專利名稱：人參皂苷Rb的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人參皂苷Rb3在制備治療或預(yù)防腦血管疾病的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著人口老齡化進(jìn)程的加速以及生活方式的改變，心腦血管疾病已成為一個(gè)全球性的健康問題，腦血管意外的死亡率在世界范圍分別居第3位，極大的危害人民的健康。新型有效的防治腦血管病藥物的開發(fā)已是臨床亟需。
人參皂苷Rb3是從西洋參莖葉或三七葉中分離提取的四環(huán)三萜類人參二醇型皂苷單體。
人參皂苷Rb3結(jié)構(gòu)式(R1-glu-glu；R2-glu-xyl)據(jù)報(bào)道，人參皂苷Rb3對(duì)培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞缺血損傷具有明顯的保護(hù)作用李愛紅，柯開富.人參皂苷Rb1、Rb3、Rg1對(duì)培養(yǎng)小鼠皮層細(xì)胞缺血損傷的保護(hù)作用及濃度—效應(yīng)關(guān)系.腦與神經(jīng)疾病雜志.2003，11(2)72～76；可以抑制正常培養(yǎng)心肌細(xì)胞AP及自發(fā)性搏動(dòng)(江巖，鐘國贛，陳龍，等.人參皂甙Rb1、Rb2和Rb3對(duì)正常與致?lián)p的培養(yǎng)心肌細(xì)胞電位與收縮活動(dòng)的影響.中國藥理學(xué)報(bào).1992，13(5)403～406)，可降低麻醉大鼠在體心臟的MAP、±dp/dtmax和LVSP(楊世杰，陳霞，李紅，等.西洋參莖葉皂甙單體Rb3對(duì)大鼠血流動(dòng)力學(xué)及單鈣通道活動(dòng)的影響.中國藥理學(xué)通報(bào).1995，11(1)39～42)。但關(guān)于人參皂苷Rb3在體內(nèi)具有預(yù)防或治療腦血管疾病的作用未見報(bào)道；鑒于此，本發(fā)明人通過大量的實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb3具有預(yù)防或治療腦血管疾病的醫(yī)藥用途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了人參皂苷Rb3在制備治療或預(yù)防缺血性腦中風(fēng)的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了人參皂苷Rb3在制備治療或預(yù)防腦缺血/再灌注損傷的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了人參皂苷Rb3在制備治療或預(yù)防腦外傷的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了由人參皂苷Rb3和藥學(xué)上可接受的載體組成的用于治療腦血管疾病的藥物組合物。
本發(fā)明所述的人參皂苷Rb3在用于上述任一用途時(shí)，其使用劑量范圍為10mg～1000mg天，優(yōu)選100mg～500mg/天。
本發(fā)明中使用的人參皂苷Rb3按文獻(xiàn)孟勤，尹建元，趙俊艷，等.西洋參葉三萜皂苷的分離與鑒定.中國藥學(xué)雜志.2003，37(3)175～177所述方法制備。
本發(fā)明中使用的人參皂苷Rb3可以單獨(dú)使用或以藥物組合物形式使用。藥物組合物包括作為活性成分的人參皂苷Rb3及藥用載體。該藥物組合物可以通過口服、舌下、經(jīng)皮、經(jīng)肌肉或皮下、皮膚粘膜、靜脈途徑給藥。藥物組合物可以以粉針劑、注射液、片劑、膠囊、軟膠囊、滴丸或口服液的形式存在。本發(fā)明所提供的各種藥物劑型均可以以藥學(xué)常規(guī)方法制備而成。
本發(fā)明人通過下列試驗(yàn)證實(shí)了人參皂苷Rb3具有治療或預(yù)防腦血管疾病的作用，下面的實(shí)施例用來更詳細(xì)的說明本發(fā)明，但并不意味著本發(fā)明僅限于此。試驗(yàn)所用的人參皂苷Rb3由山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心現(xiàn)代中藥研究室按文獻(xiàn)孟勤，尹建元，趙俊艷，等.西洋參葉三萜皂苷的分離與鑒定.中國藥學(xué)雜志.2003，37(3)175～177所述方法制備，經(jīng)HPLC檢測(cè)含量＞95％。
