專利名稱：人類肝癌相關(guān)基因及其編碼蛋白的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及人類肝癌相關(guān)基因LLC2(Low expression in Liver Cancer 2)、LLC3(Low expression inLiver Cancer 3)、LLC4(Low expression in Liver Cancer 4)及其編碼蛋白的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前我國(guó)有慢性肝炎患者約1200萬例，每年死于肝病約30萬，其50％為原發(fā)性肝癌，約占全世界肝癌死亡人數(shù)的45％左右。絕大多數(shù)與HBV、HCV感染有關(guān)。肝癌發(fā)病率在我國(guó)居2-3位，主要在青壯年男性發(fā)病，在華東地區(qū)的發(fā)病率明顯高于其他地區(qū)，近年來，有持續(xù)上升趨勢(shì)。在上海，肝癌的發(fā)病率居第三位，僅次于肺癌和胃癌。最新資料顯示這個(gè)比例還有繼續(xù)上升的趨勢(shì)?，F(xiàn)在，肝癌，特別是肝炎病毒引起的肝癌已經(jīng)嚴(yán)重危害了我國(guó)人民生命安全。因此，非常有必要對(duì)肝癌發(fā)生的分子機(jī)制作深入的研究。
隨著人類基因組測(cè)序的完成，基因組學(xué)的研究重點(diǎn)已經(jīng)轉(zhuǎn)移到以解析基因功能為主的功能基因組學(xué)研究。功能基因組學(xué)的重點(diǎn)是以疾病為中心，全力解決人類疾病相關(guān)基因研究中的重大科學(xué)問題。肝癌在我國(guó)素有“國(guó)病”之稱，經(jīng)過半個(gè)世紀(jì)的探索，對(duì)于肝癌的早期診斷和治療雖然有了一定的認(rèn)識(shí)，但肝癌預(yù)后仍然很差，特別是對(duì)其發(fā)病機(jī)制的了解及治療藥物的新靶點(diǎn)方面，更是知之甚少。因此，尋找與腫瘤相關(guān)的基因，特別是尋找新的抑癌基因是近年來腫瘤研究的熱點(diǎn)。
本發(fā)明人利用比較基因組學(xué)的方法篩選到的LLC2基因定位于染色體的雜合子擴(kuò)增區(qū)8q24.13上。LLC2基因被預(yù)測(cè)可能編碼DNA甲基化酶，與DNA的復(fù)制，重組，修復(fù)有關(guān)。
DNA甲基化和基因的表達(dá)有密切的關(guān)系，DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的修飾途徑之一，可能存在于所有高等生物中。DNA甲基化能關(guān)閉某些基因的活性，去甲基化則誘導(dǎo)了基因的重新活化和表達(dá)。
DNA甲基化的主要形式5-甲基胞嘧啶，N6-甲基腺嘌呤和7-甲基鳥嘌呤。在真核生物中，5-甲基胞嘧啶主要出現(xiàn)在CpG和CpXpG中，原核生物中CCA/TGG和GATC也常被甲基化。
甲基化會(huì)抑制基因轉(zhuǎn)錄。甲基化導(dǎo)致某些區(qū)域DNA構(gòu)象變化，從而影響了蛋白質(zhì)與DNA的相互作用，抑制了轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)區(qū)DNA的結(jié)合效率。對(duì)弱啟動(dòng)子來說，少量甲基化就能使其完全失去轉(zhuǎn)錄活性。當(dāng)這類啟動(dòng)子被增強(qiáng)時(shí)，即使不去甲基化也可以恢復(fù)其轉(zhuǎn)錄活性。甲基化密度較高時(shí)，即使增強(qiáng)后的啟動(dòng)子仍無轉(zhuǎn)錄活性。因?yàn)榧谆瘜?duì)轉(zhuǎn)錄的抑制強(qiáng)度與MeCP1(methylCpG-bindingproteinl)結(jié)合DNA的能力成正相關(guān)，甲基化CpG的密度和啟動(dòng)子強(qiáng)度之間的平衡決定了該啟動(dòng)子是否具有轉(zhuǎn)錄活性。DNA甲基化對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的抑制直接參與了發(fā)育調(diào)控。隨著個(gè)體發(fā)育，當(dāng)需要某些基因保持″沉默″時(shí)，它們將迅速被甲基化，若需要恢復(fù)轉(zhuǎn)錄活性，則去甲基化。DNA甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄的直接機(jī)制某些轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含有CpG序列，甲基化以后直接影響了蛋白質(zhì)因子的結(jié)合活性，不能起始基因轉(zhuǎn)錄。甲基化抑制轉(zhuǎn)錄的間接機(jī)制CpG甲基化，通過改變?nèi)旧|(zhì)的構(gòu)象或者通過與甲基化CpG結(jié)合的蛋白因子間接影響轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合。
因此，我們可以知道，DNA甲基化的作用對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控的重要性，LLC2基因結(jié)構(gòu)中含有了甲基化酶的結(jié)構(gòu)，在本發(fā)明人的研究當(dāng)中，LLC2基因在癌旁/肝癌組織里的表達(dá)確實(shí)有差異，呈明顯的上調(diào)趨勢(shì)。因此我們認(rèn)為L(zhǎng)LC2基因很有可能通過甲基化作用對(duì)肝癌的發(fā)生產(chǎn)生影響。
本發(fā)明人利用比較基因組學(xué)的方法篩選到的LLC3基因定位于染色體的雜合子擴(kuò)增區(qū)8q24.13上。其DNA拷貝數(shù)在肝癌基因組中有明顯變化，該基因在超過50％的肝癌組織中呈現(xiàn)差異表達(dá)，在肝癌中表達(dá)豐度明顯升高，同時(shí)其在人體內(nèi)多種組織均有表達(dá)。LLC3基因的結(jié)構(gòu)主要編碼了一個(gè)DNA修復(fù)蛋白，可能參與了DNA的復(fù)制，重組，修復(fù)有關(guān)。DNA存儲(chǔ)這生物體賴以生存和繁衍的遺傳信息，因此維護(hù)DNA分子的完整性對(duì)細(xì)胞至關(guān)重要。外界環(huán)境和生物體內(nèi)的因素都經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致DNA分子的損傷或改變，而且與RNA及蛋白質(zhì)可以在包內(nèi)大量的合成，一般在一個(gè)原核細(xì)胞中只有一份DNA，在真核二倍體細(xì)胞中相同的DNA也只有一堆，如果DNA的損傷或遺傳信息的改變不能更正，對(duì)體細(xì)胞就可能影響其功能或生存，對(duì)生殖細(xì)胞則可能影響到下一代。所以在進(jìn)化過程中生物細(xì)胞所獲得的修復(fù)DNA損傷的能力就顯得十分重要也是生物能保持遺傳穩(wěn)定性之所在。在細(xì)胞中能進(jìn)行修復(fù)的生物大分子也只有DNA，反映了DNA對(duì)生命的重要性。另一方面，在生物進(jìn)化中突變優(yōu)勢(shì)與遺傳象對(duì)立統(tǒng)一而普遍存在的現(xiàn)象，DNA分子的變化并不是全部都能被修復(fù)成原樣的，正因?yàn)槿绱松锊艜?huì)有變異，有進(jìn)化。
