作紫籮(Violette marronne)(聯(lián)合島)，購土可樂(Gotu Kola)，或者印度石蓮花(印度)，或者積雪草R.(Centella repanda)(北美)，以及他樂婆(Talapetraka)(馬達加斯加)，是一種多形態(tài)的草藥，生長在海拔600米的潮濕陰暗的野外地區(qū)。
積雪草酸屬于傘形科族(Apiaceae)，特別屬于天胡妥(Hydrocotyle)亞科。積雪草相當于植物屬的名稱，積雪草酸則相當于種的名稱。積雪草酸包括三個種，分別為典型，阿比氏型和弗羅里達型(Typica、Abyssinica和Flolidana)。積雪草酸已是公知的物質(zhì)，并在馬達加斯加、印度、中國、北美印第安和印尼作為藥用已有3000年的歷史。其在不同的國家，藥用也不盡相同。其特別在傷口愈合、鎮(zhèn)靜、止痛、抗抑郁、抗病毒和抗微生物方面有益處。其通?？梢跃植繎没蚩诜Ｆ婀值氖?，積雪草酸在現(xiàn)代西藥中的應用較晚，直至1884年方有記載，在1941年才生產(chǎn)出第一種干提取物。
積雪草酸的活性成分是五環(huán)三萜物質(zhì)，以苷的形式存在；它們是積雪草酸(通式I)和羥基積雪草酸(通式II)，以及葡萄糖苷形式；它們是積雪草皂苷(通式III)和羥基積雪草苷(通式IV)。
積雪草皂苷、羥基積雪草苷、積雪草酸和羥基積雪草酸分子形成植物的天然防御。為了能夠更好地工業(yè)利用積雪草的活性成分，有必要收集天然狀態(tài)的植物，并需要一定的自然壓力，以獲得較高的三萜含量。
積雪草酸葡萄糖苷，羥基積雪草苷，以及積雪草皂苷，都是含糖的復合物，其構(gòu)成植物的羥基積雪草酸和積雪草酸的貯存形式，需在潮濕的季節(jié)才能生成。細菌、酵母或真菌等侵襲植物，激活配體釋放水解酶。三萜分子由于能夠調(diào)節(jié)及活化膠原的合成而特別有用。從積雪草酸中提取的苷及糖苷特別能夠促進膠原1和3的合成。這些活性劑可用于醫(yī)藥領(lǐng)域，主要是促進傷口愈合及治療靜脈機能不全。它們還可以用于化妝品領(lǐng)域，主要是作為抗皺和抗蜂窩組織劑應用。在先前技術(shù)中通常使用的積雪草酸的活性劑是積雪草酸和羥基積雪草酸，還可以是積雪草皂苷。由于羥基積雪草苷具有高水溶性，其通常在常規(guī)的提取脂溶性活性劑的方法中隨水洗液流出。
先前技術(shù)的方法可以得到羥基積雪草苷和積雪草皂苷的混和物。該混和物包括相對于混和物總重量的大約25wt％的積雪草皂苷，60wt％的羥基積雪草苷和15wt％的副產(chǎn)物，主要由脂肪酸和糖苷組成。先前技術(shù)的其它方法也可以得到純度為相對于混和物總重量的81wt％的羥基積雪草苷，所述提取物還包括羥基積雪草苷的異構(gòu)體，脂肪酸，主要是亞油酸、亞麻酸、棕櫚酸或油酸，以及糖，例如糖苷。
令人驚奇的是，本申請人開發(fā)出了一種新的提取方法，可以得到羥基積雪草苷、積雪草皂苷和一種新的分子的混和物，該分子稱為特米諾苷，所述混和物具有超過相對于混和物總重量的75wt％的純度，并可得到超過相對混合物種總重量95wt％的羥基積雪草苷和特米諾苷的混和物。類似地，申請人還發(fā)現(xiàn)了包含羥基積雪草苷、特米諾苷和適當?shù)姆e雪草皂苷混和物的積雪草酸提取物。
令人驚奇的是，本申請人還發(fā)現(xiàn)從積雪草酸地面部分提取的羥基積雪草苷和特米諾苷混和物可以用于調(diào)節(jié)炎癥機制的藥物中。
另外，從積雪草酸地面部分提取的羥基積雪苷、特米諾苷和積雪草皂苷的混和物還可以用于預防和延遲皮膚過早老化的化妝品組合物中。
在本發(fā)明中，術(shù)語“特米諾苷”是指化學結(jié)構(gòu)分子命名為1-[O-α-L-鼠李吡喃糖苷基-(1-4)-O-β-吡喃葡萄糖苷-(1-6)]-O-β-D-吡喃葡萄糖2α，3β，6β，23-四羥基油酰-12-基-28-酸酯，結(jié)構(gòu)式如通式V所述
該分子擁有與羥基積雪草苷相同的糖的部分，也就是說，擁有葡萄糖-葡萄糖-鼠李糖。特米諾苷萜環(huán)的結(jié)構(gòu)相當于特米諾酸(terminolicacid)的萜環(huán)，其結(jié)構(gòu)如下式的VI 特米諾苷是羥基積雪草苷的位置異構(gòu)體。先前技術(shù)中從未分離出該分子。另外，也從來沒有提到過特米諾苷能夠從積雪草酸中提取，并且，也沒有抑制的從積雪草酸中提取特米諾苷的方法。
還可以設想存在有檢測不到的積雪草皂苷的異構(gòu)體。因此，在本發(fā)明中，術(shù)語“積雪草皂苷”指的是如通式III所述的分子，如果存在的話，可能有包括一種異構(gòu)體的混和物。
在本發(fā)明中，術(shù)語“二元混和物”指的是主要包括羥基積雪草苷和特米諾苷的混和物，此混合物實際上不含有積雪草皂苷，術(shù)語“三元混和物”指的是主要包括羥基積雪草苷、特米諾苷和積雪草皂苷的混和物。
本發(fā)明的主旨是涉及一種制備包含羥基積雪草苷、特米諾苷和積雪草皂苷的混和物的提取物的方法，其特征在于包括如下步驟a).通過醇性溶劑提取地上部分的積雪草酸；b).將步驟a)得到的醇溶液通過陰離子樹脂；c).步驟b)的洗脫液通過液/液提取進行選擇性脫脂；
d).濃縮脫脂的水-醇相，并連續(xù)過濾得到水相；e).步驟d)得到的水相連續(xù)通過陽離子樹脂，并隨后通過陰離子樹脂；f).通過加入醇穩(wěn)定步驟e)得到的水相，并得到包含羥基積雪草苷、特米諾苷和積雪草皂苷的混和物。
本發(fā)明的主旨還涉及一種制備包含羥基積雪草苷和特米諾苷的混和物的提取物的方法，其特征在于包括如下步驟a).通過醇性溶劑提取地上部分的積雪草酸；b).將步驟a)得到的醇溶液通過陰離子樹脂；c).步驟b)的洗脫液通過液/液提取進行選擇性脫脂；d).濃縮脫脂的水-醇相，并連續(xù)過濾得到水相；e).步驟d)得到的水相連續(xù)通過陽離子樹脂，并隨后通過陰離子樹脂；f).通過加入醇穩(wěn)定步驟e)得到的水相；g).預純化的步驟f)得到的水-醇相進行選擇性色譜分離；并h).回收包含羥基積雪草苷和特米諾苷的混和物，得到其最終形式。
積雪草酸植物的活性成分的提取優(yōu)選用其植物的地上部分進行，目的主要是不破壞植物的根部，是保持此種植物可自然更新。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選可變化的方法為，植物的地上部分在提取步驟前浸漬于醇性溶劑中。能夠用于本發(fā)明的醇性溶劑是那些本領(lǐng)域技術(shù)人員所使用的常規(guī)的溶劑，如乙醇，特別是70％的乙醇。所得的醇性溶液隨即通過陰離子樹脂純化(步驟b)。本發(fā)明所用的陰離子樹脂優(yōu)選是具有季銨型官能基團的強陰離子樹脂。醇溶液通過陰離子樹脂可捕獲陰離子型的副產(chǎn)物，特別是酚類物質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選可變化的方法，步驟a)得到的醇性溶液在通過陰離子樹脂前進行澄清處理。優(yōu)選的澄清步驟包括在所述溶液中加入強堿溶液，如氫氧化鈉溶液及活性炭。加入強堿形成沉啶，過濾除去可與強堿反應的金屬和一些其它物質(zhì)。而活性炭通過純化可以使醇溶液脫色，并可固著脂肪酸或氧化產(chǎn)物。
繼由通過樹脂組成的步驟b)之后，優(yōu)選是在此之前進行澄清步驟，得到的洗脫液純化去除脂肪部分。為此，需經(jīng)液/液提取過程。所用的提取溶劑是非極性溶劑，優(yōu)選是鏈烷烴，如庚烷。任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的液/液提取方法都可以用于本發(fā)明的方法之中。特別是，所述的提取可以離心分離。由于羥基積雪草苷是水溶性的，故回收水醇相。
得到的水-醇相隨后濃縮成水相，隨后過濾，優(yōu)選的為數(shù)次。沉淀出在水相中不溶解的物質(zhì)。
本發(fā)明的方法的第一步驟之后，得到了水相，其中含有兩種已知的積雪草酸的葡萄糖苷，即積雪草皂苷和羥基積雪草苷，以及特米諾苷，都是可溶的。水相隨即通過陽離子樹脂，以及陰離子樹脂進行純化。此通過陽離子樹脂后再通過陰離子樹脂的步驟是本發(fā)明的重要步驟。優(yōu)選的是，所用的陽離子樹脂是強陽離子樹脂，其含有磺酸鹽型官能基團。優(yōu)選的是，所用的陰離子樹脂是強陰離子樹脂，其含有季銨鹽型官能基團。根據(jù)本發(fā)明的方法，為了增強殘留酸部分的結(jié)合能力，所用離子交換樹脂的順序是非常重要的。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的一個變化，在步驟e)的連續(xù)通過陽離子樹脂及陰離子樹脂步驟之后，和在步驟f)之前，所得水相通過活性炭?；钚蕴靠梢晕帐谷芤褐拇渭壏宇愇镔|(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明另一個優(yōu)選的變化，所得水相在步驟e)之后，步驟f)之前，任選地通過活性炭的步驟，進行一次或多次濃縮。
步驟e)之后所得的水相，任選通過活性炭和/或脫色后，隨后通過加入醇進行穩(wěn)定(步驟f))。隨即得到預純化的水-醇相，其中含有兩種已知的積雪草酸葡萄糖苷和特米諾苷，均為可溶的。得到的羥基積雪草苷、特米諾苷和積雪草皂苷的混和物優(yōu)選純度為大于相對于所述混和物總重量的75wt％。
步驟f)中得到的含有羥基積雪草苷、特米諾苷和積雪草皂苷的預純化的水-醇相可以通過選擇性的色譜方法進行純化。選擇性色譜技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)。分子通過與固定相的親和力的不同而被分離。該選擇性色譜分離步驟可以使積雪草皂苷從含有羥基積雪草苷和特米諾苷混和物中分離出來。
