專利名稱：從牛初乳中制備多種生物活性物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備多種生物活性物質(zhì)的方法，更具體地說，是一種從牛初乳中同時制備多種生物活性物質(zhì)的系統(tǒng)方法，這種方法可以最大程度利用牛初乳原料，并且降低制造成本。
發(fā)明技術(shù)背景初乳是指分娩后72小時內(nèi)母體分泌的乳液。多年科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，牛初乳含有多種珍貴的生物活性物質(zhì)，具有保健、抗病、抗衰老等功效，其效用可以和人乳相媲美，某些研究人員認為牛乳是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的最有益的人體健康的食品。
牛初乳的研究始于70年代，30多年來各國科學(xué)家在牛初乳成份及其對人體作用方面的研究都有很大進展，綜合目前國際上的研究成果，初乳中的活性物質(zhì)可以分為兩大類免疫因子和生長因子。
牛初乳中的免疫因子可以抵抗病毒、細菌、酵母菌、真菌、過敏原和其他毒素。初乳中含有5種免疫球旦白，分別是IgG，IgD，IgM，IgA和IgE，其中IgG含量最高，在人初乳中，IgG僅占2％左右，而牛初乳中IgG含量可達8％-25％，免疫球旦白對于病毒性感染、細菌性感染、寄生蟲和酵母菌都有良好的防御作用，高質(zhì)量牛初乳中免疫球旦白應(yīng)最低達到20％。牛初乳中至少含有19種致病菌的抗體，包括沙門氏菌、大腸桿菌和鏈球菌的抗體。牛初乳中還含有富脯氨基酸多肽(PRP)，可以調(diào)節(jié)人體胸腺活動而增強人體免疫功能；乳鐵旦白對癌癥、艾滋病感染、皰疹、慢性疲勞等疾病有效；乳清旦白對于癌癥和病毒有很好抵御作用，以及細胞活素和溶菌酶等免疫增強和調(diào)節(jié)物質(zhì)。
牛初乳中還含有豐富的生長因子，醫(yī)學(xué)研究表明，牛初乳中的重要生長因子除了有助于正常的生長之外，對人體組織修復(fù)有重要的作用。牛初乳中含量最豐富的生長因子是類胰島素生長因子I和II(GIF-I和GIF-II)，它們幫助機體有效地進行脂肪代謝和葡萄糖代謝，增加葡萄糖利用，增強糖耐量。牛初乳中還含有轉(zhuǎn)移生長因子(TGFA&B)，血小板誘導(dǎo)生長因子(PDGF)，表皮生長因子、骨髓生長因子等。
目前有多項技術(shù)用來提取制備牛初乳中生物活性物質(zhì)，美國專利4,526,715介紹了一種從牛初乳中通過幾種層析分離步驟制備免疫球旦白的方法。美國專利3,128,230介紹了一種從牛初乳中制備可用于治療各種細菌感染的產(chǎn)品和方法。西德專利2,813,284和歐洲專利EP-A0,046,909及EP-A0,064,103敘述了從初乳中制備含免疫球旦白產(chǎn)品的方法，該產(chǎn)品可作為抗感染產(chǎn)品。中國發(fā)明專利96116428介紹了一種從牛初乳中提取類胰島素生長因子的制備方法。
目前技術(shù)的缺陷為僅從牛初乳中制備某一種特定生物活性成份，而牛初乳中其余珍貴的生物活性成份被廢棄，這無疑是一種資源浪費，也會明顯增加制造成本。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，采用系統(tǒng)的工藝和方法同時從牛初乳中制備多種生物活性成份，最大程度地利用牛初乳這一珍貴資源，同時降低各個單一成份的制備成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是，采用系統(tǒng)方法逐個從牛初乳中提取單個生物活性成份。其特征是，將新鮮收取或冷凍牛初乳用離心方式脫脂，然后用酸制劑將脫脂初乳調(diào)整PH值至強酸性，直接用分子量8000～20,000的超微濾膜進行超濾，收集過濾液，用堿性制劑調(diào)整過濾液PH至接近弱酸性或中性，用分子量3,000～6,000的超微濾膜進行濃縮，濃縮物送入冷凍干燥裝置進行冷凍干燥成粉狀物，內(nèi)含豐富的類胰島素生長因子。