專利名稱：β－七葉皂甙鈉在制備治療白血病藥物中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及β-七葉皂甙鈉在制備治療白血病藥物中的應用。
背景技術(shù)：
七葉皂甙鈉是從中藥娑羅子干燥成熟果實中提取所得的總皂甙，主要有效成分為七葉皂苷A、B、C、D，根據(jù)德國DAC的定義七葉皂苷A、B稱為β-七葉皂甙，C、D七葉皂甙稱為α-七葉皂甙。β-七葉皂甙鈉具有抗炎性滲出、消除腫脹、增加靜脈張力、改善微循環(huán)促進肢體功能揮復等作用，這已在國外藥理學研究和臨床實踐中被證實，臨床主要應用于腦水腫、顱腦外傷、腦梗死、乙型腦炎及肢體腫脹等疾病的治療。
白血病是人體血液中白細胞的惡性病變。其病理特征是在骨髓和造血組織中有廣泛的白血病細胞異常增生及浸潤其他組織器官。在周圍血液中，白細胞有質(zhì)與量的改變，數(shù)目增多或減少，并伴有幼稚細胞增多，由于異常白血病細胞增生而影響造血組織的正常造血。臨床常有貧血、發(fā)熱、出血及肝、脾淋巴結(jié)腫大等征象。本病起病多急驟，進展迅速，自然存活期在6個月～1年之內(nèi)，經(jīng)化療取得完全緩解后，長期無病生存率可達20％～40％，骨髓移植后可有50％以上患者獲得長期無病生存。白血病具有與其他惡性癌瘤的共同特點。即(1)白血病細胞和惡性腫瘤細胞一樣，可以無限制地增生；(2)白血病細胞也可像其他惡性腫瘤細胞一樣，無阻攔地侵犯人體的各種臟器，影響臟器功能，導致全身衰竭而死亡；(3)白血病也可以表現(xiàn)為局部浸潤，如腫瘤一樣形成腫塊。如皮膚浸潤結(jié)節(jié)及兒童常見的眼窩部綠色瘤等。故一般人常將白血病稱為″血癌″。
在機體的生長發(fā)育中，細胞的增殖與死亡(壞死、凋亡)過程達到動態(tài)平衡是維護其自身恒定的必要條件，一旦兩者間的平衡失調(diào)就會誘發(fā)多種疾病。腫瘤細胞的最大特征是異常增殖，凋亡減退。腫瘤細胞凋亡的誘導是治療腫瘤的新途徑。細胞凋亡作為細胞的一種基本生命現(xiàn)象，貫穿于個體生長、發(fā)育直至死亡的整個生命過程中，因而有著極其重要的意義。有關(guān)中藥與細胞凋亡的研究已有不少報道，發(fā)現(xiàn)一些中藥可通過抑制腫瘤細胞增殖，促進其凋亡來達到治療腫瘤的目的，但大多作用微弱，無實際應用價值。β-七葉皂甙鈉(七葉皂苷，Escin)是由中藥娑羅子干燥成熟果實中提取的三萜葡萄糖甙類化合物，具有抗炎癥滲出、增加靜脈張力等藥理作用，在國內(nèi)外已被廣泛用于顱腦外傷、腦梗死及肢體腫脹等疾病的治療。
國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，β-七葉皂甙鈉可使靜脈收縮和促進淋巴回流作用，其有效持續(xù)5小時以上；另外，β-七葉皂甙鈉可抑制血漿滲入胸腔和白細胞游入胸腔，還能減輕自由基對細胞及周圍組織的損害作用，使腎上腺分泌皮質(zhì)醇，抑制組織胺所致毛細血管通透性，研究表明β-七葉皂甙鈉可用于制備治療癌性胸水的藥物。另有實驗證明，β-七葉皂甙鈉對肝癌引起的腹水，也有著較好的治療效果β-七葉皂甙鈉作用主要是抗?jié)B出及消腫，而且能擴張動脈，增加靜脈張力，改善微循環(huán)，還能使腎上腺皮質(zhì)分泌皮質(zhì)醇，抑制組織胺引起的毛細血管通透性增加，因而有明顯的抗炎、消腫作用。
但有關(guān)β-七葉皂甙鈉在抑制白血病細胞增殖和誘導凋亡的研究未見報道。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明既是為了提供β-七葉皂甙鈉在制備治療白血病藥物中的應用，為新藥篩選提供依據(jù)。
為達到發(fā)明目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案是β-七葉皂甙鈉在制備治療白血病藥物中的應用，主要通過抑制紅白血病細胞K562增殖和誘導白血病細胞K562凋亡來發(fā)揮作用，而且，β-七葉皂甙鈉也可抑制人早幼粒系白血病細胞HL-60增殖和誘導白血病細胞HL-60的凋亡。
