專利名稱：附睪特異的抗菌肽Bin1b在精子成熟方面的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及附睪特異的抗菌肽Bin1b(一種β防衛(wèi)素)在精子成熟方面的用途。
背景技術(shù)：
附睪作為一個(gè)男性附屬生殖器官，多年以來被證明與精子的成熟有關(guān).但從來未將這成熟過程和附睪來源的某個(gè)特定分子相聯(lián)系1。
哺乳動(dòng)物的精子是在睪丸中生成的，但它們離開睪丸的時(shí)候既不能游動(dòng)又不能使卵子受精。它們?cè)谕ㄟ^和睪丸相連的附睪時(shí)逐步成熟并獲得向前運(yùn)動(dòng)和受精的能力1，3。附睪的分泌液，由附睪的各個(gè)特定區(qū)域生成——分別叫做caput(頭)，corpus(體)，cauda(尾)，對(duì)精子的成熟至關(guān)重要；然后對(duì)這個(gè)成熟過程的分子機(jī)制所知甚少。在不同種屬發(fā)現(xiàn)的大約200個(gè)已知附睪蛋白中，很少有被證明直接參與附睪中精子的成熟的4，5。
Bin1b是一個(gè)大鼠附睪特異的抗菌肽2，在人類中也發(fā)現(xiàn)了它的同源物6。張永蓮和陳小章等證明了Bin1b有類似于beta-defensin的分子結(jié)構(gòu)和抗菌活性2。
此外，WO02/68463和中國(guó)專利申請(qǐng)CN 01105283.X中還公開了附睪特異的抗菌肽Bin1b的DNA和氨基酸序列、制備方法和作為抗菌肽的用途。其實(shí)驗(yàn)表明，Bin1b是一個(gè)大鼠附睪特異的beta-defensin，有抗菌活性。但沒有發(fā)現(xiàn)或公開過Bin1b與精子成熟的相關(guān)性。
鑒于精子成熟對(duì)于男性不育和生育力低下等疾病存在極其密切的聯(lián)系，因此本領(lǐng)域迫切需要尋找和開發(fā)與精子成熟有關(guān)的物質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種與精子成熟有關(guān)的多肽β-防衛(wèi)素(beta-defensin)。
本發(fā)明的另一目的是提供β-防衛(wèi)素等在促進(jìn)精子成熟等方面的用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種β-防衛(wèi)素的用途，它被用于制備促進(jìn)精子成熟的藥物。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種β-防衛(wèi)素的用途，它被用于制備提高精子運(yùn)動(dòng)性的藥物。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種β-防衛(wèi)素的用途，它被用于制備提高精子前向運(yùn)動(dòng)百分比的藥物。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的β-防衛(wèi)素和鈣離子源以及藥學(xué)上可接受的載體，其中所述的鈣離子源是鈣離子或能夠產(chǎn)生鈣離子的物質(zhì)。
在本發(fā)明第五方面，提供了一種體外促進(jìn)精子成熟的方法，包括步驟(a)在精子細(xì)胞的培養(yǎng)液中添加β-防衛(wèi)素；(b)繼續(xù)培養(yǎng)精子細(xì)胞，從而獲得成熟的精子。
在另一優(yōu)選例中，所述的β-防衛(wèi)素是附睪特異的β-防衛(wèi)素。更佳地，所述的β-防衛(wèi)素是Bin1b。
在本發(fā)明的第六方面，提供了β-防衛(wèi)素拮抗劑(如抗體、反義核酸等)的用途，它們可用于抑制精子的成熟化。


圖1顯示了免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果，表明Bin1b結(jié)合到大鼠附睪不同區(qū)段來源的精子?？笲in1b的兔源多抗血清由重組Bin1b蛋白制備?？贵w的專一性通過WESTERN BLOT檢查。
其中圖a抗體(1∶1000)和Bin1b抗原雜交，以及兩個(gè)陽性對(duì)照，DHFR-Bin1b融合蛋白(26KD)，和TrxA-Bin1b融合蛋白22KD，以及陰性對(duì)照，DHFR蛋白。
圖b免疫染色顯示Bin1b結(jié)合到大鼠附睪不同區(qū)段的來源的精子。其中ini＝起始區(qū)(initial segment)；cap＝頭部(caput)；cor＝體部(corpus)；cau＝尾部(cauda)。
圖c流式細(xì)胞儀分析結(jié)合到不同區(qū)段精子上的Bin1b的百分比。
圖2顯示了表達(dá)Bin1b的上皮細(xì)胞對(duì)精子動(dòng)性的影響以及共孵育后Bin1b的結(jié)合。
其中，圖a和b與附睪頭部上皮細(xì)胞共孵育誘導(dǎo)的精子運(yùn)動(dòng)性(a)，前向運(yùn)動(dòng)百分比(b)經(jīng)Bin1b(1∶800)抗體處理后顯著減弱。實(shí)心方框 與頭部細(xì)胞共育；實(shí)心三角，與尾部細(xì)胞共育；實(shí)心下三角，與Bin1b抗體處理的頭部細(xì)胞共育；菱形，與免疫前血清處理的頭部細(xì)胞共育；空心方框，EMEM培養(yǎng)基中孵育；實(shí)心菱形，精子基質(zhì)中孵育。
圖cRT-PCR顯示Bin1b在轉(zhuǎn)染的T84細(xì)胞Bin-T84中表達(dá)而不在載體轉(zhuǎn)染的T84細(xì)胞Vet-T84中表達(dá)。
