專(zhuān)利名稱(chēng)：甲狀旁腺激素的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甲狀旁腺激素(PTH)的新用途，具體地說(shuō)，是甲狀旁腺激素在制備治療牙本質(zhì)和牙本質(zhì)基質(zhì)的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)作為調(diào)節(jié)血鈣使之維持在正常水平的一種重要物質(zhì)，是由84個(gè)氨基酸殘基縮合而成，它的氨基段31～38氨基酸殘基的作用目前已報(bào)道促進(jìn)骨的形成，并改善骨力學(xué)強(qiáng)度，治療骨質(zhì)疏松的用途。專(zhuān)利號(hào)為94192745.8公開(kāi)了“甲狀旁腺激素類(lèi)似物和甲狀旁腺激素相關(guān)肽合成和治療骨質(zhì)疏松癥的用途”，但在全身礦化組織之一的牙本質(zhì)形成和礦化過(guò)程中有無(wú)作用和有怎樣的作用，目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)報(bào)道。有關(guān)PTH對(duì)成牙本質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞之一的牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞的影響，目前國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道；其作用機(jī)理是通過(guò)調(diào)節(jié)血漿鈣磷濃度間接影響牙齒的發(fā)育，或是直接調(diào)節(jié)牙本質(zhì)基質(zhì)形成和礦化，有待于研究確定，目前尚未報(bào)道。
甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)也是調(diào)節(jié)血鈣使之維持在正常水平的一種重要物質(zhì)，研究表明人牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞(dentalpapilla mesenchymal，DPMC)對(duì)甲狀旁腺激素的反應(yīng)具有某些成骨細(xì)胞的特性，在PTH作用下，體外培養(yǎng)條件下的DPMC已向具有成骨特性細(xì)胞的方向分化[1]。但其作用機(jī)理尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。PTH是礦化組織代謝調(diào)節(jié)中重要的激素類(lèi)物質(zhì)，在體內(nèi)對(duì)鈣磷代謝有著重要的調(diào)節(jié)作用。在研究甲狀旁腺激素對(duì)體外培養(yǎng)的人DPMC生物學(xué)特性影響時(shí)發(fā)現(xiàn)[1]PTH不影響體外培養(yǎng)的人牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞增殖，而僅促進(jìn)細(xì)胞的分化和功能活躍。PTH通過(guò)細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)介導(dǎo)。使人牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶(ALP)活性降低，而使細(xì)胞外ALP活性增加，提示PTH可能是成牙本質(zhì)細(xì)胞分化和礦化的重要的介質(zhì)。
骨形成蛋白(BMP)是與骨及牙齒硬組織形成關(guān)系極其密切的細(xì)胞因子。已有學(xué)者[2～5]采用免疫組織化學(xué)、核酸分子原位雜交技術(shù)，分別研究了BMP、BMP2A、BMP3cDNA在牙胚中以及在人牙髓組織中的分布與表達(dá)，認(rèn)為它們?cè)谘琅叩陌l(fā)育過(guò)程和牙髓自身修復(fù)過(guò)程中有重要作用。骨形成蛋白(BMP)是一種高效的骨誘導(dǎo)物質(zhì)，是間充質(zhì)細(xì)胞向骨細(xì)胞系分化的最初信號(hào)分子。在骨形成和發(fā)育過(guò)程中，BMP對(duì)于細(xì)胞的趨化、有絲分裂及分化有重要的作用。