專利名稱：促進(jìn)神經(jīng)再生的中藥復(fù)方的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及促進(jìn)神經(jīng)再生的中藥復(fù)方。

背景技術(shù)：
在現(xiàn)代創(chuàng)傷外科中，周圍神經(jīng)損傷因其致殘率高，損傷后修復(fù)及再生較為困難。盡管目前周圍神經(jīng)修復(fù)技術(shù)已經(jīng)有了長遠(yuǎn)的進(jìn)步，但即使新鮮，清潔的周圍神經(jīng)斷裂傷，能及時運用顯微外科技術(shù)進(jìn)行修復(fù)，也往往不能完全再生，造成許多神經(jīng)傷患者的殘廢。因此，如何促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷后的再生，恢復(fù)其功能已日益成為研究的重點。
在促進(jìn)周圍神經(jīng)再生因子的研究中，報告最早、唯一闡明分子結(jié)構(gòu)的神經(jīng)細(xì)胞調(diào)節(jié)因子是神經(jīng)生長因子(NGF)。研究證實了其受體及生物效應(yīng)途徑，觀察到其促進(jìn)神經(jīng)軸突再生，髓鞘化及神經(jīng)元的保護(hù)作用。同時，研究較為集中的還有神經(jīng)節(jié)苷脂，堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)，分別被證明有不同程度的促神經(jīng)生長作用。但上述因子療效不確定，且目前以單因子的研究和應(yīng)用為主，價格昂貴，難以在臨床推廣應(yīng)用。
周圍神經(jīng)損傷后的修復(fù)與再生是多因子，多因素參與的生理過程(Berger-A，Uierner-R；Rokde-H，shen-EL，Diagnosis and Treatment of Opertpheral Nerve Injury，the integrated therapyconcept.Unfallcaitrurg.1999102(1)59-68)。周圍神經(jīng)再生所需的微環(huán)境應(yīng)是一個多因素共同參與的生物網(wǎng)絡(luò)，被稱之為多因素共濟環(huán)。因此，補充單一因子對神經(jīng)再生的作用非常有限。國外目前在臨床上研究與應(yīng)用的神經(jīng)生長因子及神經(jīng)管養(yǎng)因子的替代物與誘生劑等進(jìn)展緩慢，至今沒有一種可靠的促進(jìn)神經(jīng)再生的藥物。
祖國醫(yī)學(xué)的中藥復(fù)方是多因素復(fù)合，相輔相成的藥劑。探求與開發(fā)中草藥中單方與復(fù)方制劑，有可能提供更多，比例更接近神經(jīng)生理需求與生長活性因子的環(huán)境，可能在神經(jīng)再生的過程中的雪旺氏細(xì)胞活化、再生軸索生長、變性物質(zhì)吸收及促進(jìn)局部血液循環(huán)、增強免疫力等方面均起到作用。
周圍神經(jīng)損傷修復(fù)的傳統(tǒng)方劑包括 1.補陽還五湯，該方原載于清代王清任的《醫(yī)林改錯》。全方由黃芪，當(dāng)歸、赤芍、川芎、紅花、桃仁、地龍組成(許濟群主編.方劑學(xué)上海科學(xué)技術(shù)出版社，1990150)。具有補氣活血通經(jīng)的功效。
研究人員對補陽還五湯作用機制和對周圍神經(jīng)損傷修復(fù)與再生進(jìn)行了大量的的實驗研究和臨床研究。如認(rèn)為補陽還五湯有在神經(jīng)損傷后促進(jìn)軸漿運輸?shù)淖饔?石關(guān)桐等，補陽還五湯對鉗夾大鼠坐骨神經(jīng)軸漿運輸?shù)挠绊?中國骨傷.1996.9(1)3-4。并能夠早期改善微循環(huán)，促進(jìn)局部炎性水腫消退(石關(guān)桐等，補陽還五湯對周圍神經(jīng)損傷后腓腸肌及血粘度影響的實驗研究.中國中醫(yī)骨傷科雜志.1996.4(2)4-7)。證實補陽還五湯對神經(jīng)纖維再生、雪旺氏細(xì)胞活躍增殖，髓鞘形成及結(jié)構(gòu)完整有明顯促進(jìn)作用，對失神經(jīng)肌肉萎縮有改善作用(趙翠萍、王健智等加味補陽還五湯對周圍神經(jīng)再生的形態(tài)學(xué)實驗研究.中醫(yī)正骨.1993.5(2)6-8)?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，該方具有強心，增加腦血流量，改善循環(huán)的作用，并能促進(jìn)吞噬細(xì)胞的吞噬能力(許青媛，補陽還五湯對動物腦循環(huán)與血流變學(xué)影響的實驗研究.中成藥1990，325)，還可以促進(jìn)再生神經(jīng)中血管的生長，改善血供，促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)與再生(劉美玉等補陽還五湯對小鼠額葉皮質(zhì)后神經(jīng)元胞體形態(tài)影響的主要研究.昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報.1995.16(2)43)。
2、黃芪桂枝五物湯，該方系張仲景首創(chuàng)，由黃芪、白芍、桂枝、生姜、大棗組成，該方具有益氣和營，溫陽行痹的功效，是治療氣血阻滯，營衛(wèi)失和，筋脈失養(yǎng)的血痹癥主方。
目前認(rèn)為神經(jīng)損傷后，肢體感覺和運動功能障礙以及因神經(jīng)損傷后造成的神經(jīng)營養(yǎng)不良性改變多屬外傷后氣血阻滯，營衛(wèi)失和，與血痹的病機十分相似，該方可使血脈通，氣血充，營衛(wèi)和，活血強筋(聶小圃周圍神經(jīng)損傷從血痹論治湖北中醫(yī)雜志.1997.19(6)37)。以該方治療周圍神經(jīng)損傷，獲痊愈或功能得到明顯改善(隋秀芝中醫(yī)治愈周圍神經(jīng)損傷5例.山東醫(yī)藥2001.41(16)72；張?zhí)旖? 加味黃芪桂枝五物湯治療撓神經(jīng)損傷98例報告中醫(yī)正骨1994 6(2)18)。
盡管有上述促進(jìn)周圍神經(jīng)再生的中藥研究，但這些研究及結(jié)果總體上有以下幾個特點和缺點 1.各種復(fù)方的主要成分均為黃芪，說明比較公認(rèn)的對周圍神經(jīng)損傷有肯定療效的中藥是黃芪。
2.按中醫(yī)的理論，促進(jìn)周圍神經(jīng)再生主要原理是補血補氣、活血化淤、生肌通絡(luò)。并沒有具體描述對周圍神經(jīng)損傷的治療效果。
