專利名稱：采用生物反應(yīng)器制備雙層活性人工皮膚組織的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種制備具有真皮和表皮雙層結(jié)構(gòu)的活性人工皮膚組織的方法，特別涉及一種采用生物反應(yīng)器制備活性人工皮膚組織的方法。
背景技術(shù)：
皮膚是人體最大的器官，起著保護機體內(nèi)環(huán)境并維持其穩(wěn)定的作用，由于其處于人體的體表，易受各種損傷和產(chǎn)生疾病。以皮膚移植治療各種急性和慢性皮膚病已有幾千年歷史，傳統(tǒng)治療方法是采用自體或異體移植，但由于自體移植皮膚來源有限，異體皮膚移植存在排斥反應(yīng)、傳播疾病、保藏困難等問題，難以滿足患者移植需要。近年來，皮膚移植已開始從自體皮膚移植和同種異體移植發(fā)展到組織工程化皮膚替代物移植，尋求理想的永久性皮膚替代物成為人們夢寐以求的目標。
組織工程化皮膚分為表皮替代物、真皮替代物和雙層活性皮膚。1975年Rheinwald和Green建立了角質(zhì)細胞體外培養(yǎng)和擴增技術(shù)(RheinwaldJG，Green H.Serial cultivation of human epidermal keratinocytesthe formationof keratining colonies from single cell.Cell，1975，6331-336)，隨后O’Connor和Gallico分別報道了體外培養(yǎng)的表皮替代物用于治療燒傷患者并獲得成功(O’Connor NE，Mulliken JB，Banks-Schlegel S，et al.Graftingof burns with cultured epithelium prepared form autologous epidermalcell.Lancet，1981，175.Gallico GG，O’connor NE，Comton CC，etal.Permanent coverage of large burn wounds with autologous cultured humanepithelium.N Engl J Med，1984，311448-451)。目前這類替代物在治療大面積燒傷時仍有應(yīng)用，但其存在以下缺點培養(yǎng)周期長，抗感染能力差，缺乏真皮成分，收縮大，不耐磨，易破潰，彈性欠佳，移植成功率低，因而在臨床應(yīng)用上受到一定限制。為了克服這些問題，研究者開發(fā)了真皮替代物，其可提高表皮替代物移植成功率和改善愈合質(zhì)量，且已有多種商品化的真皮替代物已應(yīng)用于臨床。Integra是由美國Integra lifesciences公司生產(chǎn)的膠原-氨基多糖真皮替代物(Phillips TJ，Arch Dermatol，1998，110(6)344-349.)，其缺點是價格昂貴，不能廣泛應(yīng)用，植入后不易觀察創(chuàng)面早期感染情況，尤其是需二次手術(shù)才能封閉創(chuàng)面。Hansbrough等將成纖維細胞接種至聚乳酸網(wǎng)構(gòu)建真皮替代物，并命名為Dermagraft，臨床上已成功用于治療糖尿病性潰瘍。單純真皮替代物由于缺少表皮的防護，感染率高。
理想的皮膚替代物應(yīng)是能夠?qū)⑺笔У恼嫫ず捅砥油瑫r修復(fù)，美國Organogenesis公司生產(chǎn)的Apligraf是第一種雙層活性的皮膚替代物，其真皮層是由成纖維細胞、牛I型膠原、培養(yǎng)基等組成的凝膠，表面接種角質(zhì)細胞，體外培養(yǎng)20天左右構(gòu)成雙層皮膚組織，臨床證明對各種頑固性和慢性皮膚潰瘍有一定療效，但因該產(chǎn)品及其制備工藝存在嚴重缺陷，導(dǎo)致臨床應(yīng)用受阻，如膠原凝膠嚴重收縮，抗膠原酶降解能力差，且由于人工皮膚構(gòu)建是在培養(yǎng)皿中靜止條件下進行，細胞培養(yǎng)環(huán)境無法控制，營養(yǎng)物及副產(chǎn)物的傳遞能力有限，不利于膠原凝膠內(nèi)部細胞生長，加之手工操作，造成生產(chǎn)過程復(fù)雜，組織均一性和質(zhì)量穩(wěn)定性得不到保障。
