專利名稱：冬凌草及其提取物在制備抗艾滋病藥物上的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及艾滋病防治藥物，具體涉及具有艾滋病毒抑制活性的天然植物藥提取物，更具體地涉及冬凌草及其提取物在制備抗艾滋病藥物上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
艾滋病是由其致病源艾滋病毒(HIV)引起的一種對人類健康造成巨大危害的傳染病，又稱世紀(jì)絕癥?，F(xiàn)已共識(shí)，要從根本上防治艾滋病，疫苗是最好的選擇。一個(gè)理想的疫苗應(yīng)該是廣譜、高效、低毒、價(jià)廉。然而由于艾滋病毒的高度變異及強(qiáng)大的逃逸功能，使得疫苗的研究變得十分艱難，在可預(yù)見的將來，這樣的疫苗要獲得成功還有十分長的路要走。因此抗艾滋病毒藥物的研究并使其投向市場服務(wù)于感染病毒的患者是一個(gè)十分迫切的任務(wù)。
迄今為止，由美國FDA公布正式上市的抗艾滋病毒藥物為23個(gè)，包括三種類型a、病毒逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑；b、病毒蛋白酶的抑制劑；c、阻斷細(xì)胞與病毒融合的短肽(表1，見下頁)。
表1抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物

另有三十多個(gè)新的候選藥物分別在臨床I，II，III期開發(fā)中(表2，見下頁)。
表2開發(fā)中的新的抗HIV藥物

臨床用藥的經(jīng)驗(yàn)表明，單個(gè)藥物的應(yīng)用很容易對病毒產(chǎn)生耐藥性。根據(jù)患者的癥狀選用不同類別的藥物進(jìn)行組合的高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(HAART)(俗稱“雞尾酒療法” )的發(fā)明及運(yùn)用在很大程度上緩解了患者的發(fā)病進(jìn)程，改善了生活品質(zhì)，延長了生命。因此，擴(kuò)大可選擇的新藥陣容是保證治療質(zhì)量而面臨的新任務(wù)。參見如下文獻(xiàn)(這些文獻(xiàn)均引入本說明書作為參考)1.Johnston MLHIV/AIDS疫苗開發(fā)——挑戰(zhàn)、進(jìn)步和未來方向，Reviews in Medical Virology，6(3)123-140，1996。
2.www.ARAS.AB.CA/haart.html3.www.hivandhepatitis.com4.www.fdg.gov通常開發(fā)一個(gè)新藥至上市需要8～10年，資金達(dá)上億美元。一般情況下，一個(gè)患者的藥物花費(fèi)每年在$8,000～12,000之間，個(gè)別藥物甚至高達(dá)$15,000～20,000。這對大部分普通患者來說是難以承受的，特別對發(fā)展中國家的患者來說，更是難以消受。這樣，另辟新徑，尋找一條適合發(fā)展中國家的創(chuàng)新藥物同樣迫切與重要。從天然植物藥的提取物中篩選抗HIV的有效成份或有效部位，使其最終成為新藥，是一條可能和可行的道路。同時(shí)也為這一領(lǐng)域的研究開辟了一條新路。
本發(fā)明者經(jīng)體外抗艾滋病毒試驗(yàn)，從大量天然植物藥中篩選到具有艾滋病毒抑制活性的冬凌草，并從冬凌草提取物中得到活性部位。
冬凌草為唇形科植物碎米椏Rabdosia rubescens(Hemsl.)Hara的干燥地上部分。夏、秋二季采割，曬干。本品莖呈方柱形，長80～70cm，表面紅褐色，有柔毛；質(zhì)硬，斷面淡綠色或黃白色。頁對生，有柄；葉片皺縮，展平后呈卵形或?qū)捖研?，長6.5～13cm，寬3～6cm；先端漸尖，基部寬楔形、截形或近心形，急縮下延至柄，邊緣有粗鋸齒；上表面綠棕色，有腺點(diǎn)，下表面綠色，沿葉脈披疏柔毛。聚傘狀圓錐花序頂生，花小，花萼筒狀鐘形，5齒裂，花冠二唇形。小堅(jiān)果寬倒卵形，頂端無毛。氣微香，味苦、甘，微寒。具有清熱解毒，活血止痛功效。用于咽喉腫痛，扁桃體炎，蛇蟲咬傷(中國藥典一部，1977版)。