具體實(shí)施例方式制備實(shí)施例1人參皂苷Rb3凍干粉針的制備精密稱取人參皂苷Rb3原料20.0g及藥用甘露醇40.0g，溶于1000ml注射用水中，充分?jǐn)嚢枋谷芙猓?.1N氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，補(bǔ)加注射用水至2000ml，加入針用活性碳2.0g，加熱至60℃攪拌30分鐘，碳棒過濾，濾液經(jīng)0.25μm微孔濾膜過濾除菌，分裝于1000支西林瓶中，裝量2.0ml/支，冷凍干燥，即得。每支含人參皂苷Rb320mg。
制備實(shí)施例2人參皂苷Rb3注射液的制備精密稱取人參皂苷Rb3原料20.0g，溶于1000ml注射用水中，充分?jǐn)嚢枋谷芙猓?.1N氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，補(bǔ)加注射用水至2000ml，加入針用活性碳2.0g，加熱至60℃攪拌30分鐘，碳棒過濾，濾液經(jīng)0.25μm微孔濾膜過濾除菌，分裝于1000支西林瓶中，裝量2.0ml/支，封口，滅菌，即得。每支含人參皂苷Rb320mg。
試驗(yàn)例1人參皂苷Rb3對(duì)大鼠局部腦缺血損傷的影響(1)材料人參皂苷Rb3注射劑按制備例1方法制備。紅四氮唑美國Sigma公司產(chǎn)品，臨用前用生理鹽水配成4％溶液。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物普通級(jí)Wistar大鼠，雄性，體重280g-350g，山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)魯動(dòng)質(zhì)字200106005號(hào)。
(2)方法與結(jié)果動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組(等容量溶劑)，模型對(duì)照組(等容量溶劑)，尼莫地平組(Nim，1.5mg/kg)，人參皂苷Rb31mg/kg組，人參皂苷Rb35mg/kg組，人參皂苷Rb310mg/kg組，人參皂苷Rb325mg/kg組，人參皂苷Rb350mg/kg組，人參皂苷Rb3100mg/kg組，每組10只。禁食12小時(shí)后，水合氯醛(350mg/kg，i.p.)麻醉，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，夾閉頸內(nèi)、頸總動(dòng)脈，頸外動(dòng)脈近心端及遠(yuǎn)心端結(jié)扎，中間剪斷。將頸外動(dòng)脈游離端拉至與頸內(nèi)動(dòng)脈成一條直線，將栓線(選用直徑0.24mm尼龍線，長度5.0cm)由頸外動(dòng)脈插入至顱內(nèi)，遇輕微阻力時(shí)停止，插入深度約為2cm。結(jié)扎頸外動(dòng)脈開口，并打開頸總動(dòng)脈動(dòng)脈夾，消毒縫合傷口，造成左側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血模型；假手術(shù)組僅進(jìn)行右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈的分離(以上實(shí)驗(yàn)均在23℃～25℃進(jìn)行)。術(shù)后各組動(dòng)物靜脈注射相應(yīng)藥物(給藥體積1ml/200g)。24小時(shí)后按文獻(xiàn)劉小光，徐理納，一種能評(píng)價(jià)溶栓和抗溶栓的大鼠腦中動(dòng)脈模型，藥學(xué)學(xué)報(bào)，1995，30662所述方法及標(biāo)準(zhǔn)觀察并記錄大鼠的行為障礙(A)提鼠尾觀察前肢屈曲情況，如雙前肢對(duì)稱伸向地面，計(jì)為0分，如手術(shù)對(duì)側(cè)前肢出現(xiàn)腕屈曲計(jì)為1分，肘屈曲計(jì)為2分，肩內(nèi)旋計(jì)為3分，既有腕屈曲和/或肘屈曲，又有肩內(nèi)旋者，計(jì)為4分。(B)將動(dòng)物置于平地面上，分別推雙肩向?qū)?cè)移動(dòng)，檢查阻力。如雙側(cè)阻力對(duì)等且有力，計(jì)為0分，如向手術(shù)對(duì)側(cè)推動(dòng)時(shí)阻力下降者，根據(jù)下降程度不同分為輕、中、重三度，分別計(jì)為1，2和3分。(C)將動(dòng)物雙前肢置一金屬網(wǎng)上，觀察雙前肢的肌張力。雙前肢肌張力對(duì)等且有力者計(jì)為0分。同樣根據(jù)手術(shù)對(duì)側(cè)肌張力下降程度不同計(jì)為1，2和3分。(D)動(dòng)物有不停地向一側(cè)轉(zhuǎn)圈者，計(jì)為1分。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分，滿分為11分，分?jǐn)?shù)越高，表示動(dòng)物行為障礙越嚴(yán)重。
