專利名稱：免佐劑抗人絨毛膜促性腺激素多肽疫苗及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的腫瘤領(lǐng)域，通?？梢杂媚[瘤疫苗，本發(fā)明的技術(shù)是一種抗人絨毛膜促性腺激素的多肽疫苗，能用于治療人絨毛膜促性腺激素依賴性腫瘤。
背景技術(shù)：
人絨毛膜促性腺激素(Human Chorionic Gonadotropin，HCG)是由人胚滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌的一種糖蛋白激素，其作用是維持并刺激妊娠黃體產(chǎn)生孕酮和雌二醇，促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞發(fā)育成熟，為胚胎著床準(zhǔn)備條件，在早期妊娠中具有重要的作用。HCG由α、β兩亞基組成，α亞基與人促黃體激素、促卵泡激素及促甲狀腺素的α亞基基本相同，激素的特異性、活性在于β亞基。此外，多種組織的腫瘤選擇性分泌單鏈βHCG或βHCG的核心片段，如生殖系統(tǒng)中的絨毛膜癌、前列腺癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌，其他系統(tǒng)中如胃癌、膀胱癌、肺癌、肝癌，甚至口腔中的鱗狀細(xì)胞癌也能檢測(cè)到。HCG通過與靶細(xì)胞上受體結(jié)合傳遞激素信息，HCG受體分布廣泛，不僅存在于性腺靶組織，且在一些非性腺組織中如前列腺、乳腺、腎上腺、甲狀腺、大腦皮層等也有表達(dá)。近幾年發(fā)現(xiàn)LH/HCG受體也存在于某些惡性腫瘤細(xì)胞表面，如子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、卵巢癌、胃癌等。因此，βHCG作為腫瘤細(xì)胞分泌的特征性分子之一，也是防治癌癥的有效靶分子之一。許多實(shí)驗(yàn)已證明利用βHCG純化蛋白、重組蛋白及合成多肽制作的疫苗能夠激發(fā)體內(nèi)產(chǎn)生保護(hù)性抗體，中和腫瘤細(xì)胞分泌的βHCG抗原，并通過阻斷HCG與腫瘤細(xì)胞表面HCG特異性結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的治療。另外，通過阻斷HCG能夠抑制胚胎發(fā)育導(dǎo)致流產(chǎn)從而發(fā)揮避孕作用。
國(guó)外學(xué)者用βHCG的C端37肽與白喉毒素或破傷風(fēng)毒素偶連，用這種偶連物誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗HCG抗體，顯示能用于治療結(jié)腸癌、胰腺癌和乳腺癌等。在中國(guó)，白喉毒素或破傷風(fēng)毒素都已經(jīng)被列為計(jì)劃免疫疫苗，許多人都曾經(jīng)被用白喉毒素和破傷風(fēng)毒素免疫過。在這些人群中使用白喉毒素或破傷風(fēng)毒素偶連物時(shí)，免疫效果會(huì)減弱。用多肽疫苗沒有白喉毒素或破傷風(fēng)毒素偶連物類似的表位抑制問題，但如何加強(qiáng)多肽疫苗的免疫原性是許多疫苗研究人員追求的目標(biāo)。
通常，多肽疫苗需要加入佐劑，才能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生足夠強(qiáng)的免疫應(yīng)答。許多常用的佐劑，如福氏完全佐劑和福氏不完全佐劑等僅能用于動(dòng)物，不能用于人體；人體可用的佐劑目前僅有鋁佐劑，而這種佐劑常常對(duì)多肽疫苗不能起到強(qiáng)化免疫原性的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種強(qiáng)化多肽免疫原性的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種免佐劑的抗HCG多肽疫苗。
本發(fā)明的再一目的是提供生產(chǎn)該免佐劑抗HCG多肽疫苗的方法。
本發(fā)明的還有一個(gè)目的是免佐劑抗HCG多肽疫苗的用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種強(qiáng)化多肽免疫原性的方法，這種方法是將兩段重復(fù)的抗原表位多肽串聯(lián)基因反復(fù)插入HSP65基因的下游，使多重復(fù)串聯(lián)抗原表位多肽與HSP65融合表達(dá)。這種強(qiáng)化多肽免疫原性方法的原理是(1).將抗原表位多肽重復(fù)多次，可以增加抗原表位的劑量，增加整個(gè)抗原的分子量，從而增加抗原表位多肽的免疫原性；(2).通過重復(fù)抗原表位基因的反復(fù)循環(huán)克隆實(shí)現(xiàn)抗原表位的多次重復(fù)；(3).分枝桿菌(卡介苗)HSP65具有在位佐劑的功能，將抗原表位多肽重復(fù)片斷與分枝桿菌(卡介苗)HSP65融合表達(dá)的蛋白作為疫苗，可以不需添加佐劑，誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答。而且，將HSP65與抗原表位融合表達(dá)可省去抗原表位多肽與在位佐劑HSP65化學(xué)偶聯(lián)的步驟。