圖d和e與Bin-T84共育誘導(dǎo)的精子運(yùn)動(dòng)性(d)和前向運(yùn)動(dòng)性(e)被抗Bin1b的抗體(1∶800)極大的減弱。實(shí)心方框，與Bin-T84共育；實(shí)心三角，精子與Vet-T84共育；空心倒三角，與Bin1b抗體處理的Bin-T84共育；空心菱形，與免疫前血清處理的Bin-T84共育；均值(mean)±SEM(N＝4-6，ONEWAY ANOVA分析法)，p＜0.0001，與對(duì)照比較。
圖f與Bin-T84培養(yǎng)前(1)后(2)的以及與和Vet-T84共育(3)的未成熟精子上的Bin1b的免疫染色，陰性對(duì)照用免疫前血清(4)。
圖g與Bin-T84共育前(1)后(2)的未成熟精子上的Bin1b結(jié)合百分比。
圖h與Bin-T84培養(yǎng)前(1)后(2)的基質(zhì)共育的尾部成熟精子Bin1b結(jié)合百分比。
圖3顯示了Bin1b在未成熟和成熟精子鈣離子吸收中的不同效應(yīng)。
其中，圖a和b細(xì)胞外的鈣離子對(duì)頭部的(a)和Bin-T84共育誘導(dǎo)的(b)未成熟精子運(yùn)動(dòng)性的效應(yīng)。箭頭所指為2mM Ca2+加入到無鈣的基質(zhì)中，實(shí)心方框，無鈣離子；實(shí)心三角，無鈣離子，后加鈣離子；圖c不同稀釋度的Bin-T84誘導(dǎo)了未成熟精子細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，100％紅，50％藍(lán)，(可以被Bin1b抗體阻斷，黑100％和粉紅50％)，而Vet-T84沒有該誘導(dǎo)效應(yīng)，綠。(注從上至下，各曲線的顏色分別是紅、藍(lán)、黑、綠和粉紅)圖d對(duì)應(yīng)于c的細(xì)胞內(nèi)鈣測(cè)量，L型鈣通道阻斷劑nifedipine0.5UM，verapamil 1UM和T型鈣通道阻斷劑pimozide 1um。圖中，control＝對(duì)照，antibody＝抗體。
圖eBin-T84共育誘導(dǎo)的未成熟精子運(yùn)動(dòng)性(9小時(shí))被nifedipineverapamil抑制，而不被pimozide抑制。
圖f成熟尾部精子細(xì)胞內(nèi)鈣測(cè)量表明對(duì)Bin-T84和Vet-T84沒有反應(yīng)。
圖g尾部精子運(yùn)動(dòng)對(duì)3小時(shí)共育的Bin1b抗體和nifedipine的敏感性，均值±SEM(n＝3-6；不成對(duì)t-測(cè)試)，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.0001對(duì)應(yīng)于相應(yīng)對(duì)照組。
圖4顯示了Bin1b反義RNA引起體內(nèi)Bin1b表達(dá)抑制，以及精子運(yùn)動(dòng)性和前向運(yùn)動(dòng)的顯著減弱。
圖a反義Bin1b RNA處理48小時(shí)后，半定量RT-PCR表明附睪頭部Bin1bMrna表達(dá)減少，GAPDH作為內(nèi)標(biāo)。
圖b-gBin1b免疫熒光，精子來自遠(yuǎn)端頭部，以正義核酸處理，作為對(duì)照(b)，反義核酸處理(c)，對(duì)應(yīng)于流式細(xì)胞儀測(cè)得的正義核酸(d)，反義核酸(e)處理的樣品。精子運(yùn)動(dòng)結(jié)果的分布(f)以及前向運(yùn)動(dòng)的百分?jǐn)?shù)(g)。均值±SEM(n＝5-15；不成對(duì)t-測(cè)試)。P＜0.05，P＜0.01，P＜0.0001。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明經(jīng)過廣泛而深入的研究發(fā)現(xiàn)，附睪特異性β-防衛(wèi)素Bin1b在附睪的不同區(qū)域能夠以不同的方式和精子頭部結(jié)合，而且附睪來源或轉(zhuǎn)染了Bin1b的細(xì)胞株，能夠誘導(dǎo)本來不具有運(yùn)動(dòng)能力的未成熟精子向前運(yùn)動(dòng)。這一效應(yīng)是由Bin1b誘導(dǎo)的Ca2+的吸收介導(dǎo)的(這一機(jī)制在維持未成熟精子的運(yùn)動(dòng)能力中起重要作用，但在維持成熟精子的運(yùn)動(dòng)能力中不起重要作用)。體內(nèi)的反義核酸實(shí)驗(yàn)表明通過抑制Bin1b的表達(dá)來減少Bin1b和附睪頭部的精子結(jié)合，會(huì)導(dǎo)致精子活性和向前運(yùn)動(dòng)的能力大大下降，進(jìn)一步肯定了beta-defensin參與了精子運(yùn)動(dòng)能力的獲得和起始了精子的成熟。
如本文所用，術(shù)語“β-防衛(wèi)素”指β-防衛(wèi)素家族的蛋白，特別優(yōu)選的是在附睪特異性表達(dá)或存在的β-防衛(wèi)素。代表性的例子包括(但并不限于)Bin1b，來自大鼠；BNBD9(AAB25872)，BNBD3(AAB25866)，BNBD7(AAB25870)，TAP(P25068)，LAP(Q28880)，EBD(O02775)來自牛；HBD1(Q09753)，HBD2(O15263)，HBD3(NP061131)來自人；EP2E(AF263555_1)CBD1(AF188607_1)，CBD2(AF209855_1)來自黑猩猩；MBD1(AAB72003)，MBD2(CAB42815)，MBD3(AF092929_1)，MBD4(AF155882_1)來自小鼠；RBD1(AAC28071)，RBD2(AAC28072)來自大鼠；GBD1(CAA76811)，GBD2(CAA08905)來自山羊；SBD1(O19038)，SBD2(O19039)來自綿羊；PBD1(O62697)來自豬。這些物質(zhì)的核酸序列和氨基酸序列都是已知的，可以用本領(lǐng)域常規(guī)的DNA重組技術(shù)而獲得其蛋白。