3.研究手段尚不夠科學(xué)。雖然研究中涉及組織學(xué)、電生理學(xué)及神經(jīng)功能學(xué)評價方法，但很多是間接的觀察。沒有以確有促進(jìn)神經(jīng)再生的物質(zhì)，如NGF(神經(jīng)生長因子)等作為對照。因此，較難充分證明各中藥復(fù)方的有效性。
4.以口服劑型為主，且配方中藥物種類較多；因為口服劑型是全身用藥，用量大、作用范圍廣，難免有副作用。
紅芪(Radix Hedysari)是豆科巖黃芪屬植物，與黃芪同科不同屬，主產(chǎn)于我國甘肅。目前已知的紅芪藥理作用主要有1)增強機體的免疫功能；2)促進(jìn)生長抗衰老；3)強心降壓；4)耐缺氧；5)抗菌抗病毒；6)生肌促進(jìn)傷口愈合。但尚未見到促進(jìn)周圍神經(jīng)再生的復(fù)方中藥制劑的臨床應(yīng)用。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是開發(fā)一種以中藥為活性成分的促進(jìn)神經(jīng)再生的藥物。
本研究與周圍神經(jīng)研究基礎(chǔ)相結(jié)合，從組織學(xué)、免疫組織化學(xué)及電生理學(xué)諸方面考察了紅芪及與其配伍的中藥復(fù)方的作用，為進(jìn)一步的臨床應(yīng)用及成藥開發(fā)提供科學(xué)的實驗依據(jù)，并進(jìn)一步驗證神經(jīng)再生的多因素共濟環(huán)假說。
本發(fā)明進(jìn)行了以下研究 1.篩選出對周圍神經(jīng)修復(fù)合理有效的復(fù)方； 2.研究復(fù)方制劑最優(yōu)的給藥方式或途徑，包括全身給藥，局部給藥； 3.在復(fù)方對促進(jìn)周圍神經(jīng)再生理論方面進(jìn)行更深入的研究，闡明復(fù)方的免疫調(diào)節(jié)機制。
本發(fā)明開發(fā)的促進(jìn)周圍神經(jīng)修復(fù)的中藥復(fù)方由如下重量份的原料藥制成紅芪6-16份、淫羊藿4-10份、地龍2-6份。
上述原料藥的優(yōu)選配比是紅芪8-14份、淫羊藿5-9份、地龍3-5份。
最佳配比是紅芪9-13份、淫羊藿6-8份份、地龍3-4份。
上述復(fù)方中君藥不變，還可以加入其它藥物，組合成多種組方，發(fā)揮不同程度的功效。
如上述復(fù)方中可另加入當(dāng)歸1-6份。
在有紅芪、淫羊藿、地龍和當(dāng)歸的復(fù)方中，還可以再加川芎1-6份和/或赤芍1-6份； 或者，有紅芪、淫羊藿、地龍和當(dāng)歸的復(fù)方中，再加紅花1-4份和/或桃仁1-4份。
還可以在紅芪、淫羊藿、地龍三種基本成份的基礎(chǔ)上，不用當(dāng)歸，另加下列藥物中的一種或幾種川芎1-6份、紅花1-4份、桃仁1-4份、赤芍1-6份。
或者，僅用紅芪一味藥的提取物。
本發(fā)明藥物可以采用中藥制劑的常規(guī)方法制備成任何常規(guī)的制劑，例如將原料藥物進(jìn)行水煎，或用醇或醇水混合物提取，然后濃縮水煎液或提取液，精制成為中藥提取物。將提取物與藥物可接受的各種載體、輔劑配伍，用本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)的制藥方法，制備成各種制劑。
本發(fā)明藥物的劑型可以是各種口服劑，如傳統(tǒng)的水煎劑、濃縮口服液、粉劑、顆粒劑、膠囊、片劑、沖劑等，也可以制成注射劑，如用于損傷局部注射或腹腔注射等。
從中醫(yī)理論講，紅芪具有益氣活血、托毒生肌之功；從西醫(yī)理論講，紅芪含紅芪多糖，能顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞活性，提高免疫功能，明顯降低血漿過氧化脂質(zhì)的含量，提升白球蛋自比值，促進(jìn)RNA合成，此外，紅芪尚能改善肺的攝氧功能。本發(fā)明人對單藥紅芪的提取物進(jìn)行了體外細(xì)胞培養(yǎng)實驗，證實其對雪旺氏細(xì)胞有較好的促生長作用。說明僅用紅芪一味單藥也有周圍神經(jīng)損傷后的修復(fù)與再生作用。
本發(fā)明配方的另幾種藥中，當(dāng)歸補血活血，赤勺清熱祛瘀，地龍通絡(luò)，川芎活血行氣，紅花、桃仁活血祛瘀，淫羊藿補腎壯陽。綜合起來，該復(fù)方制劑具有益氣、活血、通絡(luò)、補腎的功效。赤勺具有抑制血小板聚集，激活纖溶，抗血栓形成的作用；當(dāng)歸的有效成分之一阿魏酸能促進(jìn)吞噬細(xì)胞功能，抑制血栓形成，其另一有效成分免疫活性多糖能增強機體造血機能，顯著提高單核巨噬細(xì)胞的活性；地龍?zhí)崛∥锝笛獕?，地龍還含血栓溶解素，能直接催化纖溶蛋白酶類，抑制血栓形成；川芎亦含阿魏酸，具有改善微循環(huán)，降壓擴血管，抑制血小板聚集的功能；桃仁和紅花能擴張血管，且能抑制血栓形成；淫羊藿能擴張血管，抑制血小板聚集，促進(jìn)核酸、蛋白質(zhì)合成代謝，提高鈉泵活性，改善能量代謝。
在該方劑組成中，紅芪與紅花、桃仁、赤芍、當(dāng)歸、川芎具有相似的功效，都有補血活血，祛瘀止痛作用。因此，本發(fā)明以紅芪為主幾味藥物的不同組合，如紅芪、淫羊藿、地龍三味藥的組方等，均可以通過擴張損傷神經(jīng)外周及內(nèi)部的血管、抑制損傷后的局部血管血栓形成來改善損傷神經(jīng)的微循環(huán)，提高微動脈的血流量，增加損傷神經(jīng)血供；同時可以增強免疫功能，提高巨噬細(xì)胞活性，加快損傷神經(jīng)的變性壞死物質(zhì)的清除；以利于損傷神經(jīng)再生。
本發(fā)明采用坐骨神經(jīng)功能指數(shù)、神經(jīng)傳導(dǎo)速度、有髓神經(jīng)纖維計數(shù)作為藥效學(xué)實驗觀察指標(biāo)，神經(jīng)傳導(dǎo)速度綜合反映神經(jīng)干內(nèi)的感覺傳導(dǎo)速度和運動傳導(dǎo)速度的復(fù)合動作電位，在檢測神經(jīng)干外傷性損傷時，簡單快捷可行。有髓神經(jīng)纖維計數(shù)能直觀地反映神經(jīng)損傷后再生的有髓神經(jīng)纖維數(shù)，準(zhǔn)確地反映神經(jīng)再生情況。坐骨神經(jīng)功能指數(shù)是檢測大鼠坐骨神經(jīng)損傷后大體功能恢復(fù)的指標(biāo)，它能反映坐骨神經(jīng)損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的程度，相比前兩項指標(biāo)，它更具臨床意義。本實驗采用此三項指標(biāo)，從微觀到宏觀，比較全面地反映了各組大鼠坐骨神經(jīng)再生情況及其功能恢復(fù)程度，且具可比性，能較準(zhǔn)確地描述治療組和治療組、治療組和對照組結(jié)果之間的差異及其大小。實驗結(jié)果顯示，本發(fā)明藥物的各項指標(biāo)均優(yōu)于空白對照組。且光鏡下觀察組織切片，用藥組大鼠在神經(jīng)鉗夾后2周、4周和6周時，潰變髓鞘均明顯少于空白對照組。