在本發(fā)明中，在選擇性色譜分離中使用的洗脫劑為極性溶劑。優(yōu)選的是，所用溶劑為水和乙醇的混和溶劑，其體積比為水/乙醇為50/50-90/10，典型的是75/25。
在本發(fā)明中，選擇性色譜分離中應用的固定相是非極性固定相。優(yōu)選的是，該固定相由接枝的非極性二氧化硅組成。該非極性接枝優(yōu)選為2-18個碳原子，更優(yōu)選為12-18個碳原子。
本方法的這些步驟之后，即步驟h)，得到了含有羥基積雪草苷和特米諾苷的混和物。該混和物中羥基積雪草苷和特米諾苷的重量比優(yōu)選的為30-70wt％，更優(yōu)選為40-60wt％。所得到的該混和物的純度優(yōu)選為占混和物總重量的95wt％。該二元混和物基本上不包括積雪草皂苷(只可能含有痕跡量的積雪草皂苷)。
本發(fā)明的主旨還包括通過以上所描述的方法獲得的積雪草酸的提取物，其包含超過95wt％的羥基積雪草苷和特米諾苷的混和物。存在的不純物主要是脂肪酸。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選可變的方面，羥基積雪草苷和特米諾苷的混和物的比率以羥基積雪草苷占總質(zhì)量的比率為計，為30-70wt％，優(yōu)選是40-60wt％。優(yōu)選的是，本發(fā)明的提取物是抗炎劑和免疫調(diào)節(jié)劑。
根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選可變的方面，其方法還包括一平行的步驟，其為將在步驟f)之后得到的羥基積雪草苷、特米諾苷和積雪草皂苷的三元混和物的標準化，通過加入適當量的根據(jù)本發(fā)明的純的積雪草酸的提取物來完成，即加入通過本發(fā)明的方法的步驟h)之后得到的羥基積雪草苷和特米諾苷的純度大于95wt％的混和物(二元混和物)，最終提取物的純度相對于最終提取物的總重量為90-98wt％。通過加入二元混和物以固定最提取物的純度范圍相對于最終提取物的總重量為90-98wt％來對三元混和物進行標準化。例如，為得到純度為90％的最終提取物，將一份的二元混和物和一份三元混和物混和；為得到純度為98％的最終提取物，則將9份二元混和物與1份三元混和物混和。
本發(fā)明的一個主旨還包括在本發(fā)明的方法的標準化步驟后得到的標準化的積雪草酸提取物，其包含至少75wt％的羥基積雪草苷、特米諾苷和積雪草皂苷的混和物(標準化的三元混和物)，優(yōu)選為85wt％。存在的不純的物質(zhì)主要是脂肪酸。在標準化的積雪草酸提取物中，積雪草皂苷(羥基積雪草苷+特米諾苷)的質(zhì)量比優(yōu)選在5∶95-25∶75。如果積雪草皂苷質(zhì)量百分比過高，就有可能產(chǎn)生相分離。特別地，積雪草皂苷可溶于有機溶劑，而羥基積雪草苷和特米諾苷是水溶性的。由羥基積雪草苷和特米諾苷組成的混和物水溶性非常好，可溶解大約25wt％的積雪草皂苷。在此標準化的積雪草酸提取物中，羥基積雪草苷特米諾苷的質(zhì)量比優(yōu)選為30∶70～70∶30，更優(yōu)選為40∶60～60∶40。
本發(fā)明的一個主旨還包括一種藥物，其包括超過95wt％的羥基積雪草苷和特米諾苷的積雪草酸提取物，或如上所述的標準化的積雪草酸提取物，以及藥學可接受的載體。實際應用中，二元混和物較之三元混和物更適于藥用。
羥基積雪草苷和特米諾苷可以水解，特別在與皮膚菌叢接觸時，分別產(chǎn)生羥基積雪草酸和terminolic acid。然而，這些酸沒有免疫調(diào)節(jié)活性。
當一個外來的生物體，如細菌或病毒，進入體內(nèi)，后者引發(fā)一種防御體系，亦稱作免疫系統(tǒng)，進行攻擊。免疫系統(tǒng)清除外來生物體而并不破壞其自身器官。在患有自身免疫性疾病的患者，免疫系統(tǒng)不再識別自身的器官結(jié)構(gòu)；這樣便會產(chǎn)生調(diào)節(jié)失控從而進攻其自身的結(jié)構(gòu)。
在一個特定的牛皮癬病例中，器官的抗原被免疫防御包圍，進攻自體的皮膚，造成炎癥遷移。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的過度反應造成角化細胞的過度增殖，并使角化細胞和角膜細胞形成厚的，不均勻的斑塊。本發(fā)明的藥物能夠抑制免疫防御的病理性產(chǎn)物。所述藥物優(yōu)選地能調(diào)節(jié)炎癥機制。更優(yōu)選的是，所述藥物可用于治療自身免疫性疾病、慢性炎癥疾病、特異性炎癥或腸性疾病。優(yōu)選的是，所述藥物可用于治療牛皮癬、白癜風、糠疹、硬皮病、大皰疹、濕疹、特異性皮炎、過敏或類風濕性關(guān)節(jié)炎。
在皮膚病學領(lǐng)域，本發(fā)明的藥物還可以用于預防和治療與老化等有關(guān)的慢性炎性遷移。所述藥物優(yōu)選用于預防和治療選自過敏癥、皮膚色素異常、皮膚脈管炎和炎性裂隙的疾病。所述藥物還優(yōu)選地通過細胞的保護和刺激來增強真皮-表皮交互作用細胞外基層，用于調(diào)節(jié)皮膚組織的平衡。
本發(fā)明的主旨還包括包含如上所述的標準化積雪草酸提取物和化妝品可接受的載體的化妝品組合物。所述化妝品組合物優(yōu)選用于預防任何自身免疫性病理遷移，這種病理病變是由皮膚自然老化造成。所述化妝品組合物優(yōu)選用于增強細胞功能以延遲自然老化。所述化妝品組合物更優(yōu)選用于預防遭受外界攻擊加速的皮膚老化，特別是可預防光誘導的皮膚老化。
外部的環(huán)境總是在對皮膚進行攻擊，無論是紫外線輻射或是照明燈的照射，或是各種天然抗原或由于人類活動而存在的抗原，城市污染等等，都會引起一系列的生物過程從而加速皮膚老化。因此，抗炎系統(tǒng)總是在活動中，會加速皮膚中的角化細胞的更新，或甚至造成過度增殖，通過特定蛋白的過度表達造成組織衰退，最終導致功能的喪失。其結(jié)果是因不斷的更新導致角化細胞天然資源儲備的耗盡，造成皮膚過早的老化。本發(fā)明的組合物化妝方面的應用優(yōu)選的可以抑制炎性疾病并因此可預防皮膚老化。
藥物或化妝品組合物優(yōu)選是固體、糊狀或液體形式。本發(fā)明優(yōu)選的是，藥物或化妝品組合物被配方成可局部施用、口服、皮下給予、注射給予、直腸給予、及生殖器途徑給予。本發(fā)明優(yōu)選的是，當藥物或化妝品組合物被配方成局部給予時，所述藥物或化妝品組合物是水性溶液、白色或有顏色的乳劑、軟膏、乳狀物、洗液、凝膠、油膏、乳清、糊劑、泡沫劑、氣溶膠、香波或條狀物。本發(fā)明優(yōu)選的是，當藥物或化妝品組合物被配方成口服給予時，所述藥物或化妝品組合物可以是水性溶液、乳劑、片劑、明膠膠囊、膠囊、粉末、顆粒、溶液劑或口服懸浮劑。本發(fā)明優(yōu)選的是，當藥物或化妝品組合物被配方成皮下給予時，所述藥物或化妝品組合物可以是無菌注射針劑。本發(fā)明優(yōu)選的是，當藥物或化妝品組合物被配方成直腸給予時，所述藥物或化妝品組合物栓劑形式。本發(fā)明優(yōu)選的是，當藥物或化妝品組合物被配方成經(jīng)生殖器途徑給予時，所述藥物或化妝品組合物可以是小卵泡的形式。
本發(fā)明的藥物的用量依賴于所治療病癥的嚴重情況以及治療時間的需要。一般地，醫(yī)師會根據(jù)患者的情況調(diào)整藥物劑量。對于自身免疫性疾病患者的治療，應用包含相對于混和物總重量的超過95wt％的羥基積雪草苷和特米諾苷的積雪草酸提取物，特別在局部給予所述藥物的比例相對于賦形劑體積的1-3wt％，對于透皮載體的所述提取物，每天給予一到兩次。特別優(yōu)選的是，以上限定的所述藥物的劑量分每日一到三次給予。
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不對發(fā)明的范圍有任何限定。
實施例1本發(fā)明的乳劑組合物
表1
實施例2本發(fā)明的乳劑組合物
表2實施例3純度相對于提取物總重量超過95wt％的羥基積雪草苷和特米諾苷混和物的提取方法a)過柱的初始含醇溶液的化學提純凈化積雪草酸的地面部分及用于本實施例的部分包括大約2-3cm的莖葉。取250kg積雪草酸的地面部分分成等量的三批。積雪草酸的活性成分從中通過逆流提取方法提取出來。另外一批新的積雪草酸的地面部分，即未經(jīng)浸漬或過濾，其中富含活性成分的，用第二提取液，即被活性成分飽和的耗盡溶劑提取。所得的液體稱為最終溶液，直接導入化學凈化罐中。該批原料隨后用第一浸漬液進行第二次提取，此浸漬液比首次使用的溶液有稍低的負載量，能溶解更多的活性成分。用于第二提取溶液的正是該溶液。該批原料最后用新鮮溶劑作第三次提取，溶解出原料中仍存在的最終百分比的活性成分。該溶液用作第一次提取的溶液。
在該實施例中，所用的浸漬和過濾溶劑是70％的乙醇。對于250kg積雪草酸地上部分的原料來說，需用1600升的70％的乙醇。
根據(jù)預先的提取步驟是在固定的罐還是在可活動的罐中進行，積雪草酸地上部分在多于或少于活性成分飽和的70％乙醇中的浸漬的時間范圍大約從1天到幾個小時不等。在特定的活動罐的情形，加熱至60℃，浸漬時間約為2小時。隨即加入10升30％的氫氧化鈉溶液至最終溶液之中，而后加入10kg活性炭，通過攪拌可使溶液脫色。溶液繼續(xù)攪拌40分鐘后過濾。濾液以流速300l/h通過含有季銨官能基團的強陰離子樹脂。
得到的水-醇洗出液隨即用氫氧化鈉中和，使pH值在5.3-6.9，而后進行液/液提取，優(yōu)選使用庚烷分離。
