專利名稱：基因重組人溶菌酶在消除病原微生物感染炎癥上的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)中利用基因重組人溶菌酶(HLZ)作為制備治療病原微生物感染引起各種炎癥藥物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
溶菌酶是由Fleming在1922年發(fā)現(xiàn)的(Proc.R.Soc.Lond.Biol.Sci.1922；93306)。它是一種有效的抗菌劑，全稱為1，4-β-N-溶菌酶或者稱粘肽N-乙?；邗Ｋ饷?。它能切斷細(xì)菌胞壁的肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之間的β-1，4糖苷鍵的聯(lián)接，破壞肽聚糖支架，細(xì)菌在內(nèi)部滲透壓的作用下細(xì)胞脹裂開，引起細(xì)菌裂解。人和動(dòng)物細(xì)胞無細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)亦無肽聚糖，故溶菌酶對(duì)人體細(xì)胞無毒性作用。溶菌酶存在于人體多種組織及分泌物中，也存在于多種動(dòng)、植物中。除了溶菌酶在機(jī)體預(yù)防感染方面的作用外，它還有其它生物學(xué)作用。
有大量的文獻(xiàn)報(bào)道溶菌酶的抗菌作用。溶菌酶在很多鳥類蛋清中濃度很高。盡管這些脊椎動(dòng)物有免疫球蛋白系統(tǒng)，但卵及發(fā)育中的胚胎不產(chǎn)生免疫球蛋白，直到孵化前的7天才會(huì)產(chǎn)生(Jolles P，et al.Mol.Cell.Biol.Chem.1984；63165)。因此，在這段時(shí)間溶菌酶起到防御作用。而在無脊椎動(dòng)物中由于不產(chǎn)生免疫球蛋白，溶菌酶起到脊椎動(dòng)物中已退化的保護(hù)系統(tǒng)作用。有人認(rèn)為溶菌酶是單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的一種原始的非特異防御機(jī)制，在種系發(fā)育上早于更為特異的淋巴細(xì)胞-漿細(xì)胞-免疫球蛋白系統(tǒng)。但現(xiàn)在認(rèn)為溶菌酶和免疫球蛋白功能上聯(lián)系緊密。溶菌酶和分泌型免疫球蛋白組織分布相似，IgA和溶菌酶都存在于一些外分泌液如淚液、唾液、氣管支氣管分泌物及胃液等，只有少部分溶菌酶存在于內(nèi)分泌液如血液、腦膜液和腦脊髓液。溶菌酶廣泛存在于自然界動(dòng)物、植物和微生物中。
溶菌酶除可以直接裂解細(xì)菌，還可以作為免疫調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的作用，保護(hù)炎癥部位的正常組織，在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中起負(fù)反饋?zhàn)饔?Leo IG，et al.J.Clin.Invist.1979；64222)。它可能通過與多形核粒細(xì)胞膜表面的多糖部分結(jié)合，抑制多形核粒細(xì)胞向炎癥部位移動(dòng)，并可衰減炎癥部位由多形核粒細(xì)胞所產(chǎn)生的超氧化的作用，保護(hù)機(jī)體在炎癥反應(yīng)時(shí)由于免疫應(yīng)答過渡而發(fā)生的組織損傷。也有報(bào)道說在單核細(xì)胞的培液中加入高濃度溶菌酶，可提高單核細(xì)胞吞噬結(jié)核桿菌的能力(Kokoshis PL，etal.Science.1978；1991340)。溶菌酶還可與其他生物活性蛋白共同作用，充分發(fā)揮抗菌作用，如補(bǔ)體、乳轉(zhuǎn)鐵蛋白等。梁愛華等研究溶菌酶對(duì)頭孢他啶誘導(dǎo)的細(xì)菌內(nèi)毒素(LPS)釋放抑制作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)溶菌酶能抑制頭孢他啶誘導(dǎo)的細(xì)菌內(nèi)毒素釋放。近期研究發(fā)現(xiàn)溶菌酶除溶菌作用外，還有抗HIV病毒作用(Lee-Huang S.Proc Natl Acad Sci USA1999；96(6)2678)，其作用可能是由于溶菌酶結(jié)構(gòu)與組蛋白相類似，使溶菌酶與DNA和RNA結(jié)合(Steinrauf LK.Biochem Biophys Res Commun 1999；266(2)366)。
目前，人們主要從雞蛋清中來制取雞溶菌酶。然而，雞溶菌酶作為異種蛋白可引起變態(tài)反應(yīng)而無法用于人類，天然人溶菌酶的價(jià)格過于昂貴也無法用于臨床。
本發(fā)明的目的是以我公司于2000年申請(qǐng)中國專利00110463.2利用生物基因工程技術(shù)從酵母菌或大腸桿菌實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，提取純化的產(chǎn)物基因重組人溶菌酶純度高達(dá)99.8％以上，活性高達(dá)70,000u/mg，同時(shí)具有天然人溶菌酶的殺菌活性。在此基礎(chǔ)上，為本發(fā)明提供基因重組人溶菌酶的新用途，在作為制備治療病原微生物感染引起炎癥藥物中的新應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首先用基因重組人溶菌酶(HLZ)通過試管法(見附圖1)和平板法(見附圖2)作為制備治療病原微生物細(xì)菌、真菌、病毒感染引起炎癥的藥物進(jìn)行活性、殺菌和抗炎鑒定。然后，用純度99.8％以上、活性70,000u/mg的基因重組人溶菌酶作為制備治療細(xì)菌、真菌和病毒感染在皮膚黏膜表面引起上呼吸道炎癥、陰道炎癥、皮膚炎癥和口腔炎癥藥物的應(yīng)用；將具有殺菌和抗炎作用的基因重組人溶菌酶制成體內(nèi)用藥口服片劑、霧化吸入噴霧劑和體外用藥滴劑、膏劑、栓劑；以及用基因重組人溶菌酶與抗生素1∶1組合物作為制備治療病原微生物感染引起體內(nèi)外炎癥藥物聯(lián)合用藥的應(yīng)用。
本發(fā)明病原微生物中涉及的細(xì)菌是指革蘭氏陽性、陰性細(xì)菌、厭氧菌、耐藥性細(xì)菌和L型細(xì)菌；涉及的病毒是指DNA病毒和RNA病毒；上呼吸道炎癥是由耐藥金葡球菌感染引起的氣管炎、支氣管炎、肺炎、咽炎；皮膚炎癥是由革蘭氏陽性、陰性細(xì)菌感染引起的濕疹、過敏性皮炎、青春痘、風(fēng)疹、牛皮癬或蕁麻疹；口腔炎癥是由厭氧性球菌感染引起的牙齦炎或口腔潰瘍。
本發(fā)明還涉及用基因重組人溶菌酶與抗生素按1∶1組合聯(lián)合用藥，抗生素是指克拉霉素、羅紅霉素、萬古霉素或德可霉素。
本發(fā)明還涉及用基因重組人溶菌酶作為制備治療上呼吸道炎癥、陰道炎癥和皮膚炎癥的藥物是由1％基因重組人溶菌酶凍干粉和5mM磷酸鹽PH5緩沖液配制成的注射劑，靜脈注射用藥量為30,000u/ml/20g鼠，每日三次；作為制備治療口腔炎癥的藥物是由0.1％基因重組人溶菌酶凍干粉、20mM磷酸鹽PH7緩沖液、25％丙三醇和5/萬吐溫80配制成的噴霧劑，用藥量為1500μl/20g鼠，每日六次；作為制備治療體內(nèi)細(xì)菌感染引起炎癥用藥的口服片劑是由10％基因重組人溶菌酶凍干粉、50％藥用淀粉、25％藥用糊精、10mM磷酸鹽PH6緩沖液和5％蔗糖配制而成；體內(nèi)霧化吸入基因重組人溶菌酶的濃度0.025～0.4mg/ml，吸入用藥2～5天；作為制備治療體外用藥的滴劑是由0.005％基因重組人溶菌酶凍干粉、10mM磷酸鹽PH6緩沖液、20％丙三醇、6％2-吡咯烷酮-5羧酸鈉、0.9％水溶性氮酮和3/萬吐溫80配制而成；體外用藥膏劑是由0.1％基因重組人溶菌酶凍干粉、20mM磷酸鹽PH7緩沖液、20％丙三醇、1％卡波樹脂和0.3％香精配制而成。
為了更好的理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，首先，我們通過試管法(見附圖1)用基因重組人溶菌酶作為活性組分應(yīng)用對(duì)耐藥菌進(jìn)行溶菌活性鑒定，其方法是用PH7.2 Tris-HCl緩沖液將金葡菌或大腸桿菌配成107～108CFU/ml濃度的菌液定量加到不同華試管中，同時(shí)分別加入100μg～1mg不同劑量的基因重組人溶菌酶，37℃過夜，每管取一定量以10倍稀釋，并涂于LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜，觀察結(jié)果，計(jì)算原始管中的細(xì)菌總數(shù)(具體操作見實(shí)施例1)。
基因重組人溶菌酶的溶菌效果＝(對(duì)照管中細(xì)菌總數(shù)-實(shí)驗(yàn)管中細(xì)菌總數(shù))/對(duì)照管中細(xì)菌總數(shù)×100％平板法(見附圖2)用基因重組人溶菌酶溶菌活性的鑒定，其方法是用PH7.2 Tris-HCl緩沖溶液配制瓊脂糖高壓滅菌后，冷卻，加入細(xì)菌傾倒平板，打孔，孔中加入0～100mg/ml不同濃度基因重組人溶菌酶溶液，37℃孵育4～6小時(shí)，將LB營養(yǎng)瓊脂高壓滅菌，冷卻，覆蓋于瓊脂糖平板上，紫外燈照20分鐘，37℃孵化培養(yǎng)過夜，觀察瓊脂糖與營養(yǎng)瓊脂層之間細(xì)菌生長情況，測量不同濃度溶菌酶抑菌直徑。抑菌圈直徑加樣孔直徑4mm者為最低有效殺菌濃度(具體操作見實(shí)施例2)。