本發(fā)明對以上所述的各種配方組合還進(jìn)行了其它藥理實驗，包括細(xì)胞毒性試驗、結(jié)合神經(jīng)再生室進(jìn)行中藥作用機制的研究、誘導(dǎo)人及動物骨髓造血組織干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)組織細(xì)胞。優(yōu)化已經(jīng)研制出的海洋生物套管，使之具有良好神經(jīng)組織相容性，適當(dāng)?shù)慕到馕罩芷?。將定向誘導(dǎo)分化的神經(jīng)組織細(xì)胞、本發(fā)明的中藥復(fù)方的有效組份與海洋生物套管共同構(gòu)建成神經(jīng)再生室。通過動物實驗驗證其對周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)作用。
以上實驗除包括本發(fā)明的各種配方組、單味紅芪提取液組，還另設(shè)有陽性藥物對照NGF組，以及不用藥物的空白對照組。
藥理研究發(fā)現(xiàn) 1.局部給予本發(fā)明的中藥復(fù)方和NGF的電生理功能的恢復(fù)均明顯好于對照組，且SFI運動功能指數(shù)的恢復(fù)方面，本發(fā)明的中藥復(fù)方組顯示了優(yōu)于NGF組的效果，說明這組復(fù)方制劑促進(jìn)周圍神經(jīng)再生的作用。
2.本發(fā)明的中藥復(fù)方提取液全身給藥對脊髓神經(jīng)元具有保護(hù)作用。
3.本發(fā)明的中藥復(fù)方具有促進(jìn)雪旺氏細(xì)胞的增殖、分化的功能，而且證明分化的細(xì)胞是藥物作用后新增生的細(xì)胞。
因此，可以認(rèn)為本發(fā)明的中藥復(fù)方提取液對周圍神經(jīng)的修復(fù)起著肯定的作用。其作用機制可能為在周圍神經(jīng)損傷后，充分發(fā)揮其擴張神經(jīng)外周及內(nèi)部血管、改善損傷神經(jīng)的微循環(huán)、提高微動脈的血流量，并能增強免疫功能，提高巨噬細(xì)胞的活性，促進(jìn)核酸、蛋白質(zhì)合成代謝，加快損傷神經(jīng)變性壞死物質(zhì)的清除，增加對神經(jīng)再生物質(zhì)的供給，促進(jìn)軸漿流的恢復(fù)，進(jìn)而防止神經(jīng)元的變性壞死及促進(jìn)其早期恢復(fù)。
因為紅芪多糖是紅芪的主要成份，本發(fā)明采用改進(jìn)的苯酚-濃硫酸法測定了本發(fā)明藥物提取液中紅芪多糖的含量。

具體實施例方式 實施例1 多組復(fù)方的配比 用紅芪單味藥，或以紅芪、淫羊藿、地龍作為復(fù)方中的君藥，另加入當(dāng)歸、川芎、紅花、桃仁、赤芍中的一種或幾種，組方見表1。
表1 各組復(fù)方原料藥成份配比配方原料藥名稱及用量(重量份)紅芪 淫羊藿地龍當(dāng)歸桃仁赤芍川芎紅花11 -------26 42-----39 23-----412 64-----516 86-----612 641----713 1044--1-811 6363---98 644-4-- 108443---3112724-66-121444-4--1131265-11-4141152--44- 實施例2 原料藥水煎提取 設(shè)備旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(含真空泵)，電熱煎藥器，冷凝管，茄形瓶等玻璃儀器。
紅芪購自原產(chǎn)地甘肅，其余藥材購于北京同仁堂藥店。
步驟 1.按配方稱取每種藥物，其中，將紅芪切鍘成約2cm的小段，碾壓后稱量。
2.將各配方組藥物置于圓底燒瓶內(nèi)，每組藥物各煎三遍，各以藥量的10倍，8倍，6倍水加入，第一遍煎煮兩小時，后兩遍各煎一小時，每遍煎出液過濾至容器內(nèi)，將煎出液通過旋蒸儀除水，然后以蒸餾水融為含生藥量2g/ml的液體，轉(zhuǎn)至無菌瓶內(nèi)冷凍保存。
實施例3 原料藥的乙醇提取 將各藥材用75％乙醇提取三次，然后通過旋蒸回收醇，所得液體以多糖為主，濃縮。
實施例4 中藥復(fù)方提取細(xì)胞毒性試驗 將提純的本發(fā)明的中藥復(fù)方提取液0.22μm濾網(wǎng)過濾，用含15％胎牛血清的PRMI1640培養(yǎng)(Gibco BRL，美國)倍比稀釋，分置24孔板中。對數(shù)生長期的SP2/0細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為106/ml，在含倍比稀釋的紅芪培養(yǎng)液的24孔板中分別加入10ul，37℃培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞生長狀況。
觀察3天后結(jié)果顯示復(fù)方紅芪提取液在1∶16000，1∶32000時(即NGF有效地作用劑量)均對雪旺氏細(xì)胞有促進(jìn)增生及分化的作用。說明可促進(jìn)雪旺氏細(xì)胞的增生。用藥安全。
實施例5 各組藥物提取液和NGF對SD大鼠坐骨神經(jīng)培養(yǎng)對比 各組配方提取液NGF按1∶16000稀釋，作為陽性參照，正常培養(yǎng)液作陰性對照。分別放入新鮮切取的SD大鼠坐骨神經(jīng)。37℃培養(yǎng)。平行樣3個。分別于培養(yǎng)后第48h、72h和96h取出坐骨神經(jīng)，-20℃冰箱保存。酪氨酸蛋白激酶測試系統(tǒng)美國Gibco公司產(chǎn)品(NO13154-018)。含底物液和不含RR-SRC的對照液。用前按100uCi/ml加[γ-32P]ATP(＞5000Ci/mmol)(北京亞輝生物醫(yī)學(xué)工程公司)、按試劑系統(tǒng)推薦配方配制抽提液。檢測前樣品制備參照試劑盒說明，每根神經(jīng)加抽提液200ul，玻璃勻漿品勻漿，冰上放置20min，12000g離心2min，考馬斯亮蘭法測蛋白濃度[7]。按蛋白濃度取樣，用抽提液稀釋至0.5mg/ml。分別加入底物液或?qū)φ找?0ul，冰上孵育10min后12000g離心10min(4℃)。吸取反應(yīng)液上清20ul，滴于已標(biāo)記的磷酸纖維素紙上，1％(v/v)乙酸與自來水各洗兩次，每次5min。加入液閃杯中檢測。樣本檢測采用Wallac 1410液體閃爍計數(shù)器(芬蘭)計數(shù)，每樣計數(shù)1min。
結(jié)果分析①每pmol磷的cpm按下公式計算10ul含32p底物(a)及對照(b)的cpm值/1200；②參入磷的肽pmol數(shù)按下公式計算樣品cpm值×2/①a-對照cpm值×2/①b；③激酶活性按下公式計算②/30。不同濃度及不同時間的樣品結(jié)果用多樣本比較的秩和檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。方差分析第48h各組方劑、NGF及對照間均值的差異。