另一類特別優(yōu)選的蛋白是Bin1b類似物，即在其他哺乳動(dòng)物(如牛、羊、兔、狗、猴、人等)中Bin1b的同源蛋白。這些其他物種的同源蛋白的編碼序列，可根據(jù)WO02/68463公開的序列，通過雜交或擴(kuò)增的方法而獲得，進(jìn)而通過常規(guī)重組方法獲得這些同源蛋白。
在本發(fā)明中，術(shù)語“Bin1b多肽”指具有Bin1b蛋白活性的，WO02/68463中SEQ ID NO.2或3序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與Bin1b蛋白相同功能的、SEQID NO.2或3序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-20個(gè)，較佳地1-10個(gè)，更佳地1-5個(gè)，最佳地1-3個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括Bin1b蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與Bin1b DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗Bin1b多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含Bin1b多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽外，本發(fā)明還包括了Bin1b多肽的可溶性片段。通常，該片段具有Bin1b多肽序列的至少約15個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約25個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約35個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約40個(gè)連續(xù)氨基酸。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的β-防衛(wèi)素和鈣離子源(如0.1μm-100mM Ca2+)以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊、藥膏宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
使用藥物組合物時(shí)，是將安全有效量的β-防衛(wèi)素施用于哺乳動(dòng)物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
本發(fā)明還涉及β-防衛(wèi)素拮抗劑(如抗體、反義核酸等)的用途，它們可用于抑制精子的成熟化。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1Bin1b抗體制備以及在附睪來源精子上的免疫定位用WO02/68463實(shí)施例所述的方法，獲得對(duì)應(yīng)于成熟Bin1b基因45個(gè)氨基酸殘基135bp堿基的cDNA，如下所示135bp堿基的cDNAGGAATCAGAAACACCGTGTGCTTCATGCAGCGGGGCCACTGTAGGCTCTTCATGTGCCGTTCTGGGGAGAGAAAGGGGGATATTTGCTCTGACCCCTGGAACAGATGCTGCGTATCCAGTTCCATTAAAAACAGATGA(SEQ ID NO1)45個(gè)氨基酸殘基GIRNTVCFMQRGHCRLFMCRSGERKGDICSDPWNRCCVSSSIKNR(SEQ ID NO2)將145bp片段插入PET-28a克隆載體(購(gòu)自Invitrogen公司)。用Novagen pET表達(dá)試劑盒(試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司)表達(dá)并純化重組蛋白。針對(duì)該重組蛋白的抗體的制備按照參考文獻(xiàn)Hu，Y.X.et al.Get effective polyclonalantisera in one month.Cell Res.12，157-160(2002).中所述的方法。
精子的Bin1b基因免疫定位，附睪被分為起始區(qū)以及頭體尾總共四部分，精子分別從這四部分洗出，用4％的多聚甲醛作用30分鐘固定精子，免疫染色方法參考文獻(xiàn)Welch，J.E.et al.Human glyceraldehyde 3-phosphatedehydrogenase-2 gene is expressed specifically in spermatogenic cells.J.Androl 21，328-338(2000)。Bin1b的多克隆抗體的稀釋度為1∶600。用熒光顯微鏡(OlypusBM50型)進(jìn)行圖片采集。