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，當(dāng)BMP分子在某些特殊區(qū)域表達(dá)時(shí)，可誘導(dǎo)其周?chē)?xì)胞的聚集，然后再向骨和軟骨分化。BMP2是BMP家族中與骨形成最為密切的成員。Nakashima[14]等報(bào)道BMP2與膠原基質(zhì)復(fù)合后可以誘導(dǎo)牙本質(zhì)的形成。Lyons[3]和高玉好[4]等運(yùn)用分子原位雜交技術(shù)檢測(cè)了牙胚中BMP2A基因的表達(dá)與分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)造釉器上皮細(xì)胞、牙乳頭細(xì)胞、牙囊細(xì)胞和牙胚周?chē)某晒羌?xì)胞中均有大量的陽(yáng)性信號(hào)出現(xiàn)，與免疫組化研究結(jié)果相一致。認(rèn)為在牙胚發(fā)育過(guò)程中伴隨著B(niǎo)MP基因的激活與表達(dá)。BMP3是一種疏水性非膠原糖蛋白，分子量30～40KD，為二硫鍵結(jié)合的二聚體結(jié)構(gòu)。BMP3與載體結(jié)合后，可通過(guò)誘導(dǎo)激活成骨細(xì)胞的表達(dá)而具有誘導(dǎo)活性[15]。同時(shí)，BMP3在骨形態(tài)發(fā)生[16]和人胚組織發(fā)育[17]中亦有重要作用。Thomas等發(fā)現(xiàn)大鼠磨牙牙胚的釉節(jié)處(Enamal knot)有BMP3基因的表達(dá)[18]。Tabas[19]等利用體細(xì)胞雜交株，用cDNA探針雜交技術(shù)確定了BMP1、2、3、4基因在染色體上的位置，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMP3位于人第4號(hào)染色體P18.4-q21區(qū)域，與二型牙本質(zhì)發(fā)育不良(dentinogenesis imperfecta typeII)的基因位點(diǎn)重疊，提示BMP3基因可能在牙本質(zhì)形態(tài)發(fā)生過(guò)程中有重要意義。BMP3mRNA主要分布于神經(jīng)外胚層來(lái)源的組織及細(xì)胞[16]，而B(niǎo)MP3的結(jié)合位點(diǎn)富含于中胚層來(lái)源的組織，提示BMP3對(duì)于上皮-間充質(zhì)的交互作用可能有重要意義。BMP3在成牙本質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化中的作用，目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。王忠東[5]研究發(fā)現(xiàn)成熟的功能性成牙本質(zhì)細(xì)胞在一定程度的齲源性炎癥刺激下，其BMP3基因激活并表達(dá)，參與牙髓細(xì)胞的誘導(dǎo)分化過(guò)程，對(duì)牙髓的自身修復(fù)過(guò)程可能具有重要意義，認(rèn)為BMP3基因表達(dá)強(qiáng)弱與細(xì)胞的分化程度及所處的功能狀態(tài)相關(guān)。有研究表明[6～12]BMP在牙胚發(fā)育及牙髓自身修復(fù)過(guò)程中的牙本質(zhì)形成中同樣具有重要意義。Nakashima[8]將BMP置于狗牙的穿髓點(diǎn)處，觀察修復(fù)性牙本質(zhì)的形成，認(rèn)為BMP可以促進(jìn)牙髓間充質(zhì)細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)骨樣牙本質(zhì)形成，而在后者可誘導(dǎo)成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化。高玉好等[11]發(fā)現(xiàn)BMP可促進(jìn)繼代體外培養(yǎng)的人牙髓細(xì)胞3H-TdR摻入，提高增殖期ALPase活性，認(rèn)為BMP對(duì)牙髓細(xì)胞的誘導(dǎo)分化具有調(diào)節(jié)作用。