通過上述溶菌酶活性鑒定方法，分別對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒進(jìn)行活性應(yīng)用測定，結(jié)果分述如下1、在用基因重組人溶菌酶作為治療細(xì)菌感染引起炎癥的藥物中活性成分的應(yīng)用分別對(duì)革蘭氏陽性、陰性細(xì)菌、厭氧菌、耐藥性細(xì)菌和L型細(xì)菌進(jìn)行了活性鑒定，即對(duì)8株金黃色葡萄球菌、6株肺炎克雷伯氏菌、3株綠濃假單胞桿菌、7株大腸桿菌、1株鮑鰻桿菌、1株粘質(zhì)沙雷氏菌、3株變形桿菌和1株甲型鏈球菌進(jìn)行溶菌活性試驗(yàn)，這30株細(xì)菌均對(duì)基因重組人溶菌酶敏感，有效抑菌濃度范圍在50μg～1.0mg/ml之間。基因重組人溶菌酶對(duì)不同菌的最低抑菌濃度之間的差異，主要存在于相同菌的不同菌株之間。
2、在用基因重組人溶菌酶作為治療真菌感染引起的藥物中活性成分的應(yīng)用分別對(duì)8株真菌，即白色念珠菌、熱帶念珠菌和克柔氏念珠菌進(jìn)行了抑菌試驗(yàn)，它們均有明顯的抑菌效果(見附圖3a和3b)人溶菌酶在體外具有明顯的殺滅真菌的活性。其抑菌試驗(yàn)方法與上述基因重組人溶菌酶作用耐藥性細(xì)胞的抑菌實(shí)驗(yàn)相同。
3、在用基因重組人溶酶作為治療病毒感染引起炎癥的藥劑中活性成分的應(yīng)用，基因重組人溶菌酶對(duì)人宮頸癌傳代細(xì)胞(HELA)培養(yǎng)的冠狀病毒04號(hào)的抑制作用，采用不同濃度的基因重組人溶菌酶，用病毒細(xì)胞CPE法，計(jì)算藥物的半數(shù)有效濃度(IC50)和最小有效濃度(MIC)及治療指數(shù)TI來判斷藥效。具體方法是人宮頸癌傳代細(xì)胞HELA以40萬/ml濃度接種96孔培養(yǎng)板，在37℃5％CO2孵箱培養(yǎng)24小時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)至單層，棄掉培養(yǎng)液，加入100TCID50的冠狀病毒液，置37℃5％CO2吸附2小時(shí)后，棄掉病毒液，加入不同濃度的基因重組人溶菌酶藥液，藥物選用對(duì)細(xì)胞的最大無毒濃度(TD0)2倍稀釋10個(gè)濃度為6000μg/ml～1.46μg/ml，將稀釋的藥物分別加入細(xì)胞孔內(nèi)，每濃度3孔，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照和病毒對(duì)照，置37℃5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～7天，逐日在倒置顯微鏡下觀察病毒CPE，以病毒對(duì)照出現(xiàn)+++-++++時(shí)結(jié)束試驗(yàn)，用Reed-Muench法，計(jì)算藥物的半數(shù)有效濃度(IC50)和最小有效濃度(MIC)及治療指數(shù)(TI)判斷藥效，試驗(yàn)重復(fù)三次。
(1)基因重組人溶菌酶對(duì)HELA細(xì)胞的毒性作用，以陽性對(duì)照藥物更昔洛韋作比較，三次試驗(yàn)結(jié)果的平均值驗(yàn)證藥物基因重組人溶菌酶的最大無毒濃度(TD0)為750±0mg/ml，半數(shù)中毒濃度(TD50)為1500±0μg/ml。
陽性對(duì)照藥物注射用更昔洛韋的最大無毒濃度＞60000±0μg/ml，半數(shù)中毒濃度(TD50)為＞60000±0μg/ml在HELA細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對(duì)冠狀病毒04號(hào)毒力測定結(jié)果，半數(shù)感染量(TCID50)為10-3(見附圖4)。
(2)基因重組人溶菌酶在HELA細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對(duì)冠狀病毒04號(hào)抑制作用三次試驗(yàn)結(jié)果(見附圖4)的平均值驗(yàn)證藥物為基因重組人溶菌酶，CPE法，藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為23.4±0μg/ml，最小有效濃度(MIC)為46.8±0μg/ml，治療指數(shù)(TI)為16。
陽性對(duì)照藥物為注射用更昔洛韋，CPE法，藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為11.7±0μg/ml，最小有效濃度(MIC)為23.44±0μg/ml，治療指數(shù)(TI)為256。
(3)基因重組人溶菌酶在HELA細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對(duì)冠狀病毒04號(hào)預(yù)防作用三次試驗(yàn)結(jié)果的平均值驗(yàn)證藥物為基因重組人溶菌酶，CPE法，藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為5.9±0μg/ml，最小有效濃度(MIC)為11.7±0μg/ml，治療指數(shù)(TI)為64。
陽性對(duì)照藥物為注射用更昔洛韋，CPE法，藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為11.7±0μg/ml，最小有效濃度(MIC)為23.44±0μg/ml，治療指數(shù)(TI)為256。
一、基因重組人溶菌酶作為制備治療上呼吸道炎癥、陰道炎癥、口腔炎癥和皮膚炎癥藥物的應(yīng)用。
下面將分述由耐藥金黃色葡萄球菌感染引起的上呼吸道氣管炎、支氣管炎；由耐藥鏈球菌感染引起的陰道炎；由厭氧性球菌感染引起的口腔炎；由革蘭氏陽性、陰性細(xì)菌感染引起的濕疹、過敏性皮炎、青春痘、風(fēng)疹、蕁麻疹藥物的配制、用藥及治療效果(一)藥物配制A、將培養(yǎng)基高壓滅菌后，接種基因重組人溶菌酶菌株、搖床轉(zhuǎn)數(shù)為每分鐘250轉(zhuǎn)，培養(yǎng)溫度為20℃，在恒溫床上培養(yǎng)36小時(shí)。進(jìn)行種子罐培養(yǎng)，最后進(jìn)行生產(chǎn)罐培養(yǎng)。并將發(fā)酵表達(dá)完成的培養(yǎng)液進(jìn)行提取純化，對(duì)提取純化的蛋白濃縮進(jìn)行凍干，測得蛋白活性后保存。取基因重組人溶菌酶凍干粉1％，磷酸鹽緩沖液5mM(PH＝5.0)90％制成注射劑，主要用于對(duì)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌引起的抗耐藥性的病癥。如氣管炎、肺炎等疾病。
B、將培養(yǎng)基高壓滅菌后，接種基因重組人溶菌酶菌株，在恒溫床上培養(yǎng)40小時(shí)后，再將培養(yǎng)液進(jìn)行純化制成含人溶菌酶凍干粉0.1％、磷酸鹽緩沖液20mM(PH＝7.0)80％、25％丙三醇、5/萬吐溫80的噴霧劑。
C、將培養(yǎng)基高壓滅菌后，接種基因重組人溶菌酶菌株、在恒溫?fù)u床上培養(yǎng)36小時(shí)后，再將培養(yǎng)液進(jìn)行純化制成含人溶菌酶凍干粉0.005％、磷酸鹽緩沖液10mM(PH＝6.0)80％、20％丙三醇、6％2-吡咯烷酮-5-羧酸鈉、0.9％水溶性氮酮、3/萬吐溫80的滴劑。
D、將培養(yǎng)基高壓滅菌后，接種基因重組人溶菌酶菌株、在恒溫?fù)u床上培養(yǎng)48小時(shí)后，再將培養(yǎng)液進(jìn)行純化制成含人溶菌酶凍干粉0.1％、磷酸鹽緩沖液20mM(PH＝7.0)85％、20％丙三醇、卡波樹脂1％、香精0.3％膏劑。
E、將培養(yǎng)基高壓滅菌后，接種基因重組人溶菌酶菌株、在恒溫?fù)u床上培養(yǎng)40小時(shí)后，再將培養(yǎng)液進(jìn)行純化制成膠囊劑、片劑。其含人溶菌酶凍干粉10％、藥用淀粉50％、藥用糊精25％、磷酸鹽緩沖液10mM(PH＝6.0)、蔗糖5％。
(二)對(duì)小鼠的模型試驗(yàn)A、耐藥金黃色葡萄球菌上呼吸道感染所致小鼠氣管炎、支氣管炎模型的制備選用健康昆明種小鼠20只，雌雄各半，體重為18-22克，分兩組，每組10只，選取一定量的耐藥金黃色葡萄球菌用噴霧方式感染小鼠上呼吸道致小鼠氣管炎10只、支氣管炎10只，感染后即刻靜脈注射受試藥30000u/ml/20g鼠重，觀察一周，每日三次給藥，記錄小鼠有效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明基因重組人溶菌酶對(duì)耐藥金葡球菌上呼吸道感染所致小鼠氣管炎、支氣管炎有明顯療效。結(jié)果如下表