結(jié)果如圖1所示。圖1a抗體的特異性由western雜交得到證明。1b來源于附睪所有區(qū)域——除了起始區(qū)的精子都有Bin1b的免疫反應(yīng)性。1c與Bin1b抗體結(jié)合的精子，在不同的區(qū)域有差異。
實(shí)施例2Bin1b基因真核轉(zhuǎn)染Bin1b基因克隆于pCMV-tag表達(dá)載體。T84細(xì)胞以1×105細(xì)胞密度傳于35mm培養(yǎng)皿，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿60-80％，使用脂質(zhì)體lipofectin轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞在選擇性抗生素G418(濃度400ug/ml)篩選，操作過程按參考文獻(xiàn)Jiang，J.L.et al.The involvement of HAb18G/CD147 in regulation ofstoreoperated calcium entry and metastasis of human hepatoma cells.J.Biol.Chem.276，46870-46877(2001)中所述的方法進(jìn)行。
實(shí)施例3Bin1b對(duì)精子成熟的促進(jìn)作用一、實(shí)驗(yàn)方法精子-上皮細(xì)胞共培養(yǎng)從成年的SD大鼠(3月齡)收集不成熟的附睪頭部精子。近端附睪頭被溫和地剪碎放入0.4ml經(jīng)溫育的精子培養(yǎng)液(123mM氯化鈉，4mM氯化鉀，2mM氯化鈣，0.4mM硫酸鎂，0.3mM磷酸氫二鈉，25mM碳酸氫鈉，5mM葡萄糖，12.5mM乳酸鈉，0.5mM丙酮酸，8ug酚紅，4mg/ml牛血清白蛋白，最終pH值為7.4，粘度為310mOsm/kg.)5分鐘使精子擴(kuò)散到培養(yǎng)基里。精子濃度調(diào)整為6000萬/毫升。分離和培養(yǎng)附睪上皮細(xì)胞的方法如前所述。在上皮細(xì)胞長(zhǎng)滿后(培養(yǎng)后四天)，在進(jìn)行共培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)兩小時(shí)前，將培養(yǎng)的上層培養(yǎng)液去掉。3微升的精子(6000萬/毫升)加入培養(yǎng)上層，37度，5％二氧化碳的條件下，培養(yǎng)不同時(shí)間，取出10微升精子進(jìn)行精子運(yùn)動(dòng)力測(cè)試。
精子運(yùn)動(dòng)力測(cè)試測(cè)試時(shí)用HTM-IVOS系統(tǒng)(版本10.8，Hamiltion-Thorn Research公司，Beverly，MA)。設(shè)定參數(shù)如下4倍物鏡，最低細(xì)胞大小為6象素，最低對(duì)照值為65，最低靜止對(duì)照值為30，最低VAP基值為30.0，最低VSL基值為20.0，直線參數(shù)50％，靜止頭部大小為0.29-10，靜止頭部深度為0.29-1.11，放大值為0.82。六個(gè)視野以每視野60Hz的頻率進(jìn)行分析。每個(gè)樣品至少200個(gè)精子運(yùn)動(dòng)軌跡在37度分析，每個(gè)運(yùn)動(dòng)軌跡記錄30個(gè)點(diǎn)。系統(tǒng)的回放功能被用來檢查分析的精度。
附睪頭部精子的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的測(cè)定精子置于2uM Fura-2/AM在37度5％二氧化碳培養(yǎng)45分鐘，洗滌兩遍，懸浮于精子培養(yǎng)液。Fura-2處理的精子重懸于不同稀釋度的Bin-T84細(xì)胞培養(yǎng)液。Vet-T84細(xì)胞培養(yǎng)液被用做對(duì)照。340納米和380納米的激發(fā)熒光輪流用LS-50B熒光光譜儀(Perkin Elmer公司，Shelton，CN)記錄并根據(jù)Grynkiewicz等人(1985)30(Grynkiewicz，G.，Poenie，M.&Tsien，R.Y.A new generationof Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.J BiolChem.260，3440-50(1985).)的方法以340/380的比例進(jìn)行計(jì)算。
流式細(xì)胞分析大鼠精子用Bin1b多克隆抗體以1∶200比例進(jìn)行染色，以免疫前血清作為對(duì)照。4度培養(yǎng)過夜后精子用含有4mg/ml的牛血清白蛋白的PBS洗滌兩遍，以1∶50加二抗-羊抗兔FITC標(biāo)記的IgG(Zymed實(shí)驗(yàn)室，South San Francisco，CA)室溫保溫45分鐘。洗滌三遍后，精子用流式細(xì)胞儀分析(Beckman Coulter，Krefeld，Germany)。每份樣品10000個(gè)獨(dú)立精子用FITC發(fā)出的熒光分析。以正常兔血清染色作為負(fù)對(duì)照以此作為特異精子Bin1b染色的本底。減去背景熒光就得到特異性精子染色的百分率。
體內(nèi)反義寡核苷酸處理在麻醉?xiàng)l件下切開雄性SD大鼠(＞3月齡)的睪丸表面的皮膚。30微升的Bin1b反義寡核苷酸(20ug/ml)(5’-AGAGTAACAAAACCTTCTAG-3’)或正義對(duì)照(5’-CATGAAGGTTTTGTTACTCT-3’)被注射入附睪頭部中間邊側(cè)，注射后48小時(shí)收集精子分析。