在本發(fā)明中，術(shù)語“X2n”指抗原表位串聯(lián)排列，X2指兩段βHCG109-118串聯(lián)多肽，n指用于串聯(lián)排列的重復(fù)抗原表位(X2)的個(gè)數(shù)，可以等于1或大于1，抗原表位之間可以直接相聯(lián)，也可以有間隔的氨基酸殘基。在疫苗研究中，表位之間可以在空間上相鄰也可以不相鄰。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種抗人絨毛膜促性腺激素免佐劑多肽疫苗。該疫苗采用本發(fā)明的第一方面所述的方法進(jìn)行設(shè)計(jì)。在疫苗分子中，(重復(fù)抗原表位)n等于ThrCysAspAspProArgPheGlnAspSerThrCysAspAspProArgPheGlnAspSerAlaArgThrCysAspAspProArgPheGlnAspSerThrCysAspAspProArgPheGlnAspSerAlaArgThrCysAspAspProArgPheGlnAspSerThrCysAspAspProArgPheGlnAspSerAlaSer，即含有六段(但不限于)作為抗原表位的βHCG109-118肽段；為了敘述方便，在實(shí)施例中，本發(fā)明含六段βHCG109-118的抗原表位用“X6”表示。βHCGCTP37是指HCGβ亞基109-145多肽，即HCGβ鏈C端37肽，其氨基酸序列是ThrCysAspAspProArgPheGlnAspSerSerSerSerLysAlaProProProSerLeuProSerProSerArgLeuProGlyProSerAspThrProIleLeuProGln。HSP65是指源于用作卡介苗的分枝桿菌來源的熱激蛋白，國(guó)際基因庫登錄號(hào)是M17705。將抗原表位多肽與HSP65融合表達(dá)，能強(qiáng)化多肽疫苗的免疫原性，不需添加佐劑就能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈免疫應(yīng)答。將βHCGCTP37和六段抗原表位與HSP65融合表達(dá)所獲得的免佐劑抗人絨毛膜促性腺激素多肽疫苗表示為“HSP65-X6-βHCGCTP37”。
在本發(fā)明的第三方面，是提供生產(chǎn)抗人絨毛膜促性腺激素的重復(fù)表位多肽疫苗的方法，其技術(shù)路線詳述如下1.βHCGCTP37基因的設(shè)計(jì)與獲得在不改變?chǔ)翲CGCTP37多肽氨基酸序列的前提下，選用大腸桿菌偏愛的密碼子，借助于計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)四條寡核苷酸，通過PCR法獲得βHCGCTP37多肽基因的核苷酸序列，5’端添加了BamHI的識(shí)別位點(diǎn)，3’端添加了終止密碼子和HindIII的識(shí)別位點(diǎn)。
2.HSP65基因的設(shè)計(jì)與獲得在不改變HSP65氨基酸序列的前提下，選用大腸桿菌偏愛的密碼子，借助于計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)兩條寡核苷酸，從市售的卡介苗提取的DNA中通過PCR法獲得HSP65基因的核苷酸序列，5’端添加了NcoI的識(shí)別位點(diǎn)，3’端添加了NheI和BglII的識(shí)別位點(diǎn)。
3.重復(fù)抗原表位(X2)基因的設(shè)計(jì)和獲得在不改變兩段βHCG109-118串聯(lián)多肽氨基酸序列的前提下，選用大腸桿菌偏愛的密碼子，借助于計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)兩條寡核苷酸，通過PCR法獲得重復(fù)抗原表位多肽基因的核苷酸序列，5’端添加了XbaI的識(shí)別位點(diǎn)，3’端添加了NheI的識(shí)別位點(diǎn)。重要的一點(diǎn)是其中一個(gè)絲氨酸Ser的密碼子選用TCA，以便于陽性克隆的篩選。因?yàn)檩d體質(zhì)粒采用單酶切，插入X2基因時(shí)會(huì)有正向和反向兩種情況，如果是正向插入則TCA表達(dá)為Ser，HSP65-X2n-βHCGCTP37蛋白的分子量比HSP65-X2(n-1)-βHCGCTP37蛋白要大2400左右；如果是反向插入則TCA反向序列TGA為終止密碼子，HSP65-X2n-βHCGCTP37蛋白的分子量比HSP65-X2(n-1)-βHCGCTP37蛋白的分子量小。所以用SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色可判斷正向正確插入X2基因的重組克隆。