β-七葉皂甙鈉終濃度為10～70mg.L-1，有效時間為24～72小時，終濃度優(yōu)選30～50mg.L-1，所述的藥物還含有藥物賦形劑或載體，β-七葉皂甙鈉也可與其他藥物共同使用。
本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在(1)β-七葉皂甙鈉可抑制K562、HL-60細胞增殖，極易顯著誘導白血病細胞凋亡，為其應用于白血病治療提供了有益線索；(2)β-七葉皂甙鈉體外抗腫瘤活性很強，量效關(guān)系明顯，作用隨時間延長而增強，為抗白血病新藥篩選提供了基礎。


圖1為β-七葉皂甙鈉對K562細胞生長的影響示意圖；圖2為β-七葉皂甙鈉對CFU-K562集落形成的影響示意圖；圖3為K562細胞經(jīng)β-七葉皂甙鈉作用不同時間后的DNA片段分析圖其中1為Maker(50bp Ladder)，2為對照細胞，3為經(jīng)10mg.L-1的藥物作用24h的細胞，4為經(jīng)30mg.L-1的藥物作用24h的細胞，5為經(jīng)50mg.L-1的藥物作用24h的細胞，6為經(jīng)70mg.L-1的藥物作用24h的細胞；圖4為流式細胞術(shù)分析β-七葉皂甙鈉作用后的K562細胞DNA含量結(jié)果圖其中a為對照細胞，b為經(jīng)30mg.L-1的藥物作用24h的細胞，c為經(jīng)50mg.L-1的藥物作用24h的細胞；圖5為β-七葉皂甙鈉對HL-60細胞生長的影響示意圖；圖6為β-七葉皂甙鈉對CFU-HL-60集落形成的影響示意圖；圖7為HL-60細胞經(jīng)β-七葉皂甙鈉作用不同時間后的DNA片段分析圖其中1為Maker(50bp Ladder)，2為對照細胞，3～5為分別為經(jīng)30mg.L-1的藥物作用24、48、72h的細胞，6～8分別為經(jīng)50mg.L-1的藥物作用24、48、72h的細胞。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述實施例1β-七葉皂甙抑制K562細胞增殖及誘導凋亡1材料與方法1.1主要試劑和儀器β-七葉皂甙鈉購自煙臺綠葉制藥有限公司，批號20021006，純度為88.6％，用IMDM培養(yǎng)液配成所需濃度的工作液，用0.25μm孔徑的濾膜正壓過濾除菌，4℃保存。Annexin V-FITC購自PharMingen，PI由Sigma公司提供。流式細胞儀，美國Coulter公司，Epics-XL型。
1.2細胞培養(yǎng)K562細胞株購自上海細胞所，在37，5％CO2條件下，用含體積分數(shù)10％小牛血清、青霉素(1×105U.L-1)、鏈霉素(100μmol.L-1)的IMDM培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)，實驗用細胞均處于對數(shù)生長期。
1.3細胞增殖抑制試驗取對數(shù)生長期細胞，以0.5×106.ml-1為起始濃度，分別加入10、30、50和70mg.L-1的β-七葉皂甙鈉，對照組不加藥物。分別于培養(yǎng)24、48和72h后，進行以下實驗I，臺盼藍染色，計數(shù)活細胞數(shù)，確定細胞活力，并計算藥物對細胞生長的抑制率，同樣的實驗重復3次；II，CFU-K562集落培養(yǎng)2ml IMDM培養(yǎng)體系中含體積分數(shù)20％小牛血清、青霉素(1×105U.L-1)、鏈霉素(100μmol.L-1)、0.3％瓊脂和5×103.ml-1細胞，以0.5ml.孔-1接種于24孔培養(yǎng)板中，每組設3個平行孔，培養(yǎng)5天后計數(shù)集落(＞20個細胞)數(shù)。
1.4細胞形態(tài)學觀察細胞懸液經(jīng)離心涂片機涂片，甲醇固定5min、蘇木精染色1min、1％鹽酸分化10s。自來水沖洗，晾干，油鏡下觀察。