牙齒發(fā)育中生長(zhǎng)中心的成釉細(xì)胞早于成牙本質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)，成釉細(xì)胞中的BMP含量總是較成牙本質(zhì)細(xì)胞豐富，而且在其相應(yīng)部位的成牙本質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)前胞漿中就有BMP的存在，提示成釉細(xì)胞通過(guò)合成和分泌BMP，誘導(dǎo)成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化，進(jìn)而形成牙本質(zhì)[13]。目前，針對(duì)PTH對(duì)牙本質(zhì)的作用，僅限于基礎(chǔ)理論的研究，無(wú)相關(guān)報(bào)道以藥物形式用于臨床。
目前，牙本質(zhì)形成障礙疾病主要是遺傳性牙本質(zhì)發(fā)育不全(dentinogenesis imperfecta，DGI)，它是一種常染色體顯性遺傳病，發(fā)病率約為1/8000，外顯率約為100％。臨床上分為三型；I型(DGI-I)，患者除牙本質(zhì)生成不全外，還伴有成骨發(fā)育不全的癥狀，其病因?yàn)閺V泛的I型膠原基因突變。II型(GI-II)，又名遺傳性乳光牙本質(zhì)，其表現(xiàn)為牙齒色澤從半透明到淡藍(lán)色到深棕色并出現(xiàn)乳光樣色彩，牙齒常有嚴(yán)重磨損，少數(shù)病例可伴有牙釉質(zhì)發(fā)育不全，但不伴有骨發(fā)育障礙，X線(xiàn)片可見(jiàn)牙根短，髓室和根管完全閉鎖。Aplin等將其基因定位于4q21區(qū)域GATA6211和D4S1563之間遺傳學(xué)距離為2cm的范圍內(nèi)，Grosby等學(xué)者在此范圍內(nèi)將DSPP基因確定為侯選基因，學(xué)者們通過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)DSPP基因3號(hào)外顯子3658位點(diǎn)有一個(gè)C→T突變，形成了蛋白合成的終止子，此無(wú)義突變使讀碼框提前，導(dǎo)致牙本質(zhì)涎蛋白和牙本質(zhì)鱗蛋白缺失，因而導(dǎo)致了HAP成核及礦化不全，最終形成病理性DGI-II。III型(DGI-III)，又稱(chēng)白蘭地型牙本質(zhì)發(fā)育不全，為孤立發(fā)生于馬里蘭州的3個(gè)隔離民族群中的特殊的遺傳性乳光牙本質(zhì)，其特征為牙本質(zhì)極薄，髓室和根管明顯增大。在牙齒發(fā)育過(guò)程中，如果發(fā)生各種原因引起的鈣磷代謝障礙，也可以導(dǎo)致牙本質(zhì)發(fā)育不全。目前治療牙本質(zhì)和牙本質(zhì)基質(zhì)的疾病的藥物有鈣和維生素D、降鈣素、雌激素替代治療和二膦酸鹽等，其缺陷包括使用鈣劑和維生素D治療的毒副作用有(1)化合物本身的毒副作用局部刺激癥狀有惡心、嘔吐、胃腸不適、食欲減退、便秘等胃腸道癥狀，以及注射部位的疼痛、壞死等；全身癥狀包括大量投用鈣劑可干擾磷、鋅、鐵等生命元素的吸收利用；注射過(guò)快引起的心率失常以致室顫等。(2)添加劑或夾雜物的毒副作用 添加劑的毒副作用鈣劑中添加枸櫞酸、醋酸等影響口感；加入人造色素、香精或糖精等，對(duì)嬰幼兒產(chǎn)生不利影響，對(duì)未發(fā)育成熟的神經(jīng)也有毒害作用；添加糖分，可影響食欲及營(yíng)養(yǎng)平衡。夾雜物的毒副作用，生物或礦物源制劑常污染或混雜鉛、汞、鎘等有害元素，盡管它們?cè)阝}制劑中含量很少，但鈣劑多為累月或常年服用，多服有引起蓄積性中毒的可能。雌激素的使用在劑量和療程上有較高的要求，劑量必須是由低量逐漸增加，直至最佳劑量。有報(bào)道認(rèn)為任何一種能增血中雌激素含量，增加雌激素代謝水平的治療都可增加乳癌，子宮內(nèi)膜癌和靜脈栓塞的危險(xiǎn)性，同時(shí)加用小劑量孕激素可減小副作用。降鈣素過(guò)去曾用于皮下注射而現(xiàn)在用于鼻噴入，這種用法為大多數(shù)人所接受而副作用鮮有報(bào)道。二膦酸鹽類(lèi)藥物的副作用是用藥者可能出現(xiàn)胃腸道的不良反應(yīng)，如腹瀉和消化不良等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)方案是提供甲狀旁腺激素的新用途，具體地說(shuō)，是甲狀旁腺激素在制備治療牙本質(zhì)和牙本質(zhì)基質(zhì)的疾病的藥物中的用途。