本發(fā)明人利用比較基因組學(xué)的方法篩選到的LLC4基因定位于染色體的雜合子擴(kuò)增區(qū)8q24.13上。其DNA拷貝數(shù)在肝癌基因組中有明顯變化，該基因在超過50％的肝癌組織中呈現(xiàn)差異表達(dá)，在肝癌中表達(dá)豐度明顯升高，同時(shí)其在人體內(nèi)多種組織均有表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種肝癌相關(guān)基因LLC2、LLC3、LLC4及它們的編碼的蛋白的應(yīng)用。
本發(fā)明的上述目的是通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明提供了一種蛋白多肽在制備治療原發(fā)性肝癌的藥物中的應(yīng)用，所述蛋白多肽具有與SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4及SEQ ID NO.6中所示任一種氨基酸序列至少70％同源性的序列。優(yōu)選的，所述的蛋白多肽是含有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4及SEQ ID NO.6中任一序列的多肽。
本發(fā)明還提供了一種多核苷酸序列在制備治療原發(fā)性肝癌的藥物中的應(yīng)用，所述的多核苷酸是具有SEQ ID NO1、SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.5中所示的任一編碼序列；或者與SEQ ID NO1中的110-1456位核苷酸序列、SEQ ID NO3中的228-971位核苷酸序列及SEQ ID NO5中的32-1174位核苷酸序列中任一序列具有至少70％同源性的序列；或者在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO1、SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.5中所示的任一序列雜交的序列。
優(yōu)選的，所述的多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2、SEQ ID NO.4及SEQ ID NO.6中所示的任一氨基酸序列的多肽。
本發(fā)明還提供了一種用于診斷和治療肝癌的試劑盒，所述試劑盒含有下列(I)-(V)中任一所示的序列或者它們的連續(xù)片段，(I)SEQ ID NO1、SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.5中任一所示的編碼序列；(II)與SEQ ID NO1中的110-1456位核苷酸序列、SEQ ID NO3中的228-971位核苷酸序列及SEQ ID NO5中的32-1174位核苷酸序列中任一序列具有至少70％同源性的序列；
(III)在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO1、SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.5中所示的任一序列雜交的序列；(IV)具有與SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4及SEQ ID NO.6中所示任一種氨基酸序列至少70％同源性的序列；(V)含有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4及SEQ ID NO.6中任一序列的多肽。
在本發(fā)明的再一方面，還提供了一種用于診斷和治療肝癌的生物芯片，所述生物芯片的載體上含有下列(i)-(v)的序列或者它們的連續(xù)片段，(i)SEQ ID NO1、SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.5中任一所示的編碼序列；(ii)與SEQ ID NO1中的110-1456位核苷酸序列、SEQ ID NO3中的228-971位核苷酸序列及SEQ ID NO5中的32-1174位核苷酸序列中任一序列具有至少70％同源性的序列；(iii)在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO1、SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.5中所示的任一序列雜交的序列；(iv)具有與SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4及SEQ ID NO.6中所示任一種氨基酸序列至少70％同源性的序列；(v)含有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4及SEQ ID NO.6中任一序列的多肽。
根據(jù)本發(fā)明公開的人類肝癌相關(guān)基因LLC2、LLC3、LLC4及它們的編碼蛋白的應(yīng)用，對(duì)其進(jìn)行深入的研究有可能發(fā)現(xiàn)肝癌發(fā)病的新機(jī)制，同時(shí)，這些基因也可能作為肝癌治療的新的靶點(diǎn)，并且可為進(jìn)一步開發(fā)后續(xù)診治肝癌的藥物提供重要的參考價(jià)值。


圖1是LLC2基因表達(dá)產(chǎn)物在人、鼠、兔和線蟲中的同源比對(duì)，結(jié)果顯示LLC2基因在物種之間具有保守性；
圖2是LLC3基因表達(dá)產(chǎn)物在人、鼠劑果蠅中的同源比對(duì)，結(jié)果顯示LLC3基因在物種之間具有保守性；圖3是LLC4基因表達(dá)產(chǎn)物在人、鼠及線蟲中的同源比對(duì)結(jié)果圖，結(jié)果顯示LLC4基因在物種之間具有保守性；圖4是通過RT-PCR驗(yàn)證LLC2基因在肝癌/癌旁組織中的表達(dá)差異的電泳結(jié)果圖，N為癌旁組織，C為癌組織；圖5是圖4的電泳結(jié)果圖的灰度掃描的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，由該圖可以清晰地看出，有9對(duì)標(biāo)本中為有和無的關(guān)系；圖6是通過RT-PCR驗(yàn)證LLC3基因在肝癌/癌旁組織中的表達(dá)差異的電泳結(jié)果圖，N為癌旁組織，C為癌組織；圖7是圖6的電泳結(jié)果圖的灰度掃描的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，由該圖可以清晰地看出，有8對(duì)標(biāo)本中為有和無的關(guān)系；圖8是通過RT-PCR驗(yàn)證LLC4基因在肝癌/癌旁組織中的表達(dá)差異的電泳結(jié)果圖，N為癌旁組織，C為癌組織；圖9是圖8的電泳結(jié)果圖的灰度掃描的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，由該圖可以清晰地看出，有11對(duì)標(biāo)本中為有和無的關(guān)系；圖10為PCR分析LLC2基因在人的各組織中的分布的RT-PCR電泳結(jié)果圖；圖11為圖10的電泳結(jié)果圖的灰度掃描的統(tǒng)計(jì)結(jié)果；圖12為PCR分析LLC3基因在人的各組織中的分布的RT-PCR電泳結(jié)果圖；圖13為圖12的電泳結(jié)果圖的灰度掃描的統(tǒng)計(jì)結(jié)果；圖14為PCR分析LLC4基因在人的各組織中的分布的RT-PCR電泳結(jié)果圖；圖15為圖14的電泳結(jié)果圖的灰度掃描的統(tǒng)計(jì)結(jié)果；圖16為5種肝癌細(xì)胞株中LLC2基因表達(dá)豐度圖；