B、耐藥鏈球菌感染所致小鼠陰道炎模型的制備選用健康昆明種小鼠10只，雌雄各半，體重為18-22克，挑取一定量的耐藥鏈球菌用涂抹方式感染小鼠陰道致小鼠陰道炎10只，感染后即靜脈注射受試藥30000u/ml/20g鼠重，觀察一周，每日三次給藥，記錄小鼠有效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明基因重組人溶菌酶對(duì)耐藥鏈球菌感染所致小鼠陰道炎有明顯療效。結(jié)果如下表

C、厭氧性球菌上呼吸道感染所致小鼠口腔炎模型的制備選用健康昆明種小鼠10只，雌雄各半，體重為18-22克，挑取一定量的厭氧性球菌用噴霧方式感染小鼠上呼吸道致小鼠口腔炎10只，感染后即口腔噴霧受試藥1500u/ml/20g鼠重，觀察一周，每日六次給藥，記錄小鼠有效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明基因重組人溶菌酶對(duì)厭氧性球菌上呼吸道感染所致小鼠口腔炎有明顯療效。結(jié)果如下表

D、對(duì)由革蘭氏陽性菌和部分陰性菌引起的濕疹、過敏性皮炎、青春痘、風(fēng)疹、牛皮癬、蕁麻疹等皮膚性感染的療效如下表


二、基因重組人溶菌酶作為制備治療體內(nèi)細(xì)菌感染引起呼吸道炎癥(氣管炎、支氣管炎、肺炎、咽炎等)藥物的應(yīng)用。
采用小鼠腹腔感染敗血癥或咽喉感染細(xì)菌模型來觀察HLZ對(duì)小鼠體內(nèi)炎癥的治療作用。
試驗(yàn)菌株金黃色葡萄球菌01193、金黃色葡萄球菌MSSA022、金黃色葡萄球菌MRSA028、表葡萄球菌MRSE0210、肺炎鏈球菌01182、腸球菌ATCC700802用于小鼠敗血癥感染試驗(yàn)。方法是挑取一定量的菌苔接種于2mlM-H液體培養(yǎng)基中，在35℃培養(yǎng)6小時(shí)候后，取出用滅菌生理鹽水進(jìn)行適應(yīng)稀釋(10-1、10-2、10-3、10-4)，每組5只鼠，分別腹腔感染不同菌量的受試菌液，測定引起小鼠100％死亡的最小致死菌量(MLD)，用該菌量作為體內(nèi)感染菌量。
基因重組人溶菌酶藥劑靜脈注射對(duì)細(xì)菌感染小鼠敗血癥的治療試驗(yàn)，把受試小鼠按體重性別均勻分組，每組10只鼠，然后取出經(jīng)35℃培養(yǎng)6小時(shí)的上述6種菌種的菌液，用無菌生理鹽水稀釋至1MLD，分別注入小鼠腹腔體內(nèi)，每鼠0.5ml，制備小鼠敗血癥模型，再將各受試藥物以1∶0.5劑間距設(shè)5-6個(gè)劑量組，分別于感染后即刻靜脈注射不同濃度的受試藥液，0.5ml/20g鼠重，同時(shí)設(shè)感染對(duì)照組(不給藥)，觀察并記錄小鼠死亡數(shù)，連續(xù)觀察7-14天，按Bliss法計(jì)算半數(shù)有效劑量ED50及95％可信限。
殺菌試驗(yàn)結(jié)果表明靜脈注射給藥對(duì)細(xì)菌感染具有一定的體內(nèi)療效，其半數(shù)有效劑量ED50分別是金黃色葡萄球菌01193為41.47mg/kg，金黃色葡萄球菌MSSA022為38.35mg/kg，金黃色葡萄球菌MRSA028為153.40mg/kg，表皮葡萄球菌MRSE0210為18.57mg/kg，肺炎鏈球菌01182為14.08mg/kg，腸球菌ATCC700802為150.2mg/kg。基因重組人溶菌酶靜脈給藥的表皮葡萄球菌MRSE0210、肺炎鏈球菌01182感染小鼠的體內(nèi)療效分別顯著地強(qiáng)于克拉霉素4倍和9倍以上。試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)見附表1、2。
三、基因重組人溶菌酶與克拉霉素聯(lián)用，分別可增強(qiáng)克拉霉素單用對(duì)所試的金葡球菌MRSA028、化膿性鏈球01181D的體內(nèi)療效19.6、18.7倍。
試驗(yàn)菌株化膿性鏈球菌01-18-1，金黃色葡萄球菌MRSA BAA-42用于經(jīng)霧化吸入對(duì)小鼠細(xì)菌呼吸道感染炎癥的治療作用。方法是將小鼠放入超聲霧化器，內(nèi)裝30ml上述試驗(yàn)菌液，濃度為108CFU/ml，給小鼠霧化吸入20分鐘，間隔10分鐘，再霧化吸入20分鐘，連續(xù)霧化吸入3次，最后霧化吸入后6小時(shí)，分別用無菌棉簽挑取咽部黏膜涂于無藥粘脂平板表面，35℃培養(yǎng)18-20小時(shí)，觀察有無細(xì)菌生長，進(jìn)行細(xì)菌鑒定和活菌計(jì)數(shù)。細(xì)菌培養(yǎng)呈陽性，且活菌數(shù)≥103CFU/ml，表明感染模型成功，該感染模型可用于治療試驗(yàn)。
基因重組人溶菌酶霧化吸入對(duì)小鼠細(xì)菌性呼吸道感染炎癥的治療試驗(yàn)取呼吸道感染細(xì)菌成功的小鼠，每組10只鼠，裝入盛有不同濃度的受試藥液的玻璃缸內(nèi)進(jìn)行霧化吸入治療，每次霧化吸入20分鐘，間隔10分鐘，再霧化吸入20分鐘，共霧化吸入三次，于霧化吸入藥液后第一天、第二天、第三天、第四天、第五天分別用滅菌棉簽挑取咽喉部黏膜涂于無藥瓊脂平皿表板。在35℃培養(yǎng)18-20小時(shí)，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。試驗(yàn)設(shè)細(xì)菌性呼吸道感染對(duì)照組(不給藥)。將給藥組小鼠咽部活菌數(shù)與感染對(duì)照組小鼠咽部活菌數(shù)進(jìn)行Student校驗(yàn)，以評(píng)價(jià)受試藥物經(jīng)霧化吸入對(duì)小鼠細(xì)菌性呼吸道感染炎癥的治療作用。試驗(yàn)結(jié)果表明濃度為0.4、0.2、0.1、0.05、0.025mg/ml的基因重組人溶菌酶經(jīng)霧化吸入，對(duì)小鼠呼吸道感染化膿性鏈球菌01-18-1和金黃色葡萄球菌MRSA BAA-42具有明顯療效，在給藥第二天、第三天、第四天和第五天均明顯地使咽部感染細(xì)菌數(shù)降低，與感染對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.05)且療效優(yōu)于克拉霉素、羅紅霉素給藥組(P＜0.05)。試驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)見附表3。
基因重組人溶菌酶與克拉霉素(1∶1)聯(lián)合用藥經(jīng)霧化吸入對(duì)小鼠細(xì)菌性呼吸道感染金葡球菌BAA-42、化膿性鏈球菌01181的療效與克拉霉素單用比較有顯著性差異(P＜0.05)?；蛑亟M人溶菌酶與克拉霉素聯(lián)用的最佳濃度為(1.5+0.1)mg/ml，在該濃度下，其療效顯著地強(qiáng)于其它各給藥濃度組。
四、基因重組人溶菌酶對(duì)細(xì)菌1040株體外抗菌活性及其與克拉霉素、羅紅霉素聯(lián)用的增效作用。
本試驗(yàn)中采用的臨床分離菌種有金黃色葡萄球菌MRSA 211株、金葡球菌MSSA 92株、表皮葡球菌MRSE 123株、表皮葡球菌MSSA 69株、肺炎鏈球菌40株、大腸埃希菌123株、肺炎克雷伯菌92株、腸球菌屬55株、不動(dòng)桿菌55株、枸櫞酸桿菌57株、銅綠假單孢菌29株、沙雷氏菌44株、陰溝腸桿菌12株等總共1040株菌。
對(duì)照抗菌素為克拉霉素、羅紅霉素、阿莫西林、萬古霉素、德可霉素。
試驗(yàn)方法將受試藥物用滅菌蒸鎦水溶解，適當(dāng)稀釋。分別取1ml藥液加9ml融化的Tris-HCl瓊脂糖固體培養(yǎng)基混勻，倍比稀釋，制備系列含藥平皿。每皿所含藥物終濃度分別為4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03-0.001mg/ml；用多點(diǎn)接種儀將稀釋至105CFU/ml的試驗(yàn)菌液接種于各含藥平皿表面，置35℃培養(yǎng)8-10小時(shí)，取出，再分別吸取6ml融化的M-H培養(yǎng)基(50℃)覆蓋上述系列平皿表面，再置于35℃培養(yǎng)10小時(shí)取出，觀察結(jié)果，以無細(xì)菌生長平皿內(nèi)所含最低藥物濃度為該菌的最低抑菌濃度(MIC)。分別以累積抑制50％、90％所試菌株的MIC值計(jì)為MIC50、MIC90。所試菌株的MIC值最小值至其最大值計(jì)為MICRange(范圍)。試驗(yàn)的對(duì)照溶菌酶為雞溶菌酶。
試驗(yàn)結(jié)果表明基因重組人溶菌酶對(duì)所試革蘭氏陽性、陰性菌均具有抗菌作用。對(duì)克拉霉素、羅紅霉素耐藥的金葡球菌MRSA、表皮葡球菌MRSE、呈現(xiàn)有抗菌作用，對(duì)表葡球菌的作用強(qiáng)于對(duì)金葡球菌的抗菌作用。對(duì)革蘭氏陰性菌中的大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、枸櫞酸桿菌、沙雷菌均具有一定抗菌作用。本發(fā)明對(duì)上述58株菌的試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)見附表4。