資料表明，冬凌草莖葉含揮發(fā)油，油中成份為α-蒎烯(α-Pinene)、β-蒎烯0.16～1％、檸檬烯(Limonene)0.16％、1.8桉油素(Cineole)0.33％、對-聚傘花素(P-Cymene)0.16％、王醛(Nonaldehyde)1.33％、癸醛(Decanal)1％b-、β-欖香烯(β-Elemene)20.23％、棕櫚酸(Palmatic acid)6.6％。還得到兩種二萜冬凌草甲素(Oridinin)、乙素(Ponicidin)、丙素C20H26O6、丁素C20H30O6、己素、戊素C23H32O6、庚素、辛素以及α-香樹脂醇(α-Amyrin)和五個(gè)未知結(jié)構(gòu)成份。此外，根、莖和葉尚含微量元素鐵、鋅、錳、銅、鉻、鎳、鈷、鉬、硒等。
中國發(fā)明專利和專利申請CN94110281.4、95100286.4、95113606.2、95112013.1、97121836.6、98111550.0、0113767.3、01115446.2、02125611.x涉及抗腫瘤中藥，其中包含冬凌草；中國發(fā)明專利申請CN03118782.x涉及抗炎、抗病毒的中藥，其中也包含冬凌草。然而，這些專利申請揭示的都是一些復(fù)方方劑，而且無一提及冬凌草的抗艾滋病毒作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供冬凌草及其提取物在制備抗艾滋病藥物上的應(yīng)用。
一、冬凌草提取物的制備冬凌草干燥后粉碎成粉末狀，用乙醇迴流或室溫浸泡去除葉綠素等溶解于乙醇中的物質(zhì)。殘留物經(jīng)水提和乙醇沉淀后制成粗提物DBSHH和DBSHE。粗提物DBSHH用凝膠層析柱Sephadex-G75分離得到DBSHH1、DBSHH2、DBSHH3、DBSHH4四個(gè)組分。
二、冬凌草提取物的細(xì)胞毒性試驗(yàn)在一96孔培養(yǎng)板中，將制備物系列稀釋，每三孔為一樣品，然后加入適量實(shí)驗(yàn)室T-細(xì)胞株MT-2。在CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)3天后，對細(xì)胞進(jìn)行染色，測定OD值，經(jīng)閱讀軟件轉(zhuǎn)換成活細(xì)胞生存百分率。如果制備物毒性很強(qiáng)，則細(xì)胞會(huì)全部或大部死亡，活細(xì)胞生存百分率為零或很低；反之，制備物無毒性或低毒性，活細(xì)胞生存百分率則接近100或很高。從此實(shí)驗(yàn)，可以確定制備物在抗病毒試驗(yàn)中的最大起始濃度。
三、抗艾滋病毒試驗(yàn)(一)在96孔培養(yǎng)板中，將上述試驗(yàn)得到的制備物最大起始濃度作系列稀釋。加適量滴度的實(shí)驗(yàn)室艾滋病毒株(HIV-IIIB)與細(xì)胞株MT-2。在CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)6天左右后，對細(xì)胞進(jìn)行染色，測OD值，經(jīng)閱讀軟件轉(zhuǎn)換成未感染細(xì)胞百分率。如果制備物對病毒無抑制作用，則被感染的細(xì)胞最終成多核巨細(xì)胞而破裂死亡(合胞體)；如有抗病毒作用，則有不同程度的未感染細(xì)胞存活。以存在50％未感染細(xì)胞的制備物濃度為有效濃度。
四、抗艾滋病毒試驗(yàn)(二)用植物血凝素(PHA)刺激正常人外周血單核淋巴細(xì)胞(hPBMC)一天。
將制備物在96孔培養(yǎng)板中系列稀釋，加適量已刺激過的正常人外周血單核淋巴細(xì)胞(hPBMC)與從病人血中分離到并經(jīng)培養(yǎng)的艾滋病毒(Isolate)共同在CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)若干小時(shí)后，洗去制備物與病毒，加入培養(yǎng)液繼續(xù)在CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。自第二天后，每天收集培養(yǎng)板孔中的樣品上清液，至第八天。測定上清液P24(艾滋病毒核殼蛋白)含量。
將所得結(jié)果制成曲線與陽性對照曲線比較，判別制備物有無抗病毒作用及抗病毒作用的程度。