圖17為5種肝癌細(xì)胞株中LLC3基因表達(dá)豐度圖；圖18為5種肝癌細(xì)胞株中LLC4基因表達(dá)豐度圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1肝組織RNA的抽提抽提RNA試劑采用TRIzol reagent(GIBCO/BRL)，該試劑是基于酸性酚一步抽提法生產(chǎn)的。用于抽提RNA所用的器皿和水均要進(jìn)行無RNA酶處理，以保證實(shí)驗(yàn)中無RNA酶的環(huán)境。
將碾杵和勻漿器等器皿在200℃干烤4h，去除RNA酶，冷卻；加入液氮中預(yù)冷，將組織從液氮中迅速取出，碾成粉末；用刮匙將組織放入預(yù)先加入TRIzol試劑的勻漿器中，勻漿數(shù)分鐘；將勻漿后的液體轉(zhuǎn)入無RNA酶的離心管中，加入氯仿后，4℃離心分層；將上層水相轉(zhuǎn)入一無RNA酶的離心管中，加異丙醇，4℃離心沉淀RNA；用75％乙醇洗滌沉淀2次；用無RNA酶的去離子水溶解沉淀。抽提的RNA質(zhì)量鑒定紫外分光光度計(jì)測(cè)定260/280比值(比值均在1.7～2.0)；并在MOPS甲醛變性膠中觀察有無降解。
超低溫保存。
實(shí)施例2cDNA的合成反轉(zhuǎn)錄(RT)總RNA 1μgoligo dT(10pmol/l) 1μlH2O補(bǔ)至12μl70℃變性3分鐘，置于冰上冷卻；再加入 5×Buffer 4μlDTT 2μldNTP1μlSuperScript II 1μl42℃反應(yīng)1小時(shí)，70℃變性15分鐘，置于冰上冷卻。
實(shí)施例3LLC2的PCR擴(kuò)增以β-actin作內(nèi)對(duì)照，反應(yīng)混合物中各成分為β-actin(F)、β-actin(R)、LLC2(F)、LLC2(R)、10×Buffer、MgCl2、dNTP、Taq DNA聚合酶、cDNA模板分別為0.2、0.2、0.4、0.4、1.0、1.0、0.2、0.1和5μLcDNA模板，最后補(bǔ)充ddH2O使反應(yīng)體系為10μL。PCR的反應(yīng)條件是94℃變性5min；然后每個(gè)循環(huán)94℃ 30s、53℃ 30s、72℃ 30s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7min。
其中，β-actin(F)和β-actin(R)分別為引物5’-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’(SEQ ID NO.7)，和引物5’-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3’(SEQ ID NO.8)。
LLC2(F)和LLC2(R)分別為引物5’-AGGCTCTTGGAGTCAGCAAA-3’(SEQ IDNO.9)，和引物5’-TGGGGAGCATAGGATTTCAC-3’(SEQ ID NO.10)實(shí)施例4
LLC3的PCR擴(kuò)增以β-actin作內(nèi)對(duì)照，反應(yīng)混合物中各成分為β-actin(F)、β-actin(R)、LLC3(F)、LLC3(R)、10×Buffer、MgCl2、dNTP、Taq DNA聚合酶、cDNA模板分別為0.2、0.2、0.4、0.4、1.0、1.0、0.2、0.1和5μLcDNA模板，最后補(bǔ)充ddH2O使反應(yīng)體系為10μL。PCR的反應(yīng)條件是94℃變性5min；然后每個(gè)循環(huán)94℃ 30s、53℃ 30s、72℃ 30s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7min。
其中，β-actin(F)和β-actin(R)分別為引物5’-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’(SEQ ID NO.7)，和引物5’-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3’(SEQ ID NO.8)。
LLC3(F)和LLC3(R)分別為引物5’-GGCCACACCTATGAAGAGGA-3’(SEQ IDNO.11)，和引物5’-AACAGACAGCTGGGGTAGGA-3’(SEQ ID NO.12)實(shí)施例5LLC4的PCR擴(kuò)增以β-actin作內(nèi)對(duì)照，反應(yīng)混合物中各成分為β-actin(F)、β-actin(R)、LLC4(F)、LLC4(R)、10×Buffer、MgCl2、dNTP、Taq DNA聚合酶、cDNA模板分別為0.2、0.2、0.4、0.4、1.0、1.0、0.2、0.1和5μLcDNA模板，最后補(bǔ)充ddH2O使反應(yīng)體系為10μL。PCR的反應(yīng)條件是94℃變性5min；然后每個(gè)循環(huán)94℃ 30s、53℃ 30s、72℃ 30s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7min。
其中，β-actin(F)和β-actin(R)分別為引物5’-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’(SEQ ID NO.7)，和引物5’-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3’(SEQ ID NO.8)。
LLC4(F)和LLC4(R)分別為引物5’-GCTGAAAGCATGTGCCTCTT-3’(SEQ IDNO.13)，和引物5’-GCTACGGAGCCAACACACTT-3’(SEQ ID NO.14)