基因重重組人溶菌酶對(duì)金葡球菌MRSA、MSSA菌株的MIC50、均為4000μg/ml，MICRange在0.5->4000μg/ml；對(duì)表葡球菌MRSE、MSSE的MIC50、分別為6.25μg/ml和2000μg/ml(表5)。對(duì)肺炎鏈球菌、鏈球菌屬和腸球菌的抗菌作用較弱，多數(shù)菌株的MIC值在≥4000μg/ml。
基因重組人溶菌酶對(duì)革蘭氏陰性菌中的大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、不動(dòng)桿菌、銅綠假單孢菌及沙雷菌、枸櫞酸桿菌、陰溝腸桿菌等雖有抗菌作用，但其抗菌作用弱，多數(shù)菌株的MIC值≥4000μg/ml。
基因重組人溶菌酶與克拉霉素、羅紅霉素以1∶1聯(lián)用對(duì)體外給藥(見附表5)，具有明顯增效作用，可以使克拉霉素、羅紅霉素的抗菌活性增效2-16倍以上，個(gè)別菌株可增效1000倍以上。克拉霉素、羅紅霉素對(duì)耐藥金葡球菌和表葡球菌的敏感率，分別由單用的25.3、24.4％和25.9、25.6％提高至39.8、55.1％和30.7、38.5％；使克拉霉素、羅紅霉素對(duì)肺炎鏈球菌的敏感率分別由單用的11.5％、15.4％提高至23.1％和23.1％(見附表6)。聯(lián)用與單用具有顯著性差異(P＜0.05)，尤其以人溶菌酶與克拉霉素聯(lián)合應(yīng)用的增效作用顯著?；蛑亟M人溶菌酶與萬古霉素、德可霉素聯(lián)用可降低萬古霉素、德可霉素對(duì)金葡球菌MRSA、表葡球菌MRSE的MIC50、MIC90值2-4倍以上。
以上所有應(yīng)用結(jié)果表明利用本公司生物基因工程技術(shù)開發(fā)出的高純度、高活性的基因重組人溶菌酶，不僅具有切斷肽聚糖中N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸之間的β-1，4-糖苷鍵，破壞菌體肽聚糖支架，直接裂解細(xì)菌、保護(hù)炎癥部位的正常組織、提高單核細(xì)胞吞噬結(jié)核桿菌的能力、抑制細(xì)菌內(nèi)毒素的釋放作用；而且基因重組人溶菌酶能分解粘厚的粘蛋白，消除黏膜炎癥，分解黏膜液，促使粘多糖代謝及清潔上呼吸道作用。
應(yīng)用試驗(yàn)還表明基因重組人溶菌酶不僅可以作為制備治療細(xì)菌、真菌、病毒在皮膚黏膜表面感染引起各種炎癥的藥物；將基因重組人溶菌酶與抗生素聯(lián)合用藥，還可以大大增強(qiáng)體內(nèi)外細(xì)菌感染引起各種炎癥成倍的治療效果。這就為生物工程制藥提供了新的研制方向，也為臨床治愈細(xì)菌感染引起炎癥提供新的制劑和福音。


圖1是用基因重組人溶菌酶試管法鑒定對(duì)細(xì)菌的活性試驗(yàn)；
圖2是用基因重組人溶菌酶平板法鑒定對(duì)細(xì)菌的活性試驗(yàn)；圖3a是用基因重組人溶菌酶對(duì)真菌處理后抑菌效果圖；圖3b是用基因重組人溶菌酶對(duì)真菌處理前對(duì)照?qǐng)D；圖4-A是正常HELA細(xì)胞照片；圖4-B是04號(hào)冠狀病毒感染HELA細(xì)胞照片；圖4-C是用基因重組人溶菌酶對(duì)冠狀病毒處理最小有效濃度照片。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1本實(shí)施例為用基因重組人溶菌酶試管法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行溶菌活性鑒定方法。
用PH7.2的10mMTris-HCl緩沖液將金黃色葡萄球菌(或大腸桿菌)配成107-108CFU/ml左右濃度的菌液，以每管2ml分別加入到不同華試管中，然后，在不同華試管中分別加入100μg-1mg不同劑量的基因重組人溶菌酶，37℃過夜，每管取20μl以10倍稀釋法稀釋，再取100μl涂于LB培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)過夜，觀察結(jié)果，計(jì)算原始管中細(xì)菌總數(shù)。
基因重組人溶菌酶的溶菌效果＝(對(duì)照管中的細(xì)菌總數(shù)-實(shí)驗(yàn)管中的細(xì)菌總數(shù))/對(duì)照管中細(xì)菌總數(shù)×100％。
實(shí)施例2本實(shí)施例為用基因重組人溶菌酶平板法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行殺菌活性鑒定方法。(材料同實(shí)施例1)用PH7.2的10mMTris-HCl緩沖液配制1％瓊脂糖高壓滅菌后，冷卻至40℃，加入細(xì)菌至106傾倒平板，用打孔器在平板上打孔，在孔中加入0-100mg/ml不同濃度的基因重組人溶菌酶溶液，37℃孵箱中孵育4-6小時(shí)，然后將LB營養(yǎng)瓊脂高壓滅菌后，冷卻至40℃，覆蓋于上述瓊脂糖平板上，將該平板置于紫外燈下照射20分鐘，在37℃孵育箱培養(yǎng)過夜，觀察瓊脂糖與營養(yǎng)瓊脂層之間細(xì)菌生長情況，測量不同濃度溶菌酶形成的抑菌圈的直徑。抑菌圈的直徑加樣孔直徑4mm者為最低有效殺菌濃度。
實(shí)施例3本實(shí)施例為用基因重組人溶菌酶對(duì)真菌的抑菌實(shí)驗(yàn)方法。
菌株由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院校驗(yàn)科提供的8株白色念珠菌、熱帶念珠菌、克柔氏念珠菌。
緩沖液PH＝7.2的10mMTris-HCl緩沖液10％SDS
LB培養(yǎng)基實(shí)施方法，與基因重組人溶菌酶作用耐藥菌的實(shí)施例1抑菌實(shí)驗(yàn)相同。
實(shí)施例4本實(shí)施例是用基因重組人溶菌酶經(jīng)霧化吸入對(duì)小鼠細(xì)菌性呼吸道感染治療作用。
模型制備試驗(yàn)前將小鼠放入密封玻璃缸內(nèi)，玻璃缸連接至超聲霧化器(型號(hào)402，上海合力醫(yī)療器械廠生產(chǎn))，內(nèi)裝30ml試驗(yàn)菌液，菌液濃度為108CFU/ml，開動(dòng)超聲霧化器，給小鼠霧化吸入20分鐘，間隔10分鐘，再霧化需吸入20分鐘，連續(xù)霧吸入3次。末次霧化吸入后6小時(shí)，分別用無菌棉簽挑取咽部黏膜涂于無藥粘脂平板表在，35℃培養(yǎng)18-20小時(shí)，觀察有無細(xì)菌生長，進(jìn)行細(xì)菌鑒定和活菌計(jì)數(shù)。細(xì)菌培養(yǎng)陽性，且活菌數(shù)≥103CFU/ml，表明感染模型成功。提示該感染模型可用于治療試驗(yàn)。
基因重組人溶菌酶(HLZ)霧化吸入對(duì)小鼠細(xì)菌性呼吸道治療試驗(yàn)。
取呼吸道感染細(xì)菌成功的小鼠，隨機(jī)分組，每組10只鼠，裝入盛有濃度的受試藥液(連接了超聲霧化器)的玻璃缸內(nèi)進(jìn)行霧化吸入治療，每次霧化吸入20分鐘，間隔10分鐘，再霧化吸入20分鐘，共霧化吸入3次，于霧化吸入藥液后第一天、第二天、第三天、第四天、第五天分別用滅菌棉簽挑取咽喉部黏膜涂于無藥瓊脂平皿表板。35℃培養(yǎng)18-20小時(shí)，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)設(shè)細(xì)菌性呼吸道感染對(duì)照組(不給藥)。將給藥組小鼠咽部活菌數(shù)與感染對(duì)照組小鼠咽部活菌數(shù)進(jìn)行Student檢驗(yàn)，以評(píng)價(jià)受試藥物經(jīng)霧化吸入對(duì)小鼠細(xì)菌性呼吸道感染的治療作用。
實(shí)施例5本實(shí)例施為用基因重組人溶菌酶對(duì)冠狀病毒04號(hào)抑菌毒力實(shí)驗(yàn)。
試驗(yàn)材料1.驗(yàn)證藥物基因重組人溶菌酶 蛋白含量4.3845mg2.陽性對(duì)照藥物注射用更昔洛韋 批號(hào)020802 由湖北科益藥業(yè)股份有限公司提供。
3.細(xì)胞人宮頸癌傳代細(xì)胞(HELA)由中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所病毒資源中心提供。
4.病毒冠狀病毒04號(hào)分離株(SARS病人血清04號(hào)標(biāo)本)由佑安醫(yī)院提供。
5.CO2培養(yǎng)箱NUAIR US AUTO FLOW提供6.(XSZ-D2)由重慶光學(xué)儀器廠生產(chǎn)7.其它試劑、器材等均由中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所病毒資源中心提供。
試驗(yàn)方法預(yù)備試驗(yàn)1.基因重組人溶菌酶對(duì)HELA細(xì)胞的毒性測定HELA細(xì)胞以40萬/ml濃度接種96孔培養(yǎng)板，37℃、5％CO2培養(yǎng)2小時(shí)，加入驗(yàn)證藥物，基因重組人溶菌酶倍比稀釋為6000ug/ml-11.7ug/ml，陽性對(duì)照藥物更昔洛韋稀釋為6000ug/ml-11.7ug/ml，每濃度接種3孔，每孔100μl，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照，37℃5％CO2孵箱培養(yǎng)6天，每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化(CPE)，以25％以下形態(tài)變化為“+”，26％-50％形態(tài)變化為“++”，51％-75％形態(tài)變化為“+++”，76％-100％形態(tài)變化為“++++”，用Reed-Muench法，計(jì)算藥物半數(shù)中毒濃度(TD50)和最大無毒濃度(TD0)。
