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肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因修飾骨髓間質(zhì)干細(xì)胞在心肌缺血治療中的應(yīng)用的制作方法

文檔序號(hào):1079478閱讀:229來源:國(guó)知局
專利名稱:肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因修飾骨髓間質(zhì)干細(xì)胞在心肌缺血治療中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域,具體說是涉及以骨髓間質(zhì)干細(xì)胞為基因載體,攜帶肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因在心肌缺血治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)
缺血性心臟病是發(fā)病率高且嚴(yán)重危害人體健康的心臟病,在西方國(guó)家它是成年人死亡的首要病因。我國(guó)相對(duì)而言,冠心病的發(fā)病率較低,但卻呈逐年上升的趨勢(shì)。目前冠心病的治療方法主要有手術(shù)干預(yù)和藥物治療兩大類。針對(duì)局部心肌缺血情況,已經(jīng)開展了多種促血管生長(zhǎng)因子的基因治療研究;針對(duì)局部心肌組織壞死,也開展了干細(xì)胞局部注射的替代療法。研究表明,將從骨髓獲得的單個(gè)核細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞注射到心肌缺血的局部及周邊,可以改善心臟的功能。但干細(xì)胞替代治療面臨的一個(gè)主要問題是移植的干細(xì)胞在局部組織的存活率問題。研究表明,移植到局部損傷組織的干細(xì)胞,90%以上因環(huán)境不適而死亡,難以達(dá)到預(yù)期的治療效果。選擇合適的基因?qū)Ω杉?xì)胞進(jìn)行修飾,提高細(xì)胞的移植存活率將可能提高治療效果。如用癌基因akt修飾能明顯提高間質(zhì)干細(xì)胞在心肌缺血部位的存活率,從而大大提高治療效果。將促血管生長(zhǎng)因子基因和干細(xì)胞結(jié)合起來,對(duì)心肌缺血同時(shí)進(jìn)行基因和細(xì)胞治療,目前還沒有這方面的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于心肌缺血治療的方法,即用攜帶肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor.HGF)基因的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymalstem cells,MSC)局部注射治療缺血性心臟病。該方法既可以改善心肌局部缺血(HGF具有明顯的促血管生成作用)、降低局部膠原沉積(HGF具有抗纖維化作用),又可以修復(fù)部分壞死的心肌細(xì)胞(MSC具有向心肌細(xì)胞分化的能力)。同時(shí),HGF又是一個(gè)存活因子和趨化因子。其趨化作用可使修飾的干細(xì)胞因局部的HGF水平高而停留在損傷組織局部,而抗凋亡作用又可使細(xì)胞的移植存活率升高。因此,HGF基因修飾的MSC在心肌缺血的治療中具有明顯的優(yōu)勢(shì)。
具體實(shí)施方案如下1.分離和鑒定骨髓間質(zhì)干細(xì)胞,證明重組腺病毒可以有效的轉(zhuǎn)染骨髓間質(zhì)干細(xì)胞。
2.證明攜帶人干細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞可以整合到缺血心肌局部,并且能明顯改善心肌缺血和心臟的功能。


圖1 MSCs的肌源性分化。
5-aza處理MSCs 14天后免疫組化染色肌源性標(biāo)志α橫紋肌肌動(dòng)蛋白結(jié)果圖2通過Ad-GFP(攜帶綠色熒光蛋白基因的重組腺病毒)對(duì)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染測(cè)定腺病毒載體對(duì)間質(zhì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率。
圖3當(dāng)MOI=150pfu/cell時(shí),Ad-GFP對(duì)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染情況。
1.光鏡下的間充質(zhì)干細(xì)胞;2.同一視野下熒光顯微鏡的觀察結(jié)果圖4酶聯(lián)免疫(ELISA)方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染AD-HGF(MOI=150pfu/cell)后細(xì)胞培養(yǎng)上清HGF的表達(dá)水平。
圖5心肌缺血局部注射高表達(dá)HGF的MSCs(5×106)后28天大體心臟切片TTC染色結(jié)果。