實(shí)施例6生物信息學(xué)分析LLC2基因生物信息學(xué)分析該基因mRNA全長(zhǎng)為2061bp，定位于染色體的雜合子擴(kuò)增區(qū)8q24.13上，含有3個(gè)外顯子，1個(gè)內(nèi)含子，其開放閱讀框架長(zhǎng)為1346bp，編碼了一個(gè)含有448個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。它的蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)是Pi＝8.21，其相對(duì)分子量是50175.5。
生物信息學(xué)核酸序列同源比對(duì)分析，顯示其與鼠類，兔子及線蟲均有同源區(qū)域，如圖1所示。蛋白質(zhì)同源分析還發(fā)現(xiàn)在這個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)很可能是一個(gè)甲基化酶，甲基化酶的作用一般是可能對(duì)某些基因其到修飾作用，從而影響到該基因的表達(dá)調(diào)控。所以對(duì)該基因的功能研究有很好的幫助。
實(shí)施例7生物信息學(xué)分析LLC3基因生物信息學(xué)分析該基因mRNA全長(zhǎng)為1258bp，定位于染色體的雜合子擴(kuò)增區(qū)8q24.13上，含有10個(gè)外顯子，9個(gè)內(nèi)含子，其開放閱讀框架長(zhǎng)為743bp，編碼了一個(gè)含有247個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。它的蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)是Pi＝7.62，其相對(duì)分子量是27932.5。
生物信息學(xué)核酸序列同源比對(duì)分析，顯示其與鼠類及果蠅均有同源區(qū)域，如圖2所示。蛋白質(zhì)同源分析還發(fā)現(xiàn)在這個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)很可能是一個(gè)DNA修復(fù)蛋白，可能參與了DNA的復(fù)制，重組，修復(fù)有關(guān)。
實(shí)施例8生物信息學(xué)分析LLC4基因生物信息學(xué)分析該基因mRNA全長(zhǎng)為1286bp，定位于染色體的雜合子擴(kuò)增區(qū)8q24.13上，含有8個(gè)外顯子，7個(gè)內(nèi)含子，其開放閱讀框架長(zhǎng)為1142bp，編碼了一個(gè)含有380個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。它的蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)是Pi＝5.31，其相對(duì)分子量是43273.09。
生物信息學(xué)核酸序列同源比對(duì)分析，顯示于鼠、兔及線蟲均有同源區(qū)域。蛋白質(zhì)同源分析發(fā)現(xiàn)LLC4基因結(jié)構(gòu)編碼了保守蛋白質(zhì)，如圖3所示。
實(shí)施例9LLC2基因在肝癌及其癌旁組織中的表達(dá)利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)LLC2基因在24對(duì)肝癌/癌旁組織中的表達(dá)，24例肝癌及癌旁組織均為HBV陽性的原發(fā)性肝癌的手術(shù)病人。手術(shù)切除的肝臟一經(jīng)離體，迅速切取病灶及周圍正常組織，放入液氮中(-80℃)保存。發(fā)現(xiàn)肝癌組織LLC2的表達(dá)明顯高于癌旁組織，其中有14對(duì)上調(diào)，所占比率高達(dá)58.3％(p＜0.01)。其中有9對(duì)接近有和無的關(guān)系。結(jié)果見圖4和圖5。
實(shí)施例10LLC3基因在肝癌及其癌旁組織中的表達(dá)利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)LLC3基因在24對(duì)肝癌/癌旁組織中的表達(dá)，24例肝癌及癌旁組織均為HBV陽性的原發(fā)性肝癌的手術(shù)病人。手術(shù)切除的肝臟一經(jīng)離體，迅速切取病灶及周圍正常組織，放入液氮中(-80℃)保存。發(fā)現(xiàn)肝癌組織LLC3的表達(dá)明顯高于癌旁組織，其中有14對(duì)上調(diào)，所占比率高達(dá)58.3％(p＜0.01)。其中有8對(duì)接近有和無的關(guān)系。結(jié)果見圖6和圖7。
實(shí)施例11LLC4基因在肝癌及其癌旁組織中的表達(dá)利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)LLC4基因在24對(duì)肝癌/癌旁組織中的表達(dá)，24例肝癌及癌旁組織均為HBV陽性的原發(fā)性肝癌的手術(shù)病人。手術(shù)切除的肝臟一經(jīng)離體，迅速切取病灶及周圍正常組織，放入液氮中(-80℃)保存。發(fā)現(xiàn)肝癌組織LLC4的表達(dá)明顯高于癌旁組織，其中有14對(duì)上調(diào)，所占比率高達(dá)58.3％(p＜0.01)。其中有11對(duì)接近有和無的關(guān)系。結(jié)果見圖8和圖9。
實(shí)施例12LLC2基因在人體正常組織中的表達(dá)為了解LLC2基因在人體各組織中的表達(dá)。分別提取人的各組織的總RNA，包括脾、心，腦，小腸，胰臟，肌肉，肺，睪丸，腎，肝組織。以上述引物，RT-PCR檢測(cè)LLC2基因在人各組織中的表達(dá)。由圖可以看出在各組織中呈廣泛表達(dá)的趨勢(shì)，但肌肉的表達(dá)量最高。結(jié)果見圖10和圖11。
實(shí)施例13LLC3基因在人體正常組織中的表達(dá)為了解LLC3基因在人體各組織中的表達(dá)。分別提取人的各組織的總RNA，包括脾、心，腦，小腸，胰臟，肌肉，肺，睪丸，腎，肝組織。以上述引物，RT-PCR檢測(cè)LLC3基因在人各組織中的表達(dá)。由圖可以看出在各組織中呈廣泛表達(dá)的趨勢(shì)，但肌肉的表達(dá)量最高。結(jié)果見圖12和圖13。
實(shí)施例14LLC4基因在人體正常組織中的表達(dá)為了解LLC4基因在人體各組織中的表達(dá)。分別提取人的各組織的總RNA，包括脾、心，腦，小腸，胰臟，肌肉，肺，睪丸，腎，肝組織。以上述引物，RT-PCR檢測(cè)LLC4基因在人各組織中的表達(dá)。由圖可以看出在各組織中呈廣泛表達(dá)的趨勢(shì)，但胰和肌肉的表達(dá)量最高。結(jié)果見圖14和圖15。
實(shí)施例15不同肝癌細(xì)胞株中LLC2基因的表達(dá)以5種肝癌細(xì)胞株(PLC，QGY-7703，Bel-7402，HepG2和Hep3B)的RNA為模板，用同樣的引物進(jìn)行RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)PCL中LLC2基因表達(dá)豐度最高、Bel-7402，HepG2，Hep3B次之、QGY-Q7703最弱。結(jié)果見圖16。
