專利名稱：抗微生物感染的免疫球蛋白的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種抗微生物感染的免疫球旦白制劑的制備方法及其應用，尤其涉及一種采用疫苗免疫接種乳牛，誘發(fā)其高敏感狀態(tài)，用其牛奶制備抗微生物感染的免疫球旦白制劑的方法及其應用。
發(fā)明技術背景正常人體胃腸道及呼吸道粘膜上均有含量豐富的免疫球旦白A，抵御侵犯人體的多種致病性微生物，當人體免疫功能減弱或缺乏時，人體腔道粘膜免疫球旦白A含量會顯著降低，從而使致病微生物侵犯人體，導致各類感染性疾病的發(fā)生和發(fā)展。
嬰幼兒身體內免疫功能尚未發(fā)育完成，主要靠母乳的免疫球旦白來殺滅微生物，所以非母乳喂養(yǎng)的嬰兒容易發(fā)生各類感染。
人體免疫功能低下或免疫功能缺乏也會引起嚴重的感染，尤其后天性免疫缺乏癥患者(愛滋病人)會因為免疫功能缺陷而極易患各種感染性疾病。
眾所周知，牛初乳中含有大量免疫球旦白，能對抗各種微生物感染，但牛初乳來源較少，不易收集，不容易形成大批量的生產(chǎn)規(guī)模。
多項實驗研究已經(jīng)證實，通過免疫接種乳牛，能誘發(fā)乳牛產(chǎn)生特異性抗體以抵抗各類微生物，美國專利(4,324,784)公布的技術，用變異鏈球菌接種乳牛產(chǎn)生的特異性抗體能防治齲齒。
進一步研究發(fā)現(xiàn)，采用復合抗原致敏乳牛，誘發(fā)乳牛進入高敏感免疫狀態(tài)，其分泌的牛奶中產(chǎn)生的抗體能有效對抗多種微生物。
本發(fā)明所要解決的技術問題是，選擇適當?shù)目乖臃N乳牛，誘發(fā)乳牛高敏感免疫狀態(tài)，并從其分泌的牛奶中制備抗微生物感染的免疫球旦白，用來預防和治療各類微生物感染。

發(fā)明內容
本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術方案，其特征是，選擇合適的抗原或抗原組合，制備單價或多價復合抗原疫苗，免疫接種經(jīng)選擇的健康乳牛，監(jiān)測接種乳牛血清以確定其已進入高敏感免疫狀態(tài)，重復追加接種足夠劑量的疫苗以維持其高敏感免疫狀態(tài)，測試牛奶中免疫球旦白的生物活性，從收集的牛奶中，通過采用超微濾膜分離提純的方法，制備高純度抗微生物感染的免疫球旦白。
本發(fā)明的技術特征是，單獨的抗原或者復合抗原都可以被用作制備接種乳牛的疫苗，抗原類型可以是細菌、病毒、孢子體、螺旋體等微生物或其他物質，只要該抗原可以引發(fā)接種的乳牛進入高敏感免疫狀態(tài)。最適宜的抗原類型是細菌，最好是采用多價抗原形式的滅活細菌疫苗。
本發(fā)明的技術特征是，選擇的免疫接種對象可以是乳?；蛉檠?，最好是健康乳牛，接種方式可以是皮下注射、皮內注射、靜脈注射、腹膜內注射、乳房內注射、口服、灌腸、肌肉注射等，只要該接種形式能使接種動物致敏，最好的接種方式是肌肉注射，如果肌肉注射不能引發(fā)高敏感免疫狀態(tài)，可以同時采用靜脈注射或乳房內注射的方法聯(lián)合接種，以誘發(fā)接種動物進入高敏感免疫狀態(tài)。接種的劑量要足夠，劑量范圍從1，times，10，sup.6cells到1.times.10.sup.8cells。
本發(fā)明的技術特征是，應該監(jiān)測接種乳牛是否對抗原敏感，以及是否已進入高敏感免疫狀態(tài)。有很多已知的方法可以檢測這種敏感性，其中包括皮膚敏感性試驗、測定血清中特異性抗體滴度，最好的方法是分別測試乳牛接種前后血清對多價抗原復合疫苗產(chǎn)生的抗體凝集反應，如果在接種后出現(xiàn)特異性抗體凝集反應，則證實已經(jīng)進入高敏感免疫狀態(tài)。
