專利名稱：控制對蝦病毒感染的受體阻斷劑的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物疾病防治藥物篩選及應(yīng)用技術(shù)，可應(yīng)用于對蝦病毒防治藥物的篩選，是篩選控制對蝦病毒感染的受體阻斷劑。
背景技術(shù)：
病毒對對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重影響，特別是白斑綜合癥病毒(WSSV)是對蝦的最主要病原，嚴(yán)重阻礙了養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。對該病原的研究成為海洋生物學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一，針對對蝦病防治的藥物開發(fā)受到普遍關(guān)注。
目前多數(shù)對蝦病毒防治藥物開發(fā)的技術(shù)路線是借用醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)學(xué)的藥物控制技術(shù)，例如有些對蝦病毒防治藥物配方中采用病毒唑(黃家慶，馬文俊，葉春宇.南美白對蝦養(yǎng)殖過程中兩種常見病的防治.養(yǎng)魚世界雜志，2003.7.)、鹽酸嗎啉雙胍(林興忠，南美白對蝦蛻殼綜合防治措施.水產(chǎn)科技，20014.)、病毒靈[湖南省康大動(dòng)物保健品有限責(zé)任公司蝦寶(復(fù)方病毒靈)，湘獸藥字(2001)X051508，湘獸藥生證字051號]等藥物，這些藥物利用的是對病毒在細(xì)胞內(nèi)感染過程中的某些生化代謝途徑進(jìn)行抑制而起到防治效果，這類藥物通常副作用大，藥效不顯著，有殘留。對于對蝦等水產(chǎn)動(dòng)物而言，病毒感染導(dǎo)致對蝦發(fā)病后，就不再進(jìn)食，無法給藥，而人或大型畜禽動(dòng)物可以繼續(xù)強(qiáng)制喂藥或經(jīng)注射給藥。因此對感染開始之后的代謝抑制的藥物在對蝦中的應(yīng)用效果非常不理想。
此外，目前還有一些免疫增強(qiáng)類藥物在對蝦中得到應(yīng)用，例如β-1，3-葡聚糖[Song，Y.L.，et al..Glucan-induced disease resistance in tiger shrimp(Penaeus monodon).Dev.Biol.Stand.，1997，90413-421；Chang，C.F.，etal..Dietary β-1，3-glucan effectively improves immunity and survival ofPenaeus monodon challenged with white spot syndrome virus.Fish ShellfishImmunol.，2003，15(4)297-310]、肽聚糖(Itami，T.et al.，Enhancement ofdisease resistance of kuruma shrimp，Penaeus japonicus，after oraladministration of peptidoglycan derived from Bifidobacterium thermophilum.Aquaculture，1998，164277-288)等，這類藥物屬于非特異性免疫增強(qiáng)劑，能一定程度提高對蝦的普通免疫能力，從而對病毒感染起到一定的防治作用，但這類藥物沒有特異性，不能有針對性地對病毒感染起到阻斷作用，一旦對蝦受到其它的應(yīng)激作用，難免其非特異性免疫機(jī)能會(huì)出現(xiàn)下降，從而對病毒感染的抵抗能力降低。
最近國外采用白斑綜合癥病毒(WSSV)的結(jié)構(gòu)蛋白VP28或VP19的表達(dá)產(chǎn)物來進(jìn)行WSSV感染的防治[Witteveldt，J.，et al..Protection ofPenaeus monodon against white spot syndrome virus by oral vaccination.J.Virol.，2004，78(4)2057-2061]，這種途徑的機(jī)制目前尚不清楚，但我們的研究證實(shí)，VP28和VP19均不是該病毒與對蝦細(xì)胞受體相結(jié)合的蛋白，因此這兩種蛋白不會(huì)是直接與病毒受體結(jié)合而阻斷WSSV感染。上述研究者認(rèn)為病毒蛋白引起的保護(hù)機(jī)制與對蝦免疫相關(guān)。由于表達(dá)的蛋白產(chǎn)物存在成本高、產(chǎn)品易失活、可能會(huì)被微生物活體內(nèi)酶消化的問題，其應(yīng)用的可行性有待證實(shí)，而且這一途徑也仍處于研究階段。