2.在HELA細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對(duì)冠狀病毒04號(hào)的毒力的測定冠狀病毒04號(hào)的分離(SARS病人血清分離)HELA細(xì)胞以每毫升40萬濃度接種試管，37℃5％CO2培養(yǎng)24小時(shí)，棄掉培養(yǎng)液，每管加入SARS病人血清0.2ml，33℃轉(zhuǎn)鼓培養(yǎng)5小時(shí)后，加入維持液1ml，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照，33℃轉(zhuǎn)鼓培養(yǎng)5-7天。細(xì)胞出現(xiàn)CPE變化后，采用PCR的方法檢測冠狀病毒，04號(hào)標(biāo)本PCR陽性，確定為冠狀病毒分離株。用終末稀釋法純化病毒2次，PCR檢測冠狀病毒仍為陽性，經(jīng)免疫熒光測定雙份SARS病人血清，IgM陽性，IgG4倍升高，確定為冠狀病毒。采用病毒CPE法測定其效價(jià)。
病毒CPE法HELA細(xì)胞以每毫升40萬濃度接種96孔培養(yǎng)板，37℃5％CO2培養(yǎng)24小時(shí)，加入病毒液，病毒稀釋10-1-10-5，5個(gè)濃度，每濃度3孔，每孔100μl，設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照，37℃5％CO2培養(yǎng)5-7天，每24小時(shí)在倒置顯微鏡下觀察記錄細(xì)胞形態(tài)變化(CPE)以25％以下變化為“+”，26％-50％變化為“++”，51％-75％為“+++，76％-100％變化為“++++”，用Reed-Muench法，計(jì)算病毒半數(shù)感染濃度TCID50。
正式試驗(yàn)基因重組人溶菌酶在HELA細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對(duì)冠狀病毒04號(hào)的抑制作用試驗(yàn)?zāi)康挠^察不同濃度的基因重組人溶菌酶在HELA細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對(duì)冠狀病毒04號(hào)的抑制作用，試驗(yàn)采用病毒細(xì)胞病變(CPE)法，計(jì)算藥物的半數(shù)有效濃度(IC50)和最小有效濃度(MIC)及治療指數(shù)TI，判斷藥效。
HELA細(xì)胞以40萬/ml濃度接種96孔培養(yǎng)板，37℃5％CO2孵箱培養(yǎng)24小時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)至單層，棄掉培養(yǎng)液，加入100 TCID50的冠狀病毒液，置37℃5％CO2吸附2小時(shí)后，棄掉病毒液，加入不同濃度的基因重組人溶菌酶藥液，藥物選用對(duì)細(xì)胞的最大無毒濃度(TD0)2倍稀釋10個(gè)濃度即750μg/ml-1.46μg/ml，陽性對(duì)照藥物更昔洛韋為2倍稀釋10個(gè)濃度即6000μg/ml-1.46μg/ml，將稀釋的藥物分別加入細(xì)胞孔內(nèi)，每濃度3孔，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照和病毒對(duì)照，置37℃5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5-7天，逐日在倒置顯微鏡下觀察病毒CPE，以病毒對(duì)照出現(xiàn)+++-++++時(shí)結(jié)束試驗(yàn)，用Reed-Muench法，計(jì)算藥物的半數(shù)有效濃度(IC50)和最小有效濃度(MIC)及治療指數(shù)(TI)判斷藥效，試驗(yàn)重復(fù)三次。
試驗(yàn)結(jié)果預(yù)備試驗(yàn)結(jié)果基因重組人溶菌酶對(duì)HELA細(xì)胞的毒性作用基因重組人溶菌酶和陽性對(duì)照藥物注射用更昔洛韋在HELA細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)，采用細(xì)胞形態(tài)變化(CPE)法。計(jì)算藥物最大無毒濃度(TD0)和半數(shù)中毒濃度(TD50)，以下試驗(yàn)結(jié)果為三次試驗(yàn)結(jié)果的平均值。
1.基因重組人溶菌酶對(duì)HELA細(xì)胞的毒性試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證藥物基因重組人溶菌酶最大無毒濃度(TD0)為750±0μg/ml，半數(shù)中毒濃度(TD50)為1500±0μg/ml陽性對(duì)照藥物注射用更昔洛韋最大無毒濃度(TD0)為＞6000±0μg/ml，半數(shù)中毒濃度(TD50)為＞6000±0μg/ml。
2.在HELA細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對(duì)冠狀病毒04號(hào)毒力測定結(jié)果(TCID50)冠狀病毒04號(hào)半數(shù)感染量(TCID50)為10-3(見附圖4)正式試驗(yàn)結(jié)果(見附圖4)基因重組人溶菌酶在HELA細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對(duì)冠狀病毒04號(hào)的抑制作用(以下試驗(yàn)數(shù)據(jù)為三次試驗(yàn)結(jié)果的平均值)驗(yàn)證藥物基因重組人溶菌酶CPE法，藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為23.4±0μg/ml，最小有效濃度(MIC)為46.8±0μg/ml，治療指數(shù)(TI)為16。
陽性對(duì)照藥物注射用更昔洛韋CPE法，藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為11.7±0μg/ml，最小有效濃度(MIC)為23.44±0μg/ml，治療指數(shù)(TI)為256。
基因重組人溶菌酶在HELA細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對(duì)冠狀病毒04號(hào)的預(yù)防作用(以下試驗(yàn)數(shù)據(jù)為三次試驗(yàn)結(jié)果的平均值)驗(yàn)證藥物基因重組人溶菌酶CPE法，藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為5.9±0μg/ml，最小有效濃度(MIC)為11.7±0μg/ml，治療指數(shù)(TI)為64。
陽性對(duì)照藥物注射用更昔洛韋CPE法，藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為11.7±0μg/ml，最小有效濃度(MIC)為23.44±0μg/ml，治療指數(shù)(TI)為256。
實(shí)施例6本實(shí)施例是基因重組人溶菌酶凍干粉的制備方法。
將培養(yǎng)基高壓滅菌后，接種基因重組人溶菌酶菌株，搖床轉(zhuǎn)數(shù)為每分鐘250轉(zhuǎn)，培養(yǎng)溫度為20，在恒溫?fù)u床上培養(yǎng)36-40小時(shí)，進(jìn)行種子罐培養(yǎng)，最后進(jìn)行生產(chǎn)罐培養(yǎng)，并將發(fā)酵表達(dá)完成的培養(yǎng)液進(jìn)行提取純化，對(duì)提取純化的蛋白濃縮液進(jìn)行凍干，測得蛋白活性后保存。
實(shí)施例7本實(shí)施例是用基因重組人溶菌酶對(duì)細(xì)菌感染體內(nèi)注射藥劑的治療試驗(yàn)。
把受試小鼠按體重、性別均勻分組，每組10只鼠，然后取出經(jīng)35□培養(yǎng)6小時(shí)的上述6種菌種的菌液，用無菌生理鹽水稀釋至1MLD，分別注入小鼠腹腔體內(nèi)，每鼠0.5ml，制備小鼠敗血癥模型，再將各受試藥物以1∶0.5劑間距設(shè)5-6個(gè)劑量組，分別于感染后即刻靜脈注射不同濃度的受試藥液，0.5ml/20g鼠重，同時(shí)設(shè)感染對(duì)照組(不給藥)，觀察并記錄小鼠死亡數(shù)，連續(xù)觀察7-14天，按Bliss法計(jì)算半數(shù)有效劑量ED50及95％可信限。(見表1、2)實(shí)施例8本實(shí)施例是用基因重組人溶菌酶與抗生素1∶1組合物體內(nèi)聯(lián)合用藥治療炎癥效果。