本發(fā)明提供了甲狀旁腺激素在制備治療牙本質(zhì)和牙本質(zhì)基質(zhì)的疾病中的用途。
進(jìn)一步地，是甲狀旁腺激素在制備治療牙本質(zhì)發(fā)育不全的藥物中的用途。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它包含有效量的甲狀旁腺激素制成的制劑。
其中每制劑單位含有甲狀旁腺激素0.5mg～4mg。該藥物組合物作用于人體內(nèi)的血藥濃度的范圍為8～42nmol/ml，進(jìn)一步地該藥物組合物作用于人體內(nèi)的血藥濃度為33.3nmol/ml。
本發(fā)明還提供了該藥物組合物在制備治療牙本質(zhì)和牙本質(zhì)基質(zhì)的疾病中的用途。
進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了該藥物組合物在制備皮下注射給藥的治療牙本質(zhì)和牙本質(zhì)基質(zhì)的疾病的藥物中的用途。其中所述的藥物組合物注射液或粉針劑。
本發(fā)明還提供了該藥物組合物在制備口服給藥的治療牙本質(zhì)和牙本質(zhì)基質(zhì)的疾病的藥物中的用途。進(jìn)一步地，所述的制劑為口服制劑。
本發(fā)明還提供了該藥物組合物在制備口含給藥的治療牙本質(zhì)和牙本質(zhì)基質(zhì)的疾病的藥物中的用途。進(jìn)一步地，所述的口含制劑為口含片、口腔粘附片、膜劑、噴霧劑。本發(fā)明還提供了甲狀旁腺激素在制備治療牙本質(zhì)發(fā)育不全的藥物中的用途。
本發(fā)明采用現(xiàn)代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，利用體外建立的人成牙本質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞-牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，用地高辛?biāo)記的cDNA探針，對(duì)體外培養(yǎng)的人牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞BMP2mRNA和BMP3mRNA表達(dá)情況，以及細(xì)胞經(jīng)PTH作用5d后，細(xì)胞表達(dá)的變化情況進(jìn)行觀察，探討PTH對(duì)人牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞的影響及途徑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的人牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞BMP2mRNA和BMP3mRNA陽(yáng)性雜交信號(hào)較弱；細(xì)胞經(jīng)PTH作用5d后，BMP2mRNA的表達(dá)無(wú)明顯變化，而在細(xì)胞漿內(nèi)，出現(xiàn)BMP3mRNA陽(yáng)性雜交信號(hào)。說(shuō)明體外培養(yǎng)的人牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞具有合成BMP2和BMP3的潛能，PTH顯著提高細(xì)胞合成BMP3的能力。本發(fā)明通過(guò)人DPMC在PTH作用下的礦化能力進(jìn)行比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)人血藥濃度為33.3nmol/ml的PTH顯著增加細(xì)胞的礦化結(jié)節(jié)和基質(zhì)小泡的數(shù)目，通過(guò)體外培養(yǎng)，說(shuō)明PTH能顯著提高人DPMC的礦化程度，促進(jìn)細(xì)胞分化。
在PTH的作用下，BMP3基因被激活、表達(dá)，通過(guò)自分泌和旁分泌作用參與牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞的誘導(dǎo)和分化，促進(jìn)牙本質(zhì)和牙本質(zhì)樣基質(zhì)的形成，達(dá)到治療牙本質(zhì)發(fā)育不全的目的，采用本發(fā)明的用途，解決了體內(nèi)合成PTH的問(wèn)題，且PTH接近生理水平，維持PTH在正常值水平時(shí)間較長(zhǎng)，通過(guò)PTH作用，避免了臨床應(yīng)用鈣劑、二氫速固醇等的副反應(yīng)，且制作簡(jiǎn)便，費(fèi)用低廉，易于推廣。