有研究認(rèn)為肝素鈉[Jackson，T.，et al..Efficient infection of cells inculture by type O foot-and-mouth disease virus requires binding to cellsurface heparan sulfate.J.Virol.，1996，70(8)5282-5287]、植物凝集素[Cartwright B.Effect of concanavalin A on vesicular stomatitis virusmaturation.J.Gen.Virol.，1977，34(2)249-256]等多糖或多糖衍生物可以抑制部分醫(yī)學(xué)病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合，但這些研究還只是停留在細(xì)胞及分子水平上的研究，未在感染抑制水平得到實(shí)際驗(yàn)證。
在本發(fā)明完成時(shí)，尚無其它單位或個(gè)人開展對蝦病毒受體阻斷劑的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立能夠用來篩選對病毒與對蝦細(xì)胞膜蛋白的結(jié)合有阻斷作用的物質(zhì)的快捷方法，并采用所建立的方法，篩選到可用于控制白斑綜合癥病毒(WSSV)感染的受體阻斷劑。
本發(fā)明其技術(shù)內(nèi)容是本發(fā)明基于本實(shí)驗(yàn)室建立的病毒與對蝦細(xì)胞膜蛋白之間的一種結(jié)合分析技術(shù)進(jìn)行病毒受體結(jié)合阻斷劑的篩選過程，是對病毒與對蝦細(xì)胞膜蛋白的結(jié)合有阻斷作用的物質(zhì)的篩選。通過比較待篩選物處理對病毒與對蝦細(xì)胞膜蛋白的結(jié)合作用的影響完成篩選。該結(jié)合分析技術(shù)采用一種標(biāo)記物標(biāo)記參與結(jié)合的病毒(或?qū)ξr細(xì)胞膜蛋白)，然后與固相支持物上附著的對蝦細(xì)胞膜蛋白(或病毒)進(jìn)行結(jié)合，標(biāo)記物就能用來指示出結(jié)合反應(yīng)的活性強(qiáng)弱。在結(jié)合分析技術(shù)基礎(chǔ)上，用待篩選的物質(zhì)對病毒(或?qū)ξr細(xì)胞膜蛋白)預(yù)處理，然后進(jìn)行結(jié)合分析，根據(jù)與陽性和陰性對照相比的結(jié)合活性的強(qiáng)弱可判斷待篩選的物質(zhì)是否對病毒與對蝦細(xì)胞膜蛋白的結(jié)合具有阻斷作用。
標(biāo)記物與病毒(或?qū)ξr細(xì)胞膜蛋白)的連接是一種共價(jià)鍵化學(xué)反應(yīng)，可采用現(xiàn)有的多種蛋白質(zhì)標(biāo)記技術(shù)，如可采用地高辛蛋白標(biāo)記物(Digoxigenin-3-O-succinyl-ε-amino-caproic acid-N-hydroxysuccinimide ester，縮寫為DIG-NHS)或生物素蛋白標(biāo)記物(D-Biotinoyl-ε-aminocaproic acid-N-hydroxysuccinimide ester，縮寫為Biotin-7-NHS)或熒光素蛋白標(biāo)記物[5(6)-Carboxyfluorescein-N-hydroxysuccinimide ester，縮寫為FLUOS]等進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記物的檢測可采用與相應(yīng)標(biāo)記物具有特異性親和作用的抗體或親和素偶聯(lián)的酶催化反應(yīng)進(jìn)行。
標(biāo)記的病毒(或?qū)ξr細(xì)胞膜蛋白)與在固相支持物上附著的對蝦細(xì)胞膜蛋白(或病毒)結(jié)合。固相支持物為操作過程中的換液和洗滌提供了方便。該固相支持物可采用現(xiàn)有的多種常用技術(shù)，如聚苯乙烯酶標(biāo)板、硝酸纖維素濾膜、聚砜膜、活化的載波片等，這種附著可以是共價(jià)的或非共價(jià)的。為了避免固相支持物的游離位置非特異性地對標(biāo)記的病毒(或標(biāo)記的對蝦細(xì)胞膜蛋白)吸附，在加入標(biāo)記的病毒(或標(biāo)記的對蝦細(xì)胞膜蛋白)進(jìn)行結(jié)合孵育之前，需要用一種與病毒(或?qū)ξr細(xì)胞膜蛋白)不發(fā)生作用的物質(zhì)(例如脫脂奶粉溶液)將固相支持物上的游離位點(diǎn)封閉。
標(biāo)記的病毒(或?qū)ξr細(xì)胞膜蛋白)與在固相支持物上包被的對蝦細(xì)胞膜蛋白(或病毒)進(jìn)行孵育后，加入抗標(biāo)記物的抗體的酶標(biāo)偶聯(lián)物，最后通過抗體上偶聯(lián)的酶對顯色液中的底物進(jìn)行催化顯色，如果病毒與對蝦細(xì)胞膜蛋白具有結(jié)合作用，就會(huì)產(chǎn)生顯色信號，顯色信號的強(qiáng)弱反映了結(jié)合活性強(qiáng)度。