上述程序的篩選和抗病毒試驗(yàn)證明，冬凌草的提取物DBSHH和DBSHE均有體外抗HIV活性，以DBSHH為佳。
將粗提物DBSHH用凝膠層析柱Sephadex-G75分離純化后得到4個(gè)組分，用此4個(gè)組分別進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)，結(jié)果顯示DBSHH1、DBSHH2和DBSHH4在濃度小于200微克/毫升時(shí)，細(xì)胞存活率＞50％；而DBSHH3顯示出一定的細(xì)胞毒性，當(dāng)濃度小于12.5微克/毫升時(shí)，細(xì)胞生存率＞50％。DBSHH2CC50為200微克/毫升。
體外抗HIV活性試驗(yàn)(一)的結(jié)果顯示DBSHH2樣品在濃度為2.5～200微克/毫升之間有抗病毒活性作用，未感染細(xì)胞百分率＞50％(EC50＝2.5微克/毫升)；DBSHH1無活性，DBSHH3在濃度為200微克/毫升時(shí)，對細(xì)胞有一定毒性，在10～100微克/毫升時(shí)有病毒抑制作用；DBSHH4在50～200微克/毫升時(shí)有病毒抑制活性。AZT為陽性對照藥物疊氮胸苷(齊多夫定)，有穩(wěn)定的病毒抑制活性(0.01～1微克/毫升)。


圖1顯示冬凌草提取物對MT-2的細(xì)胞毒性。
圖2顯示冬凌草提取物在MT-2細(xì)胞中抗愛滋病的活性。
圖3顯示冬凌草提取物DBSHH2組分在人外周血淋巴單核細(xì)胞培養(yǎng)中的抗原代病毒試驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例和試驗(yàn)例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但這些實(shí)施例和試驗(yàn)例絕非對本發(fā)明有任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員在本說明書的啟示下對本發(fā)明實(shí)施中所作的任何變動(dòng)都將落在權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
實(shí)施例1 冬凌草粗提物的制備在40克冬凌草粉末中加入250毫升95％乙醇，37％搖床過夜。將混合物于3,000rpm低速離心20分鐘，棄去上清液，沉淀中加入200毫升水煮20分鐘，冷卻至室溫后，于3,000rpm離心20分鐘，棄去沉淀，上清液再于4,000rpm離心20分鐘，取上清液(約200毫升)加2倍體積95％乙醇，4℃過夜后，于4,000rpm離心20分鐘。上清液減壓干燥得DBSHE 2.2克，沉淀減壓干燥得DBSHH 1.2克。
實(shí)施例2 冬凌草粗提物的純化將15克Sephadex-G75(Sigma cat.no.G-75-120)混勻于400毫升雙蒸消毒水中，使其浸泡膨脹過夜。將浸泡的Sephadex-G75混勻液緩緩地裝入20毫米×500毫米玻璃柱中。
將120毫克實(shí)施例1所得的DBSHH溶于1.2毫升雙蒸水，取1毫升溶液加于柱中，用雙蒸水洗脫樣品，流速為每分鐘0.5毫升。根據(jù)樣品洗脫的顏色分別收集得到四個(gè)部分DBSHH1、DBSHH2、DBSHH3、DBSHH4。減壓干燥所得樣品，于4℃儲(chǔ)存。
試驗(yàn)例1 冬凌草提取物的細(xì)胞毒性試驗(yàn)在一96孔培養(yǎng)板中，每孔加入一定量的培養(yǎng)液(含2mM谷氨酰胺和25mMHEPES的RPMI1640)。分別在3～5縱行底部的三個(gè)孔中加入濃度為200微克/毫升的冬凌草提取物100微升，在6～8和9～11縱行的底部三孔中加入其他稀釋的樣品或?qū)φ諛悠?如AZT等)，使每孔中的液量為200微升，混勻。將孔中的混合液系列二倍稀釋，得到一系列三平行孔的含二倍稀釋藥物稀釋液的培養(yǎng)液。加100微升MT-2混懸液(細(xì)胞計(jì)數(shù)為～5×105/毫升)至第1、第3～11縱行的每一孔中。置培養(yǎng)板于37℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。取出培養(yǎng)板，在每孔中取100微升細(xì)胞混懸液進(jìn)行1％醋酸/乙醇溶液染色。在孔板讀數(shù)儀上讀數(shù)。