PTH既然有成骨作用，又有破骨作用，作為激素類(lèi)藥物，不同的藥藥方法會(huì)產(chǎn)生不同的后果，本發(fā)明采用間斷給予給藥，間歇性皮下注射每日清晨8～9點(diǎn)進(jìn)行一次皮下注射，每周六次，間隔一天再重復(fù)(甲狀旁腺激素的生理節(jié)律在每日清晨達(dá)到最高，以后緩慢下降)，通過(guò)該給藥方法的使用，能有效提高骨質(zhì)量。
顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
以下通過(guò)實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式
，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1有效量的甲狀旁腺激素(1-2mg)與輔料(或附加劑)制成水針劑。
實(shí)施例2有效量的甲狀旁腺激素(1-2mg)與輔料(或附加劑)制成溶液，干燥，滅菌，制成粉針劑。
實(shí)施例3 本發(fā)明藥物組合物口含片制備將PTH與空白顆粒充分混合，在常溫條件下直接壓片，每片含PTH為2～4mg。
實(shí)施例4 本發(fā)明藥物組合物粘附片將輔料、PTH分三層下層用HPC/CP作基質(zhì)，中層為PTH，上層為乳糖，直接壓片，每片含PTH0.5～1mg。
實(shí)施例5 本發(fā)明藥物膜劑制備用聚乙烯作基質(zhì)，用膜壓機(jī)直接壓片成膜劑，每片含PTH0.5～1mg。
實(shí)施例6 本發(fā)明藥物噴霧劑用常規(guī)的噴霧劑輔料與PTH混合，制備成PTH噴霧劑，規(guī)格2～4mg/撳。
以下通過(guò)具體的體外實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物藥效學(xué)試驗(yàn)證明本發(fā)明的有益效果。
實(shí)驗(yàn)例1 本發(fā)明藥物組合物甲狀旁腺激素對(duì)人牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞骨形成蛋白表達(dá)1、材料甲狀旁腺激素(Bachem Japan)質(zhì)粒pSP65-BMP2和pGEX2T-BMP3(美國(guó)基因研究所Dr Wozney惠贈(zèng))2、方法2.1分組對(duì)照組含2％FCS(胎牛血清)的DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle′sMediumDulbecco改良細(xì)胞培養(yǎng)液)培養(yǎng)液。
實(shí)驗(yàn)組將PTH用含2％FCS的DMEM培養(yǎng)液稀釋?zhuān)瑵舛葹?3.3nmol/L。
2.2細(xì)胞培養(yǎng)取合法水囊引產(chǎn)7月齡男胎的牙乳頭組織。用組織塊法進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，免疫組化進(jìn)行細(xì)胞起源鑒定。取生長(zhǎng)良好的第4代人牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞，用0.25％胰酶消化后，以2×103細(xì)胞濃度接種到鋪有無(wú)菌蓋玻片(6mm2)的24孔板中，在含分別用含10％FCS的DMEM培養(yǎng)液內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下孵育24h。棄去細(xì)胞培養(yǎng)上清液，分別換成對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)5d，將長(zhǎng)有細(xì)胞的蓋玻片取出，95％乙醇固定30min，備用。