行為評(píng)分后處死大鼠，取腦，去掉嗅球、小腦和低位腦干，冠狀切成5片，腦片用紅四氮唑(TTC)染色，正常組織經(jīng)染色后呈紅色，梗塞組織呈白色，染色后照相，用中國航空航天大學(xué)病理圖像分析軟件求梗塞面積比。數(shù)據(jù)用X±s表示，以組間t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
結(jié)果如表1所示，缺血24小時(shí)后，大鼠表現(xiàn)出明顯的行為障礙，大鼠腦組織也出現(xiàn)明顯的灶狀缺血區(qū)，達(dá)到全腦的25％左右；給予不同劑量的人參皂苷Rb3，動(dòng)物行為障礙有不同程度的減輕，大鼠腦缺血區(qū)也有明顯好轉(zhuǎn)，且呈劑量依賴性。
人參皂苷Rb350mg/kg抗腦缺血作用強(qiáng)于25mg/kg(P＜0.05)，但是與100mg/kg比較無明顯差別(P＞0.05)。提示當(dāng)劑量≥50mg/kg時(shí)，藥效并沒有繼續(xù)增加。
表1 人參皂苷Rb3對(duì)大鼠局部腦缺血損傷的影響(n＝10，X±s)

與模型對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與50mg/kg組比較△P＜0.05，#P＞0.05。
試驗(yàn)例2人參皂苷Rb3對(duì)大鼠腦缺血/再灌注損傷的影響(1)材料人參皂苷Rb3注射劑按制備例2方法制備。紅四氮唑美國Sigma公司產(chǎn)品，臨用前用生理鹽水配成4％溶液。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物普通級(jí)Wistar大鼠，雄性，體重280g-350g，山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。合格證號(hào)魯動(dòng)質(zhì)字200106005號(hào)。
(2)方法與結(jié)果動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組(等容量溶劑)，模型對(duì)照組(等容量溶劑)，尼莫地平組(Nim，1.5mg/kg)，人參皂苷Rb31mg/kg組，人參皂苷Rb35mg/kg組，人參皂苷Rb310mg/kg組，人參皂苷Rb325mg/kg組，人參皂苷Rb3100mg/kg組，每組10只。禁食12小時(shí)后，按實(shí)驗(yàn)例1所述方法造成左側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血；術(shù)后10min各組動(dòng)物靜脈注射相應(yīng)藥物(給藥體積1ml/200g)。缺血2小時(shí)后，抽出尼龍線，造成大鼠腦缺血/再灌注損傷；再灌22小時(shí)后，按按實(shí)驗(yàn)例1所述方法進(jìn)行行為評(píng)分、腦片染色。數(shù)據(jù)用X±s表示，以組間t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
結(jié)果如表2所示，缺血2小時(shí)再灌22小時(shí)后，大鼠表現(xiàn)出明顯的行為障礙，大鼠腦組織也出現(xiàn)明顯的灶狀缺血區(qū)，達(dá)到全腦的25％左右；給予不同劑量的人參皂苷Rb3，動(dòng)物行為障礙有不同程度的減輕，大鼠腦缺血區(qū)也有明顯好轉(zhuǎn)，且呈劑量依賴性。
人參皂苷Rb350mg/kg抗腦缺血/再灌損傷作用強(qiáng)于25mg/kg(P＜0.05)，但是與100mg/kg比較無明顯差別(P＞0.05)。提示當(dāng)劑量≥50mg/kg時(shí)，藥效并沒有繼續(xù)增加。
表2 人參皂苷Rb3對(duì)大鼠腦缺血/再灌注損傷的影響(n＝10，X±s)

與模型對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與50mg/kg組比較△P＜0.05，#P＞0.05。