美國專利RE35,399和中國發(fā)明專利(申請?zhí)?1109937.9)闡述了一種雙層皮膚替代物的制備方法，該皮膚替代物是由三部分組成培養(yǎng)的角質(zhì)細胞構(gòu)成表皮，中間是無孔膠原層，在多孔、交聯(lián)化的膠原海綿基質(zhì)上培養(yǎng)成纖維細胞構(gòu)成真皮層。首先從皮膚樣品中分離角質(zhì)細胞和成纖維細胞，經(jīng)體外培養(yǎng)后，將成纖維細胞接種到膠原海綿上，把海綿的另一面制成無孔膠原，將角質(zhì)細胞“滴降”到無孔膠原上，培養(yǎng)后形成皮膚替代物。由于該皮膚替代物是在培養(yǎng)皿中生產(chǎn)的，一方面造成接種的成纖維細胞大部分截留在膠原海綿表面，并且在膠原海綿中分布不均勻，使構(gòu)建的組織在解剖學結(jié)構(gòu)上與天然組織有很大差別，另一方面如上所述靜止培養(yǎng)過程不利于細胞生長和基質(zhì)分泌，再者各培養(yǎng)皿之間、批與批之間的差異較大。
Halberstadt(Halberstadt CR，Hardin R，Bezverkov K，et al.The in vitrogrowth of a three-dimensional human dermal replacement using a single-passperfusion system，Biotechnol Bioeng，1994，43740-746.)等人將2×105cells/cm2的人成纖維細胞接種到PGA/PLA材料制成的多孔網(wǎng)狀支架上，通過一種封閉的單向灌注培養(yǎng)系統(tǒng)，經(jīng)過2-～3周的培養(yǎng)可以構(gòu)建出具有生物學活性的真皮替代物，并可有效地重復(fù)生產(chǎn)真皮組織替代物。其優(yōu)點在于與靜止培養(yǎng)相比可以縮短真皮構(gòu)建的時間；PGA/PLA支架材料的降解速度可控；構(gòu)建的人工真皮可直接冷凍保存；但此系統(tǒng)只限于構(gòu)建人工真皮。
Prenosil和Villeneuve(Prenosil JE，Villeneuve PE.Automated productionof cultured epidermal autograpts and sub-confluent epiderlmal autografts in acomputer controlled bioreactor.Biotechnol Bioeng，1998，59679-683.)將人的表皮細胞直接接種到FEP膜上，而FEP膜放置在聚碳酸酯生長室內(nèi)，多個生長室可堆疊起來，通過連接在一個多管道的蠕動泵上，可以自動進行流量控制。其優(yōu)點在于由于聚碳酸酯材料做的支撐板是透明的，可以監(jiān)測表皮的形成情況。同樣，此反應(yīng)器系統(tǒng)只限于構(gòu)建表皮替代物，無法實現(xiàn)雙層活性皮膚的體外構(gòu)建。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是公開一種采用生物反應(yīng)器制備雙層活性人工皮膚組織的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，滿足有關(guān)領(lǐng)域的需要。
本發(fā)明的方法包括如下步驟(1)以復(fù)合膠原海綿為支架材料，置于灌注式生物反應(yīng)器的多孔支架上，加入含5～15％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基，浸泡過夜，棄培養(yǎng)基，按1×105cells/cm2～5×106cells/cm2細胞密度將成纖維細胞懸液加入反應(yīng)器中，通過蠕動泵進行灌注接種，至培養(yǎng)液中殘留的細胞密度低于接種密度的5～20％后，進行灌注培養(yǎng)，同時檢測反應(yīng)器出口處培養(yǎng)液中葡萄糖濃度。