將小鼠放入超聲霧化器中，內(nèi)裝30ml金葡球菌MRSA028或化膿鏈球菌01181試驗(yàn)菌液，濃度為108CFU/ml，給小鼠霧化吸入20分鐘，間隔10分鐘，再霧化吸入20分鐘，連續(xù)霧化吸入3次，最后霧化吸入6小時(shí)，分別用無菌棉簽挑取咽部黏膜涂于無藥粘脂平板表面，35℃培養(yǎng)18-20小時(shí)，觀察有無細(xì)菌生長，進(jìn)行細(xì)菌鑒定和活菌計(jì)數(shù)。呈陽性，活菌數(shù)≥103CFU/ml，表明感染成功。
取呼吸道感染細(xì)菌成功小鼠，每組10只，裝入有不同濃度的基因重組人溶菌酶與克拉霉素1∶1的霧化吸入藥液后第1、2、3、4、5天，分別用滅菌棉簽挑取咽喉部黏膜涂于無藥瓊脂平皿表板。在35℃培養(yǎng)18-20小時(shí)，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。試驗(yàn)設(shè)細(xì)菌性呼吸道感染對(duì)照組(不給藥)。將給藥組小鼠咽部活菌數(shù)與感染對(duì)照組小鼠咽部活菌數(shù)進(jìn)行Student檢驗(yàn)，評(píng)價(jià)治療作用。
結(jié)果表明基因重組人溶菌酶與克拉霉素1∶1聯(lián)用的最佳濃度為(1.5+0.1)mg/ml治療上述細(xì)菌感染炎癥比單用克拉霉素有顯著性差異(P＜0.05)。對(duì)體內(nèi)呼吸道被金葡球菌、化膿鏈球菌感染炎癥的療效比單用克拉霉素分別增強(qiáng)19.6倍和18.7倍。
實(shí)施例9本實(shí)施例是用基因重組人溶菌酶對(duì)細(xì)菌體外抗菌活性及其與抗生素聯(lián)用的增效作用。
將基因重組人溶菌酶用滅菌蒸鎦水溶解，適當(dāng)稀釋，分別取1ml分別藥液加9ml融化的Tris-HCl瓊脂糖固體培養(yǎng)基混勻，倍比稀釋，制備系列含藥平皿。每皿所含基因重組人溶菌酶終濃度分別為4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03-0.001mg/ml；用多點(diǎn)接種儀將稀釋至105CFU/ml的試驗(yàn)菌(金葡球菌、表葡球菌、肺炎鏈球菌、腸球菌等)接種于各含藥平皿表面，置35℃培養(yǎng)8-10小時(shí)，取出，再分別吸取6ml融化的M-H培養(yǎng)基(50℃)覆蓋上述系列平皿表面，再置于35℃培養(yǎng)10小時(shí)取出，觀察結(jié)果。以無菌生長平皿內(nèi)所含最低藥物濃度為該菌的最低抑菌濃度MIC?？煞謩e以累積抑制50％、90％所試菌株的MIC值計(jì)為MIC50、MIC90。
基因重組人溶菌酶單用對(duì)革蘭氏陽性、陰性菌均具有抗菌作用；對(duì)克拉霉素、羅紅霉素耐藥的金葡球菌、表皮葡球菌呈現(xiàn)抗菌作用；對(duì)表葡球菌的作用強(qiáng)于對(duì)金葡球菌的抗菌作用。若將受試藥物換成基因重組人溶菌酶與抗生素聯(lián)用，試驗(yàn)結(jié)果如下基因重重組人溶菌酶與克拉霉素、羅紅霉素1∶1聯(lián)用，可使克拉霉素、羅紅霉素的抗菌活性增效2-16倍以上；克拉霉素、羅紅霉素對(duì)耐藥金葡球菌和表葡球菌的敏感率，分別由單用的25.3、24.4％和25.9、25.6％提高至39.8、55.1％和30.7、38.5％；使克拉霉素、羅紅霉素對(duì)肺炎鏈球菌的敏感率分別由單用的11.5、15.4％提高至23.1、23.1％；以基因重重組人溶菌酶與克拉霉素聯(lián)用增效更顯著；與萬古霉素、德可霉素聯(lián)用可降低萬古霉素、德可霉素對(duì)金葡球菌、表葡球菌的MIC50、MIC90值2-4倍以上。
表1 基因重組人溶菌醇對(duì)金葡球菌MRSA028感染所致小鼠敗血癥的體內(nèi)療效試驗(yàn)結(jié)果感染細(xì)菌(菌號(hào))感染濃度 動(dòng)物數(shù) 死亡數(shù) 死亡率ED50(mg/kg)受試藥物 給藥途徑 劑量(mg/kg)菌量(CFU/ML) (mg/ml) (只) (只)(％) (95％可信限)金葡球菌MRSA028人溶菌酶i.v400(120萬單位) 1610 10 1001.9×105(HLZ) 200(60萬單位)8 10 10 100100(30萬單位)4 10 10 10050(15萬單位) 2 10 10 100克拉霉素i.v200 8 10 3 30(CLA) 100 4 10 6 60 122.825 1 10 10 100 (82.5-246.7)克拉霉素/溶 i.v12.5 0.5/0.5 10 3 30菌酶 6.25 0.25/0.25 10 4 40 6.293.13 0.125/0.125 10 8 80 (2.21-18.03)感染對(duì)照組(1MLD)ip*-- 10 10 100感染對(duì)照組(1/10MLD) ip -- 10 8 80*ip腹腔感染細(xì)菌。
表2 基因重組人溶菌酶對(duì)肺炎鏈球菌01181感染所致小鼠敗血癥的體內(nèi)療效試驗(yàn)結(jié)果感染細(xì)菌(菌號(hào)) 濃度動(dòng)物數(shù)死亡數(shù) ED50(mg/kg)受試藥物給藥途徑劑量(mg/kg) 死亡率(％)感染菌量(mg/ml) (只) (只) (95％可信限)(CFU/ML)251.00 10 8 8012.5 0.50 10 7 70肺炎鏈球菌01181 HLZ i.v 6.25 0.25 10 6 60 2.093.12 0.13 10 5 50 0.00-1000.001.56 0.06 10 3 30200 8.0 10 3 30i.v 100 4.0 10 5 50 98.2克拉霉素 502.0 10 7 70 60.1-233.1251.0 10 8 8012.5 0.5 10 1010025/25 1.00/1.00 10 10100i.v12.5/12.5 0.50/0.50 10 7 702.521克拉+溶菌酶 6.25/6.25 0.25/0.25 10 4 40 0-1000.03.12/3.12 0.13/0.13 10 2 201.56/1.56 0.06/0.06 10 8 80感染對(duì)照組 - 10 10100
表3 基因重組人溶菌酶霧化吸入對(duì)小鼠呼吸道感染金葡球菌的療效試驗(yàn)結(jié)果給藥量(ul) 給藥后菌落計(jì)數(shù)(CFU)細(xì)菌給藥感染菌量 藥物 濃度 ×(cfu/ml) (mg/ml)給藥次數(shù) 第1天 第2天 第3天第4天 第5天(次/日)金葡球菌 0.2100×4253.80±22.88222.10±18.46165.80±16.08116.20±13.97 76.70±11.60MRSA 0.1100×4254.20±25.42221.30±18.12172.70±17.62116.70±15.59 78.30±17.86BAA-42 人溶菌酶0.05 100×4253.90±15.91218.80±18.70174.50±26.28119.80±17.64 80.80±14.280.025 100×4256.40±14.31227.20±17.02176.90±11.14121.50±12.41 84.20±20.900.0125 100×4258.50±46.60230.50±12.99182.80±20.67121.90±14.69 86.50±15.716.0100×4241.90±16.62211.50±16.85134.60±13.5882.00±12.0957.60±15.373.0100×4246.30±19.03217.50±24.42141.00±18.5483.20±13.4560.70±13.98克拉霉素1.5100×4247.10±21.31218.30±23.98146.30±13.5583.00±13.0264.40±15.690.75 100×4248.50±26.32219.50±30.00156.10±20.8792.00±11.0868.00±14.020.375 100×4250.80±19.69221.00±16.21165.00±16.6393.60±13.1269.20±13.806+0.4 100×4232.10±34.94204.10±18.16126.20±17.7478.80±12.0550.40±16.93克拉霉素3+0.2 100×4232.60±24.76206.80±21.70134.00±20.9679.70±13.0052.60±19.20+人溶菌 1.5+0.1100×4224.00±18.65195.10±10.69118.00±15.1369.30±16.2346.50±19.29酶 0.75+0.05 100×4239.00±25.11206.60±15.76137.00±18.8788.20±14.3152.70±17.780.375+0.025100×4239.30±20.22209.40±34.95138.40±18.6590.40±12.2364.30±10.82菌對(duì)照 - - 275.60±21.60250.30±29.12194.30±17.63130.10±19.34 86.70±12.88