試驗(yàn)例3人參皂苷Rb3對(duì)小鼠閉合性腦外傷的保護(hù)作用(1)材料人參皂苷Rb3注射劑按制備例方法2制備。清潔級(jí)昆明系小鼠，18～22g，雌雄各半，由山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。合格證號(hào)魯動(dòng)質(zhì)字200106003號(hào)。
(2)方法與結(jié)果取小鼠70只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(等容量溶劑)，模型對(duì)照組(等容量溶劑)，人參皂苷Rb32mg/kg組，人參皂苷Rb310mg/kg組，人參皂苷Rb320mg/kg組，人參皂苷Rb350mg/kg組，人參皂苷Rb3100mg/kg組，人參皂苷Rb3200mg/kg組，每組10只。按文獻(xiàn)王超云，蔣王林，智紅英，等.黃芩苷對(duì)腦損傷的保護(hù)作用.中草藥，2004，35(2)188~190所述方法造成小鼠閉合性腦外傷模型，各組靜脈給藥，24小時(shí)后剝?nèi)∈竽X，稱量濕重，70℃烘干24小時(shí)，稱干重，計(jì)算腦含水量；腦含水量高于正常值表示腦部水腫。
結(jié)果如表3所示，閉合性腦外傷造成小鼠腦嚴(yán)重水腫，給予不同劑量的人參皂苷Rb3，小鼠腦水腫有不同程度的減輕，且呈劑量依賴性。
人參皂苷Rb3100mg/kg降低腦水腫作用強(qiáng)于50mg/kg(P＜0.05)，但是與200mg/kg比較無明顯差別(P＞0.05)。提示當(dāng)劑量≥100mg/kg時(shí)，藥效并沒有繼續(xù)增加。
中國科學(xué)院成都分院分析測(cè)試中心分析、測(cè)試結(jié)果報(bào)告單表4

溴化率的計(jì)算1、二氫青蒿素(DHA)分子量為284.34，溴原子(Br)分子量為79.90，氫原子(H)分子量為1；2、二氫青蒿素的一個(gè)氫原子被溴原子取代后，溴代二氫青蒿素的分子量為(284.34-1)+79.90＝363.243、溴化率的計(jì)算79.90÷363.24＝21.996％≈22.0％。
檢驗(yàn)報(bào)告上22.90％屬正常值。
具體實(shí)施例方式
權(quán)利要求
1.人參皂苷Rb3在制備治療或預(yù)防腦血管疾病的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，人參皂苷Rb3在制備治療或預(yù)防缺血性腦中風(fēng)的藥物中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，人參皂苷Rb3在制備治療或預(yù)防腦缺血/再灌注的藥物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，人參皂苷Rb3在制備治療或預(yù)防腦外傷的藥物中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～4任一所述的應(yīng)用，人參皂苷Rb3的使用劑量范圍為10mg～1000mg/天。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，人參皂苷Rb3的使用劑量?jī)?yōu)選為100mg～500mg/天。
7.由人參皂苷Rb3和藥學(xué)上可接受的載體組成的用于治療或預(yù)防腦血管疾病的藥物組合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物組合物，該組合物可以通過靜脈、口服、舌下、經(jīng)皮、經(jīng)肌肉、皮下或皮膚粘膜途徑給藥。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其可以以片劑、丸劑、顆粒劑、膠囊、懸浮液、溶液、糖漿或注射劑形式存在。
全文摘要
本發(fā)明提供了人參皂苷Rb
文檔編號(hào)A61P9/00GK1679598SQ20041002387
公開日2005年10月12日 申請(qǐng)日期2004年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月6日
發(fā)明者田京偉, 馬成俊, 蔣王林, 任召言, 傅風(fēng)華, 劉珂 申請(qǐng)人:山東綠葉天然藥物研究開發(fā)有限公司