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基灌注速度為0.5～4d-1，控制出口處葡萄糖濃度不低于1.0～2.0g/L。在此反應(yīng)器中經(jīng)10～20d的灌注培養(yǎng)，完成真皮構(gòu)建；(2)用角質(zhì)細胞無血清培養(yǎng)基代替新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在上述人工真皮上按密度1×105cells/cm2～5×106cells/cm2接種角質(zhì)細胞，靜止培養(yǎng)1～2d后，用角質(zhì)細胞培養(yǎng)基灌注培養(yǎng)2～5d，灌注速率為0.5～2d-1。而后去除角質(zhì)細胞無血清培養(yǎng)基，采用含2～10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基進行氣液界面培養(yǎng)，同時檢測反應(yīng)器出口處培養(yǎng)液中葡萄糖濃度，控制灌注速率為0.5～4d-1，使葡萄糖濃度不低于1.0～2.0g/L。培養(yǎng)8～14d后，完成表皮構(gòu)建。
所說的復(fù)合膠原海綿由氨基多糖類物質(zhì)和膠原溶液組成，氨基多糖類物質(zhì)含量為膠原干重的5～25％(g/g)；所說的氨基多糖類物質(zhì)包括殼聚糖、6-硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸或肝素納中的一種或一種以上。
其中所說的膠原溶液為牛筋去筋膜、脂質(zhì)制成的肌腱粉末浸泡于醋酸溶液中而獲得的膠原-HAc溶液，其濃度一般為5.0～10.0mg/mL，該膠原-HAc溶液是這樣制備的牛筋去筋膜、脂質(zhì)制成肌腱粉末，浸泡于醋酸溶液中，制得終濃度為8.0mg/mL的膠原-HAc溶液?；蛘咧苯淤徺I商品化的膠原，配制成終濃度為5.0～10.0mg/mL的膠原-HAc溶液。
所說的復(fù)合膠原海綿是這樣制備的將殼聚糖、6-硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸和肝素納一種或一種以上加入膠原-HAc溶液，-20℃冰箱冷凍過夜，真空冷凍干燥24hr，采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(Sigma)對膠原海綿進行化學交聯(lián)，清洗，凍干，消毒，即獲得所說的復(fù)合膠原海綿。此復(fù)合膠原海綿經(jīng)1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺交聯(lián)后，能夠克服單純膠原凝膠或膠原海綿機械強度不夠、收縮率高、降解速度過快、戊二醛交聯(lián)具細胞毒性等缺點，并且可改善材料的生物相容性，促進在三維支架材料上細胞的貼附和增殖；所說的角質(zhì)細胞為從表皮組織中分離的角質(zhì)細胞，分離方法為一種常規(guī)的方法，在Johnson EW，Meunier SF，Roy CJ，Parenteau NL.Serialcultivation of normal human keratinocytesa defined system for studying theregulation of growth and differentiation.In Vitro Cell Dev Biol，1992，28A429-435.文獻中已經(jīng)有詳細的報道；所說的成纖維細胞為從真皮組織中分離的成纖維細胞，分離方法為一種常規(guī)的方法，在Halberstadt CR，Hardin R，Bezverkov K，et al.The in vitrogrowth of a three-dimensional human dermal replacement using a single-passperfusion system，Biotechnol Bioeng，1994，43740-746.文獻中已經(jīng)有詳細的報道；所說的灌注式生物反應(yīng)器在中國專利申請?zhí)?00410016651.6中有公開的描述。