實(shí)施例16不同肝癌細(xì)胞株中LLC3基因的表達(dá)以5種肝癌細(xì)胞株(PLC，QGY-7703，Bel-7402，HepG2和Hep3B)的RNA為模板，用同樣的引物進(jìn)行RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)QGY-7703，Bel-7402及Hep3B中LLC3基因的表達(dá)量都較高。結(jié)果見圖17。
實(shí)施例17不同肝癌細(xì)胞株中LLC4基因的表達(dá)以5種肝癌細(xì)胞株(PLC，QGY-7703，Bel-7402，HepG2和Hep3B)的RNA為模板，用同樣的引物進(jìn)行RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)LLC4基因在QGY-7703，Bel-7402及HepG2中的表達(dá)依次降低。結(jié)果見圖18。
序列表<110>上海人類基因組研究中心<120>人類肝癌相關(guān)基因及其編碼蛋白的應(yīng)用<130>NP-1303<160>14<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>2061<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(110)..(1456)<400>1attttccggc accggcatgg ccgggtgagc tgcaggctac cttatttaag accgggaatt60tagtcagcct ggtgagccga ctctgaggag atggagtatc gctgaggtg atg aga gag118Met Arg Glu1aat gtg gtt gtt agc aac atg gag aga gaa agt ggg aag ccc gtg gct 166Asn Val Val Val Ser Asn Met Glu Arg Glu Ser Gly Lys Pro Val Ala5 10 15gtt gtc gca gtt gtg act gag cct tgg ttt acc cag cga tac aga gaa 214Val Val Ala Val Val Thr Glu Pro Trp Phe Thr Gln Arg Tyr Arg Glu20 25 30 35tat ctc cag agg cag aaa ctc ttt gat aca cag cac cgt gtg gaa aag 262Tyr Leu Gln Arg Gln Lys Leu Phe Asp Thr Gln His Arg Val Glu Lys40 45 50atg ccg gat ggc tcg gtg gcg cta ccg gtg ctg gga gag acg ctt cca 310Met Pro Asp Gly Ser Val Ala Leu Pro Val Leu Gly Glu Thr Leu Pro55 60 65
gag cag cac ctg cag gag ctg agg aat cgt gtt gcc cca ggc agt ccc358Glu Gln His Leu Gln Glu Leu Arg Asn Arg Val Ala Pro Gly Ser Pro70 75 80tgt atg ctc acg cag ctc ccg gat cct gtt cct tcg aag agg gcc cag406Cys Met Leu Thr Gln Leu Pro Asp Pro Val Pro Ser Lys Arg Ala Gln85 90 95ggt tgt tca cct gcc caa aaa ttg tgt ctt gag gtg agt cgc tgg gtg454Gly Cys Ser Pro Ala Gln Lys Leu Cys Leu Glu Val Ser Arg Trp Val100 105 110 115gag ggt cgg gga gtc aag tgg tca gcc gag ttg gag gct gat ttg ccc502Glu Gly Arg Gly Val Lys Trp Ser Ala Glu Leu Glu Ala Asp Leu Pro120 125 130cga tca tgg caa cgg cat ggt aat ctc ttg ttg ctg agt gaa gac tgt550Arg Ser Trp Gln Arg His Gly Asn Leu Leu Leu Leu Ser Glu Asp Cys135 140 145ttc caa gcc aag cag tgg aaa aat ctg gga ccg gaa ctc tgg gag acc598Phe Gln Ala Lys Gln Trp Lys Asn Leu Gly Pro Glu Leu Trp Glu Thr150 155 160gtt gcc ttg gca ctt ggc gtc cag cgt ttg gca aaa cga ggg cgg gta646Val Ala Leu Ala Leu Gly Val Gln Arg Leu Ala Lys Arg Gly Arg Val165 170 175tca ccg gat ggt act cga act cca gca gtg aca ctg ctg ctg ggt gac694Ser Pro Asp Gly Thr Arg Thr Pro Ala Val Thr Leu Leu Leu Gly Asp180 185 190 195cat ggc tgg gta gag cat gtg gat aat ggt atc cgt tat aag ttt gac742His Gly Trp Val Glu His Val Asp Asn Gly Ile Arg Tyr Lys Phe Asp200205 210gtg acc cag tgt atg ttc tcc ttt gga aac atc act gag aag ctt cga790Val Thr Gln Cys Met Phe Ser Phe Gly Asn Ile Thr Glu Lys Leu Arg215 220 225gtg gca tcg ttg tcc tgt gct gga gaa gtg ctg gtg gat ctc tat gca838Val Ala Ser Leu Ser Cys Ala Gly Glu Val Leu Val Asp Leu Tyr Ala230 235 240