表4 基因重組人溶菌酶、雞溶菌酶、克拉霉素和羅紅霉素體外抗菌譜MIC細(xì)菌HLZCLZ CLA ROXμg/ml(萬μ/ml)μg/ml(萬μ/ml)μg/mlμg/ml金葡球菌MRSA02-22 250(0.8)8(0.04) 4000 4000金葡球菌MRSA02-23 250(0.8)8(0.04) 4000 4000金葡球菌MRSA02-26 250(0.8)4(0.02) 4000 4000金葡球菌MRSA02-28 500(1.5)15.6(0.08) 4000 4000金葡球菌02-19-531.3(0.1) 2(0.001)4000 4000表葡球菌MssE25 15.6(0.05) 4(0.02) 0.5 0.5表葡球菌MRSE02-29 62.5(0.2) 500(2.5)31.3 500表葡球菌MRSE02-5 0.5(0.0015) 0.5(0.0025) 0.5 0.5表葡球菌MRSE02-6 0.5(0.0015) 0.5(0.0025) 0.5 0.5表葡球菌MRSE02-20-20.5(0.0015) 0.5(0.0025) 4000 1000表葡球菌MRSE02-20-30.5(0.0015) 4(0.02) 4000 1000表葡球菌MRSE02-20-40.5(0.0015) 0.5(0.0025) 4000 4000表葡球菌MRSE02-20-54(0.012)0.5(0.0025) 4000 4000表葡球菌MRSE02-20-64(0.012)0.5(0.0025) 4000 4000表葡球菌MRSE02-20-70.5(0.0015) 0.5(0.0025) 1 1表葡球菌MRSE02-20-80.5(0.0015) 0.5(0.0025) 0.5 0.5表葡球菌MRSE02-20-90.5(0.0015) 0.5(0.0025) 0.5 0.5表葡球菌MRSE02-20-10.5(0.0015) 0.5(0.0025) 0.5 0.5表葡球菌MRSE02-3 1000(3) 15.6(0.08) 4000 4000表葡球菌MRSE02-4 4(0.012)8(0.04) 500 4000
續(xù)表4MIC細(xì)菌HLZ CLZCLA ROXμg/ml(萬μ/ml)μg/ml(萬μ/ml) μg/ml μg/ml表葡球菌MRSE02-10 4(0.012) 250(1.25)1000 1000表葡球菌MRSE02-12 0.5(0.0015)0.5(0.0025) 8 125表葡球菌MRSE02-11 0.5(0.0015)0.5(0.0025) 0.50.5表葡球菌MRSE02-15 8(0.024) 2(0.01) 1000 4000表葡球菌MRSE02-17 4(0.012) 0.5(0.0025) 2504000表葡球菌MRSE02-18 0.5(0.0015)0.5(0.0025) 0.50.5表葡球菌MRSE02-20 8(0.024) 0.5(0.0025) 4000 4000表葡球菌MRSE02-21 15.6(0.05) 250(1.25)0.50.5表葡球菌MRSE02-22 4(0.012) 0.5(0.0025) 0.50.5枸櫞酸桿菌02-7-48(0.02)4000(20) 2 2枸櫞酸桿菌02-7-58(0.02)250(0.63)0.50.5枸櫞酸桿菌02-7-68(0.02)62.5(0.31) 8 250枸櫞酸桿菌02-7-962.5(0.2) 125(0.63)8 15.6枸櫞酸桿菌02-7-7125(0.4) 15.6(0.08) 31.3 250大腸埃希菌01-2-22 31.3(0.1) 500(2.5) 1000 1000大腸埃希菌01-2-30 62.5(0.2) 4000(10) 4000 4000大腸埃希菌01-2-32 15.6(0.05) 250(1.25)8 500大腸埃希菌01-2-33 31.3(0.1) 2000(10) 4000 4000大腸埃希菌01-2-36 62.5(0.2) 4000(20) 250500大腸埃希菌01-2-37 31.3(0.1)＞4000(20) 4000 4000大腸埃希菌01-2-39 31.3(0.1) 500(2.5) 5001000
續(xù)表4MIC細(xì)菌HLZ CLZ CLA ROXμg/ml(萬μ/ml)μg/ml(萬μ/ml)μg/mlμg/ml大腸埃希菌01-2-41 31.3(0.1)500(2.5) 4000 4000大腸埃希菌01-2-42 15.6(0.05) 500(2.5) 62.5 4000大腸埃希菌01-2-43 0.5(0.0015) ＞4000(20) 15.6 250大腸埃希菌01-2-45 31.3(0.1)2000(10) 250 500大腸埃希菌01-2-51 31.3(0.1)＞4000(20) 4000 4000大腸埃希菌01-2-52 31.3(0.1)＞4000(20) 4000 250大腸埃希菌01-2-53 8(0.024) 4000(20) 31.3 250大腸埃希菌01-2-54 31.3(0.1)1000(5)4000 1000大腸埃希菌01-2-56 31.3(0.1)＞4000(20) 15.6 250大腸埃希菌01-2-57 0.5(0.0015) 200(10)31.3 250大腸埃希菌01-2-58 0.5(0.0015) 400(20)4000 500大腸埃希菌01-2-59 31.3(0.1)400(20)125 250沙雷氏菌2-31-8 8(0.02) 500(0.25) 8 15.6沙雷氏菌2-31-8 8(0.02) 1000(5)8 15.6沙雷氏菌2-31-8 8(0.02) 125(0.63) 15.6 15.6肺炎克雷伯菌02-6-1415.6(0.05) 1000(5)62.5 4000肺炎克雷伯菌02-6-184(0.012) ＞4000(20) 500 1000注HLZ指人溶菌酶，CLZ指對(duì)照溶菌酶(雞溶菌酶)，CLA指克拉霉素，ROX指羅紅霉素表5 基因重組人溶菌酶與克拉霉素、羅紅霉素單用及其(1∶1)聯(lián)合應(yīng)用體外作用比較MIC(μg/ml)細(xì)菌名稱HLZ CLZ CLA CLA/HLEROX ROX/HLZ金葡MRSA02-20 ＞4000 1000 400062.5/62.5 4000 62.5/62.5金葡球菌MRSA02-22 250 8 400062.5/62.5 4000 62.5/62.5金葡球菌MRSA02-26 250 4 40000.5/0.54000 0.5/0.5金葡球菌02-19-1＞4000 62.5 4000500/5004000 2000/2000金葡球菌02-19-2＞4000 62.5 4000500/5004000 2000/2000金葡球菌02-19-531.30.5 40008/84000 250/250金葡球菌02-19-25 ＞4000 0.5 1 0.5/0.54000 0.5/0.5金葡球菌02-19-28 ＞4000 8 250 125/1251000 500/500金葡球菌02-19-39 ＞4000 0.5 8 0.5/0.562.5 0.5/0.5表葡球菌02-20-22 2 40000.5/0.54000 0.5/0.5表葡球菌02-20-32 4 40001/11000 8/8表葡球菌02-20-42 2 40000.5/0.54000 8/8表葡球菌02-20-64 2 40000.5/0.54000 0.5/0.5表葡球菌02-20-72 2 10000.5/0.51000 0.5/0.5
續(xù)表5細(xì)菌名稱MIC(μg/ml)HLZ CLZ CLA CLA//HLZ ROX ROX/HLZ表葡球菌MRSE02-4 4 8 500 62.5/62.5 4000 15.6/15.6表葡球菌MRSE02-5 8 8 4000 2000/2000 4000 8/8表葡球菌MRSE02-9 ＞4000 15.6 4000 0.5/0.54000 1/1表葡球菌MRSE02-10 4 250 1000 0.5/0.51000 0.5/0.5表葡球菌MRSE02-12 0.5 0.5 8 0.5/0.5125 0.5/0.5表葡球菌MRSE02-13 15.662.5 15.6 2/2500 15.6/15.6表葡球菌MRSE02-15 8 2 1000 0.5/0.54000 0.5/0.5表葡球菌MRSE02-17 4 0.5 250 2/24000 8表葡球菌MRSE02-20 8 0.5 4000 0.5/0.54000 0.5/0.5表葡球菌MRSE02-23 ＞4000 0.5 1000 0.5/0.54000 0.5/0.5大腸埃希菌02-1-20 ＞4000 250 500 15.6/15.6 4000 62.5/62.5大腸埃希菌02-1-24 ＞4000 ＞40004000 125/1254000 4/4大腸埃希菌02-1-3 ＞4000 ＞4000500 250/250250 62.5/62.5大腸埃希菌02-1-4 ＞4000 ＞4000125 62.5/62.5 125 31.3/31.3