本發(fā)明的技術特征是，在首次免疫接種誘發(fā)乳牛高敏感免疫狀態(tài)后，應該重復追加接種注射，以維持這種已誘發(fā)的高敏感免疫狀態(tài)，重復注射應維持足夠的劑量，至少應等于首次接種劑量，必要時可加大劑量，但不超過初始劑量的150％，重復接種的時間和次數(shù)取決于抗原的選擇及組合，通常是每兩周重復注射一次，一般可重復注射4～6次，但在這期間至少每兩周監(jiān)測一次血清抗體凝集反應，如果接種乳牛出現(xiàn)免疫耐受現(xiàn)象，則應停止使用該乳牛的牛奶作為原料制備免疫球旦白。
本發(fā)明的技術特征是，制備高純度免疫球旦白的方法是，對收集的牛奶采用離心方式脫脂，用酸劑調整牛奶PH至4.5～4.9，最好是PH4.7～4.8，加熱30℃～50℃，最好40℃，加熱時間20分鐘～40分鐘，最好30分鐘，可降溫至4℃后靜置過夜，用濾布過濾器，最好是尼龍濾布過濾器濾除凝集的酪旦白后直接噴霧干燥，或加堿劑，調整PH至6.8～7.0后噴霧干燥成干粉，或者在加熱后直接用離心機離心沉淀酪旦白，離心時間15分鐘～45分鐘，最好30分鐘，離心速度3000～6000轉/分，最好5000轉/分，離心沉淀去除酪旦白后，上清液用分子量為100,000～120,000D的超微濾膜分離過濾、濃縮物濃縮至原體積10～30％時，冷凍干燥或噴霧干燥制備干粉，噴霧干燥時溫度不能超過140°F。
本發(fā)明的技術特征是，為了保持免疫球旦白的生物活性，所有的工藝均需嚴格控制溫度，牛奶原料進行巴氏消毒時，溫度不能超過140°F，時間不能超過15秒，在整個制備過程中，都要注意控制溫度，在噴霧干燥時，溫度也不能超過140°F。
本發(fā)明的技術特征是，本發(fā)明制備的免疫球旦白干粉中，免疫球旦白含量約為8％，其中免疫球旦白(IgG)是主要成份，具有生物活性，可以采用多種已知的方法進行測定，抗體凝集試驗是一種簡單有效的方法。
本發(fā)明的技術特征是，本發(fā)明制備的免疫球旦白可以制備成多種形式制劑使用，可以直接應用干粉制劑，或加溶液配制成口服液應用，或者與其他藥物輔料混合制備成片劑、膠囊劑、散劑、沖劑、顆粒劑、油劑、乳劑等服用，還可以作為食品添加劑制備成食品使用，如牛奶、奶粉、速溶咖啡、速溶茶、餅干、糕點、冰琪淋等，還可以制備成口香糖、含片形式，以對抗口腔中微生物，或制備成氣霧劑以對抗咽喉或呼吸道微生物，還可以制備成水溶性溶液與超聲霧化裝置共同應用以對抗上呼吸道微生物。
本發(fā)明的技術特征是，本發(fā)明制備的免疫球旦白制劑，適用于嬰幼兒，尤其適用于未采用母乳喂養(yǎng)的嬰兒預防和治療胃腸道微生物感染；適用于體質虛弱、抵抗力低下、免疫功能低下的人群用來預防和治療胃腸道微生物感染、呼吸道微生物感染、口腔、咽喉部微生物感染；適用于免疫功能低下或免疫功能缺乏的患者用來預防和治療各類微生物感染，尤其是愛滋病病人的胃腸道感染；還適用于長期服用腎上腺皮質激素類藥物的病人所發(fā)生的各類空腔器官感染。
本發(fā)明的技術特征是，本發(fā)明方法制備的免疫球旦白制劑用于預防和治療各類微生物感染的劑量是0.1～20g/天，較好的范圍是1～10g/天，最好是2～5g/天，取決于感染類型和患者狀態(tài)，長期服用無毒付作用，可以與任何其他藥物或營養(yǎng)成分共同使用。
本發(fā)明的有益效果是，制備的高純度免疫球旦白能有效對抗各類致病微生物，長期服用無毒付作用，原料來源豐富，制備過程簡單，容易推廣普及。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明實施例1免疫接種及抗體滴度檢測選用大腸桿菌(Escherichia Coli，American Type Culture StrainNo.13076)，用標準細菌培養(yǎng)基在37℃溫度下培養(yǎng)48小時，60℃二小時滅活細菌，離心收集細菌，用雙蒸餾水沖洗五次，用生理鹽水稀釋成最終濃度為4.times.10.sup.8cells，選擇健康乳牛，在臀部肌肉注射5ml，然后每周注射一次，連續(xù)注射四周，共注射5次，在第五周未，收集接種乳牛牛奶，采用微粘集程序測定抗大腸桿菌抗體，以未免疫注射前的乳牛的牛奶作為對照，表1監(jiān)視其結果。
