專利名稱：紅厚殼內(nèi)酯e2的制備方法及其在制備抗sars的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及紅厚殼內(nèi)酯E2(calanolide E2)的制備方法及其在制備抗SARS的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有的紅厚殼內(nèi)酯E2(calanolide E2)的制備方法存在以下缺點a.紅厚殼內(nèi)酯E2(calanolide E2)在植物果中的含量不太高，生產(chǎn)成本較高；b.制備方法需要有機溶劑量較大，可能造成環(huán)境污染。
本發(fā)明的發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，紅厚殼內(nèi)酯E2(calanolide E2)在滇南紅厚殼(Calophyllum polyanthum Wall.et Choisy)果中的含量較高，達到0.11％。滇南紅厚殼植物容易栽培，5-6年結(jié)果，15年單株產(chǎn)果20-30公斤，20-50年為盛果期，單株產(chǎn)果100-200公斤，原料有保證；不破壞資源，可持續(xù)利用。所以，研究開發(fā)從滇南紅厚殼果中分離提取其中的紅厚殼內(nèi)酯E2，并開發(fā)出其藥用價值具有重大的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種從滇南紅厚殼果中分離提取紅厚殼內(nèi)酯E2的方法，它包括以下步驟(1)取滇南紅厚殼(Calophyllum polyanthum Wall.et Choisy)果陰干，粉碎成粉；(2)取粉碎的粗粉，用約6倍量(重量)的95％乙醇在室溫浸泡多次，每次72小時；(3)過濾，合并濾液，減壓回收溶劑得乙醇浸膏；(4)取240g浸膏，以適量甲醇溶解后，吸附于100-150目硅膠，室溫揮發(fā)至干，經(jīng)硅膠柱層析(1500g，200-300目)，用乙酸乙酯-石油醚(0∶10-1∶1V/V)梯度洗脫石油醚洗脫5000mL，檢查出有少量的目標化合物，合并為第一流份；乙酸乙酯-石油醚(2∶8)洗脫10000mL，每250ml為一流份，第2至第17流份有目標化合物，隨后用乙酸乙酯-石油醚(3∶7)洗脫10000mL，每250ml為一流份，共得42個流份，其中第1-17流份合并為A1組分(4.5克)；(5)A1組分(4.5克)在乙酸乙酯(20mL)中重結(jié)晶，析出1.9g黃色結(jié)晶狀化合物紅厚殼內(nèi)酯E2(calanolide E2)，得率0.11％。
上述方法中使用的溶劑均為目前制藥工業(yè)常用的試劑，避免了環(huán)境污染。
本發(fā)明還提供了紅厚殼內(nèi)酯E2在制備抗SARS病毒的藥物中的應(yīng)用。
在上述的應(yīng)用中，所述的藥物是人體可接受的劑型，其中含有抗SARS病毒有效量的紅厚殼內(nèi)酯E2。
與現(xiàn)有的中成藥復(fù)方相比，紅厚殼內(nèi)酯E2(calanolide E2)不是一個對癥(如退熱、止咳等)治療藥物，而是一個對SARS病毒有直接抑制作用的治療藥物。


圖1中的圖片顯示了光學(xué)顯微鏡下觀察的VERO細胞形態(tài)。
圖2是紅厚殼內(nèi)酯E2對SARS病毒細胞病變抑制作用的劑量曲線。
圖3是紅厚殼內(nèi)酯E2對HepG2和VeroE6細胞的毒性實驗曲線。
具體實施例方式