得到的脫脂相通過連續(xù)蒸發(fā)濃縮，條件是減壓，溫度不超過70℃。該濃縮可去除脫脂相中的積雪草皂苷。產(chǎn)物濃縮至乙醇體積有相當于最初脫脂相體積的90％的量被回收，以及至積雪草皂苷從脫脂相中沉淀出來。該相隨后被過濾，母液回收。羥基積雪草苷水溶性很好，可以溶解在濃縮過程中沉淀出的大約20wt％的積雪草皂苷。
b)制備預純化的水-醇相的步驟回收的濃縮的水相通過陽離子樹脂及隨后通過陰離子樹脂進行純化。陽離子樹脂是強陽離子樹脂，具有磺酸鹽型的官能基團。陰離子樹脂是強陰離子樹脂，具有季銨型官能基團。得到的洗脫液是水-醇相，隨后被鹽酸中和至pH值為6.75+/-0.25，并通過活性炭進行脫色。
根據(jù)與前述濃縮相同的原則，所得溶液在減壓條件下，在反應器中被過濾并濃縮，直至得到水相。再加入乙醇調(diào)節(jié)以得到穩(wěn)定的水-醇相溶液，固體含量為每升200g+/-20，乙醇濃度為體積比35％+/-3.5％。得到富含羥基積雪草苷和特米諾苷的預純化相，其中仍然含有積雪草皂苷。
c)純化步驟得到的預純化的水-醇相通過選擇性色譜法進行分離。在選擇性色譜分離過程中，所用的固定相包含有接枝的非極性二氧化硅，其非極性接枝含有18個碳原子，粒徑為10μm。所用溶劑為相對于混和物總體積的65％的水和35％的乙醇。而后得到的洗脫液被濃縮，干燥并粉碎。這些步驟可得到干燥的積雪草酸提取物。
干燥的提取物中含有相對于提取物總重量的99.8wt％的質(zhì)量比為51∶49的羥基積雪草苷和特米諾苷的混和物(二元混和物)。
實施例4提取和制備標準化的羥基積雪草苷、特米諾苷和積雪草皂苷的方法包括得到富含羥基積雪草苷及特米諾苷，并含有積雪草皂苷(純化步驟之前)的三元混和物的預純化相的步驟的提取方法與實施例3所描述的步驟相同。
該預純化相的純度以羥基積雪草苷、特米諾苷及積雪草皂苷為計為80wt％。存在的不純雜質(zhì)主要為脂肪酸。若以羥基積雪草苷、特米諾苷及積雪草皂苷的含量為100％，則混和物包含大約羥基積雪草苷39wt％，特米諾苷為39wt％，及積雪草皂苷為22wt％。
提取物通過加入100wt％的實施例3所得到的二元混和物進行標準化(即等量的三元混和物和二元混和物)。
隨即得到90wt％純度的標準化的積雪草酸提取物。該提取物包含若以羥基積雪草苷、特米諾苷及積雪草皂苷的含量為100％，則含有45.7wt％的羥基積雪草苷，44.5wt％的特米諾苷，及9.8wt％的積雪草皂苷。
實施例5兩種羥基積雪草苷和特米諾苷異構(gòu)體的分離300mg的羥基積雪草苷和特米諾苷混和物在30℃下通過流動相為81∶19v/v的水∶乙腈的制備的色譜柱進行分離(高純度標記C18(250×4.6))，。在210nm波長下進行檢測。得到95mg的特米諾苷和85mg的羥基積雪草苷。
羥基積雪草苷和特米諾苷的化學結(jié)構(gòu)通過光譜測定法進行分析確定(1H NMR，13C NMR，以及質(zhì)譜)。
實施例6羥基積雪草苷和特米諾苷對過度增殖的人角化細胞中的細胞生長的調(diào)節(jié)作用的評估在該實施例及以下的實施例中，提取物包含相對于本發(fā)明提取物總重量的99.8wt％的羥基積雪草苷和特米諾苷的混和物，所述混和物包含相對于混和物總重量的51wt％的羥基積雪草苷和49wt％的特米諾苷。
由于本發(fā)明的提取物主要含有羥基積雪草苷和特米諾苷的混合物，在本實施例和以下的實施例中，所述提取物不再表示其特性，均以“羥基積雪草苷和特米諾苷的混和物”，或“本發(fā)明的混和物”來表示。
本實施例是評估羥基積雪草苷和特米諾苷對過度增殖的人角化細胞中的細胞生長的調(diào)節(jié)作用。該實施例是在角化細胞生長因子(以下稱作KGF)和/或人白細胞彈性蛋白酶(以下稱作HLE)刺激的角化細胞HaCaT上進行的。
a)羥基積雪草苷和特米諾苷混和物的細胞毒性研究該細胞毒性研究包括確定不引起細胞毒性的最大劑量值。該研究是用HaCaT人類角化細胞進行的，細胞培養(yǎng)在96孔平板中，細胞數(shù)量為每孔最大為20×103，最小為10×103。細胞成活率的評估是通過應用中性紅的色度法分析完成的。中性紅是一種弱陽離子型染料，可通過非離子擴散機制滲入細胞膜，并在細胞內(nèi)與磷酸和/或溶酶體基質(zhì)的羧基基團結(jié)合。對中性紅的積聚和儲留的調(diào)節(jié)在細胞膜破壞時可被觀察到。在中性紅存在時細胞培養(yǎng)后得到的溶液的光密度與活細胞的數(shù)量成比例。
先測定9個不同濃度的寬范圍值，從0.001-1mg/ml。不同的測定溶液在補充了10vol％的胎牛血清(FCS)的Dulbecco’s改良培養(yǎng)基(Dulbecco’s Essential Medium，DMEM)中制備。24小時后，通過中性紅發(fā)現(xiàn)濃度小于等于1mg/ml的樣本對細胞反應沒有顯著的調(diào)節(jié)作用。僅在最高檢測濃度，即1mg/ml下觀察到只有很小的中性紅攝取的減少，即10％的抑制?；谶@些結(jié)果，建立了0.05-5mg/ml限定范圍的的濃度，以確定最大的無毒劑量。細胞存活通過72小時培養(yǎng)后的中性紅色度分析法評估。結(jié)果確認無毒濃度為小于等于1mg/ml。從1mg/ml起，就觀察到了輕微的劑量依賴性的毒性。最高檢測濃度，5mg/ml下，通過中性紅觀察到細胞抑制作用達到43％。
檢測的限定范圍2的濃度為0.075-5mg/ml。以1％的濃度將羥基積雪草苷和特米諾苷的混合物溶于二甲基亞砜(以下稱DMSO)之后，在HaCaT細胞上進行檢測。細胞存活通過72小時培養(yǎng)后的中性紅色度分析法評估。結(jié)果類似于不加DMSO的檢測結(jié)果。
表3列出所有的結(jié)果；細胞存活率用與對照的百分比表示。
表3n.t.表示未檢測根據(jù)這些結(jié)果，決定選擇濃度300μg/ml，作為檢測羥基積雪草苷和特米諾苷混和物的抗增殖活性的最大劑量。
b)對細胞增殖的影響檢測原理是基于在含或不含羥基積雪草苷和特米諾苷混和物時對人角化細胞的過度增殖進行的評估。該方法是基于測定在培養(yǎng)基中的用KGF或HLE刺激后的細胞密度。該細胞密度的檢測是通過使用中性紅的色度法完成的。應用微板讀數(shù)器在540nm下讀取溶液的吸光度。
共檢測羥基積雪草苷和特米諾苷混和物的4個濃度C1＝10μg/ml C2＝30μg/ml C3＝100μg/ml C4＝300μg/mlb.1)用KGF刺激準備6批檢測樣本一個對照組(不受刺激細胞)，KGF對照組(100ng/ml的KGF刺激的細胞)和4個處理組(用羥基積雪草苷和特米諾苷混和物處理及用KGF刺激的細胞)。分別在t＝0天，t＝2天，t＝5天時測定光密度。應用回歸線O.D.＝0.00355×103(細胞數(shù)每孔)+0.0018，將光密度的平均值O.D.轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎芏?，即每孔的細胞?shù)。
表4列出在KGF活化細胞2天及5天后記錄的細胞密度。
表4n.s.表示無統(tǒng)計學的顯著性差異。
以上結(jié)果顯示本發(fā)明的混和物對KGF活化2天及5天的HaCaT細胞生長沒有顯著的調(diào)節(jié)作用。
b.2)用HLE刺激準備6批檢測樣本一個對照組(不受刺激細胞)，HLE對照組(3nM，即90ng/ml的HLE刺激的細胞)和4個處理組(用羥基積雪草苷和特米諾苷混和物處理及用HLE刺激的細胞)。分別在t＝0天，t＝2天，t＝5天時測定光密度。應用回歸線O.D.＝0.00458×103(細胞數(shù)每孔)+0.041將光密度的平均值O.D.轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎芏?，即每孔的細胞?shù)。
表5列出在HLE活化細胞2天及5天后記錄的細胞密度。
表5n.s.表示無統(tǒng)計學的顯著性差異。
p≤0.05意思是結(jié)果具有統(tǒng)計學顯著性意義，其誤差為0.05％。
以上結(jié)果表明本發(fā)明的混和物對HLE活化2天及5天的HaCaT細胞的生長有小的減弱的作用。這種輕微的抑制作用僅在較高濃度時才出現(xiàn)。300μg/ml的羥基積雪草苷和特米諾苷的混和物與對照組相比，使HLE處理5天的活化細胞的生長降低了18％。
c)結(jié)論結(jié)論是，KGF在濃度100ng/ml，HLE在濃度90ng/ml時，刺激HaCaT細胞的生長。
羥基積雪草苷和特米諾苷的混和物在檢測所用的濃度范圍內(nèi)不能調(diào)節(jié)KGF刺激的HaCaT細胞的生長。但本發(fā)明的混和物可以劑量依賴的形式調(diào)節(jié)HLE刺激的HaCaT細胞的生長劑量依賴性。羥基積雪草苷和特米諾苷的混和物在劑量為300μg/ml時能夠降低HLE刺激的HaCaT細胞生長達18％。
實施例7羥基積雪草苷和特米諾苷的混和物對培養(yǎng)的人角化細胞的抗炎活性的證實本實施例的主旨是通過暴露于刺激壓力的培養(yǎng)的人角化細胞中制造和釋放的促炎癥表皮細胞因子、IL-1α和PGE-2評估本發(fā)明的混和物的抗炎活性。
a)羥基積雪草苷和特米諾苷混和物的細胞毒性研究該細胞毒性研究是通過與實施例4相同的方法完成，并得到相同的結(jié)果。另外，還增加了人角化細胞、K02-1H4屬的分析，以確定對目標細胞的無毒濃度。
準備8個濃度的檢測樣本，從0.075-5mg/ml。預溶解于DMSO中的羥基積雪草苷和特米諾苷混和物在所選濃度下加入到培養(yǎng)基中。最終DMSO的濃度為1％。通過分析中性紅評估細胞的存活力。
結(jié)果表明培養(yǎng)72小時后小于等于2.5mg/ml的濃度是無毒的。最高濃度，5mg/ml，導致了30％的中性紅攝取的抑制。
表6列出了結(jié)果。細胞存活用與對照的百分比表示。