ggg att ggt tat ttt aca ttg cct ttc cta gtt cat gct ggt gct gcc886Gly Ile Gly Tyr Phe Thr Leu Pro Phe Leu Val His Ala Gly Ala Ala245 250 255ttc gtc cat gct tgt gag tgg aat ccc cat gct gta gtt gct ctg aga934Phe Val His Ala Cys Glu Trp Asn Pro His Ala Val Val Ala Leu Arg260 265 270 275aat aac ctt gag atc aat gga gta gca gat cgg tgc caa ata cac ttt982Asn Asn Leu Glu Ile Asn Gly Val Ala Asp Arg Cys Gln Ile His Phe280 285 290gga gat aac aga aaa ctg aag ctc tca aat att gca gat agg gtg atc1030Gly Asp Asn Arg Lys Leu Lys Leu Ser Asn Ile Ala Asp Arg Val Ile295 300 305ctg ggg ctg att ccc agc tct gaa gaa ggc tgg ccc att gcc tgc caa1078Leu Gly Leu Ile Pro Ser Ser Glu Glu Gly Trp Pro Ile Ala Cys Gln310 315 320gtg tta agg cag gat gct gga ggc att ttg cat atc cac caa aat gtg1126Val Leu Arg Gln Asp Ala Gly Gly Ile Leu His Ile His Gln Asn Val325 330 335gaa tct tcc cca ggg aag aat ctt cag gct ctt gga gtc agc aaa gta1174Glu Ser Ser Pro Gly Lys Asn Leu Gln Ala Leu Gly Val Ser Lys Val340 345 350 355gag aaa gag cat tgg ctg tat cct cag caa att acc acc aac caa tgg1222Glu Lys Glu His Trp Leu Tyr Pro Gln Gln Ile Thr Thr Asn Gln Trp360 365 370aaa aat gga gct acc agg gat tct agg gga aaa atg ctg tca cca gcc1270Lys Asn Gly Ala Thr Arg Asp Ser Arg Gly Lys Met Leu Ser Pro Ala375 380 385acc aag cca gag tgg caa agg tgg gca gaa tct gca gaa act cga atc1318Thr Lys Pro Glu Trp Gln Arg Trp Ala Glu Ser Ala Glu Thr Arg Ile390 395 400gcc act ctt ctt cag cag gtg cat ggg aaa cca tgg aag aca caa att1366Ala Thr Leu Leu Gln Gln Val His Gly Lys Pro Trp Lys Thr Gln Ile405 410 415
ctg cac atc caa cca gtg aaa tcc tat gct ccc cat gtg gat cac ata 1414Leu His Ile Gln Pro Val Lys Ser Tyr Ala Pro His Val Asp His Ile420 425 430 435gtc ctg gat ctg gaa tgc tgc ccc tgt cct tca gtt ggc tag 1456Val Leu Asp Leu Glu Cys Cys Pro Cys Pro Ser Val Gly440 445aggaggtaga tcctgggaca catgggatcc acgtgcgagt ggcccttaaa tgtatcagtt1516cagtccaggt tgtcatccct tttgtcccct ggtgatcagt ttttttcata ttttatagcc1576ctgaaagcag gctctagatc gattcaaatt atttcatttg tcttccattg ataacagaaa1636atgaaatacc tgtttgggag aagcagcatg gcccattgaa atgaggctca tctgtgcaat1696tatgaattcc aaattctgac ctcagttctg gaattgaagt ttcagtatgt tttggcctcg1756ggtttcgtta tttgcaaaat gagagtttct ttgaactgtc tcacgtgact attaagcaac1816tatacacagg acatcggtta ttttagagtg aaagacacag tgctttttcc aaattgctct1876ggctaccata tagaaaattg actgaaggag ggccaagatg gaaacagaga gaccagtgag1936gaggcttctg tggttgtcca ggtctgaggt gatggtaact tggactcgga tggtggtaat1996gggaggtaga ttgatatgat aaataaaatt gacagcccaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa2056aaaaa2061<210>2<211>448<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met Arg Glu Asn Val Val Val Ser Asn Met Glu Arg Glu Ser Gly Lys1 5 10 15Pro Val Ala Val Val Ala Val Val Thr Glu Pro Trp Phe Thr Gln Arg20 25 30
Tyr Arg Glu Tyr Leu Gln Arg Gln Lys Leu Phe Asp Thr Gln His Arg35 40 45Val Glu Lys Met Pro Asp Gly Ser Val Ala Leu Pro Val Leu Gly Glu50 55 60Thr Leu Pro Glu Gln His Leu Gln Glu Leu Arg Asn Arg Val Ala Pro65 70 75 80Gly Ser Pro Cys Met Leu Thr Gln Leu Pro Asp Pro Val Pro Ser Lys85 90 95Arg Ala Gln Gly Cys Ser Pro Ala Gln Lys Leu Cys Leu Glu Val Ser100 105 110Arg Trp Val Glu Gly Arg Gly Val Lys Trp Ser Ala Glu Leu Glu Ala115 120 125Asp Leu Pro Arg Ser Trp Gln Arg His Gly Asn Leu Leu Leu Leu Ser130 135 140Glu Asp Cys Phe Gln Ala Lys Gln Trp Lys Asn Leu Gly Pro Glu Leu145 150 155 160Trp Glu Thr Val Ala Leu Ala Leu Gly Val Gln Arg Leu Ala Lys Arg165 170 175Gly Arg Val Ser Pro Asp Gly Thr Arg Thr Pro Ala Val Thr Leu Leu180 185 190Leu Gly Asp His Gly Trp Val Glu His Val Asp Asn Gly Ile Arg Tyr195 200 205Lys Phe Asp Val Thr Gln Cys Met Phe Ser Phe Gly Asn Ile Thr Glu210 215 220