4.pED-βHCGCTP37重組基因工程菌的構(gòu)建βHCGCTP37基因經(jīng)BamHI、HindIII切割插入經(jīng)BamHI、HindIII切割的pED中，組成融合表達(dá)的重組質(zhì)粒pED-βHCGCTP37，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，獲得重組基因工程菌。
5.Hh重組基因工程菌的構(gòu)建HSP65基因經(jīng)NcoI、BglII切割插入經(jīng)NcoI、BamHI切割的pED-βHCGCTP37中，組成融合表達(dá)的重組質(zhì)粒HSP65-βHCGCTP37簡(jiǎn)稱Hh，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，獲得重組基因工程菌。
6.HX2nh重組基因工程菌的構(gòu)建X2基因經(jīng)XbaI、NheI切割插入經(jīng)NheI切割的Hh中，組成融合表達(dá)的重組質(zhì)粒HX2h，仍然留有單一位點(diǎn)NheI，在此基礎(chǔ)上重復(fù)操作可再插入一段X2基因，即插入X2基因n次則得到融合表達(dá)的重組質(zhì)粒HX2nh，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，獲得重組基因工程菌。
7.工程菌發(fā)酵及重組HSP65-βHCGCTP37和HSP65-X6-βHCGCTP37蛋白的獲得以LB為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，玉米漿培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵參數(shù)如下溫度36-38℃，pH6.8-7.2。發(fā)酵后離心收集工程菌，反復(fù)凍融裂解菌體，離心獲得上清可溶性蛋白，硫酸銨分級(jí)沉淀，20％-40％硫酸銨沉淀中含有目的融合蛋白，沉淀重新溶解后經(jīng)離子交換柱層析純化，用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，可以判斷純化的HSP65的純度。
在本發(fā)明的第四方面是免佐劑抗HCG多肽疫苗的用途，如上所述，免佐劑抗HCG多肽疫苗能用于治療乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和前列腺癌，也能用于避孕和動(dòng)物去勢(shì)。


圖1，載體質(zhì)粒pET28a-HSP65，以及重組質(zhì)粒Hh和HX6h。
圖2.基因重組抗原HSP65-X6-βHCGCTP37的堿基序列(1953bp)。
圖3.HX6h質(zhì)粒的βHCGCTP37和X6及HSP C端部分基因測(cè)序結(jié)果。
圖4.SDS-PAGE電泳顯示HSP65-βHCGCTP37和HSP65-X6-βHCGCTP37的融合表達(dá)。1.標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；2.大腸桿菌BL21細(xì)胞全蛋白；3.載荷pED質(zhì)粒的大腸桿菌BL21細(xì)胞全蛋白；4.載荷pED-βHCGCTP37質(zhì)粒的大腸桿菌BL21細(xì)胞全蛋白；5.載荷pET28a質(zhì)粒的大腸桿菌BL21細(xì)胞全蛋白；6.載荷pET28a-HSP65質(zhì)粒的大腸桿菌BL21細(xì)胞全蛋白；7.載荷Hh質(zhì)粒的大腸桿菌BL21細(xì)胞全蛋白；8.載荷HX2h質(zhì)粒的大腸桿菌BL21細(xì)胞全蛋白；9.載荷HX4h質(zhì)粒的大腸桿菌BL21細(xì)胞全蛋白；10.載荷HX6h質(zhì)粒的大腸桿菌BL21細(xì)胞全蛋白。
圖5.SDS-PAGE電泳顯示HSP65-βHCGCTP37和HSP65-X6-βHCGCTP37蛋白的純化.1.標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；2.載荷pET28a質(zhì)粒的大腸桿菌BL21細(xì)胞全蛋白；3.載荷HX6h質(zhì)粒的大腸桿菌BL21細(xì)胞全蛋白；4.載荷Hh質(zhì)粒的大腸桿菌BL21細(xì)胞全蛋白；5.分離的HSP65-X6-βHCGCTP37；6.分離的HSP65-βHCGCTP37。A箭頭顯示HSP65-X6-βHCGCTP37的位置；B箭頭顯示HSP65-βHCGCTP37的位置。