圖6大鼠心肌注射MSCs、Ad-HGF和高表達(dá)HGF的MSCs后28天時(shí),缺血區(qū)的血管生成情況。
a.對(duì)照組(AD-GFP);b.注射Ad-HGF實(shí)驗(yàn)組;c.注射MSCs實(shí)驗(yàn)組;d.注射高表達(dá)HGF的MSCs實(shí)驗(yàn)組圖7原位雜交檢測(cè)注射的MSCs在局部缺血組織中的整合情況。
a.陽性對(duì)照組(雄性大鼠心肌組織);b.陰性對(duì)照組(雌性大鼠心肌組織);c.注射MSCs實(shí)驗(yàn)組圖8天狼猩紅染色法檢測(cè)治療后局部缺血組織的膠原沉積情況。
a.正常心肌組織;b.結(jié)扎未治療組(對(duì)照組);c.注射Ad-HGF治療組;d.注射高表達(dá)HGF的MSCs實(shí)驗(yàn)組表1 心肌缺血區(qū)大小和形態(tài)計(jì)量學(xué)測(cè)定結(jié)果。
表2 血液動(dòng)力學(xué)測(cè)定結(jié)果。
具體實(shí)施例方式(1)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)將大鼠脫臼致死,用75%的乙醇浸泡消毒,在無菌條件下分離股骨并剪去兩端,用PBS沖出骨髓,進(jìn)行Percoll(密度1.073)梯度密度離心,取中間單核細(xì)胞層,離心收集細(xì)胞,用DMEM-LG培養(yǎng)(Sigma)基洗細(xì)胞三次。將獲得的細(xì)胞用含10%血清(Hyclone)的DMEM-LG分瓶培養(yǎng),24h后洗去未貼壁的細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)直至出現(xiàn)細(xì)胞克隆(約10天)。將細(xì)胞克隆消化后分瓶培養(yǎng),記為第一代。本實(shí)驗(yàn)使用細(xì)胞為傳代培養(yǎng)的第3~5代細(xì)胞。
(2)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化將細(xì)胞接種于12孔培養(yǎng)板,培養(yǎng)48h后,加入10μmol/L的5-氮雜胞苷(5-aza,Sigma),繼續(xù)培養(yǎng),以后每周換液兩次,同時(shí)加入相同濃度的5-aza。14天時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行肌源性標(biāo)志檢測(cè),即免疫組化檢測(cè)α橫紋肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)??功翙M紋肌肌動(dòng)蛋白抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品。結(jié)果如圖1所示,5-aza處理后細(xì)胞表達(dá)α橫紋肌肌動(dòng)蛋白肌細(xì)胞標(biāo)志。
(3)腺病毒載體對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板,待細(xì)胞長(zhǎng)至80~90%匯合時(shí),進(jìn)行腺病毒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染之前將培養(yǎng)液吸出,用DMEM-LG洗細(xì)胞一次,加入不同MOI的Ad-GFP(攜帶綠色熒光蛋白基因的重組腺病毒,由美國(guó)百特醫(yī)療用品公司基因治療部(Gene Therapy Unit,Baxter HealthcareCompany,USA)惠贈(zèng)),MOI分別為0、50、100、150、200、400pfu(plaque forming unit)/細(xì)胞,以DMEM-LG為對(duì)照。1-2小時(shí)后吸出病毒液,同時(shí)加入完全培養(yǎng)基。48小時(shí)后在熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)情況,并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果表明腺病毒轉(zhuǎn)染MSC具有很高的效率,如圖2和圖3所示。
(4)Ad-HGF轉(zhuǎn)染MSC后HGF的表達(dá)用MOI=200pfu/細(xì)胞的Ad-HGF(攜帶人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因的重組腺病毒,由放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)血液學(xué)研究室構(gòu)建)轉(zhuǎn)染細(xì)胞,于不同時(shí)間收集培養(yǎng)上清,用ELISA方法檢測(cè)HGF的表達(dá)情況。培養(yǎng)上清和包被液(0.5mol/LNaHCO3緩沖液,pH 9.6)以1∶1的比例混勻,加入酶標(biāo)板,每孔100μl,4℃包被24h;倒掉包被液,用5%小牛血清的PBS封閉過夜;加入HGF抗體(R&D),100μl/孔,37孵育60min;棄去一抗,用含0.05%TWEEN-20的PBS洗去未結(jié)合的抗體,3×5min;加入二抗,每孔100μl,37℃孵育45min,清洗同上;用OPD-H2O2系統(tǒng)顯色,490nm波長(zhǎng)測(cè)定。結(jié)果MSC轉(zhuǎn)染Ad-HGF后,HGF的表達(dá)水平明顯升高,并可以持續(xù)14天以上。如圖4所示。