所說的角質(zhì)細胞無血清培養(yǎng)基在中國專利申請?zhí)?00410016367.9中有詳細的描述，其特征在于此無血清培養(yǎng)基為一種水溶液，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和以下的組分基礎(chǔ)培養(yǎng)基12-18g/L組氨酸0.1-1.0mmol/L異亮氨酸 0.1-0.6mmol/L色氨酸0.05-0.3mmol/L苯丙氨酸 0.3-0.6mmol/L賴氨酸0.7-1.2mmol/L甲硫氨酸 0.05-0.3mmol/L酪氨酸0.3-0.6mmol/L
角質(zhì)細胞生長因子 20-200ng/L和/或表皮生長因子5-20ng/L泛酸鹽 0.02-0.04mmol/L氯化膽堿 0.1-0.5mmol/L葉酸 0.01-0.03mmol/L肌糖 0.1-0.4mmol/L煙酰胺 0.05-0.5mmol/L維生素B6 0.02-0.06mmol/L核黃素 0.001-0.01mmol/L硫胺 0.01-0.03mmol/L胰島素 1-20μg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白 1-20μg/L乙醇胺 0.01-0.05mmol/L磷酸乙醇胺 0.01-0.05mmol/L氯化鍶 1-5mmol/L牛血清白蛋白 5-20μg/L氫化可的松 0.1-1μg/L三碘甲狀腺胺 10-40pmol/L氯化鈣 0.03-0.5mmol/L氯化鎂 5-10mmol/L抗氧化劑 適量青霉素 50-200U/L鏈霉素 50-200U/L所說的基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括MCDB153、無鈣DMEM或無鈣DMEM與Ham′s F12以體積比為1∶0.3～3的混合物。
所說的抗氧化劑包括巰基乙醇0.01-0.05mmol/L和/或過氧化氫酶50-150U/L和/或超氧化物歧化酶50-150U/L和/或亞硒酸鈉0.01-0.05mmol/L。
采用新型的生物反應(yīng)器系統(tǒng)，可以在同一反應(yīng)器中構(gòu)建具有真皮層和表皮層的雙層活性人工皮膚，避免了以往生物反應(yīng)器系統(tǒng)只可構(gòu)建人工真皮或人工表皮的局限性，同時通過反應(yīng)器的疊加，使一次制備過程可以同時構(gòu)建多塊人工皮膚，與手工操作相比，制備過程更有效且可重復(fù)。
采用生物反應(yīng)器系統(tǒng)制備具真皮和表皮雙層結(jié)構(gòu)的活性人工皮膚，使制成的人工皮膚具一定機械強度、延緩降解速度、細胞和胞外基質(zhì)在材料中分布均勻，制備周期短，生產(chǎn)可重復(fù)，批與批之間差異小等特點。
與以往制備方法相比，采用灌注接種和培養(yǎng)方式，一方面物質(zhì)的傳遞方式由被動擴散變成主動傳遞，使細胞在膠原海綿中的分布更均勻，有利于組織的形成、細胞生長和細胞胞外基質(zhì)的分泌，在此動態(tài)培養(yǎng)環(huán)境中，一定程度上能夠減輕營養(yǎng)物和副產(chǎn)物的擴散限制，降低了在三維材料內(nèi)部營養(yǎng)物耗竭和副產(chǎn)物毒性對細胞正常生長和代謝的影響，從而進一步改善工程化組織的結(jié)構(gòu)、成分和功能；另一方面采用灌注培養(yǎng)方式，根據(jù)反應(yīng)器進出口葡萄糖濃度的變化，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的灌注策略，維持培養(yǎng)環(huán)境在一個相對穩(wěn)定的水平，使之更接近體內(nèi)細胞和組織穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，促進細胞增殖和功能表達，縮短培養(yǎng)時間，使構(gòu)建的組織在解剖學結(jié)構(gòu)上更接近于天然組織。