二、結(jié)果結(jié)果如圖2-4以及表1所示。
圖2a原本不運(yùn)動(dòng)的精子與附睪頭部上皮細(xì)胞，而不是體部和尾部的細(xì)胞，共同培養(yǎng)后3小時(shí)開始運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)在5小時(shí)達(dá)到平臺(tái)并能保持到9小時(shí)。
圖2b在附睪頭部細(xì)胞存在時(shí)，精子在3小時(shí)獲得緩慢的前向運(yùn)動(dòng)能力，這運(yùn)動(dòng)能力逐漸增強(qiáng)并保持到9小時(shí)，而其它的處理未觀察到前向運(yùn)動(dòng)的明顯變化。
圖2cBin1b的表達(dá)通過RT-PCR得到了確認(rèn)。
圖2d-e而利用Vet-T84細(xì)胞或Bin1b抗體存在時(shí)，則無明顯增加。
圖2h起初不含Bin1b的未成熟精子，與Bin-T84培養(yǎng)液(本發(fā)明人假定它含有分泌的Bin1b)溫育1小時(shí)以后80％有Bin1b的陽性免疫反應(yīng)。
圖3a-b當(dāng)在共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中使用不含鈣離子的培養(yǎng)液時(shí)，利用附睪頭部細(xì)胞或Bin-T84細(xì)胞，溫育時(shí)間長(zhǎng)達(dá)9小時(shí)，都未見到精子運(yùn)動(dòng)性或前向運(yùn)動(dòng)能力的提高。
圖3c-d將未成熟的精子與含Bin1b的培養(yǎng)液，而不是對(duì)照的Vet-T84培養(yǎng)液溫育，導(dǎo)致濃度依賴的鈣離子吸收的增強(qiáng)，這效應(yīng)能夠被Bin1b的抗體或鈣離子通道的抑制劑，nifedipine(0.5uM)和verapamil(1uM)(已知是抑制L型鈣通道)強(qiáng)烈抑制。而T型鈣通道的抑制劑pimozide(1uM)則無此作用。
圖3enifedipine和verapamil明顯減弱了Bin1b誘導(dǎo)的精子運(yùn)動(dòng)；而T型鈣通道的特異抑制劑，pimozide則不那么有效。
圖3g含Bin1b的培養(yǎng)液對(duì)附睪尾部成熟精子鈣離子吸收的影響，在整個(gè)溫育過程中未發(fā)現(xiàn)鈣離子吸收的明顯增強(qiáng)。從附睪尾部收集的精子具有旺盛的活力，其活力只有大約20％被Bin1b抗體抑制.nifedipine在0.5uM的濃度時(shí)能在未成熟的精子中強(qiáng)烈抑制Bin1b誘導(dǎo)的精子運(yùn)動(dòng)，對(duì)附睪尾部精子的運(yùn)動(dòng)能力沒有作用，至少還不如Bin1b抗體。
圖4b-c其結(jié)果是導(dǎo)致了附睪頭部遠(yuǎn)端(distal)區(qū)域Bin1b對(duì)精子結(jié)合的明顯下降.免疫熒光。
4d-e其結(jié)果是導(dǎo)致了附睪頭部遠(yuǎn)端區(qū)域Bin1b對(duì)精子結(jié)合的明顯下降.流式細(xì)胞計(jì)數(shù)。
4f-g與Bin1b表達(dá)和精子結(jié)合的下降相符合，從Bin1b反義核酸處理過的大鼠附睪頭部遠(yuǎn)端區(qū)域取出的精子與來自正義核酸處理的對(duì)照大鼠的精子相比，其活力和前向運(yùn)動(dòng)的能力明顯下降了。
表1未成熟大鼠精子與附睪頭/尾上皮細(xì)胞共育后的運(yùn)動(dòng)參數(shù)比較。

注數(shù)據(jù)由CASA系統(tǒng)得到。VAP＝平均路徑速度，VSL＝直線速度討論Bin1b的表達(dá)具有區(qū)域特異性，只存在于頭部中間，而在其它區(qū)域都不存在，使得本發(fā)明人推測(cè)它除了作為一個(gè)抗菌肽，可能在精子成熟過程中起到作用，因?yàn)橛凶C據(jù)表明附睪頭部的微環(huán)境對(duì)精子獲得向前運(yùn)動(dòng)的能力有重要作用7，8。Bin1b的信號(hào)肽序列表明它是一個(gè)分泌蛋白，它可能直接和精子結(jié)合影響它的運(yùn)動(dòng)。本發(fā)明人用Bin1b的抗體進(jìn)行免疫組化來驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)，抗體的特異性由western雜交得到證明(圖1a)。來源于附睪所有區(qū)域¨D¨D除了起始區(qū)(initial segment)(圖1b)的精子都有Bin1b的免疫反應(yīng)性，與Bin1b抗體結(jié)合的精子，在不同的區(qū)域有差異(圖1c)。精子結(jié)合的方式也因區(qū)域而異，附睪頭部的精子整個(gè)精子頭部都有免疫反應(yīng)，而附睪尾部的精子主要的信號(hào)集中在頂體后(post-acrosome)區(qū)域。Bin1b因區(qū)域而變的精子結(jié)合方式表明它在精子通過附睪時(shí)，可能修飾了精子的特定功能。