表6根據(jù)結(jié)果，確定選擇1mg/ml為檢測羥基積雪草苷和特米諾苷混和物抗炎活性的最大劑量。
b)抗炎活性該分析是基于評估受刺激的人角化細胞產(chǎn)生的促炎癥細胞因子完成的。該方法通過在含或不含羥基積雪草苷和特米諾苷混和物培養(yǎng)的以及通過PMA，即巴豆醇-1，2-肉豆蔻酸-13-醋酸酯刺激的角化細胞中測定釋放至細胞外培養(yǎng)基中的細胞內(nèi)IL-1α，和PGE-2的量完成。
該研究在幼兒包皮分離的角化細胞，K02-1H4屬上進行。檢測羥基積雪草苷和特米諾苷混和物的3個濃度C1＝0.1mg/ml C2＝0.5mg/ml C3＝1.0mg/mlb.1)PGE-2的釋放表7列出了細胞活化以后得到的PGE-2的量，作為基數(shù)其通過蛋白質(zhì)的pg/μg值表示。PMA誘導的PGE-2的產(chǎn)生及抗炎活性(而后稱為AlA)可根據(jù)下式計算PGE-2產(chǎn)物＝PGE-2(PMA)-PGE-2(無PMA)AlA＝[PGE-2產(chǎn)物(對照細胞)-PGE-2產(chǎn)物(處理細胞)/PGE-2產(chǎn)物(對照細胞)]×100
表7角化細胞暴露于PMA得到了非常明確的PGE-2的產(chǎn)物并釋放PGE-2進入對照培養(yǎng)基中。特別地，無刺激培養(yǎng)基中記錄的的基數(shù)值在用PMA刺激后增加了8倍。結(jié)果說明PGE-2是一種表達、產(chǎn)生和釋放能夠被炎癥物質(zhì)如PMA誘導的細胞因子。
用羥基積雪草苷和特米諾苷混和物處理的在培養(yǎng)基中用PMA刺激后記錄的PGE-2的量明顯低于對照組。本發(fā)明混和物對PMA誘導的PGE-2的釋放的抑制效果是劑量依賴性的。在C1、C2、C3組中記錄到的差異具有統(tǒng)計學的顯著意義(p≤0.01，t檢驗)。羥基積雪草苷和特米諾苷混和物的最高濃度為1mg/ml時，能夠完全抑制PMA誘導的PGE-2的生成。
b.2)細胞內(nèi)IL-1α的產(chǎn)物表8列出了在細胞活化以后得到的細胞內(nèi)IL-1α的量，作為基數(shù)其通過蛋白質(zhì)的pg/μg值表示。PMA誘導的IL-1α的產(chǎn)生及抗炎活性(而后稱為AlA)可根據(jù)下式計算IL-1α產(chǎn)物＝IL-1α(PMA)-IL-1α(無PMA)AlA＝[IL-1α產(chǎn)物(對照細胞)-IL-1α產(chǎn)物(處理細胞)/IL-1α產(chǎn)物(對照細胞)]×100
表8角化細胞暴露于PMA導致了一些IL-1α的產(chǎn)物并釋放進入對照培養(yǎng)基中。特別地，無刺激培養(yǎng)基中記錄的基數(shù)值在用PMA刺激后增加了4倍。結(jié)果說明IL-1α是一種其表達、產(chǎn)生和釋放能夠被炎癥物質(zhì)如PMA誘導的細胞因子。
在用羥基積雪草苷和特米諾苷混和物處理的在培養(yǎng)基中用PMA刺激后記錄的IL-1α的量明顯低于對照組。本發(fā)明混和物對PMA誘導的IL-1α的產(chǎn)生和聚積的抑制效果是劑量依賴性的。在C1、C2、C3組的差異具有統(tǒng)計學的顯著意義(p≤0.01，t檢驗)。羥基積雪草苷和特米諾苷混和物的最高濃度為1mg/ml，能夠降低80％PMA誘導的IL-1α的生成。
c)結(jié)論羥基積雪草苷和特米諾苷混和物的抗炎活性可通過體外模型進行評估，是通過其調(diào)節(jié)兩種表皮細胞因子，PGE-2和IL-1α，的產(chǎn)物完成的，該二細胞因子在炎癥過程中起重要作用。通過對用刺激劑PMA刺激的人正常的角化細胞培養(yǎng)進行研究。該實施例顯示PMA在10ng/ml的無毒劑量，首先誘導細胞內(nèi)IL-1α的明顯升高，而后向培養(yǎng)基中生成和釋放PGE-2。羥基積雪草苷和特米諾苷混和物能夠明顯降低PMA誘導的PGE-2的釋放。混和物在劑量為1mg/ml時能夠完全抑制PGE-2的釋放。本發(fā)明的混和物能夠以劑量依賴的方式調(diào)節(jié)PMA誘導的IL-1α的生成和在細胞內(nèi)的積累劑量依賴性。
由于兩種細胞因子在炎癥過程中的重要性，羥基積雪草苷和特米諾苷混和物顯示出的劑量依賴性調(diào)節(jié)PGE-2的表達和釋放，及在體外由角化細胞刺激IL-1α的生成的能力使之被認為其具有抗炎活性。
實施例8羥基積雪草苷和特米諾苷混和物在培養(yǎng)的人角化細胞中的抗炎活性的評估該實施例的主旨是對羥基積雪草苷和特米諾苷混和物在干擾素γ誘導的TNF-α和IL-8的產(chǎn)物中的抗炎活性的評估。
a)細胞毒性研究該細胞毒性研究是通過與實施例4相同的方法完成，并得到相同的結(jié)果。
根據(jù)這些結(jié)果，確定選擇1mg/ml作為用于測定羥基積雪草苷和特米諾苷混和物的抗炎活性的最大劑量。
b)干擾素-γ對表皮細胞因子的影響該研究是針對正常的人角化細胞進行的。細胞首先用4個濃度的干擾素γ(IFN-γ)處理24小時。
接著，在對照培養(yǎng)基和用IFN-γ處理的培養(yǎng)基中，通過分析培養(yǎng)基上清中的IL-8和TNF-α以及分析細胞蛋白質(zhì)來測定炎性培養(yǎng)基，。該測定方法為考馬斯藍檢測法；其是標準方法。結(jié)果見表9和表10
表9
表10結(jié)果顯示干擾素γ在檢測的濃度范圍，100-2000U/ml，以劑量依賴的形式明顯的誘導刺激了TNF-α和IL-8的生成。字母U是單位的縮寫；1U相當于一個劑量單位的干擾素γ。
對于表皮細胞因子TNF-α，其在無刺激的培養(yǎng)基中的基準值在使用1000和2000U/ml的干擾素刺激后，分別升高了3.3倍和4.5倍。對于表皮細胞因子IL-8，其無興奮性的基準值，在使用1000和2000U/ml的干擾素刺激后，分別升高了26倍和38倍。
這些結(jié)果表明，干擾素能夠刺激兩種表皮細胞因子的表達、生成和釋放。根據(jù)這些結(jié)果，確定選擇1000U/ml濃度作為刺激角化細胞的濃度。
c)羥基積雪草苷和特米諾苷混和物的抗炎活性該研究在人正常的角化細胞中進行。細胞在誘導刺激壓力之前，首先用被研究物質(zhì)處理48小時。接著，通過加入干擾素γ，IFN-γ誘導刺激壓力。這些被激活的細胞在研究用產(chǎn)物存在下培養(yǎng)24小時。最后，檢測培養(yǎng)上清中的IL-8和TNF-α及細胞蛋白質(zhì)水平。
c.1)細胞因子IL-8的分析結(jié)果下表列出了在細胞活化以后得到的IL-8的量，作為基數(shù)其通過蛋白質(zhì)的pg/μg的值表示。每個濃度的抗炎活性(而后稱為AlA)可根據(jù)下式計算AlA＝[IL-8(對照細胞+IFN)-IL-8(處理細胞+IFN)/IL-8(對照細胞+IFN)]×100用羥基積雪草苷和特米諾苷混和物處理的角化細胞樣本的結(jié)果見下表11
表11所得結(jié)果顯示在100U/ml的干擾素γ的刺激后確實有IL-8的生成和向?qū)φ张囵B(yǎng)基中的釋放。無刺激培養(yǎng)基中記錄的基數(shù)值在用IFN-γ刺激后增加了18倍。而且，這些結(jié)果還顯示IFN-γ刺激的培養(yǎng)基的IL-8的量按劑量依賴性方式明顯降低。干擾素誘導的IL-8的產(chǎn)生明顯低于對照組。最高濃度的羥基積雪草苷和特米諾苷混和物能夠抑制63％的IFN-γ誘導的IL-8。C1、C2、C3、C4組記錄的相對于對照組的差異具有統(tǒng)計學的顯著意義(p≤0.01，t檢驗)。
c.2)細胞因子TNF-α的結(jié)果下表列出了在細胞活化以后得到的TNF-α(pg/mg蛋白質(zhì))的量，其也作為基數(shù)。每個濃度的抗炎活性(而后稱為AlA)可根據(jù)下式計算AlA＝[TNF-α(對照細胞+IFN)-TNF-α(處理細胞+IFN)/TNF-α(對照細胞+IFN)]×100用羥基積雪草苷和特米諾苷混和物處理的角化細胞樣本的結(jié)果見下表12
表12所得結(jié)果顯示在濃度為100U/ml的干擾素γ的刺激后確實有TNF-α的生成和向?qū)φ张囵B(yǎng)基中的釋放。無刺激培養(yǎng)基中記錄的基數(shù)值在用1000U/ml的IFN-γ刺激后增加了2.2倍。所得結(jié)果還顯示IFN-γ刺激的培養(yǎng)基的TNF-α的量按劑量依賴性方式輕微降低。干擾素誘導的IL-8的量明顯低于對照組。最高濃度的羥基積雪草苷和特米諾苷混和物能夠抑制26％的IFN-γ誘導的TNF-α。
d)結(jié)論羥基積雪草苷和特米諾苷混和物的抗炎活性可在體外模型中，通過其能調(diào)節(jié)在炎癥過程發(fā)揮重要作用的兩種表皮細胞因子，IL-8和TNF-α，的生成來評估。通過對用刺激劑-IFN-γ刺激的培養(yǎng)的人正常角化細胞進行研究。
該實施例顯示無毒劑量1000U/ml的IFN-γ首先誘導IL-8水平的顯著升高，而后，生成TNF-α并向培養(yǎng)基中釋放。本發(fā)明的混和物能夠以劑量依賴的形式調(diào)節(jié)IFN-γ誘導的IL-8的生成和在細胞內(nèi)的積累劑量依賴性?；旌臀镌趧┝繛?mg/ml時能夠以63％水平抑制IL-8的釋放。
羥基積雪草苷和特米諾苷混和物能夠降低IFN-γ誘導的TNF-α的釋放。該混和物在劑量為1mg/ml時能夠抑制26％的TNF-α的釋放。
如果在一個封閉系統(tǒng)中，即在體外進行的分析檢驗所得到的結(jié)果被推斷假設其化學活性在體內(nèi)是有效的，則以下的觀察是客觀的TNF-α不僅是在角化細胞中，而且在特別是巨噬細胞和B淋巴細胞中是一種IL-8生成的活性劑。