第一次超濾的濃縮物加堿性制劑調(diào)整PH至弱酸性或中性并加熱后離心沉淀酪旦白，收集的酪旦白用旦白水解酶在一定溫度下水解，加工制作酪旦白磷酸多肽(CPPs)。殘余的乳清液用分子量80,000～160,000的超濾膜再次濃縮，濃縮物噴霧干燥或冷凍干燥成粉狀物質(zhì)，富含各種免疫球旦白。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案也可以采用另一種方法和程序，其特征是將牛初乳用離心方式脫脂，然后用酸性制劑將脫脂初乳酸化，同時，稀釋脫脂初乳，用低分子量超微濾膜進行超濾分離(分子量8,000～20,000濾膜)，收集過濾液，用堿性制劑調(diào)整過濾液PH至弱酸性或中性，用分子量3,000～6,000的超微濾膜進行濃縮，濃縮物進行冷凍干燥成千粉，內(nèi)含豐富的類胰島素生長因子。第一次超濾濃縮物加堿性制劑調(diào)整PH至弱酸性或中性后，直接用分子量80,000～160,000的超微濾膜進行超濾分離，分離濃縮物直接采用冷凍干燥或噴霧干燥的方法制備富含免疫球旦白的干粉。而過濾液高溫旦白變性后加入旦白水解酶在一定溫度條件下進行旦白水解過程，結(jié)束時高溫滅活旦白水解酶，噴霧干燥成干粉，其中，含有豐富的酪旦白磷酸多肽。如果希望制備高純度磷酸多肽，可以在酪旦白水解結(jié)束后，用分子量4,000～10,000的超濾膜進行超濾分離，過濾液噴霧干燥，即可獲得高純度磷酸多肽。
通過上述工藝和方法，從牛初乳中加工制備高生物活性類胰島素生長因子(IGF-1)制劑、酪旦白磷酸多肽(CPPs)制劑和高生物活性的免疫球旦白制劑，本發(fā)明的技術(shù)特征是，收集的牛初乳是母牛分娩三日內(nèi)(72小時)的牛初乳，收集的牛初乳是新鮮或冷凍狀態(tài)(4℃)，對收集的牛初乳進行脫脂程序，可以采用冷凍離心的方法，離心速度2,000～4,000轉(zhuǎn)/分，最佳為3,000轉(zhuǎn)/分，離心時溫度不高于10～28℃，離心后去除離心液表面的脂肪。
本發(fā)明的技術(shù)特征是，采用酸制劑調(diào)整脫脂初乳的PH值至強酸性，采用的酸制劑可以是HCL或其他酸制劑，調(diào)整PH值至2.2～3.5，優(yōu)選2.8～2.9，調(diào)整PH值至規(guī)定的區(qū)間后，采用分子量為8,000～20,000的超濾膜，采用常規(guī)超濾設(shè)備，最理想的是采用切面交錯流體超濾設(shè)備進行分離，收集過濾液，用堿性制劑調(diào)整過濾液的PH值至5.5～7.5，優(yōu)選5.8～6.2，調(diào)整PH值后的過濾液采用分子量為3,000～6,000的超濾膜，優(yōu)選為分子量4,000～5,000超濾膜采用常規(guī)超濾設(shè)備濃縮至起始容量10％～60％，優(yōu)選20％～30％后，送至冷凍干燥設(shè)備，制備冷凍干燥粉，內(nèi)含豐富的類胰島素生長因子。在調(diào)整PH值后，也可以在過濾液中加入相當于過濾液1倍～5倍，優(yōu)選2倍～3倍的無菌蒸鎦水稀釋過濾液后進行濃縮，尤其采用切面交錯流體超濾裝置時更應(yīng)采用后一步驟。與此同時，收集第一次超濾分離的濃縮物，加堿性制劑，可以是NaOH也可以是其他堿性制劑，調(diào)整濃縮物PH至弱酸性或中性，PH值3.8～5.2，優(yōu)選4.5～4.8，調(diào)整濃縮物PH值后，加熱析出酪旦白，加熱溫度40℃～55℃，最好45℃～50℃，加熱時間15分鐘～90分鐘，最好30分鐘～45分鐘，最好是加熱至看到乳水明顯分離，然后用離心機離心沉淀析出酪旦白，離心速度3,000～6,000轉(zhuǎn)/分，優(yōu)選5,000轉(zhuǎn)/分，收集離心上清液，用分子量80,000～160,000的超微濾膜進行分離和濃縮，濃縮物冷凍干燥或噴霧干燥成干粉，即獲得含生物活性免疫球旦白的制劑。