圖1為灌注式生物反應(yīng)器系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖。
圖2為反應(yīng)器結(jié)果示意圖。
具體實施例方式
參見圖1和圖2，本發(fā)明用于雙層活性皮膚組織體外構(gòu)建的灌注式生物反應(yīng)器系統(tǒng)，包括加液裝置、灌注式生物反應(yīng)器、收液裝置、液體回流裝置和供氣裝置；所說的灌注式生物反應(yīng)器包括設(shè)有上蓋1的封閉容器2；設(shè)置在封閉容器2中將封閉容器2分隔為上室3和下室4的多孔支撐板5，設(shè)置在多孔支撐板5上方靠近封閉容器2內(nèi)壁的緊固密封件6；用于皮膚構(gòu)建的支架材料或細胞材料復(fù)合物7平放在多孔支撐板5上，并通過緊固密封件6固定，表皮層構(gòu)建時多孔支撐板5可提供氣液界面；上室3設(shè)有液體入口8和液體出口9，下室設(shè)有液體入口8和液體出口9，上蓋1設(shè)有液體入口8、氣體入口10和氣體出口11，上蓋1下方設(shè)有液體分布器101，用于分布從上蓋1的液體入口8進入的培養(yǎng)基。
所說的加液裝置與灌注式生物反應(yīng)器的液體入口8相連接，所說的收液裝置與灌注式生物反應(yīng)器的液體出口9相連接，所說的液體回流裝置通過管線分別與加液裝置和收液裝置相連通，所說的供氣裝置通過管線與灌注式生物反應(yīng)器的氣體入口10相連通；所說的加液裝置包括加液蠕動泵12和與其相連接的加液儲液瓶13，加液儲液瓶13通過管線與灌注式生物反應(yīng)器的液體入口8相連通，由于所說的生物反應(yīng)器有三個液體入口8，接種時選用上蓋1的液體入口8，灌注培養(yǎng)可能選擇邊側(cè)的液體入口8，因此最好在加液蠕動泵12與灌注式生物反應(yīng)器的各個液體入口8相連的管路之間設(shè)置控制閥門26，以控制液體從哪個入口8進入；所說的收液裝置包括收液蠕動泵14、收液儲液瓶15、收液控制閥16和收液瓶17，收液蠕動泵14的進口與灌注式生物反應(yīng)器的液體出口9相連通，收液蠕動泵14的出口與收液儲液瓶15的入口相連通，收液儲液瓶15的出口通過儲液蠕動泵25與收液瓶17相連通，收液控制閥16設(shè)置在收液儲液瓶15與儲液蠕動泵25之間的管線上，用于控制收液量，生物反應(yīng)器各個出口與收液蠕動泵14之間設(shè)有控制閥門26。
所說的液體回流裝置包括通過回流管線19設(shè)置在收液儲液瓶15與加液儲液瓶13之間的回流控制閥18；
所說的供氣裝置包括依次相互連接的空氣泵20、空氣流量計21和空氣過濾器22，空氣過濾器22與灌注式生物反應(yīng)器相連接；所說的檢測裝置包括插在加液儲液瓶13、收液儲液瓶15中的溶氧電極23和收液儲液瓶15中的pH電極24，溶氧電極23和pH電極24分別與溶氧測定儀和pH測定儀連接，以檢測和控制加液儲液瓶13、收液儲液瓶15中培養(yǎng)基的溶氧濃度和pH。
由圖1可見，可將多個所說的灌注式生物反應(yīng)器并聯(lián)連接，以滿足擴大生產(chǎn)量的需要。
實施例1取幼兒包皮，剪成1cm2左右的皮膚塊，用含有200U/mL慶大霉素的PBS清洗3遍，75％酒精清洗2遍，再用PBS清洗2遍。將皮膚組織加入到200U/mL的中性蛋白酶(Sigma)中，4℃下消化18hr，使真皮和表皮分離。從表皮組織中獲得角質(zhì)細胞，從真皮組織中獲得成纖維細胞。
將表皮剪碎，用0.25％的胰酶(Sigma)/0.06％EDTA共6mL(胰酶/EDTA消化液的體積大約為被消化組織體積的3倍)作用8min，并用等量的小牛血清中和胰酶活性。