圖6.ELISA測(cè)定結(jié)果顯示只有HSP65-X6-βHCGCTP37蛋白能誘發(fā)小鼠產(chǎn)生抗HCG抗體。圖例○生理鹽水◆HSP▲Hh■HX6h圖7.EMT6腫瘤生長(zhǎng)曲線顯示經(jīng)HSP65-X6-βHCGCTP37免疫的小鼠較經(jīng)HSP65-βHCGCTP37免疫的小鼠和注射生理鹽水的正常小鼠荷瘤小。圖例○生理鹽水▲Hh■HX6h圖8.EMT6腫瘤平均大小(圖A)及腫瘤平均重量(圖B，圖例□生理鹽水 Hh■HX6h)顯示經(jīng)HSP65-X6-βHCGCTP37免疫的小鼠較經(jīng)HSP65-βHCGCTP37免疫的小鼠和注射生理鹽水的正常小鼠荷瘤EMT6小(P＜0.005)。
圖9.RM-1接種小鼠生存時(shí)間曲線，顯示經(jīng)HSP65-X6-βHCGCTP37免疫的小鼠較經(jīng)HSP65-βHCGCTP37免疫的小鼠和注射生理鹽水的正常小鼠荷瘤RM-1后存活時(shí)間長(zhǎng)(P＜0.001)。
實(shí)施例材料(1)菌株與質(zhì)粒大腸桿菌(Escherichia coli AS1.357)該菌種從中國(guó)菌種保藏中心獲得。宿主菌E.coli BL21是基因工程常用工具菌種，在與基因工程研究有關(guān)的實(shí)驗(yàn)室一般都有保存。
質(zhì)粒pET28a購(gòu)自Novagen公司。
卡介苗由上海生物制品公司生產(chǎn)，該制品中含有牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)。
質(zhì)粒pED由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。
質(zhì)粒pET28a-HSP65由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存，HSP65蛋白也由本實(shí)驗(yàn)室分離純化。
(2)酶和試劑分子克隆工具酶和試劑、細(xì)菌基因組、質(zhì)粒抽提試劑盒為普洛麥格(Promega)公司產(chǎn)品。
(3)培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基，配方見參考文獻(xiàn)Sambrook J，F(xiàn)ristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989。該書是基因工程技術(shù)的經(jīng)典著作，在許多高校圖書館都有收藏。
玉米漿培養(yǎng)基含有玉米漿25g/L，牛肉浸膏15g/L，味精10g/L。
方法分子生物學(xué)操作方法質(zhì)粒提取、聚合酶鏈反應(yīng)、內(nèi)切酶酶切、DNA片斷的回收、連接和轉(zhuǎn)化大腸桿菌在基因工程研究領(lǐng)域，這些都是常規(guī)操作方法，參見Sambrook J，F(xiàn)ristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989，pp.16-340。
重組蛋白表達(dá)量的測(cè)定參見Sambrook J，F(xiàn)ristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989，方法進(jìn)行。
實(shí)施例1 HSP65-X6-βHCGCTP37多肽基因的設(shè)計(jì)、合成和克隆根據(jù)HSP65基因和βHCGCTP37多肽基因的氨基酸序列，選用大腸桿菌偏愛的密碼子，在計(jì)算機(jī)的輔助下設(shè)計(jì)出8條寡核苷酸片段。首先通過PCR法合成βHCGCTP37多肽基因，將該基因克隆到pED的L-ansB-C基因的C端，轉(zhuǎn)化大腸桿菌得到重組質(zhì)粒命名為pED-βHCGCTP37。再以pET28a-HSP65質(zhì)粒為模板，通過PCR的方法獲得HSP65基因，將該基因替換pED-βHCGCTP37中的L-ansB-C基因，轉(zhuǎn)化大腸桿菌得到重組質(zhì)粒命名為Hsp65-βHCGCTP37(簡(jiǎn)稱Hh)。然后通過PCR法獲得βHCG109-118多肽兩次重復(fù)串聯(lián)排列的基因(簡(jiǎn)稱X2)，將該基因克隆到Hh的Hsp65基因和βHCGCTP37基因之間，轉(zhuǎn)化大腸桿菌得到重組質(zhì)粒命名為H X2h；重復(fù)克隆X2基因得到重組質(zhì)粒H X4h；再重復(fù)克隆X2基因得到重組質(zhì)粒H X6h。