實施例6 動物體內(nèi)藥效學(xué)實驗 模型及分組取SD雄性大鼠隨機分為兩組，一組以鉗夾法造成雙側(cè)坐骨神經(jīng)損傷，隨機分為服藥組與對照組，將體外篩選后的療效較好的方劑已低，中，高三種劑量隨機擇鼠灌服，對照組采用生理鹽水，另一組將大鼠雙側(cè)坐骨神經(jīng)切斷后斷端留取兩毫米間隙，采用我們自制的海洋生物套管套接縫合，用藥組局部給予方劑，對照組局部應(yīng)用NGF+神經(jīng)節(jié)苷脂。
觀察時間3d，1W，2w，3w，6w，9w。
早期觀察項目 1.SC增值形態(tài)，數(shù)量 2.再生新芽發(fā)出時間，走行 3.纖維通過套管的時間 4.髓鞘形成時間及層數(shù)(光鏡與電鏡) 5.各組神經(jīng)損傷處巨噬細(xì)胞聚集數(shù)量的變化 6.細(xì)胞內(nèi)亞微結(jié)構(gòu)的變化(DIC)。
晚期觀察項目 1.觀察神經(jīng)纖維再生數(shù)量 2.神經(jīng)傳導(dǎo)速度和活動電位 3.測量肌張力和肌肉干濕重量。
組織學(xué)染色方法固蘭髓鞘染色和HE染；SY-38生長圓錐染色；S-100雪旺氏細(xì)胞染色；SMI-31軸索染。
實施例7 復(fù)方藥物作用機制的研究 在進(jìn)行大鼠體內(nèi)實驗過程中，分別在局部或全身給藥前和給藥一段時間之后，取材或取血，檢測巨噬細(xì)胞數(shù)量和功能的變化，體內(nèi)MHC抗原的變化，來檢測中藥紅芪對大鼠免疫狀態(tài)的影響。
實施例8 對藥物誘導(dǎo)人及鼠造血組織干細(xì)胞向神經(jīng)組織細(xì)胞定向分化的觀察實驗 1.實驗?zāi)康? 研究本發(fā)明復(fù)方對神經(jīng)干細(xì)胞生長的影響，為開展人工神經(jīng)的研究作基礎(chǔ)。
2.方法 用不同方法分離及純化造血組織干細(xì)胞將不同方法分選的造血組織干細(xì)胞及骨髓基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行定向誘導(dǎo)分化在促神經(jīng)生長因子(EGF、FGF-2、PDGF)作用下，將以上細(xì)胞誘導(dǎo)分化成神經(jīng)組織細(xì)胞；利用單克隆抗體進(jìn)行鑒定，所用抗體包括抗神經(jīng)上皮干細(xì)胞蛋白(nestin)鑒別神經(jīng)干細(xì)胞，抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶鑒別神經(jīng)元細(xì)胞，抗S100鑒別雪旺氏細(xì)胞；對誘導(dǎo)出的神經(jīng)組織細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)電位測定。
3.結(jié)果 證明該復(fù)方可有效促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與分化，將有利于人工神經(jīng)的研究與應(yīng)用。
實施例9 中藥復(fù)方的有效成份與海洋生物套管共同構(gòu)建成神經(jīng)再生室研究 1.人工海洋生物管橋制備和性能優(yōu)化 材料的生物性能(動物體內(nèi)吸收時相及組織相容性)研究；材料與雪旺氏細(xì)胞相容性及抑制成纖維細(xì)胞生長特性的研究具體如下，無菌手術(shù)取出坐骨神經(jīng)，剪碎，用培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿中進(jìn)行體外雪旺氏細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)皿中墊放生物材料膜，并設(shè)置對照，分不同時期以倒置顯微鏡、光鏡切片、組織學(xué)及免疫組織化學(xué)染色、掃描電鏡等手段觀察雪旺氏細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的形態(tài)、活性和密度，進(jìn)行單位面積計數(shù)，并觀察雪旺氏細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)及功能活性。
2.將誘導(dǎo)分化出的神經(jīng)組織細(xì)胞懸液或干細(xì)胞和本發(fā)明的中藥復(fù)方有效成分接種在本課題研制出的海洋生物材料支架上，然后將二者一同加入轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器中，使細(xì)胞與材料均勻的結(jié)合，構(gòu)建神經(jīng)再生室，進(jìn)行大鼠坐骨神經(jīng)修復(fù)試驗。
①實驗動物隨機分成兩大組，第一組進(jìn)一步分為A組取大鼠左腿坐骨神經(jīng)行外膜原位縫合；B組取大鼠右腿坐骨神經(jīng)行套管小間隙原位套接。第二組進(jìn)一步分為C組取大鼠左腿坐骨神經(jīng)行外膜旋轉(zhuǎn)180度縫合；D組取大鼠右腿坐骨神經(jīng)行套管小間隙遠(yuǎn)側(cè)斷端旋轉(zhuǎn)180度套接。另取一小組大鼠作為正常神經(jīng)對照。②實驗方法SD大鼠用2.5％戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔注射麻醉后，由股外側(cè)肌間隙進(jìn)入暴露雙側(cè)坐骨神經(jīng)，在坐骨結(jié)節(jié)下方1.0cm處銳性切斷坐骨神經(jīng)，然后依據(jù)各組進(jìn)行相應(yīng)處理。③實驗各組動物預(yù)先行骨髓穿刺，分離骨髓基質(zhì)細(xì)胞及造血組織干細(xì)胞并定向培養(yǎng)成神經(jīng)組織細(xì)胞，實驗組個體的神經(jīng)組織細(xì)胞用于生物組織管橋制備，其余各組神經(jīng)組織細(xì)胞用于體外活性實驗觀察；④分別在術(shù)后第一、二、三、四周，每次從第一組和第二組隨機取大鼠，取材后行手術(shù)顯微鏡下觀察，光鏡下有髓神經(jīng)纖維計數(shù)，鋨酸染色組織學(xué)切片觀察，電生理學(xué)檢查及功能檢查(坐骨神經(jīng)功能指數(shù))。
以上實施例1～9的實驗結(jié)果顯示 1.局部給予本發(fā)明的中藥復(fù)方和NGF的電生理功能的恢復(fù)均明顯好于對照組，且SFI運動功能指數(shù)的恢復(fù)方面，本發(fā)明的中藥復(fù)方組顯示了優(yōu)于NGF組的效果，充分說明了這組復(fù)方制劑促進(jìn)周圍神經(jīng)再生的作用。