本發(fā)明人用體外培養(yǎng)的附睪上皮細(xì)胞來研究Bin1b對(duì)精子成熟的可能作用，這種細(xì)胞過去曾用來證明Bin1b的抗菌活性2。對(duì)表達(dá)Bin1b的附睪頭部細(xì)胞和作為對(duì)照的尾部細(xì)胞進(jìn)行了培養(yǎng)，讓它們?cè)谝粋€(gè)流動(dòng)的過濾裝置上長(zhǎng)滿，以保證形成上皮的極性和正常的附睪分泌。將從附睪initial segment搜集的未成熟的精子加在附睪培養(yǎng)物的頂上部分并溫育不同的時(shí)間。精子運(yùn)動(dòng)的動(dòng)力學(xué)，是精子成熟最顯著的變化9，通過計(jì)算機(jī)輔助的精子分析(CASA)來檢測(cè)。首先進(jìn)入精子培養(yǎng)液的未成熟精子不具有向前運(yùn)動(dòng)的能力，在幾分鐘內(nèi)就停止了擺動(dòng)，這與過去的觀察相符10。然而，原本不運(yùn)動(dòng)的精子與附睪頭部上皮細(xì)胞，而不是體部和尾部的細(xì)胞，共同培養(yǎng)后3小時(shí)開始運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)在5小時(shí)達(dá)到平臺(tái)并能保持到9小時(shí)(圖2a).精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)的分析表明，與附睪頭部細(xì)胞共培養(yǎng)的精子，其平均通道速率averaged-path(VAP)和直線速率straight-linevelocities(VSL)與和附睪尾部細(xì)胞共培養(yǎng)的精子相比有顯著提高.(表1)然而，當(dāng)精子和精子培養(yǎng)液或來自上皮細(xì)胞的新鮮培養(yǎng)液共培養(yǎng)時(shí)，基本未觀察到精子運(yùn)動(dòng)。由于精子的前向運(yùn)動(dòng)是與精子成熟相關(guān)的特征之一9，前向運(yùn)動(dòng)的百分?jǐn)?shù)也被用來衡量Bin1b的效果。就象圖2b所顯示的，在附睪頭部細(xì)胞存在時(shí)，精子在3小時(shí)獲得緩慢的前向運(yùn)動(dòng)能力，這運(yùn)動(dòng)能力逐漸增強(qiáng)并保持到9小時(shí)，而其它的處理未觀察到前向運(yùn)動(dòng)的明顯變化。這表明通過與附睪頭部上皮細(xì)胞的體外共培養(yǎng)，非運(yùn)動(dòng)的未成熟精子能被誘導(dǎo)獲得和保持前向運(yùn)動(dòng)性。為了弄清精子運(yùn)動(dòng)能力的提高和獲得前向運(yùn)動(dòng)的能力是否因于Bin1b的作用，本發(fā)明人使用了Bin1b的抗體，結(jié)果表明Bin1b的抗體逆轉(zhuǎn)了附睪上皮細(xì)胞誘導(dǎo)的精子運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)和獲得前向運(yùn)動(dòng)的能力，而使用免疫前血清這些參數(shù)則無變化(圖2a，b)。這些結(jié)果表明Bin1b可能在誘導(dǎo)未成熟精子的運(yùn)動(dòng)能力方面起作用。
為了確認(rèn)Bin1b的作用并排除附睪頭部上皮細(xì)胞分泌的其它因子的參與，Bin1b cDNA被轉(zhuǎn)染到一個(gè)小腸上皮細(xì)胞株，T84，它本身不表達(dá)Bin1b。從而得到穩(wěn)定表達(dá)Bin1b的細(xì)胞株(Bin-T84)，和一個(gè)只轉(zhuǎn)染了載體的對(duì)照細(xì)胞株(Vet-T84)，Bin1b的表達(dá)通過RT-PCR得到了確認(rèn)(圖2c)。用同樣不具有運(yùn)動(dòng)能力的未成熟精子進(jìn)行了精子共培養(yǎng)試驗(yàn)。如圖2d-e所示，與Bin-T84共培養(yǎng)的精子，隨時(shí)間的增長(zhǎng)，精子運(yùn)動(dòng)性和前向運(yùn)動(dòng)的百分?jǐn)?shù)也在增加，這與和附睪頭部上皮細(xì)胞共培養(yǎng)的精子相似(圖2a-b)，而利用Vet-T84細(xì)胞或Bin1b抗體存在時(shí)(Fig2d-e)則無明顯增加。起初不含Bin1b的未成熟精子，與Bin-T84培養(yǎng)液(本發(fā)明人假定它含有分泌的Bin1b)(圖2h)溫育1小時(shí)以后80％有Bin1b的陽性免疫反應(yīng)。然而，對(duì)于原本就有Bin1b著色的來自附睪尾部的成熟精子，未發(fā)現(xiàn)Bin1b免疫反應(yīng)的顯著增強(qiáng)?？傊瑥母讲G頭部細(xì)胞或Bin-T84細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果，肯定了本發(fā)明人的假設(shè)，Bin1b參與了精子的成熟過程——未成熟的精子開始獲得前向運(yùn)動(dòng)的能力，這也是來自附睪頭部起始區(qū)精子的一個(gè)典型變化9。Bin1b參與起始精子的成熟可以用來解釋為何這個(gè)beta-防衛(wèi)素只在頭部中間區(qū)域表達(dá)。