具體方法如下8條寡核苷酸如下P15’GAC GAC CCG CGT TTC CAG GAC TCT TCT TCT TCT AAA GCT CCG CCG CCA TCT CTG 3’P25’AGT GTC AGA CGG ACC CGG CAG ACG AGA CGG AGA CGG CAG AGA TGG CGG CGG AGC3’P35’GGGG GAT CCG ACT GGT GGC ACT TGC GAC GAC CCG CGT TTC CAG GAC3’P45’AAAA AGC TTA CTG CGG CAG GAT CGG AGT GTC AGA CGG ACC CGG CAG3’P55’TTG ACC ATG GCC AAG ACA ATT GCG TAC3’P65’TAA AAG ATC TGC GCT AGC GAA ATC CAT GCC ACC CAT 3’P75’ATA TCT AGA ACT TGC GAC GAC CCG CGT TTC CAG GAC TCT ACT TGC GAC GAC CCG3’P85’AAA GCT AGC AGA GTC CTG GAA ACG CGG GTC GTC GCA AGT TGA GTC CTG GAA ACG3’通過PCR獲得βHCG CTP37多肽基因第一步寡核苷酸片段P1和P2按一定比例混合，二者互為引物和模板，94℃，1min，58℃，45sec，72℃，45sec，共15輪；72℃，10min。再以該P(yáng)CR產(chǎn)物為模板，用P3和P4引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，94℃，1min，58℃，1min，72℃，1min，共20輪；72℃，10min。將擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BamH1和HindIII消化，與用相同限制性內(nèi)切酶消化的pED質(zhì)粒連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)，所獲得的轉(zhuǎn)化子中含連有βHCG CTP37多肽融合蛋白基因的重組質(zhì)粒pED-βHCGCTP37。
通過PCR獲得HSP65-βHCGCTP37多肽基因以P5為上游引物，P6為下游引物，pET28a-HSP65質(zhì)粒為模板，經(jīng)94℃變性5min，然后以94℃變性1min、62℃復(fù)性2min、72℃延伸4min共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)后，再72℃延伸10min。將擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶NcoI和BglII消化，與用相同限制性內(nèi)切酶消化的pED-βHCGCTP37質(zhì)粒連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)，所獲得的轉(zhuǎn)化子中含HSP65-βHCGCTP37多肽融合蛋白基因的重組質(zhì)粒Hh，其結(jié)構(gòu)框架見圖1。
通過PCR獲得HSP65-X6-βHCGCTP37多肽基因以寡核苷酸片段P7和P8按一定比例混合，二者互為引物和模板，經(jīng)94℃變性5min，然后以94℃變性1min、58℃復(fù)性50sec、72℃延伸30sec共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后，再72℃延伸10min。將擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物X2用限制性內(nèi)切酶XbaI和NheI消化，與用限制性內(nèi)切酶NheI消化的Hh質(zhì)粒連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，所獲得的轉(zhuǎn)化子中含HSP65-X2-βHCGCTP37多肽融合蛋白基因的重組質(zhì)粒HX2h。限制性內(nèi)切酶XbaI和NheI是同尾酶，酶連后形成的粘合位點(diǎn)不再被XbaI或NheI識(shí)別，因此重組質(zhì)粒H X2h中仍然只留有一個(gè)NheI酶切位點(diǎn)。再將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物X2用限制性內(nèi)切酶XbaI和NheI消化，與用限制性內(nèi)切酶NheI消化的H X2h質(zhì)粒連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，所獲得的轉(zhuǎn)化子中含HSP65-X4-βHCGCTP37多肽融合蛋白基因的重組質(zhì)粒H X4h；再次進(jìn)行這一過程得到含HSP65-X6-βHCGCTP37多肽融合蛋白基因的重組質(zhì)粒H X6h，其結(jié)構(gòu)框架見圖1。進(jìn)行核酸的序列分析，進(jìn)一步驗(yàn)證GRF基因及其讀碼框的正確性.測(cè)序圖見圖3。從測(cè)序結(jié)果可以看出，HSP65序列、六段βHCG109-118重復(fù)序列和βHCGCTP37序列已經(jīng)串聯(lián)，實(shí)現(xiàn)了基因融合。