待篩選的物質(zhì)與標(biāo)記的病毒(或?qū)ξr細(xì)胞膜蛋白)在常溫下進(jìn)行簡單的混合孵育，若篩選物能與病毒(或?qū)ξr細(xì)胞膜蛋白)發(fā)生相互結(jié)合作用，進(jìn)行上述結(jié)合分析時(shí)，與結(jié)合了待篩選物的標(biāo)記病毒(或標(biāo)記對蝦細(xì)胞膜蛋白)與固相支持物上的對蝦細(xì)胞膜蛋白(或病毒)的結(jié)合活性就會(huì)受到抑制，從而能通過顯色反應(yīng)顯示這種抑制作用的強(qiáng)弱，進(jìn)而能快速地篩選對對蝦病毒感染具有阻遏作用的物質(zhì)。
結(jié)合分析技術(shù)的原理是病毒表面的病毒粘附蛋白與宿主細(xì)胞膜上的受體存在特異性結(jié)合作用，這種結(jié)合作用是病毒入侵宿主細(xì)胞并引起感染的前提，對這種結(jié)合作用具有阻斷效果的物質(zhì)也將對病毒感染起到抑制。因此所篩選到的具有阻斷活性的物質(zhì)對病毒感染將具有抑制作用，可應(yīng)用于抗病毒藥物的開發(fā)。
本發(fā)明人采用上述技術(shù)，對多種待測物進(jìn)行結(jié)合抑制分析表明，肝素鈉、植物血球凝集素和伴刀豆球蛋白對白斑綜合癥病毒(WSSV)與對蝦鰓細(xì)胞膜蛋白(BCMP)的結(jié)合具有明顯的抑制作用。這種阻斷作用可以反映在機(jī)體水平上的感染抑制，因此提出將肝素鈉、植物血球凝集素和伴刀豆球蛋白作為病毒感染的受體阻斷劑，可分別應(yīng)用于對蝦或其他甲殼類生物抗白斑綜合癥病毒感染。
肝素鈉(Heparin Sodium)是一種粘多糖硫酸酯，主要來源為豬、牛、羊等動(dòng)物腸粘膜、肺、肝臟等器官，其醫(yī)學(xué)上的用途是抗凝血藥，對脊椎動(dòng)物有抗凝血作用和降血脂作用，低分子量肝素對于口服給藥仍然有效，但未見將其作為病毒結(jié)合阻斷劑在醫(yī)學(xué)或其它領(lǐng)域的應(yīng)用。
植物血球凝集素(phytohemagglutinin P，簡寫為PHA-P)主要來源于菜豆、豌豆、蓖麻、云豆、大豆、蠶豆及花生等豆類植物，是一種糖蛋白，為低聚糖與蛋白質(zhì)的復(fù)合物，在醫(yī)學(xué)臨床上作免疫增強(qiáng)劑，用于某些免疫受損的疾病的治療。
伴刀豆球蛋白(Concanavalin，簡寫為Con A)是一種植物蛋白，主要來源于豆類植物。
肝素鈉結(jié)合阻斷作用的篩選方法為肝素鈉處理地高辛標(biāo)記的白斑綜合癥病毒(DIG-WSSV)后與酶標(biāo)板上包被的BCMP進(jìn)行結(jié)合分析。濃度為0.086μg/μl DIG-WSSV經(jīng)0.015μg/μl-32μg/μl肝素鈉處理后，與0.015μg/μl BCMP包被酶標(biāo)板的結(jié)合分析顯示，隨肝素鈉濃度的提高，結(jié)合活性顯著降低。
機(jī)體水平的感染實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了肝素鈉處理對WSSV感染的抑制作用。感染實(shí)驗(yàn)的方法為肝素鈉處理WSSV粗提液后直接注射感染健康凡納濱對蝦；同時(shí)設(shè)立不用肝素鈉處理的WSSV粗提液感染對照組。所用肝素鈉濃度范圍為200μg/μl以內(nèi)。感染驗(yàn)證結(jié)果的特征為肝素鈉對WSSV粗提液進(jìn)行處理后感染的實(shí)驗(yàn)組相對于WSSV粗提液感染對照組表現(xiàn)為存活時(shí)間延長，死亡率下降。
PHA-P和Con A的篩選方法為對0.047μg/μl DIG標(biāo)記的BCMP處理后在0.008μg/μl的WSSV包被的酶標(biāo)板上進(jìn)行結(jié)合分析。PHA-P的濃度范圍為0.006μg/μl-0.1μg/μl，Con A濃度范圍為0.008μg/μl-1.0μg/μl，結(jié)合分析說明PHA-P和Con A均能顯著抑制BCMP與WSSV之間的結(jié)合。
通過在對蝦或?qū)ξr飼料中使用肝素鈉、植物血球凝集素或伴刀豆球蛋白，能抑制WSSV浸染對蝦時(shí)進(jìn)入對蝦細(xì)胞，無法引起感染，從而對對蝦白斑病的發(fā)生起到防治作用。肝素鈉、植物血球凝集素和伴刀豆球蛋白可應(yīng)用于各種對蝦、螯蝦等養(yǎng)殖動(dòng)物的WSSV感染的控制。由于在相應(yīng)的原料來源中，肝素、植物血球凝集素和伴刀豆球蛋白的含量可觀，因此在作為白斑綜合癥病毒的防治應(yīng)用中，可以使用含有上述物質(zhì)的原料，如動(dòng)物內(nèi)臟或豆類植物，也可以使用這些原料的粗提物。