1.5DNA片段分析收集2.5×106細胞，經(jīng)冷PBS洗滌后，加入50μl細胞裂解液(1％NP-40、0.5mol.L-1EDTA、1mol.L-1Tris.HCL，pH 7.5)作用10s后收集上清。重復提取1次，合并上清共100μl，加入RNAase A和10％SDS，使終濃度分別為3mg.L-1和1％，56℃作用2h。然后加入蛋白酶K，終濃度為2mg.L-1，37℃作用3h。加入1/10體積的3mol.L-1乙酸鈉和2倍體積的100％乙醇，沉淀DNA。離心并洗滌后，DNA沉淀加10μl TE緩沖液(10mmol.L-1Tris.CL，1mol.L-1EDTA，pH 8.0)在56℃水浴中溶解30min。然后加染料，在1.2％瓊脂糖凝膠上電泳2～3h，紫外光下觀察并攝影，同樣的實驗重復3次。
1.6Annexin V-FITC/PI標記法分析收集細胞1×105，冷PBS洗滌后，重新懸浮于100μl Binding緩沖液(10mmol.L-1HEPES/NaOH、140mmol.L-1NaCl、2.5mmol.L-1CaCl2，pH7.4)，加入5μl Annexin V-FITC和10μl PI(50mg.L-1)，輕搖混勻后，室溫孵育15min(避光)，加入400μl Binding緩沖液，1h內(nèi)用流式細胞儀分析細胞凋亡、壞死和活細胞的百分率。
1.7流式細胞術(shù)檢測DNA含量0.5×106細胞用PBS洗滌后，用含1％多聚甲醛的PBS液，4℃固定30min，洗滌后，沉淀重新懸浮于0.1％Triton-100的PBS液中，加PI(1g.L-1)25μl，4℃暗處保存。檢測前30min加入10μg.L-1RNAase A5μl，室溫放置30min，流式細胞儀檢測。
1.8統(tǒng)計學處理用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包中的t檢驗進行統(tǒng)計學處理。
2結(jié)果2.1細胞增殖抑制試驗結(jié)果結(jié)果見圖1和圖2。從圖1和圖2可見藥物作用呈時間和劑量依賴式30mg.L-1和50mg.L-1的β-七葉皂甙鈉分別作用于細胞24、48和72h，細胞生長抑制率和集落形成抑制率均明顯高于對照組(P＜0.05)。10mg.L-1的β-七葉皂甙鈉作用不顯著(P＞0.05)，70mg.L-1的β-七葉皂甙具有一定的細胞毒作用，細胞增殖被完全抑制。
2.2細胞形態(tài)學結(jié)果K562細胞經(jīng)30～50mg.L-1的藥物作用24～72h后，顯微鏡下可見部分細胞變長，膜鼓起并逐漸脫離細胞形成凋亡小體。染色后可觀察到細胞出現(xiàn)一系列的形態(tài)變化染色質(zhì)濃聚，形成致密的染色質(zhì)團塊，并沿核膜邊緣聚集，胞質(zhì)空泡化，繼之核固縮，碎裂成大小不等的核物質(zhì)，細胞膜包裹裂解的細胞核及細胞漿形成凋亡小體。
2.3DNA片段分析結(jié)果結(jié)果見圖3。從圖3可見30、50和70mg.L-1的β-七葉皂甙鈉作用于細胞24h可見DNA梯帶，10mg.L-1組未見。
2.4Annexin V-FITC/PI標記法結(jié)果不同濃度的藥物作用于K562細胞24h后，各處理組凋亡、壞死和活細胞的百分率具體見表1，細胞凋亡率最高達48.7％，70mg.L-1組細胞壞死比率明顯增高。
表1
2.5流式細胞術(shù)分析DNA含量結(jié)果結(jié)果見圖4。30和50mg.L-1的β-七葉皂甙鈉作用于細胞24h，流式細胞儀直方圖上呈現(xiàn)特征性的亞二倍體峰，即凋亡小峰(Ap峰)。凋亡率分別為21.8％和42.4％，與Annexin V-FITC/PI標記法結(jié)果相符。
3.結(jié)論實驗發(fā)現(xiàn)β-七葉皂甙鈉可時間和劑量依賴式抑制細胞增殖，極顯著誘導細胞凋亡流式細胞術(shù)觀察到Ap峰，瓊脂糖凝膠電泳觀察到DNA梯帶；Annexin V-FITC測定觀察到細胞凋亡率明顯增加。30和50mg.L-1的β-七葉皂甙鈉分別作用于細胞24，48和72h，細胞生長抑制率最高達81.8％，細胞凋亡率最高達48.7％。低劑量(10mg.L-1)的β-七葉皂甙鈉作用不明顯；高劑量(70mg.L-1)的β-七葉皂甙鈉作用于K562細胞48和72h，細胞增殖完全被抑制，出現(xiàn)細胞毒作用。本研究表明，β-七葉皂甙鈉體外抗白血病活性很強，量效關(guān)系明顯，作用隨時間延長而增強，極有希望發(fā)展成抗白血病新藥。