2.3雜交方法2.3.1探針制備及標(biāo)記質(zhì)粒pSP65-BMP2和pGEX2T-BMP分別含有BMP2和BMP3的cDNA片段，用堿裂解法提取質(zhì)粒，純化后酶切，回收所需片段，采用隨機(jī)引物法標(biāo)記探針(DIG DNA Labeling and Detection kit，BoehringerMannheim Company)2.3.2原位雜交步驟石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至DEPC(焦碳酸二乙酯)水及0.1mol/LPBS(pH7.4，0.1mol/LPBSNaCl8.5g，KH2PO40.2g，Na2HPO4.12H2O 2.9g，KCl 0.2g，用蒸餾水溶解后補(bǔ)足100ml。)后，分別用0.2mol/L HCL和蛋白酶K(1ug/ml)處理，0.2％甘氨酸中和10分鐘，4％多聚甲醛室溫固定30分鐘后；梯度酒精脫水，室溫干燥，BMPs探針濃度為1ug/ml，42℃濕盒雜交20小時(shí)后，2×SSC(2×SSC0.3mol/L氯化鈉，0.03mol/L檸檬酸鈉)室溫振洗15分鐘×3，1×SSC(1×SSC溶液0.15mol/L NaCl，0.015mol/L檸檬酸鈉)室溫振洗15分鐘×3，0.5×SSC37℃振洗15分鐘×3，Buffer(緩沖劑)I(100mmol/L Tris-HCL pH7.5，，150mmol/LNaCl)充分洗滌15分鐘×2.2％正常羊血清封閉30分鐘后，滴加抗標(biāo)記堿性磷酸酶地高辛抗體(1∶100)2小時(shí)(37℃)，經(jīng)Buffer I，BufferIII(100mmol/L Tris-HCl pH9.5，100mmol/L NaCl，50mmol/L MgCl2)依次洗滌后，用顯示液BufferIII1000μl，左旋咪唑0.24mg，NBT(硝基藍(lán)四唑)4.5μl及BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯，5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate)3.5μl暗處顯色2小時(shí)，TE液中止反應(yīng)，甲基綠末復(fù)染，常規(guī)脫水透明封片。
實(shí)驗(yàn)對(duì)照同時(shí)設(shè)立不加探針的空白對(duì)照及RNase消化對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照為已反復(fù)證明為有陽(yáng)性反應(yīng)的骨肉瘤，每例標(biāo)本均同時(shí)作HE染色。
3、結(jié)果3.1細(xì)胞生長(zhǎng)情況人牙乳頭間組織在2～5d內(nèi)有原代細(xì)胞從組織塊邊緣游出，以組織塊為中心呈放射狀排列生長(zhǎng)。人牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞大多為梭形或星形成纖維樣細(xì)胞，早期的細(xì)胞為較小的矛狀細(xì)胞，少數(shù)有3個(gè)以上的突起，隨后細(xì)胞變寬，胞體豐富，胞漿均勻，核圓，核仁清晰。細(xì)胞在18代以前細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，穩(wěn)定，以后則細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，衰老。
3.2細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)、倍增時(shí)間和起源鑒定在接種后第1d，人牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞數(shù)有所下降，第2d細(xì)胞數(shù)開(kāi)始回升，并進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)呈“S”形。人牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞倍增時(shí)間為40.1h。
采用ABC免疫組化的方法對(duì)所培養(yǎng)的人牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行抗波形絲蛋白、抗角蛋白染色，細(xì)胞為明顯的抗波形絲蛋白陽(yáng)性，胞漿內(nèi)分布均勻；抗角蛋白陰性。表明培養(yǎng)的細(xì)胞并非上皮細(xì)胞而是中胚層來(lái)源的成纖維樣細(xì)胞。