實(shí)施例2 HSP65-βHCGCTP37和HSP65-X6-βHCGCTP37多肽基因在大腸桿菌中的表達(dá)將重組質(zhì)粒Hh和H X6h分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。從生長(zhǎng)有不同轉(zhuǎn)化子平板上挑取單菌落種入LB液體培養(yǎng)基中，在37℃振蕩培養(yǎng)過夜，按2％比例轉(zhuǎn)種入新鮮的玉米漿液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)4小時(shí)，加入終濃度為0.1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)T7RNA聚合酶，繼續(xù)培養(yǎng)從而表達(dá)融合蛋白。誘導(dǎo)后每隔1小時(shí)取少量菌液，離心回收菌體，SDS-PAGE電泳再經(jīng)薄層掃描顯示已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了HSP65-βHCGCTP37多肽基因和HSP65-X6-βHCGCTP37多肽基因的融合表達(dá)，并且HSP65-X2n-βHCGCTP37蛋白的分子量比HSP65-X2(n-1)-βHCGCTP37蛋白要大2400左右。融合蛋白在誘導(dǎo)后6小時(shí)達(dá)到穩(wěn)定的最大表達(dá)量，融合蛋白占細(xì)菌總蛋白的40％左右，結(jié)果見圖4。
實(shí)施例3融合蛋白分離純化誘導(dǎo)表達(dá)后的工程菌經(jīng)離心回收菌體，將菌體懸浮在破壁液(pH8.0磷酸緩沖鹽，0.02％溶菌酶)中，凍融后在30℃攪拌90分鐘，加入DNase將DNA消化至溶液不粘稠為止，離心回收上清，用硫酸銨分級(jí)沉淀，目的蛋白主要在20％-40％硫酸銨沉淀中。將沉淀的融合蛋白重新溶解在pH8.0磷酸緩沖鹽中，離心后上清上DEAE纖維素DE52柱(2×60cm)，用PBS/NaCl梯度洗脫，分部收集進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，HSP65在120mmol處的洗脫峰中，用SDS-PAGE電泳檢查制備樣品的純度，見圖5。
實(shí)施例4 HSP65-βHCGCTP37和HSP65-X6-βHCGCTP37蛋白疫苗的免疫原性研究選用7-8周齡BALB/C小鼠，HSP65-βHCGCTP37實(shí)驗(yàn)組、HSP65-X6-βHCGCTP37實(shí)驗(yàn)組、HSP65空白對(duì)照組和生理鹽水陰性對(duì)照組各8只。除生理鹽水組外所有小鼠都進(jìn)行卡介苗(BCG)(上海生物制品公司)的預(yù)免疫，凍干的卡介苗用生理鹽水配制成5×106CFU/ml，每只鼠皮下注射100μl。預(yù)免疫兩周后，進(jìn)行第一次免疫，分別皮下注射100μl(0.5μg/μl于生理鹽水)的HSP65-βHCGCTP37、HSP65-X6-βHCGCTP37和HSP65蛋白，無須福氏佐劑乳化。以后每隔2周加強(qiáng)免疫一次，共進(jìn)行2次加強(qiáng)免疫。生理鹽水組注射相同量的生理鹽水。每次免疫后2周內(nèi)眥取血一次，血量為0.5-0.8ml，離心，取血清冷凍保存；預(yù)免疫80天后處死大鼠，眼球取血，離心取血清冷凍保存。
用純化的pED-βHCGCTP37融合蛋白4℃過夜包被96孔ELISA酶標(biāo)板，每孔100μl含100ng融合蛋白。包被后，用5％牛血清白蛋白(BSA)溶液在37℃滿孔封閉一小時(shí)。免疫后取血所得抗血清，用5％BSA(于pH7.5的PBS中)稀釋100倍，然后每孔加入100μl稀釋后的抗血清于37℃作用1小時(shí)。用PBST(含0.1％Tween-20)洗滌6次后加入100μl以1∶20000稀釋的羊抗小鼠IgG二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記)，每孔100μl，37℃作用1小時(shí)。PBST洗滌6次，每孔加入100μl過氧化氫尿素和3、3`、5、5`-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液于37℃顯色20分鐘后，加入50μl 2MH2SO4終止反應(yīng)，并于450nm波長(zhǎng)下，測(cè)定各孔吸光度值。結(jié)果見圖6。從結(jié)果可以看出，只有含重復(fù)抗原表位的HSP65-X6-βHCGCTP37蛋白能誘發(fā)特異的抗HCG抗體。