2.本發(fā)明的中藥復(fù)方提取液全身給藥對脊髓神經(jīng)元具有保護(hù)作用。在該制劑作用機制的研究方面證實其具有促進(jìn)神經(jīng)再生過程中發(fā)揮重要作用的雪旺氏細(xì)胞的增殖、分化的功能。同時證明分化的細(xì)胞是藥物作用后新增生的細(xì)胞。因此，可以認(rèn)為本發(fā)明的中藥復(fù)方提取液對周圍神經(jīng)的修復(fù)起著肯定的作用。其作用機制可能為在周圍神經(jīng)損傷后，充分發(fā)揮其擴張神經(jīng)外周及內(nèi)部血管、改善損傷神經(jīng)的微循環(huán)、提高微動脈的血流量，并能增強免疫功能，提高巨噬細(xì)胞的活性，促進(jìn)核酸、蛋白質(zhì)合成代謝，加快損傷神經(jīng)變性壞死物質(zhì)的清除，增加對神經(jīng)再生物質(zhì)的供給，促進(jìn)軸漿流的恢復(fù)，進(jìn)而防止神經(jīng)元的變性壞死及促進(jìn)其早期恢復(fù)。
實施例10 本發(fā)明的中藥復(fù)方提取液對周圍神經(jīng)再生促進(jìn)作用觀察(一) 本實驗用鉗夾大鼠的坐骨神經(jīng)的方法作成周圍神經(jīng)損傷的模型，以本發(fā)明的中藥復(fù)方提取液作為治療藥物與神經(jīng)生長因子及空白組作為對照，通過對坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)，神經(jīng)傳導(dǎo)速度，再生髓鞘計數(shù)的測量來探明本發(fā)明的中藥復(fù)方提取液是否對周圍神經(jīng)再生有促進(jìn)作用。
1.實驗方法 實驗動物與分組實驗采用40只成年健康的SD雄性大鼠，由北京醫(yī)科大學(xué)動物實驗部提供，體重250g左右，隨機分成4組，每組10只大鼠。各組編號為N、Q、S、B。
2.實驗藥物 1)含紅芪50份、當(dāng)歸10份、赤芍8份、地龍5份、川芎5份、紅花5份、桃仁5份、淫羊藿15份，濃縮為1.125g/ml。
2)含紅芪、淫羊藿、地龍，濃縮為0.774g/ml。
3)補陽還五湯成分含黃芪、當(dāng)歸、赤芍、川芎、桃仁、紅花、地龍，濃縮為2.6g/ml。
3.實驗方法及觀察指標(biāo) SD大鼠用2.5％戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔注射麻醉后，由股外側(cè)肌間隙進(jìn)入暴露雙側(cè)坐骨神經(jīng)，在坐骨結(jié)節(jié)下方1.0cm處以無齒鉗鉗夾坐骨神經(jīng)(3齒30秒種)造成寬2mm損傷區(qū)，此種方法經(jīng)組織學(xué)證實能夠使神經(jīng)外膜完整情況下，軸索全部斷裂。然后關(guān)閉切口。Q組實驗藥物1)提取液灌藥劑量為2ml/只/天，S組實驗藥物2)灌藥劑量2ml/只/天；B組實驗藥物3)補陽還五湯，灌藥劑量2ml/只/天；N組生理鹽水灌藥劑量2ml/只/天；每天一次。術(shù)中麻醉死亡3只(S組1只，Q組2只)。每組中，5只于2周時(灌藥為每天一次，共14天)，5只于4周時(每天灌藥一次，共28天)，取出雙側(cè)坐骨神經(jīng)行組織學(xué)觀察，每組大鼠術(shù)前與2、4周取材前行坐骨神經(jīng)功能指數(shù)測定，每組大鼠2周與4周取材前取雙側(cè)坐骨神經(jīng)行神經(jīng)傳導(dǎo)速度測定。
觀察指標(biāo)坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)、神經(jīng)傳導(dǎo)速度、組織形態(tài)學(xué)及有髓神經(jīng)纖維計數(shù)。
SFI測定自制大鼠足印行走箱，高15cm，寬15cm，長50cm，通道遠(yuǎn)端放置一長20cm，寬15cm，高15cm單側(cè)開門的鼠箱。行走箱底放置與行走箱等長、等寬的白紙。在培養(yǎng)皿內(nèi)放入少許棉花，倒入適量碳素墨水使棉花浸濕，將大鼠后足在培養(yǎng)皿內(nèi)蘸一下，放入行走箱的一端，其自行走向箱的另一端，在此過程中，標(biāo)記紙上留下大鼠雙側(cè)后足印各4-5個。各組10只大鼠鉗夾術(shù)前于標(biāo)記紙上留下后足印，鉗夾術(shù)后2、4周再于標(biāo)記紙上留下后足印，均取雙側(cè)足印，前者為正常組(N)，后者為實驗組(E)。各測量3個變量，測量精確到毫米。
足印長度(print length factor，PLF)足印的最長距離，即從足跟到足尖，每次選用最長的PLF值。
足距寬度(toe spread factor，TSF)第1-5趾連線距離，每次選用最長的TSF值。
中間足趾距離(intermediary toe spread，ITF)第2-4趾連線距離，每次選用最長的TSF值。
將上述3個變量代入Bain公式便可計算出SFI. SFI＝-38.3(EPL-NPL/NPL)+109.5(ETS-NTS/NTS)+13.3(EIT-NIT/NIT)-8.8 EPL實驗組足印長度；NPL正常組足印長度；ETS實驗組足距寬度；NTS正常組足距寬度；EIT實驗組中間足趾距離；NIT正常組中間足趾距離。
SFI以±10為正常值，-100為神經(jīng)完全離斷的指標(biāo)。
神經(jīng)傳導(dǎo)速度(NCV)行SFI檢測后，按原徑路暴露雙側(cè)坐骨神經(jīng)，在鉗夾損傷處兩側(cè)約1.5cm處放置電極，中樞端為刺激電極，外周端為引導(dǎo)電極，用Oxford肌電圖儀測量神經(jīng)傳導(dǎo)速度。公式速度＝兩電極間距離/動作電位潛時的差值 組織學(xué)檢查 取材及染色各組大鼠分別于鉗夾術(shù)2周，4周后原手術(shù)徑路暴露坐骨神經(jīng)，取出鉗夾處以遠(yuǎn)0.5cm的神經(jīng)節(jié)段，置入10％福爾馬林，固定24小時后，行鋨酸染色。
鋨酸染色 1％鋨酸后固定及染色72小時 流水沖洗10分鐘后，蒸餾水浸泡10分鐘共3次 脫水酒精50％→70％→75％→80％→85％→90％→95％→100％(1次)，→100％(2次)各15分鐘→二甲苯(1次)→二甲苯(2次)各15分鐘 浸蠟60分鐘→30分鐘→30分鐘→15分鐘 包埋 切片3-5微米的神經(jīng)橫斷切片 烤片38℃12-24小時 二甲苯5分鐘2次 封片 鏡檢每個標(biāo)本選1-2張切片，鋨酸染色的切片在觀察各組切片髓鞘的染色及形態(tài)數(shù)量差異的基礎(chǔ)上，作腓總神經(jīng)有髓神經(jīng)纖維計數(shù)研究。