3.3原位雜交結(jié)果體外培養(yǎng)的人牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞BMP2mRNA和BMP3mRNA陽(yáng)性雜交信號(hào)較弱；細(xì)胞經(jīng)PTH作用5d后，BMP2mRNA的表達(dá)無(wú)明顯變化；而在細(xì)胞漿內(nèi)，出現(xiàn)BMP3mRNA陽(yáng)性雜交信號(hào)，雜交陽(yáng)性物質(zhì)為胞漿內(nèi)藍(lán)紫色細(xì)顆粒狀。
實(shí)驗(yàn)例2 本發(fā)明藥物組合物對(duì)牙本質(zhì)形成的影響通過(guò)切除大鼠甲狀旁腺建立牙本質(zhì)發(fā)育不全的動(dòng)物模型，觀察甲狀旁腺功能低下對(duì)牙本質(zhì)形成的影響。
本實(shí)驗(yàn)觀察切除大鼠甲狀旁腺后，人工給予不同劑量的PTH后牙本質(zhì)形成的改變，觀察與給予PTH劑量有無(wú)相關(guān)性，檢測(cè)血清中總鈣含量，觀察血鈣水平與牙本質(zhì)形成的關(guān)系。
一、實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組選用年齡35d(5周)的純系雄性SD大鼠32只，隨機(jī)分為八組I正常對(duì)照組(control)II甲狀旁腺自體種植組(PTT)III.甲狀旁腺摘除組(PTX)，生理鹽水皮下注射1mlIV甲狀旁腺摘除組(PTX)，PTH每日皮下注射50μg/kg，每周六次。
V甲狀旁腺摘除組(PTX)，PTH每日皮下注射100μg/kg，每周六次。
VI甲狀旁腺摘除組(PTX)，PTH每日皮下注射200μg/kg，每周六次。
VII甲狀旁腺摘除組(PTX)；維生素D3肌肉注射2000U/只，隔日一次。
VIII甲狀旁腺摘除組(PTX)；PTH制劑每日口服一次，每周六次。
二、方法2.1手術(shù)方法大鼠用2％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(40mg/kg)，8％硫化鈉頸部脫毛，沖洗，固定于手術(shù)臺(tái)上，消毒，鋪巾，在頸中部縱向切開(kāi)皮膚、皮下組織，暴露甲狀腺甲狀旁腺，以后分組進(jìn)行。
2.1.1II組分離甲狀旁腺，再種植于動(dòng)物頸部皮下。術(shù)后48h及7d檢測(cè)血液中總鈣濃度。只有總鈣濃度維持于正常水平的大鼠用于進(jìn)一步觀察。動(dòng)物蘇醒后，在籠內(nèi)自由飲食喂養(yǎng)。
2.1.2III、IV、V、VI、VII、VIII組完全切除甲狀旁腺，縫合。術(shù)后同I組。
2.2總鈣測(cè)定大鼠尾部靜脈采血0.3ml，手術(shù)前一天采血一次，以后每三天采血一次，用MTB(甲基白里香酚藍(lán)法)測(cè)定血液總鈣含量，直至處死大鼠前一天。當(dāng)血鈣降至6mg/dl以下時(shí)(約為PTX11日)，計(jì)為實(shí)驗(yàn)0日，實(shí)驗(yàn)四周各組處死一半的動(dòng)物，余下一半繼續(xù)實(shí)驗(yàn)至十二周處死。
2.3標(biāo)記各組均在實(shí)驗(yàn)日前一天和處死大鼠前一天給大鼠腹膜內(nèi)注射四環(huán)素(10mg/kg)對(duì)牙本質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。在第一次注射四環(huán)素后兩周給予大鼠10mg/kg鈣黃綠素腹腔內(nèi)注射。
2.4取材和樣本處理處死大鼠，取下牙頜組織，拔除下頜切牙，分別固定在10％福爾馬林液中一周，以復(fù)合酸脫鈣，常規(guī)脫水、脫脂，包埋，沿下頜切牙中心矢狀切開(kāi)，制作成厚度＜10μm的切片，在熒光顯微鏡下觀察。
三、結(jié)果1、術(shù)后動(dòng)物一般情況記錄2、熒光顯微鏡下觀察3、牙本質(zhì)沉積率(標(biāo)記末段鈣黃綠素與第二次注射四環(huán)素之間的距離，μm per day)IV、V、VI組牙本質(zhì)沉積率在III組和I、II組之間，并隨PTH注射劑量升高而升高。