Bin1b是怎樣起作用的？防衛(wèi)素(defensin)是帶正電荷(極性)的分子，具有空間上分割的疏水和帶點(diǎn)區(qū)域，這能使它們能夠插入磷脂膜，在生物膜上形成孔/通道。這是防衛(wèi)素的抗菌能力作用機(jī)制之一11。也有證據(jù)表明防衛(wèi)素能通過激活L型鈣通道調(diào)節(jié)膜的離子通道12，13。因此，Bin1b可能通過形成鈣通透的通道，或激活精子上的鈣通道，而使精子能夠積累鈣離子，而鈣離子是眾所周知對(duì)精子功能——包括精子運(yùn)動(dòng)性，精子獲能和頂體反應(yīng)起重要作用的14，15。有報(bào)道精子在通過附睪時(shí)，其儲(chǔ)存鈣離子的能力有明顯的變化16，附睪頭部精子的鈣濃度比尾部的精子高兩倍17。也有證據(jù)表明附睪頭部精子從外部介質(zhì)儲(chǔ)存鈣離子的能力比附睪尾部的精子強(qiáng)2-4倍18。而且，鈣離子依賴的機(jī)制也被包含在附睪頭部的精子在精子成熟中從無規(guī)運(yùn)動(dòng)到前向運(yùn)動(dòng)的轉(zhuǎn)變過程中19，20；然而，精子成熟過程中鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)穿過精子膜的機(jī)制還不清楚。
因而，本發(fā)明人假設(shè)Bin1b形成了離子通道或Bin1b激活了鈣通道，提供了鈣離子流的通路，這是誘導(dǎo)精子運(yùn)動(dòng)所必需的。為了驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)，本發(fā)明人首先檢驗(yàn)了Bin1b對(duì)精子運(yùn)動(dòng)作用的鈣離子依賴性。當(dāng)在共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中使用不含鈣離子的培養(yǎng)液時(shí)，利用附睪頭部細(xì)胞或Bin-T84細(xì)胞，溫育時(shí)間長(zhǎng)達(dá)9小時(shí)，都未見到精子運(yùn)動(dòng)性或前向運(yùn)動(dòng)能力的提高(圖3a-b)。然而，當(dāng)在3小時(shí)將鈣離子加回培養(yǎng)液時(shí)，在加入鈣離子兩個(gè)小時(shí)之后，觀察到精子運(yùn)動(dòng)能力的增強(qiáng)并得到了向前運(yùn)動(dòng)的能力，表明Bin1b對(duì)精子運(yùn)動(dòng)的作用依賴于細(xì)胞外的鈣離子。這些結(jié)果表明Bin1b可能能夠調(diào)節(jié)精子鈣的吸收。入圖3c-d所示，將未成熟的精子與含Bin1b的培養(yǎng)液，而不是對(duì)照的Vet-T84培養(yǎng)液溫育，導(dǎo)致濃度依賴的鈣離子吸收的增強(qiáng)，這效應(yīng)能夠被Bin1b的抗體或鈣離子通道的抑制劑，nifedipine(0.5uM)和verapamil(1uM)(已知是抑制L型鈣通道)強(qiáng)烈抑制。而T型鈣通道的抑制劑pimozide(1uM)則無此作用。同樣的，nifedipine和verapamil明顯減弱了Bin1b誘導(dǎo)的精子運(yùn)動(dòng)；而T型鈣通道的特異抑制劑，pimozide則不那么有效(圖3e)。Bin1b誘導(dǎo)精子運(yùn)動(dòng)對(duì)胞外鈣離子的依賴性，含Bin1b培養(yǎng)液誘導(dǎo)精子吸收鈣離子的能力，以及Bin1b的作用被鈣離子通道抑制劑抑制表明Bin1b可能激活了精子的鈣離子通道，導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流，這是未成熟精子獲得運(yùn)動(dòng)能力所必需的。
Bin1b對(duì)附睪不同區(qū)域精子結(jié)合方式的有改變，也就是，相比附睪頭部的精子Bin1b在精子頭部廣泛分布，附睪尾部的精子Bin1b更加集中在后頂體區(qū)域。這使本發(fā)明人提出第二個(gè)問題Bin1b對(duì)附睪尾部的成熟精子的運(yùn)動(dòng)能力的維持有作用嗎？本發(fā)明人檢驗(yàn)了含Bin1b的培養(yǎng)液對(duì)附睪尾部成熟精子鈣離子吸收的影響，在整個(gè)溫育過程中未發(fā)現(xiàn)鈣離子吸收的明顯增強(qiáng)。從附睪尾部收集的精子具有旺盛的活力，其活力只有大約20％被Bin1b抗體抑制(圖3g)，與此相反在刺激過的未成熟精子中有大于90％的被抑制了(圖2a，d)。有趣的是，nifedipine在0.5uM的濃度時(shí)能在未成熟的精子中強(qiáng)烈抑制Bin1b誘導(dǎo)的精子運(yùn)動(dòng)，對(duì)附睪尾部精子的運(yùn)動(dòng)能力沒有作用，至少還不如Bin1b抗體(圖3g)。這些結(jié)果說明了兩點(diǎn)1與誘導(dǎo)未成熟精子運(yùn)動(dòng)的關(guān)鍵作用不同，Bin1b在維持成熟精子的運(yùn)動(dòng)中起到相對(duì)次要的作用；2.Bin1b對(duì)附睪尾部精子的作用可能與包含鈣離子通道的對(duì)附睪頭部精子的作用不同?？傊诰映墒爝^程中，可能產(chǎn)生了不同于Bin1b的機(jī)制來維持成熟精子的運(yùn)動(dòng)能力。
為了在生理狀態(tài)下確認(rèn)Bin1b對(duì)精子運(yùn)動(dòng)的作用，本發(fā)明人利用針對(duì)Bin1b的反義寡聚核酸來降低Bin1b在體內(nèi)的表達(dá)，并檢驗(yàn)了它對(duì)精子活力和前向運(yùn)動(dòng)能力的作用。與正義的對(duì)照相比，Bin1b的反義核酸(20ug/ml)在附睪頭部明顯降低了Bin1bmRNA的水平，這由半定量RT-PCR來驗(yàn)證了，其結(jié)果是導(dǎo)致了附睪頭部遠(yuǎn)端區(qū)域Bin1b對(duì)精子結(jié)合的明顯下降，這由免疫熒光(圖4b-c)加上流式細(xì)胞計(jì)數(shù)(圖d-e)表明了。與Bin1b表達(dá)和精子結(jié)合的下降相符合，從Bin1b反義核酸處理過的大鼠附睪頭部遠(yuǎn)端區(qū)域取出的精子與來自正義核酸處理的對(duì)照大鼠的精子相比，其活力和前向運(yùn)動(dòng)的能力明顯下降了(圖4f，g)?？傊w外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明Bin1b對(duì)精子獲得運(yùn)動(dòng)能力并起始精子成熟起重要作用。