實施例2β-七葉皂甙鈉抑制HL-60細胞增殖及誘導凋亡1材料與方法1.1材料細胞HL-60細胞株，由中科院上海細胞所提供。
藥品β-七葉皂甙鈉購自煙臺綠葉制藥有限公司，批號20021006，純度為88.6％，用培養(yǎng)液配成所需濃度的工作液，用0.25μm孔徑的濾膜正壓過濾除菌，4℃保存。Annexin V-FITC購自PharMingen、PI由Sigma公司提供。流式細胞儀，美國Coulter公司，Epics-XL型。
1.2方法
1.2.1細胞培養(yǎng)HL-60細胞在37℃，5％CO2條件下，用含體積分數(shù)10％小牛血清、青霉素(1×105U.L-1)、鏈霉素(100μmol.L-1)的IMDM培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)，實驗用細胞均處于對數(shù)生長期。
1.2.2細胞生長抑制試驗取對數(shù)生長期細胞，以0.5×106/ml為起始細胞濃度，分別加入10，30，50和70mg.L-1的β-七葉皂甙鈉，對照組不加藥物。分別于培養(yǎng)24，48和72h后，臺盼藍染色，計數(shù)活細胞數(shù)，確定細胞活力，并計算藥物對細胞生長的抑制率，同樣的實驗重復3次；1.2.3CFU-HL-60集落培養(yǎng)采用常規(guī)體外半固體集落培養(yǎng)法。2ml IMDM培養(yǎng)體系中含體積分數(shù)20％小牛血清、青霉素(1×105U.L-1)、鏈霉素(100μmol.L-1)、0.3％瓊脂和5×103/ml細胞，以0.5ml/孔接種于24孔培養(yǎng)板中，每組設3個平行孔，培養(yǎng)5天后計數(shù)集落數(shù)(＞20個細胞)，計算藥物對細胞形成CFU-HL-60集落的抑制率。
1.2.4DNA片段分析收集2.5×106細胞，經(jīng)冷PBS洗滌后，加入50μl細胞裂解液(1％NP-40、0.5mol.L-1EDTA、1mol.L-1Tris.HCL，pH 7.5)作用10s后收集上清。重復提取1次，合并上清共100μl，加入RNAase A和10％SDS，使終濃度分別為3mg..L-1和1％，56℃作用2h。然后加入蛋白酶K，終濃度為2mg.L-1，37℃作用3h。加入1/10體積的3mol.L-1乙酸鈉和2倍體積的100％乙醇，沉淀DNA。離心并洗滌后，DNA沉淀加10μl TE緩沖液(10mmol/L Tris.CL，1mol.L-1EDTA，pH 8.0)在56℃水浴中溶解30min。然后加染料，在1.2％瓊脂糖凝膠上電泳2～3h，紫外光下觀察并攝影，同樣的實驗重復3次。
1.2.5Annexin V-FITC/PI標記法收集細胞1×105，冷PBS洗滌后，重新懸浮于100μl Binding緩沖液(10mmol.L-1HEPES/NaOH、140mmol.L-1NaCl、2.5mmol.L-1CaCl2，pH7.4)，加入5μl Annexin V-FITC和10μl PI(50mg..L-1)，輕搖混勻后，室溫孵育15min(避光)，加入400μl Binding緩沖液，1h內(nèi)流式細胞儀分析凋亡、壞死和活細胞的百分率。
1.3統(tǒng)計學處理用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包中的t檢驗進行統(tǒng)計學處理。
2結(jié)果2.1β-七葉皂甙鈉對HL-60細胞生長的影響實驗結(jié)果見圖5，藥物作用呈時間和劑量依賴式30和50mg.L-1的β-七葉皂甙鈉分別作用于細胞24，48和72h，生長抑制率明顯高于對照組(P＜0.05)，抑制率最高分別達到52.8％和79.8％。10mg.L-1的β-七葉皂甙鈉作用不顯(P＞0.05)，70mg.L-1的β-七葉皂甙具有一定的細胞毒作用。