150目篩網(wǎng)過濾，除去表皮碎塊，獲角質(zhì)細胞懸液。2000r/min離心5min，倒去上清，PBS清洗2遍，加入含200U/mL慶大霉素的角質(zhì)細胞無血清培養(yǎng)基(Gibco)，細胞接種量為2×104cells/cm2，每個25cm2的培養(yǎng)瓶(Nunc)中加培養(yǎng)基5mL，在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱(Revco)中培養(yǎng)，每三天換液一次，獲得原代培養(yǎng)的細胞。當細胞長滿方瓶底面積的75％時，進行傳代培養(yǎng)，倒去上清液，加入1.5mL的胰酶進行消化，當細胞變圓、脫落后加入等量小牛血清終止胰酶活性，細胞懸液用2000r/min的速度離心5min后倒去上清，PBS清洗兩遍，加入培養(yǎng)基，接種至方瓶或生物反應(yīng)器系統(tǒng)進行傳代培養(yǎng)和擴增，獲得構(gòu)建表皮層所需的角質(zhì)細胞。
真皮部分剪碎，加入0.05％的膠原酶(Gibco)溶液，在37℃條件下酶解40min；過濾除去殘余碎片，細胞以PBS洗滌并離心收集，成纖維細胞懸浮液按照接種量5×104/cm2接種在方瓶中原代培養(yǎng)，用含10％小牛血清的DMEM(Gibco)為培養(yǎng)基，每3天換液一次。待成纖維細胞鋪滿方瓶底部約80％左右，用0.25％胰酶液消化，按2×104/cm2的接種量在方瓶或生物反應(yīng)器中傳代培養(yǎng)和擴增，獲得構(gòu)建皮膚組織真皮層所需的成纖維細胞。
實施例2牛筋去筋膜、脂質(zhì)制成肌腱粉末分裝，于-20℃貯存?zhèn)溆?。將腱末浸泡?.1mol/L的HAc溶液中，制得終濃度為8.0mg/mL的膠原-HAc溶液。將殼聚糖溶液、肝素納溶液、硫酸軟骨素溶液添加至膠原溶液中，使終濃度分別為膠原干重的10％(g/g)、7％(g/g)和3％(g/g)，-20℃冰箱冷凍過夜，真空冷凍干燥24hr后即得膠原海綿。采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(Sigma)對膠原海綿進行化學交聯(lián)，用蒸餾水充分清洗并凍干，環(huán)氧乙烷消毒，制成可用于制備雙層活性皮膚組織的復(fù)合膠原海面基質(zhì)材料。
實施例3采用實施例2相同的方法，但是復(fù)合膠原海綿中，氨基多糖類物質(zhì)為透明質(zhì)酸，終濃度為膠原干重的20％(g/g)。
實施例4將膠原海綿置于雙層活性皮膚體外構(gòu)建的灌注式生物反應(yīng)器的多孔不銹鋼墊片支架上，加入含10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基，浸泡過夜。棄培養(yǎng)基，按5×105cells/cm2細胞密度將成纖維細胞懸液加入反應(yīng)器中，通過蠕動泵進行灌注接種，至培養(yǎng)液中殘留的細胞密度低于接種密度的10％后，進行灌注培養(yǎng)。
控制灌注速度為1d-1，同時檢測反應(yīng)器出口處培養(yǎng)液中葡萄糖濃度，當葡萄糖濃度低于2g/L時，提高灌注速率至2.5d-1。在此反應(yīng)器中經(jīng)16d的灌注培養(yǎng)，完成真皮構(gòu)建。
用角質(zhì)細胞無血清培養(yǎng)基代替10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在上述人工真皮上按密度5×105cells/cm2接種角質(zhì)細胞，靜止培養(yǎng)1d后，用角質(zhì)細胞培養(yǎng)基灌注培養(yǎng)2d，灌注速率為1d-1。而后去除角質(zhì)細胞無血清培養(yǎng)基，采用含10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基進行氣液界面培養(yǎng)，液面位置由上出口控制，培養(yǎng)基由下端進出口進行灌注，控制灌注速率為1d-1，同時檢測反應(yīng)器出口處培養(yǎng)液中葡萄糖濃度，當葡萄糖濃度低于2g/L時，提高灌注速率至3d-1。培養(yǎng)14d后，完成表皮構(gòu)建。
權(quán)利要求