續(xù)表5MIC(μg/ml)細(xì)菌名稱HLZ CLZ CLA CLA/HLZROX ROX/HLZ大腸埃希菌02-1-531.315.6 125 31.3/31.3 250 31.3/31.3大腸埃希菌02-1-7＞4000 2 62.5 62.5/62.5 125 62.5/62.5大腸埃希菌02-1-8＞4000 2 125 15.6/15.6 500 31.3/31.3大腸埃希菌02-1-13 ＞4000 ＞400062.5 31.3/31.3 250 31.3/31.3大腸埃希菌02-1-14 ＞4000 ＞4000500 31.3/31.3 500 125/125枸櫞酸桿菌02-7-7＞4000 1 4000 0.5/0.54000 4/4枸櫞酸桿菌02-7-82 1 1000 15.6/15.6 4000 0.5/0.5枸櫞酸桿菌02-7-10 ＞4000 ＞40001000 15.6/15.6 1000 500/500枸櫞酸桿菌02-7-11 ＞4000 1 62.5 4/44000 125/125枸櫞酸桿菌02-7-12 125 2 31.3 0.5/0.5250 4/4肺炎克雷伯菌02-6-1 ＞4000 4 125 0.5/0.50125 15.6/15.6肺炎克雷伯菌02-6-2 ＞4000 2 500 31.3/31.3 1000 31.3/31.3肺炎克雷伯菌02-6-3 ＞4000 ＞400062.5 31.3/31.3 125 31.3/31.3肺炎克雷伯菌02-6-4 ＞4000 4 500 15.6/15.6 1000 500/500
續(xù)表5MIC(μg/ml)細(xì)菌名稱HLZ CLZ CLA CLA/HLZROX ROX/HLZ肺炎克雷伯菌02-6-12 ＞4000 ＞40004000 1000/1000 4000 1000/1000肺炎克雷伯菌02-6-14 250 1000 62.5 62.5/62.5 4000 125/125肺炎克雷伯菌02-6-16 ＞4000 ＞40001000 125/1254000 62.5/62.5肺炎克雷伯菌02-6-19 ＞4000 1000 62.5 4/41000 62.5/62.5陰溝腸桿菌02-9-1 ＞4000 4000 1000 31.3/31.3 250 31.3/31.3陰溝腸桿菌02-9-2 ＞4000 4000 125 31.3/31.3 500 125/125陰溝腸桿菌02-9-3 ＞4000 1000 125 31.3/31.3 250 125/125陰溝腸桿菌02-9-5 31.315.6 4000 0.5/0.54 0.5/0.5陰溝腸桿菌02-9-6 ＞4000 250 125 0.5/0.5125 0.5/0.5不動(dòng)桿菌02-24-4 ＞4000 500 125 15.6/15.6 8 0.5/0.5注HLZ指人溶菌酶，CLZ指對(duì)照溶菌酶(雞溶菌酶)，CLA指克拉霉素，ROX指羅紅霉素。
表6 人溶菌酶與克拉霉素、羅紅霉素、萬古霉素、德可霉素單用和聯(lián)合使用對(duì)500株臨床分離菌的敏感率(％)

續(xù)表6

*HLZ、CLZ、CLZ、ROX、VAN、TEC分別表示人溶菌酶、雞溶菌酶、克拉霉素、羅紅霉素、萬古霉素和德可霉素。
權(quán)利要求
1.一種用人溶菌酶作為制備治療病原微生物感染引起炎癥藥物的應(yīng)用。其特征在于本發(fā)明是利用由純度99.8％以上、活性70,000u/mg的基因重組人溶菌酶作為制備治療細(xì)菌、真菌和病毒感染在皮膚黏膜表面上引起上呼吸道炎癥、陰道炎癥、皮膚炎癥和口腔炎癥藥物的應(yīng)用；用具有殺菌和抗炎性能的基因重組人溶菌酶制備治療細(xì)菌感染引起體內(nèi)炎癥藥物口服片劑、霧化吸入噴霧劑和體外炎癥藥物滴劑、膏劑和栓劑的應(yīng)用；以及用基因重組人溶菌酶與抗生素1∶1組合物作為制備治療病原微生物感染引起體內(nèi)外藥物的聯(lián)合用藥。
2.按照權(quán)利要求1所述基因重組人溶菌酶作為制備治療病原微生物感染引起炎癥藥物的應(yīng)用，其特征在于病原微生物中所指的細(xì)菌是革蘭氏陽性、陰性細(xì)菌、厭氧菌、耐藥性細(xì)菌和L型細(xì)菌；基因重組人溶菌酶對(duì)細(xì)菌敏感有效抑菌濃度在50μg-1.0mg/ml之間。
3.按照權(quán)利要求1所述基因重組人溶菌酶作為制備治療病原微生物感染引起炎癥藥物的應(yīng)用，其特征在于病原微生物中所指的病毒是DNA病毒和RNA病毒。
4.按照權(quán)利要求1所述基因重組人溶菌酶作為制備治療病原微生物感染引起炎癥藥物的應(yīng)用，其特征在于上呼吸道炎癥是指由耐藥金葡菌感染引起的氣管、支氣管炎、肺炎和咽炎。
5.按照權(quán)利要求1所述基因重組人溶菌酶作為制備治療病原微生物感染引起炎癥藥物的應(yīng)用，其特征在于皮膚炎癥是指由革蘭氏陽性、陰性細(xì)菌感染引起的濕疹、過敏性皮炎、青春痘、風(fēng)疹、蕁麻疹。
6.按照權(quán)利要求1所述基因重組人溶菌酶作為制備治療病原微生物感染引起炎癥藥物的應(yīng)用，其特征在于口腔炎癥是指由厭氧性球菌感染引起的牙齦炎或口腔潰瘍。
7.按照權(quán)利要求1所述基因重組人溶菌酶作為制備治療病原微生物感染引起炎癥藥物的應(yīng)用，其特征在于治療上呼吸道炎癥、陰道炎癥和皮膚炎癥的藥物是由1％基因重組人溶菌酶凍干粉和5mM磷酸鹽PH5緩沖液配制成的注射劑，靜脈注射用藥量30,000u/ml/20g鼠重，每日三次，上呼吸道和陰道炎癥的有效治愈率100％，皮膚炎癥的有效治愈率80-100％；用基因重組人溶菌酶對(duì)體內(nèi)呼吸道被表葡萄球菌、肺炎鏈球菌感染炎癥的療效強(qiáng)于克拉霉素4倍和9倍。
8.按照權(quán)利要求1所述基因重組人溶菌酶作為制備治療病原微生物感染引起炎癥藥物的應(yīng)用，其特征在于治療口腔炎癥的藥物是由0.1％基因重組人溶菌酶凍干粉、20mM磷酸鹽PH7緩沖液、25％丙三醇和5/萬吐溫80配制成的噴霧劑，用藥量1500μl/20g鼠重，每日六次，有效治愈率100％。
9.按照權(quán)利要求1所述基因重組人溶菌酶作為制備治療病原微生物感染引起炎癥藥物的應(yīng)用，其特征在于體內(nèi)用藥的口服片劑是由10％基因重組人溶菌酶凍干粉、50％藥用淀粉、25％藥用糊精、10mM磷酸鹽PH6緩沖液和5％蔗糖配制成的片劑。
10.按照權(quán)利要求1所述基因重組人溶菌酶作為制備治療病原微生物感染引起炎癥藥物的應(yīng)用，其特征在于體內(nèi)用藥霧化吸入基因重組人溶菌酶配制的濃度為0.025-0.4mg/ml，吸入給藥2-5天。
11.按照權(quán)利要求1所述基因重組人溶菌酶作為制備治療病原微生物感染引起炎癥藥物的應(yīng)用，其特征在于體外用藥滴劑是由0.005％基因重組人溶菌酶凍干粉、10mM磷酸鹽PH6緩沖液、20％丙三醇、6％2-吡咯烷酮-5-羧酸鈉、0.9％水溶性氮酮和3/萬吐溫80配制而成。
12.按照權(quán)利要求1所述基因重組人溶菌酶作為制備治療病原微生物感染引起炎癥藥物的應(yīng)用，其特征在于體外用藥膏劑是由0.1％基因重組人溶菌酶凍干粉、20mM磷酸鹽PH7緩沖液、20％丙三醇、1％卡波樹脂和0.3％香精配制而成。
13.按照權(quán)利要求1所述基因重組人溶菌酶作為制備治療病原微生物感染引起炎癥藥物的應(yīng)用，其特征在于基因重組人溶菌酶與抗生素聯(lián)合用藥組合物中的抗生素是克拉霉素、羅紅霉素、萬古霉素或德可霉素；用基因重組人溶菌酶與克拉霉素1∶1組合物聯(lián)合用藥最佳濃度為(1.5+0.1)mg/ml，對(duì)體內(nèi)呼吸道被金葡球菌、表鏈球菌感染炎癥的療效比單用克拉霉素分別增強(qiáng)19.6和18.7倍。
14.按照權(quán)利要求1所述基因重組人溶菌酶作為制備治療病原微生物感染引起炎癥藥物的應(yīng)用，其特征在于基因重組人溶菌酶對(duì)體外單獨(dú)給藥治療革蘭氏陽性、陰性細(xì)菌感染引起炎癥均有抗菌作用；基因重組人溶菌酶與克拉霉素或羅紅霉素1∶1聯(lián)合用藥，可使克拉霉素、羅紅霉素的抗菌活性增效2-16倍，敏感率有顯著提高；與萬古霉素、德可霉素聯(lián)用可降低它們對(duì)金葡球菌、表葡球菌的MIC50和MIC90值2-4倍。
全文摘要
本發(fā)明提供了用酵母菌工業(yè)化生產(chǎn)提取純化度達(dá)99.8％，活性高達(dá)70,000u/mg的基因重組人溶菌酶作為制備治療細(xì)菌、真菌和病毒感染皮膚黏膜表面引起各種炎癥藥物的應(yīng)用；并用具有殺菌和抗炎作用的基因重組人溶菌酶作為治療各種臨床炎癥體內(nèi)外的藥物；以及用基因重組人溶菌酶對(duì)炎癥單獨(dú)用藥或與抗生素組合物聯(lián)合用藥的方法。
文檔編號(hào)A61P31/04GK1557485SQ200410021100
公開日2004年12月29日 申請(qǐng)日期2004年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月30日
發(fā)明者李元, 李別虎, 薛小平, 黃慶生, 王延竹, 韓文君, 李 元 申請(qǐng)人:大連帝恩生物工程有限公司