本發(fā)明與已有技術(shù)對比其特點(diǎn)是1.受體阻斷劑在對蝦病毒防治的應(yīng)用，是一全新的對蝦病毒病防治技術(shù)概念。
2.針對病毒與對蝦細(xì)胞膜蛋白結(jié)合作用，篩選受體阻斷劑，可切斷病毒最初的入侵過程。
3.標(biāo)記方法省去了制備病毒或?qū)ξr細(xì)胞膜的抗體，大大減少了病毒或?qū)ξr細(xì)胞膜的用量，加快了篩選周期。
4.與常用的感染試驗(yàn)方法相比，酶標(biāo)板上的篩選過程有顯著的優(yōu)勢，特別是體現(xiàn)在快速、高通量、簡便、標(biāo)準(zhǔn)化和可重復(fù)性方面。


圖1對蝦幾種細(xì)胞膜與DIG-WSSV結(jié)合分析圖2未標(biāo)記WSSV與WSSV-DIG競爭結(jié)合BCMP圖3肝素鈉對DIG-WSSV與包被的BCMP的結(jié)合抑制試驗(yàn)圖4PHA-A對DIG-WSSV與包被的WSSV的結(jié)合抑制作用圖5Con A對DIG-BCMP與包被的WSSV的結(jié)合抑制作用圖6肝素鈉對WSSV的感染抑制效果，其中H表示肝素鈉處理病毒后感染的實(shí)驗(yàn)組，P表示病毒感染組。
具體實(shí)施例方式
以下通過實(shí)例詳細(xì)敘述本發(fā)明WSSV感染受體阻斷劑篩選方法和抑制WSSV感染效果。
1.實(shí)例一BCMP與WSSV的特異性結(jié)合作用分析1.1 WSSV純化1.1.1采集患白斑病蝦，稱取5g去除肝胰腺的頭胸部，加入5倍體積4℃預(yù)冷的PPB(“對蝦生理緩沖液”的簡寫，含NaCl，22.0g/L；K2SO4，1.1g/L；CaCl2·H2O，1.9g/L；MgSO4·7H2O，1.6g/L；組氨酸鹽酸鹽，5.0g/L；pH 6.5)，冰浴在20,000r/min勻漿3-5次，每次5s。
1.1.2在4℃于4,500×g離心15min，上清加入蔗糖至濃度為30％(W/W)，4℃在30,000×g離心2h。
1.1.3沉淀用30％(W/W)蔗糖重懸，鋪于33％-62％(W/W)蔗糖梯度上，4℃ 60,000×g離心4h，用吸管小心收集可見病毒帶。
1.1.4在收集的病毒區(qū)帶溶液中加入5倍體積的PPB稀釋混勻，4℃13,000×g離心1h，回收病毒沉淀，用PBS(“磷酸緩沖鹽溶液”的簡寫，1000ml含NaCl 8g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KH2PO40.2g，KCl 0.2g，調(diào)pH至8.5)重懸，儲(chǔ)存于-70℃1.2 WSSV定量Bradford法1.2.1分別在兩組微量離心管中加入5、10、15和20μl 0.5mg/mlBSA(“牛血清白蛋白”的簡寫)，以0.15mol/L NaCl補(bǔ)足至100μl，同時(shí)以兩管100μl 0.15mol/L NaCl作空白對照。取一定體積的提純WSSV樣品添加PBS至100μl，同時(shí)以100μl PBS作為陰性對照。
1.2.2每管加入1ml考馬斯亮藍(lán)染液(100mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50ml 95％乙醇，加入100ml 85％磷酸，然后補(bǔ)加水至1L，濾紙過濾，于4℃保存)，振蕩混勻，室溫放置2min。
1.2.3用1cm光徑的微量比色杯在分光光度計(jì)上測定OD595，以BSA的質(zhì)量(μg)與OD595作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以樣品的OD595算出病毒蛋白量。
1.3 WSSV的DIG標(biāo)記1.3.1將提純的WSSV懸液與DIG-NHS(地高辛標(biāo)記物，Roche)按摩爾比(DIG-NHS∶WSSV＝5∶1)混合，25℃振蕩2h。
1.3.2加入PBS(pH7.4)13,000×g離心1h，棄上清，DIG-WSSV沉淀用PBS(pH7.4)重懸。
1.4對蝦組織細(xì)胞膜的提取1.4.1在冰冷的勻漿緩沖液中[250mmol/L蔗糖，10mmol/LHEPES，1mmol/L EDTA，0.1mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)，pH7.4]將健康對蝦鰓組織切成1mm3大小的碎塊，用勻漿緩沖液漂洗至無可見組織液。
1.4.2加入5倍于組織體積的緩沖液，在置于冰浴的玻璃勻漿器中抽研10-20次。
1.4.3勻漿液600×g離心10min，再8000×g離心10min，棄沉淀。
1.4.5上清液100 000×g離心40min沉淀組織細(xì)胞膜，棄上清。
1.4.6用勻漿緩沖液重懸沉淀，在小號勻漿器中勻漿，再次100 000×g離心40min，棄上清。
1.4.7用小體積勻漿緩沖液重新徹底勻漿沉淀，即為對蝦組織細(xì)胞膜的粗制品。分裝，取一小份如前作蛋白測定，其余保存于-80℃。