而離心沉淀的酪旦白被收集后，在75℃～85℃下加熱10～30分鐘，然后加入胰旦白酶和/或胰凝乳旦白酶，其中酶的重量與旦白重量約0.4～1.2％，在溫度30℃～50℃和PH值6.5～8.0條件下進行2～6小時，在水解過程結(jié)束后，歷經(jīng)10分鐘85℃或45秒130℃的酶滅活程序，然后噴霧干燥成含有大量磷酸多肽的旦白水解產(chǎn)物，如果希望得到更高純度的磷酸多肽，在高溫酸滅活程序后，將旦白水解溶液用分子量為4,000～10,000的超微濾膜分離過濾，過濾液噴霧干燥，即可得到高純度的酪旦白磷酸多肽制劑。
本發(fā)明的技術(shù)特征是，為了制備高生物活性的免疫球旦白制劑，在脫脂初乳酸化用分子量為8,000～20,000的超濾膜分離后，濃縮物加入1倍～5倍，優(yōu)選2倍～3倍的蒸餾水稀釋，直接采用分子量為80,000～160,000，優(yōu)選分子量為100,000～120,000的超微濾膜，采用超濾分離設(shè)備，優(yōu)選切面交錯流體過濾(TFF)設(shè)備進行分離，濃縮物直接冷凍干燥成粉，內(nèi)含高生物活性的免疫球旦白，也可以采用噴霧干燥方法干燥成粉，而含有大量酪旦白的過濾液可以調(diào)整PH至4.5～4.8，優(yōu)選4.7，加熱50℃，半小時至1小時后，用離心機離心沉淀，離心速度5,000轉(zhuǎn)/分，收集沉淀物，進行旦白水解過程。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的優(yōu)點是，采用系統(tǒng)方法，一次性從牛初乳中提取多種生物活性物質(zhì)，減少了原材料采集、運輸、保藏的費用，而且一次系統(tǒng)加工過程獲得多種收益，大幅度降低了加工成本。同時本發(fā)明的工藝中采取的措施保護了生物活性物質(zhì)的生物活性，臨床使用效果更佳。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明實施例1收集母牛分娩后3日內(nèi)分泌的牛初乳，冷凍離心脫脂，速度為3,000轉(zhuǎn)/分，離心時間為30分鐘，去除離心液上層脂肪，在脫脂初乳內(nèi)滴入2N HCL調(diào)整PH值至2.8，采用裝有分子量為10,000超微濾膜的美國Pall公司生產(chǎn)的切面交錯流體過濾設(shè)備(TFF)進口壓為3500千克/厘米2，出口壓0.4千克/厘米2，料液溫度＜35℃，收集過濾液，用2N NaOH調(diào)PH至6.5，過濾液繼續(xù)用同樣設(shè)備和參數(shù)，但改用分子量為5,000的超微濾膜進行濃縮，棄去過濾液，收集濃縮液，送入冷凍干燥裝置冷凍干燥成粉，制備內(nèi)含豐富類胰島素生長因子的制劑。
同步收集第一次過濾分離的濃縮液，用2N NaOH調(diào)節(jié)PH值至4.7，加熱至50℃，30分鐘，使酪旦白凝固，用5000轉(zhuǎn)/分速度離心15分鐘，收集離心上清液，用分子量100,000的超濾膜及上述超濾裝置濃縮，濃縮物直接噴霧干燥成粉，制備含有免疫球旦白的制劑。
收集離心沉淀的酪旦白，進行預(yù)熱處理，在75℃溫度下保持30分鐘，冷卻至50℃時加胰旦白酶，胰旦白酶占旦白重量1％，在30℃～50℃溫度下進行2～6小時，在水解結(jié)束后，向水解產(chǎn)物內(nèi)注入130℃蒸汽45分鐘，噴霧干燥成粉，制備含有豐富酪旦白磷酸多肽的制劑。
實施例2收集牛初乳。以2000轉(zhuǎn)/分速度離心脫脂，用2N HCL滴入調(diào)節(jié)脫脂初乳至PH2.9，采用12,000分子量的超微濾膜用板框式超濾器過濾分離，過濾液用2N NaOH調(diào)整PH至6.2，換用分子量為4,000的超濾膜在板框式超濾器濃縮，濃縮物冷凍干燥成內(nèi)含豐富類胰島素生長因子的干粉。第一次超濾分離的濃縮物用2N NaOH調(diào)節(jié)PH至4.7，用分子量為120,000的超濾膜分離，濃縮液直接冷凍干燥成粉，含有大量生物活性物質(zhì)的免疫球旦白。而過濾液加熱至85℃溫度下20分鐘預(yù)熱，冷卻至45℃時加入胰凝乳旦白酶，占旦白重量的0.8％，在30-50℃溫度保持2-6小時，用85℃加熱1分鐘滅活酶，旦白水解液用分子量為10,000的中空纖維或超濾膜分離過濾，過濾液在85℃溫度下噴霧干燥成酪旦白磷酸多肽粉。