表1免疫接種前后牛奶抗大腸桿菌滴度對比免疫接種前 免疫接種后05,000
對照表1結果顯示，在免疫接種后抗大腸桿菌抗體滴度顯著升高，證明免疫接種誘發(fā)了高免疫敏感狀態(tài)。
實例2制備復合細菌疫苗從美國菌種培養(yǎng)中心(American Type Culture Collection)獲得下列菌種金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus，ATCC#.11631)、表皮葡萄球菌(staphylococcusepidermidis.155)、釀膿葡萄球菌1型(streptococcus pyogenes.Typel.8671)、3型(Type3.10389)、5型(type 5.12347)、8型(Type 8.12349)、12型(type 12.11434)、14型(type 14.12972)、18型(type 18.12357)、22型(type 22.10403)、產(chǎn)氣桿菌(Aerobacteraerogenes.884)、大腸桿菌(Escherichia Coli.11126)、腸炎(沙門)桿菌(Salmonellaenteritidis 13076)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa 7700)、肺炎桿菌(KlebsiellaPneumoniae.9590)、鼠傷寒(沙門)桿菌(Salmonella typhimurium.13311)、出血桿菌(Haemophilus typhimurium.9333)、普通變形桿菌(Proteus vulgaris 13315)、志賀痢疾桿菌(Shigella dysenteriae.13313)、肺炎雙球菌(Diplococcus pneumoniae.6303)、變異鏈球菌(Strep.sanguinis 10556)、小鏈球菌(Strep.Mitis.6249)、出血鏈球菌(Strep.Sanguinis.10556)、唾液鏈球菌(Strep.Salivarius.13419)、缺乳鏈球菌(Strep.Agalactiae.13813)。每種細菌接種按照規(guī)定，采用合適的培養(yǎng)液，在37℃恒溫下培養(yǎng)48小時，觀察培養(yǎng)是否正常，如果細菌在培養(yǎng)基中生長良好，用離心機分離培養(yǎng)液，細菌用無菌生理鹽水沖洗五次，用60℃溫度滅活2小時，殺死所有細菌，從已滅活的細菌中采集樣本繼續(xù)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)(37℃下培養(yǎng)2小時)，確認無細菌存活，收集的細菌冷凍干燥成為細菌粉，上述每種粉稱取1g，用500ml生理鹽水混懸，并反復稀釋，直至配制成濃度為2.times.10.sup.8 bacterial cells/ml的溶液，(在660nm上顯示1.0光密度單位)。
實施例3用復合疫苗免疫接種乳牛選擇健康乳牛，用實施例1配制的復合細菌疫苗免疫接種乳牛，采用肌肉注射形式，在臀部肌肉注射5ml疫苗，每隔二周相同劑量追加注射一次，共重復追加五次，在第一次注射后5天，采集接種乳牛的牛奶，采用放射免疫法測定復合抗原的抗體滴度，并與未免疫接種前采集的牛奶進行對比，發(fā)現(xiàn)免疫接種后復合抗原的抗體滴度增加百倍，證明接種乳牛處于高敏感免疫狀態(tài)。