實(shí)施例5 HSP65-βHCGCTP37和HSP65-X6-βHCGCTP37蛋白疫苗的藥效研究選用7-8周齡雌性BALB/C小鼠，HSP65-βHCGCTP37實(shí)驗(yàn)組、HSP65-X6-βHCGCTP37實(shí)驗(yàn)組和生理鹽水陰性對(duì)照組各6只。除生理鹽水組外所有小鼠都進(jìn)行卡介苗(BCG)(上海生物制品公司)的預(yù)免疫，凍干的卡介苗用生理鹽水配制成5×106CFU/ml，每只鼠皮下注射100μl。預(yù)免疫兩周后，進(jìn)行第一次免疫，分別皮下注射100μl(0.5μg/μl于生理鹽水)的HSP65-βHCGCTP37和HSP65-X6-βHCGCTP37蛋白，無須福氏佐劑乳化。以后每隔2周加強(qiáng)免疫一次，共進(jìn)行2次加強(qiáng)免疫。生理鹽水組注射相同量的生理鹽水。最后一次免疫后第3周，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠右側(cè)胸前皮下接種0.1mL(107個(gè)/mL)EMT6小鼠乳腺癌細(xì)胞。觀察記錄腫瘤生長(zhǎng)情況，用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)、短徑。腫瘤體積按公式V(mm3)＝0.4ab2計(jì)算，a＝長(zhǎng)(mm)，b＝寬(mm)，比較腫瘤大小并繪制生長(zhǎng)曲線，見圖7。于腫瘤細(xì)胞接種后第28天，全部動(dòng)物眼球取血后處死，取肝、脾、腎和卵巢子宮以及瘤組織，稱重，拍照，見圖8。表明經(jīng)HSP65-X6-βHCGCTP37免疫的小鼠比經(jīng)HSP65-βHCGCTP37免疫的小鼠和注射生理鹽水的正常小鼠荷瘤EMT6更小(P＜0.005)。
選用7-8周齡雄性C57/BL6小鼠，HSP65-βHCGCTP37實(shí)驗(yàn)組、HSP65-X6-βHCGCTP37實(shí)驗(yàn)組和生理鹽水陰性對(duì)照組各7只。除生理鹽水組外所有小鼠都進(jìn)行卡介苗(BCG)(上海生物制品公司)的預(yù)免疫，凍干的卡介苗用生理鹽水配制成5×106CFU/ml，每只鼠皮下注射100μl。預(yù)免疫兩周后，進(jìn)行第一次免疫，分別皮下注射100μl(0.5μg/μl于生理鹽水)的HSP65-βHCGCTP37和HSP65-X6-βHCGCTP37蛋白，無須福氏佐劑乳化。以后每隔2周加強(qiáng)免疫一次，共進(jìn)行2次加強(qiáng)免疫。生理鹽水組注射相同量的生理鹽水。最后一次免疫后第4周，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠前列腺接種0.02mL(2*107個(gè)/mL)RM-1小鼠前列腺癌細(xì)胞。觀察記錄小鼠存活情況，并繪制生存時(shí)間曲線，見圖9。表明經(jīng)HSP65-X6-βHCGCTP37免疫的小鼠較經(jīng)HSP65-βHCGCTP37免疫的小鼠和注射生理鹽水的正常小鼠荷瘤RM-1后存活時(shí)間更長(zhǎng)(P＜0.001)。
權(quán)利要求
1.一種制作免佐劑強(qiáng)免疫原性多肽疫苗的方法，其特征在于將兩段重復(fù)的抗原表位多肽串聯(lián)基因反復(fù)插入HSP65基因的下游，使抗原表位多肽多重復(fù)串聯(lián)。并且抗原表位多肽基因與源于分枝桿菌(Mycobacterium bovis)的熱激蛋白HSP65基因連接，使抗原表位多肽與HSP65融合表達(dá)。
2.一種免佐劑抗人絨毛膜促性腺激素多肽疫苗，該疫苗按照權(quán)利要求1所述的方法制作，其特征在于不需添加佐劑，也不需要將抗原多肽與載體化學(xué)偶聯(lián)，能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈免疫應(yīng)答，產(chǎn)生高滴度的抗人絨毛膜促性腺激素抗體，并通過阻斷人絨毛膜促性腺激素，使機(jī)體腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)受到顯著抑制。