1.5 WSSV與對蝦組織細(xì)胞膜的結(jié)合實(shí)驗(yàn)1.5.1取對蝦的肝胰腺、肌肉、鰓三種組織細(xì)胞膜，用包被緩沖液(含1.59g/L Na2CO3，2.93g/L NaHCO3，pH 9.6)稀釋至終濃度為400μg/ml，按50μl/孔加入96孔酶標(biāo)板，4℃包被過夜。
1.5.2用PBS洗板2次，各孔加入2％MPBS(含2％脫脂奶粉的PBS)250μl，于室溫靜置2h封板。
1.5.3用PBS洗板2次，各孔加入50μl用MPBST(含0.1％Tween 20的MPBS)稀釋的DIG-WSSV(濃度梯度為0.136μg/ml，2.72μg/ml，5.44μg/ml，10.88μg/ml，13.6μg/ml，16.32μg/ml，27.2μg/ml和54.4μg/ml)，室溫放置2h，2孔不加病毒作陰性對照。
1.5.4用PBST(含0.1％Tween 20的PBS)洗板5次，PBS洗板5次，加入MPBS稀釋的1∶1 000 Anti-DIG-Fab-HRP(“辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體Fab片段”的簡寫)，室溫放置1h。
1.5.5同步驟1.5.4洗板，每孔加入75μl OPD(“鄰苯二胺”的簡寫)顯色液(約10ml溶液包括2.75ml 0.2mol/L Na2HPO4，2.43ml 0.1mol/L檸檬酸，0.015ml 3％H2O2，4mg OPD，5ml dH2O)，37℃反應(yīng)至出現(xiàn)明顯信號，終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀上讀OD492值。
1.6未標(biāo)記WSSV對DIG-WSSV與BCMP結(jié)合的競爭性抑制1.6.1用50μl 400μg/ml的BCMP包被酶標(biāo)板，按1.5.2方法封板。
1.6.2用PBS洗板2次，每孔加入25μl含0.5μg DIG-WSSV的MPBST和25μl PBS稀釋的不同濃度的未標(biāo)記WSSV(濃度梯度為0.1μg/ml、0.4μg/ml、1.0μg/ml、4.0μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、100μg/ml和200μg/ml)，室溫靜置2h。
1.6.3用PBST洗板5次，PBS洗板5次，加入MPBS稀釋的1∶1000Anti-DIG-Fab-HRP，室溫放置1h。
1.6.4 PBST洗板5次，PBS洗板5次，加入75μl OPD顯色液，于37℃反應(yīng)至出現(xiàn)明顯信號，加入終止液(2mol/L H2SO4)終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀上讀吸光度值OD492。
1.7結(jié)果1.7.1 DIG-WSSV與BCMP的結(jié)合實(shí)驗(yàn)用50μl濃度為400μg/ml的BCMP包被酶標(biāo)板，DIG-WSSV與之結(jié)合的梯度為1.36μg/ml-54.4μg/ml，從附圖1可看出WSSV與BCMP間存在明顯結(jié)合，肌肉細(xì)胞膜和肝胰腺細(xì)胞膜與WSSV的結(jié)合活性很低，未觀察到DIG-WSSV與肝胰腺細(xì)胞膜間的結(jié)合。該結(jié)果與WSSV感染的對蝦組織嗜性完全相符，說明WSSV與BCMP的結(jié)合具有特異性。
1.7.2未標(biāo)記WSSV與DIG-WSSV競爭結(jié)合BCMP用50μl濃度為400μg/ml的BCMP包被酶標(biāo)板，與10μg/ml(0.5μg/孔)DIG-WSSV和0.1μg/ml-200μg/ml WSSV的混合液進(jìn)行競爭性結(jié)合，結(jié)果(附圖2)顯示當(dāng)未標(biāo)記的WSSV的量達(dá)到40μg/ml(2μg/孔)以上時(shí)，DIG-WSSV與BCMP的結(jié)合強(qiáng)度出現(xiàn)明顯下降，即出現(xiàn)明顯競爭抑制現(xiàn)象，這進(jìn)一步說明該結(jié)合作用的特異性，并說明上述實(shí)驗(yàn)方法可用于結(jié)合抑制篩選。
2.實(shí)施例二對WSSV與BCMP的結(jié)合作用有抑制效果的多糖類物質(zhì)的篩選2.1肝素鈉的結(jié)合抑制分析2.1.1肝素鈉對DIG-WSSV的處理-肝素鈉的稀釋在Eppendorf管中將原濃度為0.16g/ml的肝素鈉用dH2O按2倍稀釋的方式稀釋成4個(gè)梯度的肝素鈉。濃度分別為0.08g/ml、0.04g/ml、0.02g/ml、0.01g/ml。
-肝素鈉對DIG-WSSV的處理在四只Eppendorf管中加入300μl0.124μg/μl的DIG-WSSV(以MPBS稀釋)，各取120μl上述肝素鈉濃度梯度與管中的DIG-WSSV混和。肝素鈉在各管中的終濃度依次為32μg/μl、16μg/μl、8μg/μl和4μg/μl。