有髓神經(jīng)纖維計數(shù)實驗各組及對照組共75張切片，在光學(xué)顯微鏡放大400倍(10*40)的視野下，每張切片測量腓總神經(jīng)各個視區(qū)的有髓神經(jīng)纖維數(shù)，取均值。行統(tǒng)計學(xué)分析。
4.實驗結(jié)果 1)坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)X+SD 組別術(shù)后2周 術(shù)后4周 空白對照組 -50.3405±20.5918-22.1106±10.3532 S組 -32.9944±20.0971-11.9985±5.4533 Q組 -27.4385±13.5411-16.8660±8.6201 B組 -58.3396±12.3949-21.1303±7.0933 其中2周時N組3只5側(cè)，Q組3只5側(cè)，B組2只3側(cè)因不同程度的足趾潰瘍及攣縮未測出。補陽還五湯組和實驗藥物2)組與對照組無顯著差異(分別為P＝0.086＞0.05；P＝0.530＞0.05)；但補陽還五湯組和實驗藥物2)組有顯著差異，且實驗藥物2)組優(yōu)于補陽還五湯組，(P＝0.01＜0.05)，實驗藥物1)組與對照組比差異有顯著性意義，且優(yōu)于對照組(P＝0.046＞0.05)，實驗藥物1)組也優(yōu)于補陽還五湯組，且差異有顯著性(P＝0.002＜0.010)。4周時N組1只1側(cè)，S組2只2側(cè)，B組1只2側(cè)因不同程度的足趾潰瘍及攣縮未測出，實驗藥物1)組和補陽還五湯組與對照組差別無意義(分別為P＝0.827＞0.05，P＝0.246＞0.05)，實驗藥物2)組與對照組差別有顯著意義，且優(yōu)于對照組(P＝0.048＜0.05)，同時優(yōu)于實驗藥物1)組，且差別有意義(P＝0.023＜0.05)，但與補陽還五湯組差別無意義。
2)神經(jīng)傳導(dǎo)速度(NCV)(m/s)X+SD 術(shù)后時間 組別 2周 4周 N組17.0000±14.485526.2900±11.3439 S組20.5100±8.1175 40.7857±14.4462 B組22.5700±16.203739.1516±10.1192 Q組27.7540±3.9825 40.4375±13.9800 2周時Q組有四只四側(cè)，B組有2只2側(cè)，N組3只5側(cè)，未能測出，實驗藥物1)組、實驗藥物2)組、補陽還五湯組與對照組比均優(yōu)于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。4周時S組1只1側(cè)，B組1只1側(cè)，Q組1只2側(cè)未能測出，其中實驗藥物1)組、實驗藥物2)組、補陽還五湯組與對照組比均優(yōu)于對照組，且差異具有顯著意義(分別為P＝0.005＜0.01，P＝0.02＜0.05，P＝0.003＜0.05)，而三組用藥組間差別無顯著意義。
組織學(xué)觀察 光鏡下形態(tài)學(xué)觀察鋨酸染色切片，2周時，已開始出現(xiàn)再生有髓神經(jīng)纖維，較細(xì)，壁薄，用藥各組再生有髓神經(jīng)纖維明顯多于對照組，且部分變性髓鞘已崩解吸收，空白組仍有較多變性髓鞘，再生有髓神經(jīng)纖維較少。4周時，再生有髓神經(jīng)纖維明顯增多，用藥各組再生有髓神經(jīng)纖維明顯多于空白組，且變性髓鞘已基本崩解消失，而空白組仍有較多變性髓鞘。
3)單位視野有髓神經(jīng)纖維計數(shù)(條)X+SD 組別 術(shù)后2周 術(shù)后4周 N組11.3±1.0619.0±2.50 S組17.3±1.9929.0±3.67 B組17.6±2.8523.5±2.31 Q組17.6±3.8722.9±2.94 2周時用藥各組均明顯好于對照組，(p＝0.001＜0.01)，但各用藥組間差異無意義，4周時用藥各組均明顯好于對照組(p＜0.05)，且實驗藥物2)組明顯好于全方組及補陽還五湯組(p＝0.002＜0.01，p＝0.004＜0.01)。而全方組與補陽還五湯組間差異無意義。
實施例11本發(fā)明的中藥復(fù)方提取液對周圍神經(jīng)再生促進(jìn)作用觀察(二) 1.實驗動物與分組實驗采用30只成年健康的SD雄性大鼠，由北京醫(yī)科大學(xué)動物實驗部提供，體重250g左右，隨機分成3組，每組10只大鼠。
2.實驗藥物 1)實施例1中配方紅芪60份、淫羊藿20份、地龍6份，當(dāng)歸15份，赤芍10份，每劑提取液濃縮為0.963g/mL。(請改寫) 2)含紅芪70份、淫羊藿25份、地龍5份(寫出配比關(guān)系)。每劑濃縮為濃縮為0.774g/mL。
3.實驗方法及觀察指標(biāo) SD大鼠用2.5％戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔注射麻醉后，由股外側(cè)肌間隙進(jìn)入暴露雙側(cè)坐骨神經(jīng)，于雙側(cè)股后作小切口暴露坐骨神經(jīng)直至遠(yuǎn)端脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)分叉上5mm處，用頭部為2mm寬的無齒鉗子鉗夾神經(jīng)，鉗夾強度統(tǒng)一咬合3齒，持續(xù)時間為1分鐘。術(shù)后第二日起S組與Q組分別按每次5ml/kg每日灌藥一次，對照組每日灌服生理鹽水5ml/kg。術(shù)后3組在同一條件下分籠飼養(yǎng)6周。
全部于6周時(每天灌藥一次，共灌藥42天)取出雙側(cè)坐骨神經(jīng)行組織學(xué)觀察，每組大鼠術(shù)前與6周取材前行坐骨神經(jīng)功能指數(shù)測定。
觀察指標(biāo)坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)、組織形態(tài)學(xué)及有髓神經(jīng)纖維計數(shù)。
一般狀態(tài)包括食欲、精神狀態(tài)、攻擊性、局部感染率及死亡率。
SFI測定自制大鼠足印行走箱，高15cm，寬15cm，長50cm，通道遠(yuǎn)端放置一長20cm，寬15cm，高15cm單側(cè)開門的鼠箱。行走箱底放置與行走箱等長、等寬的白紙。在培養(yǎng)皿內(nèi)放入少許棉花，倒入適量碳素墨水使棉花浸濕，將大鼠后足在培養(yǎng)皿內(nèi)蘸一下，放入行走箱的一端，其自行走向箱的另一端，在此過程中，標(biāo)記紙上留下大鼠雙側(cè)后足印各4-5個。各組10只大鼠鉗夾術(shù)前于標(biāo)記紙上留下后足印，鉗夾術(shù)后6周再于標(biāo)記紙上留下后足印，均取雙側(cè)足印，前者為正常組(N)，后者為實驗組(E)。各測量3個變量，測量精確到毫米。