實施例4制備免疫球旦白收集免疫接種乳牛的牛奶30升，離心方式脫脂，加1N HCL調PH至4.7，加溫至40℃，持續(xù)30分鐘，用尼龍布過濾去除酪旦白，收集制備奶酪的付產(chǎn)品乳漿20升，直接用真空泵輸入裝有分子量為10,000D超微濾膜的交錯切面流體超濾裝置(TFF)，輸入壓為3Bar，輸出壓為2Bar，棄去上清液，收集的濃縮液直接輸送至裝有分子量為100,000D超微濾膜的上述同樣設備，收集濃縮物直接進行冷凍干燥成粉，得到高純度免疫球旦白干粉。
實施例5制備免疫球旦白收集免疫乳牛的牛奶，脫脂、調酸、加熱，濾除酪旦白，收集乳漿，進行巴氏消毒(溫度為140°F時間持續(xù)15秒)，乳漿直接被泵入交錯切面流體超濾裝置(TFF)(美國Pall公司產(chǎn)品)，選擇超微濾膜的分子量為120,000，濃縮至原容積20％，收集濃縮物直接以140°F的溫度噴霧干燥，得到高純度的免疫球旦白干粉。
實施例6測定免疫球旦白的生物活性用大腸桿菌制備抗原，用該抗原與實施例4中制備的免疫球旦白進行粘集反應，測試反應中，免疫球旦白與抗原特異性結合，滴度達3400，證明免疫球旦白具有生物活性。
實施例7臨床驗證免疫球旦白療效隨機選擇免疫力低下的腹瀉病人8名，服用實施例4制備的免疫球旦白，每人每天服用劑量5g，第二天起7名病人腹瀉次數(shù)明顯減少，第四天起腹瀉停止，無其他任何付反應。
權利要求
1.本發(fā)明涉及一種抗微生物感染的免疫球旦白制劑的制備方法及其應用，尤其涉及一種采用疫苗免疫接種乳牛，誘發(fā)其高敏感狀態(tài)，用其牛奶制備抗微生物感染的免疫球旦白制劑的方法及其應用，其特征是，選擇合適的抗原或抗原組合，制備單價或多價復合抗原疫苗，免疫接種經(jīng)選擇的健康乳牛，監(jiān)測接種乳牛血清以確定其已進入高敏感免疫狀態(tài)，重復追加接種足夠劑量的疫苗以維持其高敏感免疫狀態(tài)，測試牛奶中免疫球旦白的生物活性，從收集的牛奶中，通過采用超微濾膜分離提純的方法，制備高純度抗微生物感染的免疫球旦白。
2.按照權利要求1所述的方法中，本發(fā)明的技術特征是，單獨的抗原或者復合抗原都可以被用作制備接種乳牛的疫苗，抗原類型可以是細菌、病毒、孢子體、螺旋體等微生物或其他物質，只要該抗原可以引發(fā)接種的乳牛進入高敏感免疫狀態(tài)，最適宜的抗原類型是細菌，最好是采用多價抗原形式的滅活細菌疫苗。
3.按照權利要求1所述的方法中，本發(fā)明的技術特征是，選擇的免疫接種對象可以是乳?；蛉檠?，最好是健康乳牛，接種方式可以是皮下注射、皮內注射、靜脈注射、腹膜內注射、乳房內注射、口服、灌腸、肌肉注射等，只要該接種形式能使接種動物致敏，最好的接種方式是肌肉注射，如果肌肉注射不能引發(fā)高敏感免疫狀態(tài)，可以同時采用靜脈注射或乳房內注射的方法聯(lián)合接種，以誘發(fā)接種動物進入高敏感免疫狀態(tài)，接種的劑量要足夠，劑量范圍從1，times，10，sup.6 cells到1.times.10.sup.8cells。
4.按照權利要求1所述的方法中，本發(fā)明的技術特征是，應該監(jiān)測接種乳牛是否對抗原敏感，以及是否已進入高敏感免疫狀態(tài)，有很多已知的方法可以檢測這種敏感性，其中包括皮膚敏感性試驗、測定血清中特異性抗體滴度，最好的方法是分別測試乳牛接種前后血清對多價抗原復合疫苗產(chǎn)生的抗體凝集反應，如果在接種后出現(xiàn)特異性抗體凝集反應，則證實已經(jīng)進入高敏感免疫狀態(tài)。
5.按照權利要求1所述的方法中，本發(fā)明的技術特征是，在首次免疫接種誘發(fā)乳牛高敏感免疫狀態(tài)后，應該重復追加接種注射，以維持這種已誘發(fā)的高敏感免疫狀態(tài)，重復注射應維持足夠的劑量，至少應等于首次接種劑量，必要時可加大劑量，但不超過初始劑量的150％，重復接種的時間和次數(shù)取決于抗原的選擇及組合，通常是每兩周重復注射一次，一般可重復注射4～6次，但在這期間至少每兩周監(jiān)測一次血清抗體凝集反應，如果接種乳牛出現(xiàn)免疫耐受現(xiàn)象，則應停止使用該乳牛的牛奶作為原料制備免疫球旦白。