2.1.2包被將1.0μg/μl BCMP用包被液稀釋后，按1.5μg/100μl/孔的量包被于96孔酶標(biāo)板上，4℃過夜。
2.1.3洗板次日，倒去包被液，用PBST洗板3次，然后是PBS洗3次，1min/次，200μl/孔，在微量振蕩器上進(jìn)行。
2.1.4封閉用MPBS封閉，250μl/孔，室溫(25℃)靜置2h。
2.1.5洗板同2.1.3。
2.1.6肝素鈉的抑制試驗(yàn)-實(shí)驗(yàn)組加入2.1.1中肝素鈉處理過的DIG-WSSV，100μl/孔，室溫靜置孵育2h。
-陽性對照加入相同量的未處理DIG-WSSV。其余方法同實(shí)驗(yàn)組。
-陰性對照加入MPBS。其余方法同實(shí)驗(yàn)組。
2.1.7洗板同2.1.3。
2.1.8加入酶標(biāo)抗體每孔加入100μl用MPBS稀釋到1∶2000Anti-DIG-Fab-HRP(Roche)，室溫作用1h。
2.1.9洗板同2.1.3。
2.1.10顯色加OPD顯色液37℃顯色10min-20min。
2.1.11讀數(shù)用2mol/L的H2SO4終止反應(yīng)。在Tecan SAFIRE酶標(biāo)儀上測定OD492及OD695。
2.1.12結(jié)果用肝素鈉處理后的DIG-WSSV與BCMP結(jié)合結(jié)果如附圖3，肝素鈉處理后DIG-WSSV的結(jié)合活性明顯低于對照組。證明肝素鈉的處理對WSSV和受體的結(jié)合有很大程度的抑制作用。
2.2 PHA-P的結(jié)合抑制分析2.2.1 PHA-P處理用終濃度分別為0.8μg/μl、0.4μg/μl、0.2μg/μl、0.1μg/μl、0.05μg/μl、0.025μg/μl、0.0125μg/μl和0.00625μg/μl的PHA-P(Sigma)室溫將DIG-BCMP處理3h。
2.2.2包被用包被液稀釋W(xué)SSV后按0.8μg/50μl/孔的量4℃包被酶標(biāo)板過夜。
2.2.3洗板同2.1.3。
2.2.4封閉同2.1.4。
2.2.5洗板同2.1.3。
2.2.6抑制實(shí)驗(yàn)
-實(shí)驗(yàn)組每孔加入2.2.1中PHA-P處理的DIG-BCMP，4.56μg/50μg/孔，各梯度的PHA-P各設(shè)3個(gè)平行組。室溫孵育2h。
-陽性對照未經(jīng)PHA-P處理的DIG-BCMP，其余與實(shí)驗(yàn)孔相同。
-陰性對照加MPBS，其余與實(shí)驗(yàn)孔相同。
2.2.7洗板同2.1.3。
2.2.8加入酶標(biāo)抗體同2.1.8。
2.2.9洗板同2.2.3。
2.2.10顯色同2.1.10。
2.2.11讀數(shù)同2.1.11。
2.2.12結(jié)果PHA-P對DIG-BCMP與WSSV結(jié)合抑制作用的結(jié)果如圖4所示，PHA-P在低濃度下處理DIG-BCMP與WSSV結(jié)合活性就有很大程度的降低。說明PHA-P的處理可以抑制BCMP與WSSV的結(jié)合。
2.3 Con A結(jié)合抑制分析2.3.1實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法與2.2部分的基本相同，只是將2.2.1中的PHA-A用Con A(Sigma)代替，其濃度分別為lμg/μl、0.5μg/μl、0.25μg/μl.、……等2倍稀釋的8個(gè)濃度梯度，其余步驟和條件均與2.2中PHA-P的抑制試驗(yàn)方法相同。
2.3.2結(jié)果ConA對DIG-BCMP與WSSV的結(jié)合抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果見附圖5，從圖中可以看出ConA對BCMP與WSSV的結(jié)合有抑制作用。
3.實(shí)施例三感染實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證肝素鈉對WSSV處理后的抗感染效果3.1實(shí)驗(yàn)用蝦及分組3.1.1凡納濱對蝦由青島膠南養(yǎng)殖場提供，9-12cm，平均14.8g/尾。
3.1.2實(shí)驗(yàn)用蝦在實(shí)驗(yàn)室充氣暫養(yǎng)3d穩(wěn)定后，選健康活潑者分兩個(gè)組，P組為WSSV感染組，作感染對照，H組為肝素鈉實(shí)驗(yàn)組，12尾/組。
3.2毒種處理3.2.1取受WSSV感染患病的對蝦頭胸部(去除肝胰腺)病料20g，加入2％NaCl，冰浴勻漿。
3.2.2勻漿液在4℃ 4,500×g離心20min，沉淀重復(fù)處理3次。
3.3.3合并上清，用2％NaCl將WSSV粗提液的組織濃度調(diào)整為2％。