足印長度(print length factor，PLF)足印的最長距離，即從足跟到足尖，每次選用最長的PLF值。
足距寬度(toe spread factor，TSF)第1-5趾連線距離，每次選用最長的TSF值。
中間足趾距離(intermediary toe spread，ITF)第2-4趾連線距離，每次選用最長的TSF值。將上述3個變量代入Bain公式便可計算出SFI。
SFI＝-38.3(EPL-NPL/NPL)+109.5(ETS-NTS/NTS)+13.3(EIT-NIT/NIT)-8.8 EPL實驗組足印長度；NPL正常組足印長度；ETS實驗組足距寬度；NTS正常組足距寬度；EIT實驗組中間足趾距離；NIT正常組中間足趾距離。
SFI以±10為正常值，-100為神經(jīng)完全離斷的指標(biāo)。
組織學(xué)檢查 取材及染色各組大鼠分別于鉗夾術(shù)6周后原手術(shù)徑路暴露坐骨神經(jīng)，取出鉗夾處以遠(yuǎn)0.5cm的神經(jīng)節(jié)段，置入10％福爾馬林，固定24小時后，行鋨酸染色。
鋨酸染色 1％鋨酸后固定及染色72小時 流水沖洗10分鐘后，蒸餾水浸泡10分鐘共3次 脫水酒精50％→70％→75％→80％→85％→90％→95％→100％(1次)，→100％(2次)各15分鐘→二甲苯(1次)→二甲苯(2次)各15分鐘 浸蠟60分鐘→30分鐘→30分鐘→15分鐘 包埋 切片3-5微米的神經(jīng)橫斷切片 烤片38℃12-24小時 二甲苯5分鐘2次 封片 鏡檢每個標(biāo)本選1-2張切片，鋨酸染色的切片在觀察各組切片髓鞘的染色及形態(tài)數(shù)量差異的基礎(chǔ)上，作腓總神經(jīng)有髓神經(jīng)纖維計數(shù)研究。
有髓神經(jīng)纖維計數(shù)實驗各組及對照組共75張切片，在光學(xué)顯微鏡放大400倍(10*40)的視野下，如圖所示，每張切片測量腓總神經(jīng)各個視區(qū)的有髓神經(jīng)纖維數(shù)，取均值。行統(tǒng)計學(xué)分析。
4.實驗結(jié)果 1)一般狀態(tài)除術(shù)中麻醉死亡6只(Q組3只，S組2只，N組1只)外，術(shù)后各組大鼠均無明顯異常行為。術(shù)后24 h起睡眠及食欲無明顯變化，無1例出現(xiàn)傷口感染或死亡。給藥組大鼠的雙側(cè)坐骨神經(jīng)表面普遍比對照組光滑，容易從組織中分離和顯露，外膜血管豐富。
2)坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)+SD組別術(shù)后時間(6周)N-25.1729±15.3830Q-30.2700±10.8001S-19.1105±9.1048 結(jié)果顯示實驗藥物1)組和實驗藥物2)組與對照組無顯著差異(分別為P＝0.262，＞0.05；P＝0.479＞0.05)。而實驗藥物1)組與實驗藥物2)組比差異有顯著性意義，且實驗藥物2)組優(yōu)于實驗藥物1)組(P＝0.03，＜0.05)。
3)組織學(xué)觀察 光鏡下形態(tài)學(xué)觀察 鋨酸染色切片，6周時，再生有髓神經(jīng)纖維明顯增多，中藥組及NGF組再生有髓神經(jīng)纖維多于空白組，中藥組變性髓鞘已基本崩解消失，空白組仍有較多變性髓鞘。提示，本發(fā)明的中藥復(fù)方提取液能夠促進(jìn)有髓神經(jīng)纖維的再生和變性髓鞘的分解吸收。
4)單位視野有髓神經(jīng)纖維計數(shù)(條)+SD組別術(shù)后時間(6周)N75.77±14.36Q112.33±17.99S109.26±15.73 本發(fā)明的中藥復(fù)方組平均單位視野有髓神經(jīng)纖維數(shù)為112.33±17.99優(yōu)于對照組75.77±14.36且統(tǒng)計學(xué)有明顯差異(P＝0.000，＜0.01)。實驗藥物2)組109.26±15.73明顯優(yōu)于對照組(P＝000，＜0.01)，而實驗藥物1)組與實驗藥物2)組間無顯著性差異。
實施例10～11結(jié)果 (1)坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)2周時，補陽還五湯組和實驗藥物2)組與對照組無顯著差異，但補陽還五湯組和實驗藥物2)組有顯著差異，且實驗藥物2)組優(yōu)于補陽還五湯組，實驗藥物1)組與對照組比差異有顯著性意義，且優(yōu)于對照組，實驗藥物1)組也優(yōu)于補陽還五湯組，且差異有顯著性。4周時實驗藥物1)組和補陽還五湯組與對照組差別無意義，實驗藥物2)組與對照組差別有顯著意義，且優(yōu)于對照組，同時優(yōu)于實驗藥物1)組，且差別有意義，但與補陽還五湯組差別無意義。6周時實驗藥物1)組和實驗藥物2)組與對照組無顯著差異；而實驗藥物1)組與實驗藥物2)組比差異有顯著性意義，且實驗藥物2)組優(yōu)于實驗藥物1)組。
(2)神經(jīng)傳導(dǎo)速度(NCV)2周時實驗藥物1)組、實驗藥物2)組、補陽還五湯組與對照組比均優(yōu)于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。4周時其中實驗藥物1)組、實驗藥物2)組、補陽還五湯組與對照組比均優(yōu)于對照組，且差異具有顯著意義，而三組用藥組間差別無顯著意義。
(3)組織學(xué)觀察2周時用藥各組均明顯好于對照組，但各用藥組間差異無意義，4周時用藥各組均明顯好于對照組，且實驗藥物2)組明顯好于全方組及補陽還五湯組，而全方組與補陽還五湯組間差異無意義。6周時本發(fā)明的中藥復(fù)方組優(yōu)于對照組且統(tǒng)計學(xué)有明顯差異。實驗藥物2)組明顯優(yōu)于對照組而實驗藥物1)組與實驗藥物2)組間無顯著性差異。
實施例12本發(fā)明的中藥復(fù)方提取液中紅芪多糖含量測定 在含紅芪70份、淫羊藿25份、地龍5份的提取液配方可以有效促進(jìn)大鼠損傷坐骨神經(jīng)再生的基礎(chǔ)上，對該方中主要物質(zhì)成分紅芪多糖采用苯酚-濃硫酸法作含量測定。