首先，該混和物僅部分地降低TNF-α的表達的事實，超出了炎癥信號表達的緩解，表明了對免疫系統(tǒng)活性的調(diào)控沒有被抑制，原因是TNF-α在細胞控制及對皮膚，特別是凋亡期的監(jiān)控中起重要作用。其次，該混和物降低IL-8的表達，造成中性粒細胞、嗜堿性多形核白細胞趨向性的減弱，和蛋白水解“壓力”的降低的結(jié)果，以及導致炎癥信號傳導的緩和，另外還有血管滲透性的減弱。另一個結(jié)果是，作為反饋，IL-8誘導的皮膚的T淋巴細胞活性減弱。
實施例9羥基積雪草苷和特米諾苷混和物對人角化細胞的SKALP產(chǎn)物的影響該實施例的主旨是通過處于分化狀態(tài)的角化細胞的細胞角蛋白10，特別是艾樂汾(elafin，這里簡寫為CK10或SKALP)的表達評估羥基積雪草苷和特米諾苷混和物抗牛皮癬的活性。
a)細胞毒性研究該研究是通過與實施例4相同的方法完成，并得到相同的結(jié)果。根據(jù)結(jié)果，決定選擇濃度1mg/ml為檢測羥基積雪草苷和特米諾苷混和物的抗牛皮癬活性的最大劑量。
b)SKALP的表達和角化細胞的分化該研究是在人正常的角化細胞中進行的。這些細胞置于三種不同的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。
-“增殖”培養(yǎng)基含gf，即生長因子的KGM培養(yǎng)基，培養(yǎng)基用生長因子補充，-“正常分化”培養(yǎng)基不含gf的KGM培養(yǎng)基，除去培養(yǎng)基的生長因子，-“牛皮癬型分化”培養(yǎng)基含F(xiàn)CS的KGM培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中補充有胎牛血清，以下稱為FCS(5％)。
接著，測定不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)72小時的細胞中的SKALP含量。測定方法是在皮膚藥理學和應用皮膚生理學，2002；15152-261.中描述的EKISA檢測法。
結(jié)果如下
1.含gf的KGM培養(yǎng)基 SKALP＝1.17+/-0.18ng/μg蛋白1002.不含gf的KGM培養(yǎng)基 SKALP＝1.34+/-0.20ng/μg蛋白1153.含F(xiàn)CS的KGM培養(yǎng)基 SKALP＝2.76+/-0.08ng/μg蛋白236所得結(jié)果顯示SKALP表達根據(jù)細胞的分化狀態(tài)而變化。SKALP的生成在細胞用包含F(xiàn)CS的培養(yǎng)基培養(yǎng)時明顯增加?！芭Ｆぐ_型”分化培養(yǎng)基中的SKALP量與增殖型培養(yǎng)基記錄的SKALP量相比增加了2.4倍。
c)產(chǎn)物“抗牛皮癬”效果的研究該研究條件如下細胞置于“正?！狈只呐囵B(yǎng)基，即無gf的KGM培養(yǎng)基中，以及在“牛皮癬型”培養(yǎng)基，即含F(xiàn)CS的KGM培養(yǎng)基中，在不含(作對照組)或含本發(fā)明的混和物的條件下，培養(yǎng)72小時。隨即測定培養(yǎng)液上清中SKALP的量。也隨之測定細胞蛋白。表13和14列出了在無gf的KGM培養(yǎng)基和含F(xiàn)CS的KGN培養(yǎng)基中進行細胞培養(yǎng)后得到的SKALP的量，以蛋白ng/μg表達。
α)“正?！狈只囵B(yǎng)基中培養(yǎng)不含gf的KGM培養(yǎng)基，
表13所得結(jié)果顯示用本發(fā)明混和物處理的樣本中SKALP的量下降。只有C4組與“無gf的KGM”對照組有統(tǒng)計學上的顯著差異(p≤0.01，t檢驗)。羥基積雪草苷和特米諾苷混和物的最高濃度能夠抑制60％的“正?！狈只囵B(yǎng)基組的SKALP的分泌。
β)“牛皮癬型”分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)含F(xiàn)CS的KGM培養(yǎng)基
表14所得結(jié)果顯示用本發(fā)明混和物處理的培養(yǎng)基中SKALP的量有劑量依賴性的下降。與“含F(xiàn)CS的KGM”對照組相比，C1、C2、C3和C4組統(tǒng)計學上有顯著差異(p≤0.01，t檢驗)。羥基積雪草苷和特米諾苷混和物的最高濃度能夠抑制40％的“牛皮癬型”分化培養(yǎng)基組的SKALP的分泌。
d)結(jié)論羥基積雪草苷和特米諾苷混和物的抗牛皮癬活性通過在體外模型中調(diào)節(jié)SKALP分泌的能力加以評估，其中SKALP被認為在牛皮癬型疾病中起重要作用。該研究是在不同培養(yǎng)基中的正常人角化細胞的培養(yǎng)基中進行的。
該實施例顯示SKALP的表達根據(jù)細胞分化狀態(tài)的不同而變化，并且在“牛皮癬型”培養(yǎng)基即含有FCS的培養(yǎng)基中顯著升高。
本發(fā)明的混和物能夠以劑量依賴性的方式抑制“正?！狈只囵B(yǎng)基組和“牛皮癬型”分化培養(yǎng)基組中的SKALP的分泌。劑量為1mg/ml的混和物能夠抑制60％的“正常”分化培養(yǎng)基組中的SKALP分泌，并抑制40％的“牛皮癬型”分化培養(yǎng)基組中的SKALP分泌。因為SKALP在牛皮癬疾病中起重要作用，羥基積雪草苷和特米諾苷混和物以劑量依賴的方式對在體外不同分化培養(yǎng)基中的角化細胞的SKALP的分泌能力的調(diào)節(jié)被認為是其抗牛皮癬活性。該結(jié)果證明根據(jù)在炎性增生反應中的細胞敏作用的方法，本發(fā)明的混和物對牛皮癬型模型特征性的表皮細胞蛋白水解有防護作用。
實施例10羥基積雪草苷和特米諾苷混和物對培養(yǎng)中的成纖維細胞NFκB活性的影響核因子κB是一種支配編碼細胞因子、趨化因子、生長因子、細胞粘附分子和某些短效蛋白質(zhì)的基因表達的轉(zhuǎn)錄因子。NFκB被一些包括細胞因子、自由基、可吸入顆粒、紫外線輻射以及細菌或病毒的物質(zhì)活化。
炎性介質(zhì)如TNF-α通過NFκB轉(zhuǎn)錄因子的活化誘導目標前炎癥反應基因的轉(zhuǎn)錄。在無刺激的條件下，轉(zhuǎn)錄因子NFκB在細胞質(zhì)內(nèi)是與抑制性蛋白IkB結(jié)合的。TNF-α與受體結(jié)合導致該復合物的磷酸化以及NFκB從抑制劑中裂解?；罨腘FKB隨即遷移進入細胞核中，與啟動子序列結(jié)合，稱為NFκB共有序列(NFκB consensus sequence)，對被NFκB激活的基因有特異性。該序列引起目標基因的轉(zhuǎn)錄。NFκB的激活能夠通過使刺激的和非刺激的核提取物與固定在載體上的NFκB共有寡核苷酸序列接觸來測定，并使用免疫酶方法如ELISA，用抗NFκB的抗體定量所結(jié)合的NFκB。
該研究可以依據(jù)測定轉(zhuǎn)錄因子NFκΚB與固定在塑性載體的共有寡核苷酸序列的結(jié)合的非常靈敏的特定方法來評估本發(fā)明的混和物對NFκB活性的影響。結(jié)合的NFκB繼而通過特定的抗NFκB抗體識別。
該分析是在分離的正常人成纖維細胞核上進行的。
培養(yǎng)基是DMEM，其包括·2mM的L-谷氨酰胺·50IU/ml青霉素，50μg/ml的鏈霉素·10％(v/v)的胎牛血清用于預培養(yǎng)，而后換成無血清培養(yǎng)基
表15
表16a)羥基積雪草苷和特米諾苷混和物的細胞毒性研究該研究是采用實施例4同樣的方法，并有同樣的結(jié)果。根據(jù)這些結(jié)果，確定選擇0.01％濃度作為最大劑量，用于檢測羥基積雪草苷和特米諾苷混和物的抗牛皮癬活性。
b)處理、提取和分析成纖維細胞在175cm2長頸瓶中，在包含10vol％的FCS的DMEM培養(yǎng)基中預培養(yǎng)，直至達飽和狀態(tài)，培養(yǎng)基隨即換成無血清的DMEM培養(yǎng)基。細胞在被檢測物或?qū)φ瘴锎嬖诘那闆r下培養(yǎng)1小時。前炎癥反應物質(zhì)生長因子α(TNF-α，在25ng/ml的最終濃度下；SigmaT0157)加入到培養(yǎng)基中，細胞在37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)1小時。之后，在冰上收集細胞，根據(jù)供應商推存的方法應用Sigma NUC-101試劑盒收集不同樣本的細胞核。每個胞核提取物的蛋白質(zhì)含量應用Biorad 500-0116檢測試劑盒確定?；罨腘FκB與特定的寡核苷酸的結(jié)合的量在應用特定的抗NFκB抗體目測后，以與同樣樣本的核提取物相同的量，即50μl，按50/50稀釋，測定。該檢測按供應商推薦的方法應用BD生物科學公司的(BD Biosciences K2058-1)轉(zhuǎn)染NFκB檢測試劑盒嚜可(Mercury)來完成。
c)NFκB分析結(jié)果見表17
表17AU代表提取物中NFκB的任意單元；其為測定值和背景噪音的差值。
NFκB在成纖維細胞核中的基數(shù)值很低。用25ng/ml濃度的TNF-α處理很大程度地活化了轉(zhuǎn)錄因子NFκB，與不含TNF-α的對照相比，約為37倍。應用過量寡核苷酸的對照可以顯示實質(zhì)上觀察到的完全反應是可特定的結(jié)合NFκB。5mM的柳氮磺吡啶，對照的NFκB易位抑制劑，明顯降低TNF-α誘導的轉(zhuǎn)錄因子NFκB的活性，相當于TNF-α的對照的44％，p＜0.01。
0.1μM地塞米松不抑制TNF-α誘導的NFκB的核易位。實際上，地塞米松抑制NFκB誘導基因的反式激活，但不抑制NFκB的活性或其向核的易位。因此具有對轉(zhuǎn)錄的抑制活性，但沒有對NFκB易位的影響；地塞米松的作用經(jīng)由糖皮質(zhì)激素受體在核水平上發(fā)生，因此其在柳氮磺吡啶的活性之后。