權(quán)利要求
1.一種從牛初乳中同時制備多種生物活性物質(zhì)的系統(tǒng)方法，其特征是在牛初乳脫脂后酸化，使類胰島素生長因子和結(jié)合旦白脫離，采用超濾方法分離類胰島素生長因子，分離液經(jīng)濃縮后制備冷凍干燥粉，然后通過超濾方法分離免疫球旦白，濃縮后制備粉末物，同時采用超濾或調(diào)整PH值后加熱凝固方式獲取酪旦白，經(jīng)水解旦白酶作用后制備酪旦白磷酸多肽，采用這種方法可以最大程度地利用牛初乳原料，大幅度降低制造成本。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，采用系統(tǒng)方法逐個從牛初乳中提取單個生物活性成份，其特征是，將新鮮收取或冷凍牛初乳用離心方式脫脂，然后用酸制劑將脫脂初乳調(diào)整PH值至強酸性，直接用分子量8,000～20,000的超微濾膜進行超濾，收集過濾液，用堿性制劑調(diào)整過濾液PH至接近弱酸性或中性，用分子量3,000～6,000的超微濾膜進行濃縮，濃縮物送入冷凍干燥裝置進行冷凍干燥成粉狀物，內(nèi)含豐富的類胰島素生長因子；第一次超濾的濃縮物加堿性制劑調(diào)整PH至弱酸性或中性，并加熱后離心沉淀酪旦白，收集的酪旦白用旦白水解酶在一定溫度下水解，加工制作酪旦白磷酸多肽(CPPS)；殘余的乳清液用分子量80,000～160,000的超濾膜再次濃縮，濃縮物噴霧干燥或冷凍干燥成粉狀物質(zhì)，富含各種免疫球旦白。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，本發(fā)明的技術(shù)解決方案也可以采用另一種方法和程序，將牛初乳用離心方式脫脂，然后，用酸性制劑將脫脂初乳酸化，同時，稀釋脫脂初乳，用低分子量超微濾膜進行超濾分離(分子量8,000-20,000濾膜)收集過濾液，用堿性制劑調(diào)整過濾液PH至弱酸性或中性，用分子量3,000-6,000的超微濾膜進行濃縮，濃縮物進行冷凍干燥成干粉，內(nèi)含豐富的類胰島素生長因子；第一次超濾濃縮物加堿性制劑調(diào)整PH至弱酸性或中性后，直接用分子量80,000-160,000的超微濾膜進行超濾分離，分離濃縮物直接采用冷凍干燥或噴霧干燥的方法制備富含免疫球旦白的干粉；而過濾液高溫旦白變性后加入旦白水解酶在一定溫度條件下進行旦白水解過程，結(jié)束時高溫滅活旦白水解酶，噴霧干燥成干粉，其中，含有豐富的酪旦白磷酸多肽，如果希望制備高純度磷酸多肽，可以在酪旦白水解結(jié)束后，用分子量4,000-10,000的超濾膜進行超濾分離，過濾液噴霧干燥，即可獲得高純度磷酸多肽。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，通過該工藝和方法，從牛初乳中加工制備高生物活性類胰島素生長因子(IGF-1)制劑、酪旦白磷酸多肽(CPPs)制劑和高生物活性的免疫球旦白制劑。
5.按照權(quán)利要求1所述的方法，本發(fā)明的技術(shù)特征是，收集的牛初乳是母牛分娩三日內(nèi)(72小時)的牛初乳，收集的牛初乳是新鮮或冷凍狀態(tài)(4℃)，對收集的牛初乳進行脫脂程序，可以采用冷凍離心的方法，離心速度2,000～4,000轉(zhuǎn)/分，(最佳為3,000轉(zhuǎn)/分，離心時溫速度不高于10℃～28℃，離心后去除離心液表面的脂肪。