試驗(yàn)例2 冬凌草提取物的抗艾滋病毒試驗(yàn)之一在一96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100微升RPMI1640(含12％小牛血清)培養(yǎng)液。
在3～5縱行底部的三孔中加入100微升DBSHH(200微克/毫升)，在6～8、9～11縱行的底部三孔中加入其他樣品或?qū)φ諛悠?如AZT等)，使每孔中的液量為200微升。
將樣品孔中的混合液作系列二倍稀釋。
在2～11縱行的每一孔中加50微升經(jīng)適當(dāng)稀釋的艾滋病毒(HIV-IIIB)。
在1～11縱行的每一孔中加100微升MT-2細(xì)胞混懸液(～5×104/毫升)。
加培養(yǎng)液于1和12縱行，使每孔液為250微升。
置培養(yǎng)板于5％CO2培養(yǎng)箱37℃約6天，更換培養(yǎng)液。
自培養(yǎng)約6天后孔板的每孔中，取100微升混懸液加到預(yù)先用氫溴化賴氨酸處理過的96孔板中。
加100微升含10％中性紅培養(yǎng)液于每孔中。
于37℃培養(yǎng)箱保溫1～1.5小時(shí)。
用PBS洗孔板兩次。
每孔中加100微升1％醋酸/乙醇溶液染色。
在孔板讀數(shù)儀上讀數(shù)。
試驗(yàn)例3 冬凌草提取物的抗艾滋病毒試驗(yàn)之二用適量的植物血凝素(PHA)刺激人外周血單核淋巴細(xì)胞(hPBMC)一天(培養(yǎng)液為20％小牛血清+血細(xì)胞介導(dǎo)素(IL-2)+RPMI1640)第二天，用上述培養(yǎng)液洗去培養(yǎng)瓶中PHA，用10毫升新鮮培養(yǎng)液混勻細(xì)胞，并加100微升細(xì)胞混懸液于一96孔板的每孔中。按試驗(yàn)例1的方法，將提取物制備成系列二倍稀釋液，加于3～5縱行，6～8、9～11縱行加其他樣品或?qū)φ諛悠?。?0微升經(jīng)hPBMC培養(yǎng)得到的陽性病人的艾滋病毒于2～11縱行。最終每孔液為250微升。
置培養(yǎng)板于5％CO2培養(yǎng)箱中保溫3～6小時(shí)后，用培養(yǎng)液洗去病毒。
用上述同樣方法加新鮮配置的系列提取物和其他樣品或?qū)φ諛悠废♂屢骸?br> 置孔板于5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。從第2天起，每天從孔板中收集50微升上清液，并補(bǔ)充孔板的培養(yǎng)液。共收集6～8天。
用0.5％Triton-X100裂解收集的樣品中的病毒。
做p24免疫分析試驗(yàn)(HIV p24ELISA kit)。
讀數(shù)并制成圖表，將提取物與對照樣品比較，轉(zhuǎn)換成提取物抑制艾滋病毒的百分率。
權(quán)利要求
1.冬凌草及其提取物在制備抗艾滋病藥物上的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中冬凌草提取物是用乙醇迴流或室溫浸泡、低速離心所得沉淀再經(jīng)水提和酒精沉淀后制成的粗提物DBSHE和DBSHH。
3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中冬凌草提取物是將權(quán)利要求2所述粗提物DBSHH用凝膠層析柱Sephadex-G75進(jìn)一步分離得到的DBSHH1、DBSHH2、DBSHH3和DBSHH4。
全文摘要
本發(fā)明提供冬凌草及其提取物在制備抗艾滋病藥物上的應(yīng)用。冬凌草粉末用乙醇迴流或室溫浸泡，低速離心所得沉淀再經(jīng)水提和乙醇沉淀后制成粗提物DBSHH和DBSHE。兩者均有體外抗HIV活性，以DBSHH為佳。用凝膠層析柱Sephadex－G75將DBSHH進(jìn)一步分離得到DBSHH－1、DBSHH－2、DBSHH－3和DBSHH－4，抗HIV活性以DBSHH－2為佳。
文檔編號(hào)A61P31/18GK1682774SQ20041001762
公開日2005年10月19日 申請日期2004年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月12日
發(fā)明者周金濤 申請人:深圳市博愛生科技開發(fā)有限公司