Lys Leu Arg Val Ala Ser Leu Ser Cys Ala Gly Glu Val Leu Val Asp225 230 235 240Leu Tyr Ala Gly Ile Gly Tyr Phe Thr Leu Pro Phe Leu Val His Ala245 250 255Gly Ala Ala Phe Val His Ala Cys Glu Trp Asn Pro His Ala Val Val260 265 270Ala Leu Arg Asn Asn Leu Glu Ile Asn Gly Val Ala Asp Arg Cys Gln275 280 285Ile His Phe Gly Asp Asn Arg Lys Leu Lys Leu Ser Asn Ile Ala Asp290 295 300Arg Val Ile Leu Gly Leu Ile Pro Ser Ser Glu Glu Gly Trp Pro Ile305 310 315 320Ala Cys Gln Val Leu Arg Gln Asp Ala Gly Gly Ile Leu His Ile His325 330 335Gln Asn Val Glu Ser Ser Pro Gly Lys Asn Leu Gln Ala Leu Gly Val340 345 350Ser Lys Val Glu Lys Glu His Trp Leu Tyr Pro Gln Gln Ile Thr Thr355 360 365Asn Gln Trp Lys Asn Gly Ala Thr Arg Asp Ser Arg Gly Lys Met Leu370 375 380Ser Pro Ala Thr Lys Pro Glu Trp Gln Arg Trp Ala Glu Ser Ala Glu385 390 395 400
Thr Arg Ile Ala Thr Leu Leu Gln Gln Val His Gly Lys Pro Trp Lys405 410 415Thr Gln Ile Leu His Ile Gln Pro Val Lys Ser Tyr Ala Pro His Val420 425 430Asp His Ile Val Leu Asp Leu Glu Cys Cys Pro Cys Pro Ser Val Gly435 440 445<210>3<211>1258<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(228)..(971)<400>3ccacgcgtcc ggcccgctct cacttttcag cggcaggcga agggggctga ggaaaggagg60tgggtctagg caggggaaat tggggtgcca ccagacggag acagcttgga ctaccagaat120caagcactct tttggaagag ggtaatctct ctccaaaaac tgaggacact taccttcccc180atatattgag tccagctgtg tttggtggcc caggtactaa tttcaag atg cca gga 236Met Pro Gly1cgt tcc agt tca aat tca ggt tca act ggt ttc atc tcc ttc agt ggt 284Arg Ser Ser Ser Asn Ser Gly Ser Thr Gly Phe Ile Ser Phe Ser Gly5 10 15gta gag tct gct ctc tcc tcc ttg aaa aac ttc caa gcc tgt atc aac 332Val Glu Ser Ala Leu Ser Ser Leu Lys Asn Phe Gln Ala Cys Ile Asn20 25 30 35tct ggt atg gac aca gct tct agt gtt gct ttg gat ctt gtg gaa agt 380Ser Gly Met Asp Thr Ala Ser Ser Val Ala Leu Asp Leu Val Glu Ser40 45 50cag act gaa gtg agt agt gaa tat agt atg gac aag gca atg gtt gaa 428
Gln Thr Glu Val Ser Ser Glu Tyr Ser Met Asp Lys Ala Met Val Glu55 60 65ttt gct aca ttg gat cgg caa cta aac cat tat gta aag gct gtt caa476Phe Ala Thr Leu Asp Arg Gln Leu Asn His Tyr Val Lys Ala Val Gln70 75 80tct aca ata aat cat gtg aaa gaa gaa cgt cca gaa aaa ata cca gat524Ser Thr Ile Asn His Val Lys Glu Glu Arg Pro Glu Lys Ile Pro Asp85 90 95tta aaa tta ttg gta gag aag aaa ttt ttg gct tta cag agc aag aat572Leu Lys Leu Leu Val Glu Lys Lys Phe Leu Ala Leu Gln Ser Lys Asn100 105 110 115tct gat gca gac ttt caa aat aat gaa aaa ttt gta cag ttt aaa caa620Ser Asp Ala Asp Phe Gln Asn Asn Glu Lys Phe Val Gln Phe Lys Gln120 125 130cag ctg aaa gaa cta aag aag caa tgt ggt ctt caa gct gac aga gaa668Gln Leu Lys Glu Leu Lys Lys Gln Cys Gly Leu Gln Ala Asp Arg Glu135 140 145gct gac gga aca gaa gga gtg gat gaa gat ata att gtg acc caa agt716Ala Asp Gly Thr Glu Gly Val Asp Glu Asp Ile Ile Val Thr Gln Ser150 155 160cag acc aac ttc acc tgc ccc att aca aag gag gaa atg aag aag cca764Gln Thr Asn Phe Thr Cys Pro Ile Thr Lys Glu Glu Met Lys Lys Pro165 170 175gtg aaa aat aaa gtg tgt ggc cac acc tat gaa gag