材料和方法 1.1材料苯酚(分析純)，重蒸后配成50g/l水溶液；濃硫酸(分析純，d＝1.84g/cm-3)；吸光度用721型分光光度計測定，使用光徑10mm石英比色皿，用Optifix定量加液器吸加50g/l苯酚及濃硫酸。葡萄糖純品。已提純本發(fā)明的中藥復(fù)方減方提取液(濃度86mg/ml) 1.2方法標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制精確稱取已經(jīng)干燥的葡萄糖純品10mg，溶于100ml水中，然后分別稀釋為濃度為2，4，8，10，20ug/ml，本發(fā)明的中藥復(fù)方減方提取液稀釋為4.3ug/ml.。先取已稀釋各標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液各0.4ml，置于10ml試管中，加入50g/l苯酚溶液0.8ml混合后，迅速加入4ml濃硫酸，混合均勻后，室溫放置30min，在波長490nm測定吸光度，空白對照以蒸餾水代替糖溶液。待測出標(biāo)準(zhǔn)曲線后，取已稀釋的本發(fā)明的中藥復(fù)方減方提取液0.4ml，置于10ml試管中，加入50g/l苯酚溶液0.8ml混合后，迅速加入4ml濃硫酸，混合均勻后，室溫放置30min，在波長490nm測定吸光度，將此吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出含有的紅芪多糖量，從而得出方劑中紅芪多糖含量。
2.結(jié)果與討論 2.1由下表所示的樣品吸光值得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得直線方程為Y＝14.73X-0.0343Chi-Square0.00091 其中Y為所含糖量，X為490nm處吸光度 稀釋的本發(fā)明的中藥復(fù)方減方提取液測得吸光度為0.076，代入方程求得所含糖量為1.0908ug，稀釋液含方劑1.72ug，從而求得方劑中所含紅芪多糖占總量的63.41％。
樣本編號所含標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖量(ug)490nm吸光值10.80.05121.60.11033.20.22544.00.28058.00.541 在減方方劑中，因為方中淫羊藿與地龍幾乎不含糖類，所以測得的糖可以認(rèn)為即是紅芪多糖。測得結(jié)果為方劑總量的63.41％ 實施例13單藥紅芪的藥效學(xué)實驗 1.實驗?zāi)康挠^察紅芪單藥對促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷后的再生作用 2.實驗方法 紅芪單藥提取液與NGF按1∶16000稀釋，作為陽性參照，正常培養(yǎng)液作陰性對照。分別放入新鮮切取的SD大鼠坐骨神經(jīng)。37℃培養(yǎng)。平行樣3個。分別于培養(yǎng)后第48h、72h和96h取出坐骨神經(jīng)，-20℃冰箱保存。酪氨酸蛋白激酶測試系統(tǒng)美國Gibco公司產(chǎn)品(NO13154-018)。含底物液和不含RR-SRC的對照液。用前按100uCi/ml加[γ-32P]ATP(＞5000Ci/mmol)(北京亞輝生物醫(yī)學(xué)工程公司)、按試劑系統(tǒng)推薦配方配制抽提液。檢測前樣品制備參照試劑盒說明，每根神經(jīng)加抽提液200ul，玻璃勻漿品勻漿，冰上放置20min，12000g離心2min，考馬斯亮蘭法測蛋白濃度[7]。按蛋白濃度取樣，用抽提液稀釋至0.5mg/ml。分別加入底物液或?qū)φ找?0ul，冰上孵育10min后12000g離心10min(4℃)。吸取反應(yīng)液上清20ul，滴于已標(biāo)記的磷酸纖維素紙上，1％(v/v)乙酸與自來水各洗兩次，每次5min。加入液閃杯中檢測。樣本檢測采用Wallac 1410液體閃爍計數(shù)器(芬蘭)計數(shù)，每樣計數(shù)1min。
3.結(jié)果分析 ①每pmol磷的cpm按下公式計算10ul含32P底物(a)及對照(b)的cpm值/1200；②參入磷的肽pmol數(shù)按下公式計算樣品cpm值×2/①a-對照cpm值×2/①b；③激酶活性按下公式計算②/30。不同濃度及不同時間的樣品結(jié)果用多樣本比較的秩和檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。方差分析第48h紅芪單藥、NGF及對照間均值的差異。
4.結(jié)論紅芪單藥有促進(jìn)雪旺氏細(xì)胞增殖及分化的作用，效果與NGF相似。說明單味紅芪也有促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷后的再生的作用。
實施例14注射劑的制備 制備注射劑將方劑的水煎劑先用旋蒸儀提純，然后在真空機中將含有的水分提出，再通過水浴鍋將其干燥為粉狀，使用時按所需用量精確稱量，用注射用水稀釋后對大鼠局部注射應(yīng)用。
實施例15口服劑的制備 將方劑的水煎劑先用旋蒸儀提純，濃縮為所需用量，對大鼠進(jìn)行灌服實驗。
權(quán)利要求
1.一種促進(jìn)周圍神經(jīng)修復(fù)的藥物，其特征在于由如下重量份的原料藥制成紅芪6-16份、淫羊藿4-10份、地龍2-6份。
2.權(quán)利要求1所述的藥物，所述原料藥的重量份是紅芪8-14份、淫羊藿5-9份、地龍3-5份。
3.權(quán)利要求1所述的藥物，所述原料藥的重量份是紅芪9-13份、淫羊藿6-8份份、地龍3-4份。
4.權(quán)利要求1所述的藥物，所述原料藥還有當(dāng)歸1-6份。
5.權(quán)利要求4所述的藥物，其中原料藥還有川芎1-6份和/或赤芍1-6份。
6.權(quán)利要求4所述的藥物，其中原料藥還有紅花1-4份和/或桃仁1-4份。
7.權(quán)利要求1所述的藥物，所述原料藥還包括下列藥物中的一種或幾種川芎1-6份、紅花1-4份、桃仁1-4份、赤芍1-6份。
8.一種促進(jìn)周圍神經(jīng)修復(fù)的藥物，其特征在于藥物的活性成分由紅芪一種原料制成。
9.權(quán)利要求1-8所述的藥物，劑型是口服劑。
10.權(quán)利要求1-8所述的藥物，劑型是注射劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及促進(jìn)神經(jīng)再生的中藥復(fù)方。該復(fù)方用紅芪、淫羊藿、地龍等中藥為主要原料制成。藥理研究證實，本發(fā)明的中藥復(fù)方各個組方的局部與全身給藥均可促進(jìn)周圍神經(jīng)再生；全身給藥對脊髓神經(jīng)元具有保護(hù)作用。本發(fā)明的中藥復(fù)方還具有促進(jìn)雪旺氏細(xì)胞的增殖、分化的功能。
文檔編號A61P25/00GK1615935SQ20041000961
公開日2005年5月18日 申請日期2004年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月28日
發(fā)明者姜保國, 張殿英, 魏光如, 黨育, 徐海林, 張培訓(xùn), 趙富強, 張宏波, 傅中國, 任俠飛 申請人:北京大學(xué)人民醫(yī)院