0.01％的本發(fā)明的產(chǎn)品沒有顯著的對TNF-α誘導的NFκB活性的調(diào)節(jié)作用，相當于對照的95％。該結(jié)果不排除其經(jīng)其它機制形成的抗炎活性。
d)結(jié)論羥基積雪草苷或其異構(gòu)體對NFκB活性的不干涉導致了配體如炎性細胞因子和趨化因子的轉(zhuǎn)錄，這些因子可使細胞在致病抗原入侵時可以抵抗致病性抗原。
羥基積雪草苷及其異構(gòu)體對于成纖維細胞生成的NFκB的活性沒有協(xié)同或?qū)棺饔谩Ｑ装Y配體在自身免疫反常異常中的調(diào)節(jié)，細胞膜上的IL-1、IL-8、TNF-α、PGE-2表明羥基積雪草苷及其異構(gòu)體實際上是在翻譯水平(更好的耐受炎癥的遷移)及表達和/或蛋白、肽或其它配體(更少的細胞內(nèi)的ILs的表達)的合成系統(tǒng)水平上起作用。
實施例11在皮炎等價模型即培養(yǎng)的人成纖維細胞中評價體外積雪草皂苷及羥基積雪草苷和特米諾苷的混和物(50/50w/w)對細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶生成的調(diào)節(jié)作用該實施例的主旨是在模擬皮膚環(huán)境中培養(yǎng)的人類皮膚成纖維細胞(膠原點陣)中評估積雪草皂苷及羥基積雪草苷和特米諾苷混和物(50/50w/w)對保護金屬蛋白酶(MMPs)及它們特定的抑制劑(TIMPs)的調(diào)節(jié)活性。建議進行體外實驗測定在含或不含本發(fā)明的產(chǎn)品及用TNF-α刺激的人成纖維細胞引起的釋放進入培養(yǎng)基中MMP-1和TIMP-1的量。該研究根據(jù)移植的方法，在源于對皮膚活檢的人成纖維細胞上進行的。根據(jù)實驗室常規(guī)的方法在相對濕度37％，空氣-CO2(95％-5％)的環(huán)境下在DMEM培養(yǎng)基(以InvitrogenTM商品名由LifeTechnologies商購)中培養(yǎng)成纖維細胞，該培養(yǎng)基中加入胎牛血清(10％FCS)及抗體。
a)細胞毒性細胞毒性研究方法同實施例6。
·積雪草皂苷
產(chǎn)品的原液事先在DMSO中溶解制備，而后在培養(yǎng)基中稀釋，得到不同的檢測溶液(DMSO的最終濃度1％)。一個寬范圍的8個濃度的樣本[從5-1000μg/ml]用來研究，以得到接近的最大的無毒性劑量(NCD)。接觸24小時后，在所測定的濃度范圍內(nèi)沒有顯著的細胞毒性發(fā)生。根據(jù)這些結(jié)果，確定一個限定的范圍(從10-1000μg/ml)以便于在接觸48小時后確定最大無毒性劑量(NCD)。結(jié)果(表18)證實培養(yǎng)48小時后低于1mg/ml的濃度無毒性。在1mg/ml的活性物質(zhì)存在下細胞存活率僅有12％的下降。
表18·羥基積雪草苷和特米諾苷混和物產(chǎn)品的原液事先在DMSO中溶解制備，而后在培養(yǎng)基中稀釋，得到不同的檢測溶液(DMSO的最終濃度1％)。一個寬范圍的8個濃度的樣本[從0.005-100mg/ml]在人稱纖維細胞上用來研究，以得到接近的最大的無毒性劑量(NCD)。接觸24小時后，濃度等于1mg/ml沒有顯著的中性紅攝取的調(diào)節(jié)作用。除此以外，記錄到劑量依賴性的細胞毒性效果。根據(jù)這些結(jié)果，確定一個限定的范圍(從0.1-10mg/ml)用于確定最大無毒性劑量(NCD)。
結(jié)果(表19)證實培養(yǎng)48小時后的無毒性濃度為1mg/ml。
表19
根據(jù)細胞毒性的研究結(jié)果，“1mg/ml”的濃度被選擇作為最大無毒性劑量(NCD)，用于測定積雪草皂苷及羥基積雪草苷和特米諾苷混和物對MMPs生成的活性作用。
b)金屬蛋白酶的生成以單分子層培養(yǎng)的人類皮膚成纖維細胞通過胰蛋白酶的消化作用從其載體中分離并懸浮在培養(yǎng)基中。計數(shù)后，細胞懸浮液在培養(yǎng)基中稀釋，并按規(guī)定的比例加入濃縮培養(yǎng)基(1.76×DMEM)、胎牛血清(FCS)和I型膠原(來源于鼠尾腱的醋酸提取物)的混和物中。冷卻下將該混和物傾于24-孔平板中，每孔1ml。皮膚等價物隨即置于37℃下培養(yǎng)72小時，條件為空氣-CO2(95％/5％)。在成纖維細胞的作用下凝膠逐漸收縮。
接種72小時后，去除培養(yǎng)基，更換包含各種不同的待研究的產(chǎn)品(進行“預處理”)的新的培養(yǎng)基。凝膠放到37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時，條件為空氣-CO2(95％/5％)。
培養(yǎng)后平板傾空。沖洗培養(yǎng)平板，而后暴露于含(處理組)或不含(對照組)不同濃度的研究樣本的TNF-α溶液中。加入TNF-α后，在37℃下培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)結(jié)束后，去除培養(yǎng)基，離心取上清檢測MMP-1和TIMP-1。
研究是在三維膠原凝膠(與皮膚等同的)中培養(yǎng)的人類成纖維細胞中進行的。
_操作條件1.用TNF-α誘導MMP-1前處理細胞24小時。
2.通過加入TNF-α(10ng/ml)誘導MMP-1，培養(yǎng)24小時。
3.測定細胞存活率，及在對照和處理組上清中的MMP-1的量。
·積雪草皂苷在三種濃度下檢測積雪草皂苷C1＝0.2mg/ml C2＝0.5mg/ml C3＝1.0mg/ml_細胞存活率(中性紅檢測)用10ng/ml的TNF-α處理的細胞對細胞存活率沒有調(diào)節(jié)作用。暴露在TNF-α下沒有觀察到中性紅攝取的下降。類似地，用TNF-α處理后也沒有觀察到積雪草皂苷處理組的細胞存活的變化。
_MMP-1的生成表20列出了細胞(+TNF)活化后培養(yǎng)液上清中的MMP-1的量(ng/ml)，和基礎值(-TNF)。
表20在對照組細胞中，所得結(jié)果顯示TNF-α誘導明顯的MMP-1的生成。在非刺激細胞中記錄的基值在用TNF-α刺激后升高了503倍。
在處理組細胞中，積雪草皂苷處理的樣本用TNF-α刺激后的MMP-1的量低于(+)TNF-α的對照組。
積雪草皂苷對TNF-α誘導的MMP-1的生成的效果是劑量依賴性的。在C1(p≤0.05)組、C2(p≤0.01)組、C3(p≤0.01)組相對于(+)TNF-α對照組都具有統(tǒng)計學意義上的顯著差異(t檢驗)。
·C1降低了MMP-1值的18％·C2降低了MMP-1值的49％·C3降低了MMP-1值的72％·羥基積雪草苷和特米諾苷混和物在三種濃度下檢測該混和物C1＝0.2mg/ml C2＝0.5mg/ml C3＝1.0mg/ml_細胞存活率(中性紅檢測)
羥基積雪草苷和特米諾苷混和物處理的細胞存活率在用TNF-α處理后沒有明顯的調(diào)節(jié)作用。
_MMP-1的生成結(jié)果顯示羥基積雪草苷和特米諾苷混和物處理和用TNF-α刺激的培養(yǎng)基上清中的MMP-1的量有劑量依賴性的降低。只在C2和C3組有統(tǒng)計學意義上的顯著差異((p≤0.01，t檢驗)。
·C1降低了MMP-1值的3％·C2降低了MMP-1值的39％·C3降低了MMP-1值的61％表21列出了上層細胞(+TNF)活化后上清中的MMP-1的量(ng/ml)，和基礎的值(-TNF)。
表21c)TIMP-1的生成也測定了積雪草皂苷或羥基積雪草苷+特米諾苷混和物處理的培養(yǎng)基上清中MMP-1的抑制劑TIMP-1的量。在3種濃度下測定每個活性物質(zhì)。
C1＝0.2mg/ml C2＝0.5mg/ml C3＝1.0mg/ml表22列出了細胞(+TNF)活化后上清中的TIMP-1的量(ng/ml)，還包括基礎值(-TNF)。
表22結(jié)果顯示·在凝膠中培養(yǎng)的成纖維細胞生成的TIMP-1不被TNF-α所調(diào)節(jié)；·包括積雪草皂苷及羥基積雪草苷+特米諾苷混和物的活性物在檢測的濃度范圍內(nèi)沒有顯示對TIMP-1生成的調(diào)節(jié)作用。
d)結(jié)論對包括積雪草皂苷及羥基積雪草苷+特米諾苷混和物的活性物對金屬蛋白酶(MMPs)和其抑制劑(TIMPs)的生成的調(diào)節(jié)作用在體外人的真皮模型上進行評估。該研究是在三維膠原基質(zhì)中培養(yǎng)的正常人成纖維細胞中進行的。該效果的評價是通過測定TNF-α的激活細胞后培養(yǎng)基上清中的MMP-1和TIMP-1的量完成的。
應用所選擇的實驗條件，所得結(jié)果如下·TNF-α在無細胞毒性劑量(10ng/ml)下誘導顯著的MMP-1生成的增加。另一方面，對TIMP-1的生成則沒有明顯的調(diào)節(jié)作用；·包含積雪草皂苷及羥基積雪草苷+特米諾苷混和物的活性物能夠以計量依賴的方式降低TNF-α誘導的MMP-1的生成量，在最高檢測濃度1mg/kg時，兩種活性物質(zhì)分別能降低TNF-α誘導的MMP-1的量的72％和61％。
·積雪草皂苷及羥基積雪草苷+特米諾苷混和物在其檢測濃度范圍內(nèi)，對TIMP-1的生成沒有影響。