1.一種用于體外構(gòu)建雙層活性人工皮膚組織的復(fù)合膠原海綿，其特征在于由氨基多糖類物質(zhì)和膠原溶液組成，氨基多糖類物質(zhì)含量為膠原干重的5～25％(g/g)；所說的氨基多糖類物質(zhì)包括殼聚糖、6-硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸或肝素納中的一種或一種以上，所說的膠原溶液為牛筋去筋膜、脂質(zhì)制成的肌腱粉末浸泡于醋酸溶液中而獲得的膠原-HAc溶液，或者是由商業(yè)化的膠原產(chǎn)品配制的膠原-HAc溶液。
2.一種采用生物反應(yīng)器制備雙層活性人工皮膚組織的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)以復(fù)合膠原海綿為支架材料，置于灌注式生物反應(yīng)器的多孔支架上，加入含5～15％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基浸泡，棄培養(yǎng)基，灌注接種成纖維細胞，至培養(yǎng)液中殘留的細胞密度低于接種密度的5～20％后，進行灌注培養(yǎng)，在反應(yīng)器中經(jīng)10～20d的灌注培養(yǎng)，完成真皮構(gòu)建；(2)在上述人工真皮上接種角質(zhì)細胞，用角質(zhì)細胞無血清培養(yǎng)基代替含新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基，靜止培養(yǎng)1～2d后，用角質(zhì)細胞培養(yǎng)基灌注培養(yǎng)2～5d，灌注速率為0.5～2d-1，而后去除角質(zhì)細胞無血清培養(yǎng)基，采用含2～10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基進行氣液界面培養(yǎng)，并根據(jù)需要調(diào)整灌注速率(0.5～4d-1)，8～14d后完成表皮構(gòu)建。所說的角質(zhì)細胞為從表皮組織中分離的角質(zhì)細胞，所說的成纖維細胞為從真皮組織中分離的成纖維細胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，以1×105cells/cm2～5×106cells/cm2細胞密度將成纖維細胞懸液加入反應(yīng)器中。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(1)的灌注速率為0.5～4d-1，使反應(yīng)器出口處培養(yǎng)液中葡萄糖濃度不低于1.0～2.0g/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，在人工真皮上按密度1×105cells/cm2～5×106cells/cm2接種角質(zhì)細胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(2)用含血清的DMEM進行灌注培養(yǎng)，灌注速率的確定是使反應(yīng)器出口處培養(yǎng)液中的葡萄糖濃度不低于1.0～2.0g/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種采用生物反應(yīng)器制備雙層活性人工皮膚組織的方法。包括如下步驟以復(fù)合膠原海綿為支架材料，置于灌注式生物反應(yīng)器的多孔支架上，將成纖維細胞懸液加入反應(yīng)器中，灌注接種及培養(yǎng)；完成真皮構(gòu)建后，接種角質(zhì)細胞，灌注培養(yǎng)，完成表皮構(gòu)建。采用生物反應(yīng)器系統(tǒng)制備具真皮和表皮雙層結(jié)構(gòu)的活性人工皮膚，使制成的人工皮膚具一定機械強度、延緩降解速度、細胞和胞外基質(zhì)在材料中分布均勻，制備周期短，生產(chǎn)可重復(fù)，批與批之間差異小等特點，且構(gòu)建的組織在解剖學結(jié)構(gòu)上更接近于天然組織。
文檔編號A61L27/60GK1562392SQ20041001715
公開日2005年1月12日 申請日期2004年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月24日
發(fā)明者譚文松, 周燕 申請人:華東理工大學