下面的實施例將對本發(fā)明作進一步的解釋，但是本發(fā)明并不僅僅局限于這些實施例，這些實施例不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在權(quán)利要求的范圍內(nèi)所做出的某些改變和調(diào)整也應(yīng)認為屬于本實施例1 從滇南紅厚殼果中分離提取紅厚殼內(nèi)酯E2(1)取滇南紅厚殼(Calophyllum polyanthum Wall.et Choisy)果陰干，粉碎成粉；
(2)取粉碎的粗粉6.1kg，用40kg 95％乙醇在室溫浸泡3次，每次72小時；(3)過濾，合并濾液，減壓回收溶劑，得乙醇浸膏890g；(4)取240g浸膏，以適量甲醇溶解后，吸附于100-150目硅膠，室溫揮發(fā)至干，經(jīng)硅膠柱層析(1500g，200-300目)，用乙酸乙酯-石油醚(0∶10-1∶1 V/V)梯度洗脫石油醚洗脫5000mL，檢查出有少量的目標化合物，合并為第一流份；乙酸乙酯-石油醚(2∶8)洗脫10000mL，每250ml為一流份，第2至第17流份有目標化合物，隨后用乙酸乙酯-石油醚(3∶7)洗脫10000mL，每250ml為一流份，共得42個流份，其中第1-17流份合并為A1組分(4.5克)；(5)A1組分(4.5克)在乙酸乙酯(20mL)中重結(jié)晶，析出1.9g黃色結(jié)晶狀化合物紅厚殼內(nèi)酯E2(calanolide E2)，得率0.11％。
實施例2 紅厚殼內(nèi)酯E2的結(jié)構(gòu)鑒定實驗條件紅外光譜(IR)用Bio-Rad FTS-135型分光光度計測定，KBr壓片。電子轟擊質(zhì)譜(EI-MS)用Auto SPEC 3000型質(zhì)譜儀測定，采用20ev的轟擊電離源。[α]D用Jasco DIP-370旋光儀測定，甲醇作溶劑。核磁共振譜(NMR)用Bruker WH-400超導(dǎo)核磁共振儀測定，四甲基硅(TMS)作內(nèi)標，氘代氯仿(CDCl3)作溶劑。青島海洋化工廠出品的200-300目硅膠，以及日本三菱化成公出品的MCI CHP-20P、RP-18作為柱層析材料；薄層層析用青島海洋化工廠出品的硅膠板指導(dǎo)分離。展開劑A乙酸乙酯-石油醚(3∶7，v/v)；B丙酮-石油醚(2∶8)；C水-甲醇(2∶98)。顯色劑A、I2；B、5％H2SO4-乙醇。
結(jié)構(gòu)鑒定按照常規(guī)操作方法，使用上述的實驗條件鑒定實施例1中制備的紅厚殼內(nèi)酯E2的結(jié)構(gòu)，得到的結(jié)果如下。
紅厚殼內(nèi)酯E2黃色，[α]D26＝+78.90°(CHCl3，c0.58)；IRvmaxcm-13500-2500(OH)，1704(C＝O)，1650(C＝C)，1624，1579，1446，1299，1193，1166，1146，1125。EI-MS(20ev)m/z388[M+](47)，374(54)，373[M-Me]+(100)，345[373-CO]+(8)，329(13)，301[329-CO]+(6)，285(1)，268(7)，257(6)，149(28)，91。1HNMR(CDCl3，400MHz) δ0.83(3H，t，J＝8Hz，H-15)，1.13(2H，m，H-14)，1.17(3H，d，J＝7Hz，H-19)，1.37(3H，s，H-16)，1.42(3H，s，H-17)，1.43(3H，d，J＝7Hz，H-18)，1.51(1H，m，H-13)，1.78(1H，m，H-13)，2.49(1H，dq，J＝6，11Hz，H-11)，2.68(1H，br.d，J＝8Hz，H-3)，2.79(1H，br.d，J＝8Hz，H-3)；3.66(1H，br m，H-4)，4.11(1H，dq，J＝6，11Hz，H-10)；5.43(1H，d，J＝10Hz，H-7)；6.57(1H，d，J＝10Hz，H-8)；12.45(s，8b-OH)。