對人成纖維細胞的研究觀察到TNF-α的炎性刺激明顯增加了(530％)MMP-1(膠原酶)釋放入培養(yǎng)基。羥基積雪草苷-特米諾苷混和物，與積雪草皂苷一樣，可顯著地以劑量依賴方式降低MMP-1的濃度(在500μg/kg，羥基積雪草苷-特米諾苷混和物＝-39％，而積雪草皂苷＝-49％)。MMP-1的抑制劑TIMPs的釋放，特別是TIMP-1，不被調(diào)節(jié)。該結(jié)果是對比了SKALPs(實施例9)的研究結(jié)果，在存在有羥基積雪草苷-特米諾苷混和物時，高濃度的白細胞蛋白酶并不增加抑制劑的分泌，但可通過角化細胞較大的降低前炎癥反應配體的量。
該研究還表明羥基積雪草苷-特米諾苷混和物以及積雪草皂苷是兩皮膚層的活性劑，即表皮層和真皮層。
實施例12特米諾苷、羥基積雪草苷和葡萄糖苷(特米諾苷、羥基積雪草苷和積雪草皂苷)混和物的抗炎活性在該實施例中，葡萄糖苷混和物是由相對于混和物總重量的40wt％的特米諾苷、40wt％的羥基積雪草苷和20wt％的積雪草皂苷組成。
為評估特米諾苷、羥基積雪草苷和葡萄糖苷(特米諾苷、羥基積雪草苷和積雪草皂苷)混和物的抗炎活性，我們研究了在用干擾素-γ(IFN-γ)或PMA誘導的刺激性應激下，這三種活性物質(zhì)對前炎癥反應表皮細胞因子(IL-8、IL-1α、PGE-2)在培養(yǎng)的人角化細胞中的生成和釋放。人角化細胞從人皮膚中分離。細胞在無血清的KGM培養(yǎng)基(角化細胞生成培養(yǎng)基，可以從Clonetics_公司商購)中培養(yǎng)，運用的是實驗室的常規(guī)技術(shù)，溫度37℃，濕潤空氣-CO2(95％-5％)。細胞生長達飽和狀態(tài)前在25cm2瓶中接種，并有規(guī)律地傳代。檢測的原理是基于在應激條件下評價人角化細胞的前炎癥反應細胞因子的生成。該方法是基于在研究產(chǎn)物存在或不存在情況下，測定應激用干擾素-γ(IFN-γ)或PMA(巴豆醇-12-肉豆蔻酸酯-13醋酸酯)刺激的細胞內(nèi)IL-1α和IL-8和PGE-2的釋放來完成的。
a)細胞毒性細胞毒性研究用與實施例6相同的方法在HaCaT人角化細胞和正常人角化細胞中完成的。
·特米諾苷*對HaCaT人角化細胞的毒性表23列出了這些結(jié)果(細胞存活率以與對照的％表示)
表23接觸24小時后，濃度≤2.5mg/ml沒有誘導顯著的對RN的細胞反應的調(diào)節(jié)作用。超過2.5mg/ml濃度，則有輕微的劑量依賴性的細胞毒性。
*對人角化細胞的毒性細胞毒性的研究是分析人角化細胞(K02-1H4屬)，以確定對靶細胞的無毒性的濃度。表24列出了這些結(jié)果(細胞存活率以與對照的％表示)
表24結(jié)果確定了在培養(yǎng)72小時后，無毒濃度小于或等于2.5mg/ml。
·羥基積雪草苷
*對HaCaT人角化細胞的毒性表25列出了這些結(jié)果
表25接觸24小時后，濃度低于1.0mg/ml的沒有誘導顯著的對RN的細胞反應的調(diào)節(jié)作用。超過1.0mg/ml濃度，則有輕微的劑量依賴性的細胞毒性。
*對人角化細胞的毒性毒性研究是對人角化細胞(K02-1H4屬)進行分析，以確定對“靶”細胞的無毒性濃度。
表26列出了所有的結(jié)果(細胞存活率以與對照的％表示)
表26結(jié)果證實無毒性濃度低于2.5mg/ml。大于該濃度，有輕微的劑量依賴性的細胞毒性效果。
·葡萄糖苷*對人角化細胞HaCaT的細胞毒性表27列出了所有的結(jié)果(細胞存活率以與對照的％表示)
表27接觸24小時后，濃度小于1.0mg/ml的沒有顯著的對RN的細胞反應的調(diào)節(jié)作用。超過1.0mg/ml，有輕微的劑量依賴性的細胞毒性作用。
*人角化細胞的細胞毒性細胞毒性的研究是對人角化細胞的分析(K02-1H4屬)，以確定對“靶”細胞的無毒性濃度。表28列出了所有的結(jié)果(細胞存活率以與對照的％表示)。
表28結(jié)果證實無毒性的濃度小于0.75mg/ml。超過此值，有輕微的劑量依賴性的細胞毒性影響。基于這些結(jié)果，濃度等于1mg/ml被選擇作為檢測三種活性劑的抗炎活性的最大劑量。
b)干擾素-γ的作用干擾素-γ(IFN-γ)對于表皮細胞因子的生成和釋放的作用應用人正常的角化細胞(K02-1H4屬)進行研究。檢測4種濃度的IFN-γC1＝100U/ml C2＝500U/ml C3＝1000U/ml C4＝2000U/ml_細胞內(nèi)IL-1α的生成結(jié)果見表29
表29結(jié)果顯示干擾素-γ在檢測的濃度范圍內(nèi)，按劑量依賴方式誘導顯著的細胞內(nèi)IL-1α的刺激。在無刺激的細胞中記錄的基線值(3.25+/-0.05pg/μg蛋白)在用1000和2000pg/ml的IFN-γ刺激后，大約分別有2.6倍和3.8倍的增加。
_IL-8的釋放IFN-γ對IL-8生成和釋放的影響是在相同的實驗條件下研究的。結(jié)果見表30
表30培養(yǎng)基中未用干擾素-γ刺激的結(jié)果證實在基礎狀態(tài)的角化細胞的培養(yǎng)基中含或不含小量的IL-8。另一方面，用IFN-γ刺激后的IL-8生成和釋放明顯增加。該劑量依賴性的細胞內(nèi)IL-8的增加(+IFN-γ)證實了前炎癥反應細胞因子在IL-8的生成和釋放中的作用。
_PGE-2的釋放IFN-γ對PGE-2的生成和釋放的影響是在相同的實驗條件下研究的。結(jié)果見表31
表31結(jié)果顯示IFN-γ不能在檢測的范圍內(nèi)刺激PGE-2的生成和釋放。
c)抗炎活性該研究是用從幼童包皮分離出的角化細胞進行分析的(K02-1H6屬)。
每種活性物質(zhì)，特米諾苷、羥基積雪草苷和葡萄糖苷，都檢測4個濃度C1＝0.01mg/ml C2＝0.25mg/ml C3＝0.50mg/ml C4＝1.00mg/ml檢測條件1.在刺激應激誘導之前用所要研究的產(chǎn)品處理細胞48小時；2.加入刺激應激誘導即用IFN-γ(1000U/ml)；3.在研究產(chǎn)品存在的情況下培養(yǎng)“活化”細胞24小時；4.分析IL-8(細胞外)和IL-1α(細胞內(nèi))。進行細胞蛋白分析。
_IL-8的釋放表32至34列出了IL-8在細胞活化后(+IFN-γ)的量，以及基礎量(-IFN-γ)。對于每種濃度的活性物質(zhì)IFN-γ誘導的IL-8的生成及抗炎活性可以根據(jù)如下公式計算AIA＝[IL-8(對照細胞+IFN)-IL-8(處理細胞-IFN)/IL-8(對照細胞+IFN)]×100·特米諾苷
表32用IFN-γ刺激后在對照組觀察到IL-8的釋放。在無刺激組中記錄的很小的基礎值說明IL-8在基態(tài)下并不存在，但其表達和釋放可由IFN-γ誘導。用IFN-γ刺激后基礎值有大約8.5倍的升高。用IFN-γ刺激后記錄的IL-8的量在用活性劑特米諾苷處理組低于(+)IFN-γ對照組。
活性劑特米諾苷對于IFN-γ誘導的IL-8的釋放的影響是劑量依賴性的。在C2(p≤0.05)、C3(p≤0.01)和C4(p≤0.01)組中發(fā)現(xiàn)有相對于(+)IFN-γ對照組的統(tǒng)計學意義上的顯著差異(t檢驗)。最大檢測濃度(1mg/ml)能夠降低IFN-γ誘導的IL-8生成的42％。
·羥基積雪草苷
表33結(jié)果顯示了在用羥基積雪草苷處理和IFN-γ刺激的組中有劑量依賴性的IL-8的降低。在C1、C2、C3和C4組中有統(tǒng)計學意義上的顯著差異(p≤0.01，t檢驗)。最大檢測濃度(1mg/ml)能夠降低IL-8生成的56％。
·葡萄糖苷
表34結(jié)果顯示了在用葡萄糖苷混和物(羥基積雪草苷、特米諾苷和積雪草皂苷)處理和IFN-γ刺激的組中有劑量依賴性的IL-8的降低。在C1、C2、C3和C4組中有統(tǒng)計學意義上的顯著差異(p≤0.01，t檢驗)。濃度(1mg/ml)能夠降低57％的IL-8生成。
_細胞內(nèi)IL-1α的生成表34至36列出了IL-1α在細胞活化后(+IFN-γ)的細胞內(nèi)含量，以及基礎值(-IFN-γ)。對每個濃度的活性物質(zhì)IFN-γ誘導IL-1α的生成及抗炎活性可以以如下公式加以計算AIA＝[IL-1α產(chǎn)量(對照細胞)-IL-1α產(chǎn)量(處理細胞)/IL-1α產(chǎn)物(對照細胞)]×100·特米諾苷
表35在(+IFN-γ)對照組中，IL-1α的基礎值在用IFN-γ處理后有3.7倍的升高，證實IL-1α是一種細胞因子，其可在細胞內(nèi)被IFN-γ誘導生成。在用特米諾苷活性劑處理的組中有明顯的IL-1α量的降低。該抑制效果是劑量依賴性的。在C1(p≤0.05)、C2(p≤0.01)、C3(p≤0.01)和C4(p≤0.01)組中發(fā)現(xiàn)有相對于(+)IFN-γ對照組的統(tǒng)計學意義上的顯著差異(t檢驗)。
活性物質(zhì)在濃度為1mg/ml時能夠降低68％的IFN-γ誘導的IL-1α的生成。
·羥基積雪草苷
表36結(jié)果顯示在用1mg/ml的羥基積雪草苷處理的組中IL-1α有54％的IL-α的降低。另外，在C1、C2和C3濃度下有相同的結(jié)果大約25％的IL-1α量的降低(p≤0.01)。
·葡萄糖苷
表37結(jié)果顯示了在用1mg/ml的葡萄糖苷混和物處理的組中IL-1α有61％的降低(p≤0.01)。
d)抗炎活性-PMA應激由于IFN-γ對PGE-2生成的釋放缺乏影響，活性物質(zhì)的抗炎作用在用PMA刺激的人正常角化細胞(K02-1H6屬)上進行研究。每個活性物質(zhì)檢測4個濃度C1＝0.10mg/ml C2＝0.25mg/ml C3＝0.50mg/ml C4＝1.00mg/ml檢測條件1.應激刺激誘導前用研究產(chǎn)物處理細胞48小時，2.應激誘導PMA(10ng/ml)，3.在研究產(chǎn)物存在下培養(yǎng)“活化”細胞24小時，4.檢測PGE-2(細胞外)和細胞蛋白。