6.按照權(quán)利要求1所述的方法，本發(fā)明的技術(shù)特征是，采用酸制劑調(diào)整脫脂初乳的PH值至強酸性，采用的酸制劑可以是HCL或其他酸制劑，調(diào)整PH值至2.2～3.5，優(yōu)選2.8～2.9，調(diào)整PH值至規(guī)定的區(qū)間后，采用分子量為8,000～20,000的超濾膜，采用常規(guī)超濾設(shè)備，最理想的是采用切面交錯流體超濾設(shè)備進行分離，收集過濾液，用堿性制劑調(diào)整過濾液的PH值至5.5～7.5，優(yōu)選5.8～6.2，調(diào)整PH值后的過濾液采用分子量為3,000～6,000的超濾膜，優(yōu)選為分子量4,000～5,000超濾膜采用常規(guī)超濾設(shè)備濃縮至起始容量10％～60％，優(yōu)選20％～30％后，送至冷凍干燥設(shè)備，制備冷凍干燥粉，內(nèi)含豐富的類胰島素生長因子，在調(diào)整PH值后，也可以在過濾液中加入相當于過濾液1倍～5倍，優(yōu)選2倍～3倍的無菌蒸鎦水稀釋過濾液后進行濃縮，尤其采用切面交錯流體超濾裝置時更應(yīng)采用后一步驟，與此同時，收集第一次超濾分離的濃縮物，加堿性制劑，可以是NaOH也可以是其他堿性制劑，調(diào)整濃縮物PH至弱酸性或中性，PH值3.8～5.2，優(yōu)選4.5～4.8，調(diào)整濃縮物PH值后，加熱析出酪旦白，加熱溫度40℃～55℃，最好45℃～50℃，加熱時間15分鐘～90分鐘，最好30分鐘～45分鐘，最好是加熱至看到乳水明顯分離，然后用離心機離心沉淀析出的酪旦白，離心速度3,000～6,000轉(zhuǎn)/分，優(yōu)選5,000轉(zhuǎn)/分，收集離心上清液，用分子量80,000～160,000的超微濾膜進行分離和濃縮，濃縮物冷凍干燥或噴霧干燥成干粉，即獲得含生物活性免疫球旦白的制劑，而離心沉淀的酪旦白被收集后，在75℃～85℃下加熱10～30分鐘，然后加入胰旦白酶和/或胰凝乳旦白酶，其中酶的重量與旦白重量約0.4～1.2％，在溫度30℃～50℃和PH值在6.5～8.0條件下進行2～6小時，在水解過程結(jié)束后，歷經(jīng)10分鐘85℃或45秒130℃的酶滅活程序，然后噴霧干燥成含有大量磷酸多肽的旦白水解產(chǎn)物，如果希望得到更高純度的磷酸多肽，在高溫酸滅活程序后，將旦白水解溶液用分子量為4,000～10,000的超微濾膜分離過濾，過濾液噴霧干燥，即可得到高純度的酪旦白磷酸多肽制劑。
7.按照權(quán)利要求1所述的方法，本發(fā)明的技術(shù)特征是，為了制備高生物活性的免疫球旦白制劑，在脫脂初乳酸化、用分子量為8,000～20,000的超濾膜分離后，濃縮物加入1倍～5倍，優(yōu)選2倍～3倍的蒸餾水稀釋，直接采用分子量為80,000～160,000，優(yōu)選分子量為100,000～120,000的超微濾膜，采用超濾分離設(shè)備，優(yōu)選切面交錯流體過濾(TFF)設(shè)備進行分離，濃縮物直接冷凍干燥成粉，或采用噴霧干燥方法干燥成粉，內(nèi)含高生物活性的免疫球旦白，而含有大量酪旦白的過濾液可以調(diào)整PH至4.5～4.8，優(yōu)選4.7，加熱50℃，半小時至1小時后，用離心機離心沉淀，離心速度5,000轉(zhuǎn)/分，收集沉淀物，進行旦白水解過程。
全文摘要
一種從牛初乳中同時制備多種生物活性物質(zhì)的系統(tǒng)方法，特征是在牛初乳脫脂后酸化，使類胰島素生長因子和結(jié)合蛋白脫離，采用超濾方法分離類胰島素生長因子，分離液經(jīng)濃縮后制備冷凍干燥粉，然后通過超濾方法分離免疫球蛋白，濃縮后制備粉末物，同時采用超濾或調(diào)整pH值后加熱凝固方式獲取酪蛋白，經(jīng)水解蛋白酶作用后制備酪蛋白磷酸多肽，采用這種方法可以最大程度利用牛初乳原料，大幅度降低制造成本。
文檔編號A61K35/20GK1557837SQ200410015868
公開日2004年12月29日 申請日期2004年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月15日
發(fā)明者高春平 申請人:高春平