13CNMR(CDCl3，100MHz) δ179.0(s，C-2)，38.6(t，C-3)，30.5(d，C-4)，108.9(s，C-4a)，159.9(s，C-4b)，78.2(s，C-6)，125.6(d，C-7)，115.7(d，C-8)，102.6(s，C-8a)，159.9(s，C-8b)，78.8(d，C-10)，45.7(d，C-11)，199.3(s，C-12)，101.9(s，C-12a)，157.4(s，C-12b)，35.6(s，C-13)，20.8(t，C-14)，13.9(t，C-15)，28.4(q，C-16)，28.0(q，C-17)，19.5(q，C-18)，10.5(q，C-19)。
實施例3 紅厚殼內(nèi)酯E2的抗SARS病毒活性研究材料和方法細胞非洲綠猴腎傳代細胞(Vero)
病毒SARS病毒北京一號(BJ-01)試劑DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司產(chǎn)品)，鏈霉素，L-谷氨酰胺(美國Invitrogen公司)，新生胎牛血清(美國Hyclone公司)、Hepes，MTS(美國Promega公司)，PMS，青霉素(Sigma公司)，碳酸氫鈉(購自京科化學(xué)試劑公司進口分裝)。
細胞培養(yǎng)液及試劑配制DMEM培養(yǎng)液DMEM培養(yǎng)基中再添加10％(v/v)新生胎牛血清、3％(w/v)L-谷氨酰胺、1％(w/v)青霉素、1％(w/v)鏈霉素、7.5％(w/v)碳酸氫鈉，10mM Hepes；MTS/PMS染色液1)配制MTS溶液在錫紙包裹的50ml離心管中加入21ml DPBS(Dulbecco’s phosphate buffered saline)，然后加入42mgMTS粉末，充分溶解，并調(diào)節(jié)pH值到6.5左右，-20℃避光保存。2)配制PMS溶液在錫紙包好的15ml離心管中加入10ml DPBS，然后加入9mgPMS粉末，充分溶解，-20℃避光保存。3)配制MTS/PMS染色液取MTS溶液7ml，PMS溶液350ul充分混勻，備用。
試驗方法藥物對SARS病毒感染細胞病變的影響按4,000 VERO細胞/孔的密度接種96孔細胞培養(yǎng)板，每孔培養(yǎng)液100ul，37℃ 5％CO2孵育24小時，細胞融合成單層后加入紅厚殼內(nèi)酯E2，紅厚殼內(nèi)酯E2按照終濃度1、0.3、0.1、0.03、0.01、0.003、0.0003mg/L的濃度梯度加入，共7個濃度，每個濃度加2孔，隨后每孔加入2ulSARS-BJ-01病毒。設(shè)置MTS對照、細胞對照和病毒對照。37℃ 5％CO2培養(yǎng)96小時。期間，顯微鏡下觀察細胞病變，96小時后以MTS法檢測細胞存活狀況，即加入MTS/PMS染色液，每孔20ul，37℃下5％CO2孵育3小時，加50ul 10％SDS，紫外分光光度儀檢測O.D(490nm)。
實驗結(jié)果紅厚殼內(nèi)酯E2對SARS病毒感染的VERO細胞病變的影響如圖1所示。從圖1中的細胞形態(tài)可以看出，“病毒對照”在感染病毒48小時即可出現(xiàn)明顯細胞病變，細胞圓縮、裂解；而在加入紅厚殼內(nèi)酯E2的情況下，對SARS病毒對VERO細胞的攻擊有顯著的抑制作用；“細胞對照”生長良好。
MTS檢測紅厚殼內(nèi)酯E2對SARS病毒細胞病變抑制作用的劑量曲線如圖2所示。由圖2可見，紅厚殼內(nèi)酯E2抗SARS病毒活性隨濃度增加而增強，半數(shù)有效濃度EC50為7.721×10mg/L(即19uM)，半數(shù)有效濃度較低。