6.按照權利要求1所述的方法中，本發(fā)明的技術特征是，制備高純度免疫球旦白的方法是，對收集的牛奶采用離心方式脫脂，用酸劑調整牛奶PH至4.5～4.9，最好是PH4.7～4.8，加熱30℃～50℃，最好40℃，加熱時間20分鐘～40分鐘，最好30分鐘，可降溫至4℃后靜置過夜，用濾布過濾器，最好是尼龍濾布過濾器濾除凝集的酪旦白后直接噴霧干燥，或加堿劑，調整PH至6.8～7.0后噴霧干燥成干粉，或者在加熱后直接用離心機離心沉淀酪旦白，離心時間15分鐘～45分鐘，最好30分鐘，離心速度3000～6000轉/分，最好5000轉/分，離心沉淀去除酪旦白后，上清液用分子量為100,000～120,000D的超微濾膜分離過濾、濃縮物濃縮至原體積10～30％時，冷凍干燥或噴霧干燥制備干粉，噴霧干燥時溫度不能超過140°F。
7.按照權利要求1所述的方法中，本發(fā)明的技術特征是，為了保持免疫球旦白的生物活性，所有的工藝均需嚴格控制溫度，牛奶原料進行巴氏消毒時，溫度不能超過140°F，時間不能超過15秒，在整個制備過程中，都要注意控制溫度，在噴霧干燥時，溫度也不能超過140°F。
8.按照權利要求1所述的方法中，本發(fā)明的技術特征是，本發(fā)明制備的免疫球旦白可以制備成多種形式制劑使用，可以直接應用干粉制劑，或加溶液配制成口服液應用，或者與其他藥物輔料混合制備成片劑、膠囊劑、散劑、沖劑、顆粒劑、油劑、乳劑等服用，還可以作為食品添加劑制備成食品使用，如牛奶、奶粉、速溶咖啡、速溶茶、餅干、糕點、冰琪淋等，還可以制備成口香糖、含片形式，以對抗口腔中微生物，或制備成氣霧劑以對抗咽喉或呼吸道微生物，還可以制備成水溶性溶液與超聲霧化裝置共同應用以對抗上呼吸道微生物。
9.按照權利要求1所述的方法中，本發(fā)明的技術特征是，本發(fā)明制備的免疫球旦白制劑，適用于嬰幼兒，尤其適用于未采用母乳喂養(yǎng)的嬰兒預防和治療胃腸道微生物感染；適用于體質虛弱、抵抗力低下、免疫功能低下的人群用來預防和治療胃腸道微生物感染、呼吸道微生物感染、口腔、咽喉部微生物感染；適用于免疫功能低下或免疫功能缺乏的患者用來預防和治療各類微生物感染，尤其是愛滋病病人的胃腸道感染；還適用于長期服用腎上腺皮質激素類藥物的病人所發(fā)生的各類空腔器官感染。
10.按照權利要求1所述的方法中，本發(fā)明的技術特征是，本發(fā)明方法制備的免疫球旦白制劑用于預防和治療各類微生物感染的劑量是0.1～20g/天，較好的范圍是1～10g/天，最好是2～5g/天，取決于感染類型和患者狀態(tài)，長期服用無毒付作用，可以與任何其他藥物或營養(yǎng)成分共同使用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗微生物感染的免疫球蛋白制劑的制備方法及其應用，尤其涉及一種采用疫苗免疫接種乳牛，誘發(fā)其高敏感狀態(tài)，用其牛奶制備抗微生物感染的免疫球蛋白制劑的方法及其應用，其特征是，選擇合適的抗原或抗原組合，制備單價或多價復合抗原疫苗，免疫接種經(jīng)選擇的健康乳牛，監(jiān)測接種乳牛血清以確定其已進入高敏感免疫狀態(tài)，重復追加接種足夠劑量的疫苗以維持其高敏感免疫狀態(tài)，測試牛奶中免疫球蛋白的生物活性，從收集的牛奶中，通過采用超微濾膜分離提純的方法，制備高純度抗微生物感染的免疫球蛋白。
文檔編號A61K35/20GK1557490SQ20041001584
公開日2004年12月29日 申請日期2004年1月15日 優(yōu)先權日2004年1月15日
發(fā)明者高春平 申請人:高春平