3.按照權(quán)利要求2所述的疫苗，其特征在于疫苗多肽中含有六段人絨毛膜促性腺激素β鏈109-118重復(fù)串聯(lián)肽段，其氨基酸序列是ThrCysAspAspProArgPheGlnAspSerThrCysAspAspProArgPheGlnAspSerAlaArgThrCysAspAspProArgPheGlnAspSerThrCysAspAspProArgPheGlnAspSerAlaArgThrCysAspAspProArgPheGlnAspSerThrCysAspAspProArgPheGlnAspSerAlaSer，末尾兩個(gè)氨基酸AlaSer對(duì)應(yīng)的DNA序列是DNA限制性內(nèi)切酶Nhe I的識(shí)別位點(diǎn)，可用于反復(fù)插入抗原表位多肽基因，使串聯(lián)更多抗原表位肽段。疫苗多肽的結(jié)構(gòu)可表示為HSP65-X2n-βHCGCTP37肽，插入基因X2n次，則疫苗多肽中含有2n個(gè)串聯(lián)的人絨毛膜促性腺激素β鏈109-118表位肽段，n≥1。
4.按照權(quán)利要求2所述的疫苗，其特征在于多肽與牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)的熱激蛋白HSP65融合表達(dá)，融合蛋白作為疫苗在不額外添加佐劑的情況下激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答。
5.一種免佐劑抗人絨毛膜促性腺激素多肽疫苗制備方法，包括用化學(xué)合成法和PCR法合成人絨毛膜促性腺激素β鏈C端37肽、兩段人絨毛膜促性腺激素β鏈109-118重復(fù)串聯(lián)肽段和HSP65的編碼序列DNA，將這些DNA分步插入表達(dá)載體，在大腸桿菌中表達(dá)出可溶性融合蛋白；經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀純化；再經(jīng)離子交換樹脂DEAE纖維素純化，得到抗人絨毛膜促性腺激素疫苗多肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述免佐劑抗人絨毛膜促性腺激素多肽疫苗，其特征在于免疫動(dòng)物能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗人絨毛膜促性腺激素抗體，通過機(jī)體內(nèi)抗人絨毛膜促性腺激素抗體與人絨毛膜促性腺激素結(jié)合，可以治療人絨毛膜促性腺激素依賴的乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和前列腺癌，也能用于避孕和動(dòng)物去勢(shì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述免佐劑抗人絨毛膜促性腺激素多肽疫苗，其特征在于可與藥物載體組合制成藥物組合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述免佐劑抗人絨毛膜促性腺激素多肽疫苗，其特征在于可與其他藥物活性成分組合制成藥物組合物。
全文摘要
將多重復(fù)串聯(lián)抗原表位多肽基因與源于分枝桿菌(Mycobacterium bovis)的熱激蛋白HSP65基因連接，產(chǎn)生融合表達(dá)蛋白可直接用于免疫。針對(duì)弱免疫原性的抗原多肽，將兩段重復(fù)的抗原表位多肽串聯(lián)基因反復(fù)插入HSP65基因的下游，實(shí)現(xiàn)了多重復(fù)串聯(lián)抗原表位多肽與HSP65的融合表達(dá)。應(yīng)用這項(xiàng)技術(shù)，研制了一種免佐劑抗人絨毛膜促性腺激素多肽疫苗。該疫苗不需添加佐劑，也不需要將抗原多肽與載體化學(xué)偶聯(lián)，能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生高滴度的抗人絨毛膜促性腺激素抗體，并通過阻斷人絨毛膜促性腺激素，使機(jī)體腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)受到顯著抑制。從而治療人絨毛膜促性腺激素依賴的乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和前列腺癌等，也能用于避孕和動(dòng)物去勢(shì)。
文檔編號(hào)A61K38/24GK1562363SQ20041001438
公開日2005年1月12日 申請(qǐng)日期2004年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月22日
發(fā)明者劉景晶, 嚴(yán)榮, 吳潔, 曹榮月 申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)