實施例4 細胞毒性試驗本實施例研究了紅厚殼內(nèi)酯對HepG2和VeroE6細胞的毒性。
試驗方法按4,000細胞/孔密度接種96孔細胞培養(yǎng)板，每孔加入培養(yǎng)液100ul，37℃ 5％CO2孵育細胞24小時后加入受試藥物。紅厚殼內(nèi)酯E2以細胞培養(yǎng)液稀釋后最終濃度分別為300、200、100、30、10、3、1、0.3、0.1、0.03、0.01mg/L，共11個濃度。每個濃度加2孔。設(shè)正常細胞對照，MTS對照。37℃ 5％CO2孵育細胞96小時后，顯微鏡下觀察細胞病變，加MTS/PMS，每孔20ul，37℃下5％CO2孵育3小時，加50ul 10％SDS，紫外分光光度儀檢測O.D(490nm)，以樣品讀數(shù)不小于細胞對照的90％作為無毒性指標。
實驗結(jié)果紅厚殼內(nèi)酯E2對HepG2和VeroE6細胞的毒性曲線如圖3所示。由圖3可見，紅厚殼內(nèi)酯E2的濃度在低于248mg/L時對VERO細胞無毒性，IC50為350.4mg/L。
權(quán)利要求
1.一種從滇南紅厚殼果中分離提取紅厚殼內(nèi)酯E2的方法，它包括以下步驟(1)取滇南紅厚殼(Calophyllum polyanthum Wall.et Choisy)果陰干，粉碎成粉；(2)取粉碎的粗粉，用約6倍量(重量)的95％乙醇在室溫浸泡多次，每次72小時；(3)過濾，合并濾液，減壓回收溶劑得乙醇浸膏；(4)取240g浸膏，以適量甲醇溶解后，吸附于100-150目硅膠，室溫揮發(fā)至干，經(jīng)硅膠柱層析(1500g，200-300目)，用乙酸乙酯-石油醚(0∶10-1∶1 V/V)梯度洗脫∶石油醚洗脫5000mL，檢查出有少量的目標化合物，合并為第一流份；乙酸乙酯-石油醚(2∶8)洗脫10000mL，每250ml為一流份，第2至第17流份有目標化合物，隨后用乙酸乙酯-石油醚(3∶7)洗脫10000mL，每250ml為一流份，共得42個流份，其中第1-17流份合并為A1組分(4.5克)；(5)A1組分(4.5克)在乙酸乙酯(20mL)中重結(jié)晶，析出1.9g黃色結(jié)晶狀化合物紅厚殼內(nèi)酯E2(calanolide E2)。
2.紅厚殼內(nèi)酯E2在制備抗SARS病毒的藥物中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物是人體可接受的劑型，并且其中含有抗SARS病毒有效量的紅厚殼內(nèi)酯E2。
全文摘要
本發(fā)明描述了紅厚殼內(nèi)酯E2所具有的抑制SARS病毒特性，及其在制備抗SARS病毒藥物中的應(yīng)用，同時提供了一種從滇南紅厚殼果中分離提取紅厚殼內(nèi)酯E2的方法。所述的藥物是人體可接受的劑型，并且其中含有抗SARS病毒有效量的紅厚殼內(nèi)酯E2。研究表明，紅厚殼內(nèi)酯E2對感染SARS病毒的VERO細胞進行保護的半數(shù)有效濃度EC50為7.721mg/L，紅厚殼內(nèi)酯E2在濃度低于248mg/L時對VERO細胞無毒性，其IC50為350.4mg/L。
文檔編號A61P31/00GK1563010SQ200410008528
公開日2005年1月12日 申請日期2004年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月25日
發(fā)明者陳紀軍, 談學(xué)海, 陳聰, 周俊, 汪建, 張雪梅 申請人:中國科學(xué)院昆明植物研究所, 北京華大基因研究中心, 上海華大天源生物科技有限公司