目前的發(fā)現(xiàn)與長(zhǎng)期以來公認(rèn)的鈣離子在精子運(yùn)動(dòng)中的作用是吻合的，并為與精子獲得運(yùn)動(dòng)能力相關(guān)的精子鈣離子吸收的調(diào)節(jié)機(jī)制提供了新的認(rèn)識(shí)。Bin1b結(jié)合到精子上活化了鈣離子通道，使得鈣離子被吸收而起始未成熟精子的運(yùn)動(dòng)。精子對(duì)鈣離子的吸收被認(rèn)為是與附睪中精子成熟相伴的變化之一，而目前的發(fā)現(xiàn)與過去觀察到的附睪頭部精子與尾部精子相比，鈣離子累積的速度18和鈣離子濃度17都要高的多相吻合。Bin1b對(duì)未成熟和成熟精子作用的差異可能是由于Bin1b對(duì)精子結(jié)合方式的不同，這可能反映了對(duì)精子膜的修飾，這是一個(gè)眾所周知的與精子成熟相關(guān)的過程21?？傊珺in1b的功能是參與了未成熟精子獲得運(yùn)動(dòng)能力所必須的鈣離子吸收，而相對(duì)次要的是維持成熟精子的運(yùn)動(dòng)能力。
最新的發(fā)現(xiàn)表明附睪特異抗菌肽Bin1b，不僅僅具有抗菌活力2，而且也參與附睪內(nèi)精子成熟過程。Bin1b在不同的條件下發(fā)揮不同的功能的推測(cè)還需要進(jìn)一步研究，比如因?yàn)榭咕牡钠鹗脊δ芩枰募?xì)胞間靜電相互作用取決于流體環(huán)境中離子強(qiáng)度11，因此在附睪內(nèi)不同區(qū)域液體的不斷改變，以及細(xì)菌感染后的環(huán)境都可能導(dǎo)致Bin1b基因不同的功能。雖然Bin1b功能的具體機(jī)制有待闡明，Bin1b的兩種功能證明了抗菌肽在附睪中的重要性。他人的最新研究也發(fā)現(xiàn)一些在人和小鼠附睪區(qū)域特異表達(dá)的抗菌肽，強(qiáng)有力的支持了它們可能參與附睪調(diào)控和先天免疫過程22，23。值得注意的是最初從精液中獲得的一種抗菌肽caltrin，也顯示了對(duì)精子獲能和受精的作用24。因此，對(duì)抗菌肽的進(jìn)一步研究，可能有助于本發(fā)明人理解精子成熟過程和它的調(diào)控。包括Bin1b在內(nèi)的抗菌肽，可能具有不僅對(duì)性傳播疾病的治療的期望11，25，而且也提供了男性不育與男性避孕的研究方向。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
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權(quán)利要求
1.一種β-防衛(wèi)素的用途，其特征在于，用于制備促進(jìn)精子成熟的藥物。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的β-防衛(wèi)素是附睪特異的β-防衛(wèi)素。
3.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的β-防衛(wèi)素是Bin1b。
4.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的藥物還含有鈣離子。
5.一種β-防衛(wèi)素的用途，其特征在于，用于制備提高精子運(yùn)動(dòng)性的藥物。
6.一種β-防衛(wèi)素的用途，其特征在于，用于制備提高精子前向運(yùn)動(dòng)百分比的藥物。
7.一種藥物組合物，其特征在于，它含有安全有效量的β-防衛(wèi)素和鈣離子源以及藥學(xué)上可接受的載體，其中所述的鈣離子源是鈣離子或能夠產(chǎn)生鈣離子的物質(zhì)。
8.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的β-防衛(wèi)素是附睪特異的β-防衛(wèi)素。
9.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的β-防衛(wèi)素是Bin1b。
10.一種體外促進(jìn)精子成熟的方法，其特征在于，包括步驟(a)在精子細(xì)胞的培養(yǎng)液中添加β-防衛(wèi)素；(b)繼續(xù)培養(yǎng)精子細(xì)胞，從而獲得成熟的精子。
全文摘要
本發(fā)明公開了附睪特異性的β－防衛(wèi)素的用途，它們被用于制備促進(jìn)精子成熟的藥物。優(yōu)選的β－防衛(wèi)素是Bin1b。還提供了一種促進(jìn)精子成熟的組合物，它含有安全有效量的β－防衛(wèi)素和鈣離子源以及藥學(xué)上可接受的載體。
文檔編號(hào)A61K38/17GK1689640SQ20041001810
公開日2005年11月2日 申請(qǐng)日期2004年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月30日
發(fā)明者陳小章, 張永蓮, 周晨曦, 蕭蒞勍, 鄭敏, 曾麗玲, 黃巧茵, 何樂思, 鍾耀華 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院