2.2β-七葉皂甙鈉對CFU-HL-60集落生成的影響實驗結(jié)果見圖6，藥物對CFU-HL-60的作用也與時間和劑量有關(guān)30和50mg.L-1的β-七葉皂甙鈉分別作用于細胞24，48和72h，集落形成抑制率明顯高于對照組(P＜0.01)，集落形成抑制率最高分別達到67.8％和89.6％。10mg.L-1的β-七葉皂甙鈉作用不顯著(P＞0.05)，70mg.L-1的β-七葉皂甙作用48和72h細胞增殖被完全抑制，抑制率達100％。
2.3DNA片段分析實驗結(jié)果見圖7，HL-60細胞經(jīng)30mg.L-1的β-七葉皂甙鈉作用24，48和72h后出現(xiàn)典型的DNA梯帶，提示β-七葉皂甙鈉可使細胞內(nèi)源性核酸酶活性增高，將核小體之間的DNA切割形成180-200bp的多聚體。50mg.L-1的藥物作用24和48h可見DNA梯帶，72h DNA梯帶不明顯，可能因為細胞壞死較多。
2.4Annexin V-FITC/PI分析不同濃度的藥物作用于HL-60細胞24h后，各處理組凋亡、壞死和活細胞的百分率具體見表2，細胞凋亡率最高達54.8％，70mg.L-1組細胞壞死比率明顯增高。
表2Annexin V-FITC分析細胞凋亡、壞死和存活的百分率(x±s)
注與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.013結(jié)論β-七葉皂甙可時間和劑量依賴式抑制HL-60白血病細胞增殖，極顯著誘導細胞凋亡瓊脂糖凝膠電泳觀察到DNA梯帶；Annexin V-FITC測定觀察到細胞凋亡率明顯增加。低劑量(10mg.L-1)的β-七葉皂甙鈉作用不明顯；高劑量(70mg.L-1)的β-七葉皂甙鈉作用于HL-60細胞48和72h，細胞增殖完全被抑制，出現(xiàn)細胞毒作用。研究表明，β-七葉皂甙鈉體外抗腫瘤活性很強，量效關(guān)系明顯，作用隨時間延長而增強，極有希望發(fā)展成抗腫瘤新藥。
權(quán)利要求
1.β-七葉皂甙鈉在制備治療白血病藥物中的應用。
2.如權(quán)利要求1所述的β-七葉皂甙鈉在制備治療白血病藥物中的應用，其特征在于β-七葉皂甙鈉抑制白血病細胞K562增殖。
3.如權(quán)利要求1所述的β-七葉皂甙鈉在制備治療白血病藥物中的應用，其特征在于β-七葉皂甙鈉誘導白血病細胞K562凋亡。
4.如權(quán)利要求1所述的β-七葉皂甙鈉在制備治療白血病藥物中的應用，其特征在于β-七葉皂甙鈉抑制白血病細胞HL-60增殖。
5.如權(quán)利要求1所述的β-七葉皂甙鈉在制備治療白血病藥物中的應用，其特征在于β-七葉皂甙鈉誘導白血病細胞HL-60凋亡。
6.如權(quán)利要求2～5之一所述的β-七葉皂甙鈉在制備抗白血病藥物中的應用，其特征在于所述的β-七葉皂甙鈉終濃度為10～70mg.L-1。
7.如權(quán)利要求6所述的β-七葉皂甙鈉在制備抗白血病藥物中的應用，其特征在于所述的β-七葉皂甙鈉終濃度為30～50mg.L-1。
8.如權(quán)利要求1～5之一所述的β-七葉皂甙鈉在制備抗白血病藥物中的應用，其特征在于所述的藥物還含有藥物賦形劑或載體。
9.如權(quán)利要求1～5之一所述的β-七葉皂甙鈉在制備抗白血病藥物中的應用，其特征在于所述的應用為所述的β-七葉皂甙鈉與其他藥物共同使用。
全文摘要
本發(fā)明涉及β－七葉皂甙鈉在制備治療白血病藥物中的應用。β－七葉皂甙鈉可抑制K562、HL－60細胞增殖，極易顯著誘導白血病細胞凋亡，為其應用于白血病治療提供了有益線索；β－七葉皂甙鈉體外抗腫瘤活性很強，量效關(guān)系明顯，作用隨時間延長而增強，為抗白血病新藥篩選提供了基礎。
文檔編號A61K31/704GK1689578SQ200410018150
公開日2005年11月2日 申請日期2004年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月30日
發(fā)明者牛泱平 申請人:浙江工業(yè)大學