_PGE-2的釋放表37-39列出了細胞活化后(+PMA)的PGE-2(pg/μg蛋白)的量，以及基礎值(-PMA)。對于每種濃度，PMA誘導的PGE-2的生成和抗炎活性可以以下公式進行計算，PGE-2產(chǎn)物＝[PGE-2(+PMA)-PGE-2(-PMA)]AIA＝[PGE-2產(chǎn)量(對照細胞)-PGE-2產(chǎn)量(處理細胞)/PGE-2產(chǎn)物(對照細胞)]×100·特米諾苷
表38在(+PMA)對照組中，將角化細胞暴露于PMA下導致顯著的PGE-2的生成及向培養(yǎng)基的釋放。在無刺激培養(yǎng)基中記錄的基礎值在用PMA刺激后有4倍的升高，證實PGE-2為一種細胞因子，其可在PMA誘導下表達、生成和釋放。結(jié)果顯示PGE-2在用特米諾苷處理和用PMA刺激的組中有按劑量依賴方式下降。在C3和C4組中發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計學意義上的顯著差異(p≤0.01，t檢驗)。活性物質(zhì)在濃度為1mg/ml時能夠降低69％的PGE-2的釋放。
·羥基積雪草苷
表39在用活性物羥基積雪草苷處理的組中PGE-2在培養(yǎng)基中的量有明顯的下降。該抑制效果屬劑量依賴性。相對于(+)PMA對照組只有C3和C4組有統(tǒng)計學意義上的顯著差異(p≤0.01，t檢驗)?；钚晕锪u基積雪草苷濃度在1mg/ml時能夠降低63％的PMA誘導的PGE-2的生成。
·葡萄糖苷
表40抑制活性為劑量依賴性的。葡萄糖苷混和物在1mg/ml濃度下能夠完全抑制PMA誘導的PGE-2的生成。
e)結(jié)論活性物質(zhì)特米諾苷、羥基積雪草苷和葡萄糖苷的抗炎活性是在體外模型中通過它們對在炎癥過程中起重要作用的表皮細胞因子(IL-8、IL-1α和PGE-2)的生成的調(diào)節(jié)能力來評估的。該研究是在干擾素-γ或PMA刺激的人的正常的角化細胞中進行的。
活性物質(zhì)的抗炎活性是通過測定以下量值來評估的·干擾素-γ活化后的IL-8和IL-1α。
·用PMA刺激后的PGE-2。
在選擇的實驗條件下，該研究顯示_IFN-γ，在檢測濃度范圍內(nèi)(100-2000U/ml)以劑量依賴方式誘導明顯的IL-1α(細胞內(nèi))的生成，并導致IL-8的生成以及向培養(yǎng)基的釋放。另一方面，相同濃度的IFN-γ并不能刺激PGE-2的釋放。
_PMA，在無毒性劑量下(10ng/ml)，導致PGE-2向培養(yǎng)基的釋放。
_活性物質(zhì)特米諾苷、羥基積雪草苷和葡萄糖苷能夠調(diào)節(jié)白細胞介素IL-8和IL-1α的生成，并能調(diào)節(jié)對炎癥應激發(fā)生反應的前列腺素-2的生成。比較細胞因子的量證實抗炎效果是根據(jù)研究物質(zhì)、細胞因子的類型而可變的，其變化為·相對于IL-8三種檢測活性劑均能夠以劑量依賴方式調(diào)節(jié)這些細胞因子在生成和在細胞外的釋放。
如果考慮用最高濃度的活性物質(zhì)處理細胞后細胞因子的量，三種檢測產(chǎn)品可以按它們的抗炎的能力分類，結(jié)果如下葡萄糖苷＞羥基積雪草苷＞特米諾苷·相對于IL-1α三種檢測活性物質(zhì)均能夠降低IFN-γ誘導的IL-1α的生成和在細胞內(nèi)的積累。三種檢測產(chǎn)品可以根據(jù)最大抗炎效果分類，如下特米諾苷≥葡萄糖苷≥羥基積雪草苷·相對于PGE-2兩種活性劑，羥基積雪草苷和特米諾苷，能夠明顯降低PMA誘導的PGE-2的釋放。葡萄糖苷的混和物能夠完全抑制PMA誘導的PGWE-2生成。根據(jù)這些結(jié)果可對產(chǎn)品作如下的分類葡萄糖苷混和物＞羥基積雪草苷≈特米諾苷由于這些細胞因子在炎癥過程中的重要性，活性物質(zhì)特米諾苷、羥基積雪草苷和葡萄糖苷通過在體外刺激的角化細胞調(diào)節(jié)IL-8和IL-1α，以及前列腺素-2的能力，被認為是非常有作用的具有“抗炎”活性的成分。
權(quán)利要求
1.一種制備包含羥基積雪草苷、特米諾苷和積雪草皂苷的混和物的積雪草酸提取物的方法，其特征在于包括以下步驟a).通過醇性溶劑提取積雪草酸的地上部分；b).將步驟a)得到的醇溶液通過陰離子樹脂；c).將步驟b)得到的洗脫液通過液/液提取進行選擇性脫脂；d).濃縮脫脂的水-醇相，并連續(xù)過濾得到水相；e).步驟d)得到的水相連續(xù)通過陽離子樹脂，并隨后通過陰離子樹脂；f).通過加入醇穩(wěn)定步驟e)得到的水相，并得到包含羥基積雪草苷、特米諾苷和積雪草皂苷的混和物。
2.一種制備包含羥基積雪草苷和特米諾苷的混和物的積雪草酸提取物的方法，其特征在于其包括以下步驟a).通過醇性溶劑提取積雪草酸的地上部分；b).將步驟a)得到的醇溶液通過陰離子樹脂；c).將步驟b)得到的洗脫液通過液/液提取進行選擇性脫脂；d).濃縮脫脂的水-醇相，并連續(xù)過濾得到水相；e).步驟d)得到的水相連續(xù)通過陽離子樹脂，并隨后通過陰離子樹脂；f).通過加入醇穩(wěn)定步驟e)得到的水相；g).將步驟f)得到的預純化的水-醇相進行選擇性色譜分離；并h).以其最終形式回收包含羥基積雪草苷和特米諾苷的混和物。
3.如權(quán)利要求1或2所述的提取方法，其特征在于在步驟b)中所用的陰離子樹脂是帶有季銨型官能基團的強效陰離子樹脂。
4.如前述任一權(quán)利要求所述的提取方法，其特征在于步驟e)所用的陽離子樹脂是帶有磺酸型官能基團的強效陽離子樹脂。
5.如前述任一權(quán)利要求所述的提取方法，其特征在于步驟e)所用的陰離子樹脂是帶有季銨型官能基團的強效陰離子樹脂。
6.如權(quán)利要求2-5任一項所述的提取方法，其特征在于步驟g)的選擇性色譜分離所用的溶劑是水和乙醇的混和溶劑，其中水/乙醇的體積比范圍為50/50-90/10。
7.如權(quán)利要求2-6任一項所述的提取方法，其特征在于用于選擇性色譜分離的固定相是非極性固定相，特別是由接枝的非極性硅酸鹽組成的固定相，所述非極性的接枝含有2-18個碳原子。
8.如權(quán)利要求2-7任一項所述的提取方法，其特征在于所得到的羥基積雪草苷和特米諾苷的混和物的純度相對于提取物總重量大于95wt％。
9.如權(quán)利要求2-8任一項所述的提取方法得到的積雪草酸提取物，其包含超過95wt％的羥基積雪草苷和特米諾苷的混和物。
10.權(quán)利要求9所述的積雪草酸提取物，其特征在于混和物中羥基積雪草苷的比例為30-70wt％，優(yōu)選為40-60wt％。
11.如權(quán)利要求1-8任一項所述的提取方法，其特征在于其還包括平行地將步驟f)所得到的混和物標準化的步驟，該步驟是通過附加入適當量的如權(quán)利要求9或10的提取物而實現(xiàn)的，其中所得到的最終提取物的純度相對于提取物總重量達到90-98wt％。
12.通過權(quán)利要求11的方法得到的標準化的積雪草酸提取物，其包括相對于提取物總重量至少75wt％的包含羥基積雪草苷、特米諾苷和積雪草皂苷的混和物，優(yōu)選是至少85wt％。
13.如權(quán)利要求12的標準化的提取物，其特征在于積雪草皂苷∶(羥基積雪草苷+特米諾苷)的質(zhì)量比為5∶95-25∶75。
14.如權(quán)利要求12或13的標準化的提取物，其特征在于羥基積雪草苷∶特米諾苷的質(zhì)量比為30∶70-70∶30，優(yōu)選為40∶60-60∶40。
15.包含權(quán)利要求9或10的積雪草酸提取物和藥學可接受的載體的藥物。
16.如權(quán)利要求15所述的藥物，其是用于調(diào)節(jié)炎性機制的。
17.如權(quán)利要求15或16所述的藥物，其是用于治療自身免疫性疾病、慢性炎性疾病、特異反應性炎性疾病或腸疾病。
18.權(quán)利要求15-17任一項所述的藥物，其是用于治療銀屑病、白癜風、糠疹、硬皮病、大皰疹皮膚病、濕疹、特異性皮炎、過敏癥或類風濕性關(guān)節(jié)炎。
19.權(quán)利要求15-18任一項所述的藥物，其是用于預防和治療與老化及其結(jié)果有關(guān)的慢性炎癥性遷移。
20.如權(quán)利要求19所述的藥物，其是用于預防和治療選自過敏反應、皮膚色素異常、皮膚血管過度形成和炎性龜裂的疾病。
21.如權(quán)利要求19所述的藥物，其是用于調(diào)節(jié)皮膚組織的動態(tài)平衡。
22.一種化妝組合物，其包含如權(quán)利要求12-14任一項所述的積雪草酸提取物和化妝可接受的載體。
23.如權(quán)利要求22所述的組合物的化妝上的應用，其用于預防由皮膚老化造成的任何自身免疫引起的病理性變異，用于延遲皮膚的自然老化過程，用于預防外界刺激引起的皮膚老化加速，特別是用于預防光誘導的皮膚老化。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備包含羥基積雪草苷、特米諾苷和任選的積雪草皂苷的混和物的提取物的方法，制備包含超過相對于提取物總重量的75wt％的羥基積雪草苷、特米諾苷和積雪草皂苷的混和物的積雪草酸提取物的方法，以及制備包含超過相對于提取物總重量的95wt％的羥基積雪草苷、特米諾苷的混和物的積雪草酸提取物的方法，本發(fā)明還涉及它們在調(diào)節(jié)炎性機制方面的應用。
文檔編號A61K8/60GK1774257SQ200380109597
公開日2006年5月17日 申請日期2003年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月10日
發(fā)明者A·盧瓦索, G·塞內(nèi), E·特龍 申請人:拜爾消費者保健股份公司