VII、VIII組牙本質(zhì)沉積率高于III組，與IV、V、VI組相比。
標(biāo)記末段鈣黃率素與第二次注射四環(huán)素之間牙本質(zhì)的面積(mm2)IV、V、VI組牙本質(zhì)面積在III組和I、II組之間，并隨PTH注射劑量升高而升高。
VII、VIII組牙本質(zhì)面積高于III組，與IV、V、VI組相比。
3、總鈣含量變化繪制五組總鈣含量變化曲線(xiàn)，I、II組血鈣含量維持正?；静蛔?，III組維持于低水平，IV、V、VI組均高于III組，低于I組，且隨PTH注射劑量升高而升高。VII、VIII組高于III組，與IV、V、VI組相比。
上述實(shí)驗(yàn)充分證明甲狀旁腺激素具有治療牙本質(zhì)發(fā)育不全的作用，具有促進(jìn)人牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞骨形成蛋白表達(dá)的用途，在PTH的作用下，BMP3基因被激活、表達(dá)，通過(guò)自分泌和旁分泌作用參與牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞的誘導(dǎo)和分化，促進(jìn)牙本質(zhì)和牙本質(zhì)樣基質(zhì)的形成，解決了體內(nèi)合成PTH的問(wèn)題，且PTH接近生理水平，維持PTH在正常值水平時(shí)間較長(zhǎng)，且無(wú)副作用，易于推廣應(yīng)用。
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權(quán)利要求
1.甲狀旁腺激素在制備治療牙本質(zhì)和牙本質(zhì)基質(zhì)的疾病中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于甲狀旁腺激素是治療牙本質(zhì)發(fā)育不全的藥物。
3.一種藥物組合物，它包含有效量的權(quán)利要求1所述的甲狀旁腺激素制成的制劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物組合物，其特征在于每制劑單位含有甲狀旁腺激素0.5mg～4mg。
5.權(quán)利要求3所述的藥物組合物在制備治療牙本質(zhì)和牙本質(zhì)基質(zhì)的疾病中的用途。
6.權(quán)利要求5所述的藥物組合物在制備皮下注射給藥的治療牙本質(zhì)和牙本質(zhì)基質(zhì)的疾病的藥物中的用途。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于所述的藥物組合物注射液或粉針劑。
8.權(quán)利要求5所述的藥物組合物在制備口服給藥的治療牙本質(zhì)和牙本質(zhì)基質(zhì)的疾病的藥物中的用途。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在所述的制劑為口服制劑。
10.權(quán)利要求5所述的藥物組合物在制備口含給藥的治療牙本質(zhì)和牙本質(zhì)基質(zhì)的疾病的藥物中的用途。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其特征在于所述的口含制劑為口含片、口腔粘附片、膜劑、噴霧劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了甲狀旁腺激素的新用途，它是甲狀旁腺激素在制備治療牙本質(zhì)和牙本質(zhì)基質(zhì)的疾病的藥物中的用途，含有有效量的甲狀旁腺激素制成的制劑，解決了體內(nèi)合成甲狀旁腺激素的問(wèn)題，且甲狀旁腺激素接近生理水平，維持PTH在正常值水平時(shí)間較長(zhǎng)，通過(guò)甲狀旁腺激素作用，避免了臨床應(yīng)用鈣劑、二氫速固醇等的副反應(yīng)，且制作簡(jiǎn)便，費(fèi)用低廉，易于推廣。
文檔編號(hào)A61K38/29GK1689642SQ20041002243
公開(kāi)日2005年11月2日 申請(qǐng)日期2004年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月30日
發(fā)明者陳新梅, 肖明振, 倪龍興, 張亞慶, 譚紅, 孫瑜 申請(qǐng)人:陳新梅, 肖明振, 倪龍興, 張亞慶, 譚紅, 孫瑜