3.3實(shí)驗(yàn)方法3.3.1 P組(感染對照組)將2％組織濃度的毒種液用2％NaCl稀釋10倍，成為0.2％的組織濃度，室溫處理3h，然后從對蝦第二至第三腹節(jié)處注射感染，0.1ml/尾。
3.3.2 H組(肝素鈉實(shí)驗(yàn)組)將2％組織濃度毒種液用含80μg/μl肝素鈉的2％NaCl稀釋10倍，成為0.2％的組織濃度，室溫處理3h，然后從對蝦第二至第三腹節(jié)處注射感染，0.1ml/尾。
3.4實(shí)驗(yàn)的結(jié)果檢測和評估3.4.1發(fā)病記錄感染后每天進(jìn)行換水，充氣飼養(yǎng)，觀察對蝦發(fā)病和死亡情況，對死蝦數(shù)量進(jìn)行記錄，取死亡的蝦鰓組織0.03g用于WSSV檢測。
3.4.2斑點(diǎn)雜交檢測病毒感染情況按本實(shí)驗(yàn)室的對蝦暴發(fā)性流行病病原核酸探針點(diǎn)雜交檢測試劑盒進(jìn)行。
3.5結(jié)果3.5.1感染試驗(yàn)結(jié)果感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果見附圖6，通過感染實(shí)驗(yàn)蝦的存活情況及斑點(diǎn)雜交檢測死亡蝦WSSV感染的情況，結(jié)果顯示肝素鈉處理毒種后注射感染的實(shí)驗(yàn)組對蝦半數(shù)存活時(shí)間較感染對照組延長了2d，前者半數(shù)存活時(shí)間是后者的1.44倍，存活率也得到提高。
3.5.2斑點(diǎn)雜交對WSSV的檢測通過斑點(diǎn)雜交方法對死亡對蝦的WSSV檢測，結(jié)果說明，H組感染后5d-7d死亡的部分對蝦并不是由于WSSV感染所致，而對照組P在注射后4d開始出現(xiàn)死亡，經(jīng)檢測所有死蝦全部為病毒感染所致，這說明肝素鈉對WSSV感染的抑制能力可能比附圖6中存活率反映出的效果更強(qiáng)。
3.5.3討論注射感染為一種很激烈的感染方式，WSSV采用這種方式感染對蝦時(shí)，其致死力極強(qiáng)，在這種感染方式上肝素鈉能使病毒感染后對蝦的存活時(shí)間顯著延遲，證明肝素鈉對WSSV的感染活性有明顯的抑制作用。說明本發(fā)明采用結(jié)合抑制篩選到的肝素鈉、植物血球凝集素和伴刀豆球蛋白可以作為WSSV受體阻斷劑，將在對蝦白斑病的防治中得到應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.控制對蝦病毒感染的受體阻斷劑的一種篩選方法，其特征在于對病毒與對蝦細(xì)胞膜蛋白的結(jié)合有阻斷作用的物質(zhì)的篩選。
2.根據(jù)權(quán)利要求1，其特征是分析待篩選物的處理對病毒與對蝦細(xì)胞膜蛋白之間的結(jié)合作用的影響。
3.根據(jù)權(quán)利要求2，其特征是采用一種標(biāo)記物標(biāo)記參與結(jié)合的病毒(或?qū)ξr細(xì)胞膜蛋白)，然后與固相支持物上附著的對蝦細(xì)胞膜蛋白(或病毒)進(jìn)行結(jié)合分析。
4.根據(jù)權(quán)利要求3，其特征在于標(biāo)記物與病毒(或?qū)ξr細(xì)胞膜蛋白)的連接是一種共價(jià)鍵化學(xué)反應(yīng)，可采用現(xiàn)有的多種蛋白質(zhì)標(biāo)記技術(shù)，如地高辛、生物素或熒光素蛋白標(biāo)記物等，標(biāo)記物的檢測可采用與相應(yīng)標(biāo)記物具有特異性親和作用的抗體或親和素偶聯(lián)的酶催化反應(yīng)進(jìn)行。
5.根據(jù)權(quán)利要求3，其特征在于固相支持物可采用現(xiàn)有的多種常用技術(shù)，如聚苯乙烯酶標(biāo)板、硝酸纖維素濾膜、聚砜膜、活化的載波片等，這種附著可以是共價(jià)的或非共價(jià)的。在加入標(biāo)記的病毒(或?qū)ξr細(xì)胞膜蛋白)進(jìn)行結(jié)合孵育之前，需要用一種與病毒(或?qū)ξr細(xì)胞膜蛋白)不發(fā)生作用的物質(zhì)，如脫脂奶粉溶液，將固相支持物上的游離位點(diǎn)封閉。
6.根據(jù)權(quán)利要求3，標(biāo)記的病毒(或?qū)ξr細(xì)胞膜蛋白)與在固相支持物上包被的對蝦細(xì)胞膜蛋白(或病毒)進(jìn)行孵育后，加入抗標(biāo)記物的抗體的酶標(biāo)偶聯(lián)物，最后通過抗體上偶聯(lián)的酶對顯色液中的底物進(jìn)行催化顯色，顯色信號的強(qiáng)弱反映了結(jié)合活性強(qiáng)度。
7.根據(jù)權(quán)利要求2，其特征在于待篩選物質(zhì)與標(biāo)記的病毒或?qū)ξr細(xì)胞膜蛋白在常溫下進(jìn)行簡單的混合孵育，再分析結(jié)合活性，最終的顯色能反映待篩選物對病毒與對蝦細(xì)胞膜結(jié)合活性的抑制效果。