(5)大鼠心肌缺血模型的建立Wistar大鼠,二級(jí),雌性,體重350-400g(購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心),用1%戊巴比妥鈉溶液麻醉(30mg/kg);剪去左側(cè)胸部的毛,用碘伏消毒,再以75%的酒精脫碘;沿肋骨走向在左側(cè)第四肋間切開皮膚,鈍性分離胸大肌,先接上呼吸機(jī),再剪開胸膜,墊高大鼠背部;以手?jǐn)D壓其腹部暴露心臟;結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支。結(jié)扎之后分四組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(1)空白對(duì)照組;(2)心肌內(nèi)注射Ad-GFP 1×109pfu組;(3)心肌內(nèi)注射Ad-HGF 1×109pfu組;(4)心肌內(nèi)注射經(jīng)200pfu/細(xì)胞Ad-HGF轉(zhuǎn)染的MSCs5×106組。
(6)大鼠心肌缺血的治療效果在結(jié)扎后28天,用1%戊巴比妥鈉溶液麻醉大鼠(30mg/kg);剪去右側(cè)脛部的毛,用碘伏消毒,再以75%的酒精脫碘;切開皮膚,分離頸動(dòng)脈,插管進(jìn)行血液動(dòng)力學(xué)檢查。結(jié)果如表1所示,治療后大鼠的血液動(dòng)力學(xué)指標(biāo)得到了明顯改善。
隨后處死大鼠,取心臟,均勻切成0.5cm厚的薄片,用含1%TTC(Sigma)的PBS溶液在37染色20min,然后用4%甲醛溶液固定,缺血區(qū)不著色,非缺血區(qū)染成磚紅色,結(jié)果如圖5所示。將組織切片掃描成數(shù)字圖像,進(jìn)行軟件分析缺血區(qū)大小和左心室厚度等指標(biāo),結(jié)果如表2所示。制作石臘切片,進(jìn)行HE(蘇木素-伊紅)染色,觀察血管的分布密度。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組缺血區(qū)明顯較少,新生血管數(shù)量明顯增多。如圖6所示。
用原位雜交檢測(cè)性別決定基因sry的方法檢測(cè)注射MSCs在局部心肌組織的整合情況。結(jié)果如圖7所示,注射的雄性MSCs細(xì)胞在雌性心肌組織缺血局部發(fā)生了整合,分化成了心肌樣細(xì)胞,形態(tài)上與周圍的心肌細(xì)胞沒有明顯的差異。
同時(shí),對(duì)組織進(jìn)行了天狼猩紅染色,用偏振光顯微鏡觀察膠原及其膠原類型,結(jié)果顯示治療組組織中膠原薄且明顯減少,而對(duì)照組創(chuàng)傷組織中有豐富的大而粗的紅色I(xiàn)型膠原(見圖8),表明HGF有明顯的減少創(chuàng)傷組織中膠原形成的作用。
權(quán)利要求
1.促血管生長(zhǎng)基因修飾干細(xì)胞在心肌缺血治療中的應(yīng)用。
2.該方法的特征是用肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因?qū)撬栝g質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行修飾,然后局部注射治療心肌缺血。
全文摘要
用攜帶人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因的重組腺病毒轉(zhuǎn)染骨髓間質(zhì)干細(xì)胞,獲得高表達(dá)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的干細(xì)胞,局部注射治療心肌缺血,既可以改善局部缺血癥狀、降低膠原沉積,又可以修復(fù)部分壞死的心肌細(xì)胞,具有明顯的治療效果。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1657101SQ20041000439
公開日2005年8月24日 申請(qǐng)日期2004年2月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月19日
發(fā)明者段海峰, 王立生, 吳祖澤, 吳丹莉, 劉紅軍, 張群偉, 王 華, 魯茁壯, 賈向旭, 哈小琴 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所
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