8.根據(jù)權(quán)利要求1，其特征在于采用該技術(shù)，篩選到肝素鈉、植物血球凝集素(PHA-P)及伴刀豆球蛋白(Con A)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8，其特征是肝素鈉、PHA-P和Con A對白斑綜合癥病毒與對蝦鰓細(xì)胞膜蛋白的結(jié)合具有明顯的阻斷作用，這種阻斷作用可以反映在機(jī)體水平上的感染抑制，從而應(yīng)用于控制白斑綜合癥病毒感染。
10.根據(jù)權(quán)利要求8，肝素鈉為一類糖胺聚糖復(fù)合物的鈉鹽及其它可溶性的肝素鹽，主要來源為豬、牛、羊等動(dòng)物腸粘膜、肺、肝臟等器官。
11.根據(jù)權(quán)利要求8，植物血球凝集素(英文名稱為phytohemagglutininP，簡寫為PHA-P)是一種植物蛋白，主要來源于菜豆、豌豆、蓖麻、云豆、大豆、蠶豆及花生等豆類植物。
12.根據(jù)權(quán)利要求8，伴刀豆球蛋白(英文名稱為Concanavalin，簡寫為Con A)是一種植物蛋白，主要來源于豆類植物。
13.根據(jù)權(quán)利要求9、10、11和12，也可為含有肝素鈉、植物血球凝集素和伴刀豆球蛋白的原料或粗提物，作為病毒感染的受體阻斷劑，應(yīng)用于對蝦及其它水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的白斑綜合癥病毒感染控制。
14.根據(jù)權(quán)利要求9，肝素鈉的結(jié)合阻斷作用的篩選方法，用0.015μg/μl-32μg/μl肝素鈉處理0.086μg/μl標(biāo)記的白斑綜合癥病毒后與酶標(biāo)板上包被的0.015μg/μl對蝦鰓細(xì)胞膜蛋白進(jìn)行結(jié)合分析。
15.根據(jù)權(quán)利要求14，其特征在于隨肝素鈉濃度提高，結(jié)合活性顯著降低。
16.根據(jù)權(quán)利要求9，其特征在于肝素鈉抗白斑綜合癥病毒感染能力通過機(jī)體水平的感染實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，感染實(shí)驗(yàn)的方法為200μg/μl以內(nèi)肝素鈉處理白斑綜合癥病毒粗提液后直接注射感染健康凡納濱對蝦；同時(shí)設(shè)立不用肝素鈉處理的白斑綜合癥病毒粗提液感染對照組。
17.根據(jù)權(quán)利要求16，其特征在于肝素鈉對白斑綜合癥病毒粗提液進(jìn)行處理后感染的實(shí)驗(yàn)組相對于白斑綜合癥病毒粗提液感染對照組表現(xiàn)為存活時(shí)間延長，死亡率下降。
18.根據(jù)權(quán)利要求9，其特征在于PHA-P的結(jié)合抑制作用的篩選方法為0.006μg/μl-0.1μg/μlPHA-P對0.047μg/μl標(biāo)記對蝦鰓細(xì)胞膜蛋白處理后與酶標(biāo)板上包被的0008μg/μl白斑綜合癥病毒進(jìn)行結(jié)合分析，PHA-P處理后能顯著抑制對蝦鰓細(xì)胞膜與白斑綜合癥病毒之間的結(jié)合。
19.根據(jù)權(quán)利要求9，其特征在于Con A的結(jié)合抑制作用的篩選方法為0.008μg/μl-1.0μg/μl Con A對0.047μg/μl標(biāo)記對蝦鰓細(xì)胞膜蛋白處理后與酶標(biāo)板上包被的0.008μg/μl白斑綜合癥病毒進(jìn)行結(jié)合分析，ConA處理后均能對蝦鰓細(xì)胞膜與白斑綜合癥病毒之間的結(jié)合。
全文摘要
一種控制對蝦病毒感染的受體阻斷劑的篩選方法，它是用病毒與對蝦細(xì)胞膜蛋白之間的結(jié)合分析技術(shù)進(jìn)行病毒受體結(jié)合阻斷劑的篩選過程，通過比較待篩選物處理對病毒與對蝦細(xì)胞膜蛋白的結(jié)合作用的影響完成篩選。篩選到三種物質(zhì)對白斑綜合癥病毒與對蝦鰓細(xì)胞膜結(jié)合有阻斷作用。該方法針對病毒與對蝦細(xì)胞膜蛋白結(jié)合作用，可切斷病毒最初的入侵過程，是一全新的對蝦病毒病防治技術(shù)概念，具有快速、高通量、簡便、標(biāo)準(zhǔn)化和可重復(fù)性的優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于控制對蝦白斑綜合癥病毒感染。
文檔編號A61K31/726GK1629309SQ20041002458
公開日2005年6月22日 申請日期2004年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月24日
發(fā)明者黃倢, 陸春玲, 梁艷, 宋曉玲, 解飛霞, 易志剛, 劉慶慧, 楊冰, 劉莉 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所