gac gcc att gtt812Val Lys Asn Lys Val Cys Gly His Thr Tyr Glu Glu Asp Ala Ile Val180 185 190 195cgc atg att gag tcc agg caa aag cgg aag aaa aag gcc tat tgc cct860Arg Met Ile Glu Ser Arg Gln Lys Arg Lys Lys Lys Ala Tyr Cys Pro200 205 210caa att ggc tgt agc cac acg gat ata aga aag tca gat ctt atc cag908Gln Ile Gly Cys Ser His Thr Asp Ile Arg Lys Ser Asp Leu Ile Gln215 220 225gat gaa gca ctt aga agg gca att gag aac cat aac aag aaa aga cat956Asp Glu Ala Leu Arg Arg Ala Ile Glu Asn His Asn Lys Lys Arg His230 235 240
cgt cat tcc gag tag gaaaagccac ctgcctgcag ggacaccagc agcctacctc 1011Arg His Ser Glu245ctaccccagc tgtctgttga gagcagtgct gaccccagca gttagggact ggctgcatag1071catacttgtt gggggtaaaa cttgttgctt ttatgtgtgc ttgaaaacat ttttcaaagt1131tacacaacag aaatgcaatc atattgttta tttttaagtg ttctataatg ttaaataaaa1191ctttgatcat ctgcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa1251aaaaaaa 1258<210>4<211>247<212>PRT<213>Homo sapiens<400>4Met Pro Gly Arg Ser Ser Ser Asn Ser Gly Ser Thr Gly Phe Ile Ser1 5 10 15Phe Ser Gly Val Glu Ser Ala Leu Ser Ser Leu Lys Asn Phe Gln Ala20 25 30Cys Ile Asn Ser Gly Met Asp Thr Ala Ser Ser Val Ala Leu Asp Leu35 40 45Val Glu Ser Gln Thr Glu Val Ser Ser Glu Tyr Ser Met Asp Lys Ala50 55 60Met Val Glu Phe Ala Thr Leu Asp Arg Gln Leu Asn His Tyr Val Lys65 70 75 80Ala Val Gln Ser Thr Ile Asn His Val Lys Glu Glu Arg Pro Glu Lys85 90 95
Ile Pro Asp Leu Lys Leu Leu Val Glu Lys Lys Phe Leu Ala Leu Gln100 105 110Ser Lys Asn Ser Asp Ala Asp Phe Gln Asn Asn Glu Lys Phe Val Gln115 120 125Phe Lys Gln Gln Leu Lys Glu Leu Lys Lys Gln Cys Gly Leu Gln Ala130 135 140Asp Arg Glu Ala Asp Gly Thr Glu Gly Val Asp Glu Asp Ile Ile Val145 150 155 160Thr Gln Ser Gln Thr Asn Phe Thr Cys Pro Ile Thr Lys Glu Glu Met165 170 175Lys Lys Pro Val Lys Asn Lys Val Cys Gly His Thr Tyr Glu Glu Asp180 185 190Ala Ile Val Arg Met Ile Glu Ser Arg Gln Lys Arg Lys Lys Lys Ala195 200 205Tyr Cys Pro Gln Ile Gly Cys Ser His Thr Asp Ile Arg Lys Ser Asp210 215 220Leu Ile Gln Asp Glu Ala Leu Arg Arg Ala Ile Glu Asn His Asn Lys225 230 235 240Lys Arg His Arg His Ser Glu245<210>5<211>1286<212>DNA<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS<222>(32)..(1174)<400>5gcttcctcgt tgcccccgcc gcgggcgcga g atg gat tcc ggg tgc tgg ttg52Met Asp Ser Gly Cys Trp Leu1 5ttc ggc ggc gag ttc gag gac tcg gtg ttc gag gag agg ccg gag cgg100Phe Gly Gly Glu Phe Glu Asp Ser Val Phe Glu Glu Arg Pro Glu Arg10 15 20cgg tca gga ccg ccc gcg tcc tac tgc gcc aag ctc tgc gag ccg cag148Arg Ser Gly Pro Pro Ala Ser Tyr Cys Ala Lys Leu Cys Glu Pro Gln25 30 35tgg ttt tat gaa gaa aca gaa agc agt gat gat gtt gaa gtg ctg act196Trp Phe Tyr Glu Glu Thr Glu Ser Ser Asp Asp Val Glu Val Leu Thr40 45 50 55ctc aag aaa ttc aaa gga gac ctg gcc tac aga cga caa gag tat cag244Leu Lys Lys Phe Lys Gly Asp Leu Ala Tyr Arg Arg Gln Glu Tyr Gln60 65 70aaa gca ctg cag gag tat tcc agt atc tct gaa aaa ttg tca tca acc292Lys Ala Leu Gln Glu Tyr Ser Ser Ile Ser Glu Lys Leu Ser Ser Thr75 80 85aat ttt gcc atg aaa agg gat gtc cag gaa ggt cag gct cgg tgt ctg340Asn Phe Ala Met Lys Arg Asp Val Gln Glu Gly Gln Ala Arg Cys Leu90 95 100gct cac ctg ggt agg cat atg gag gcg ctg gag att gct gca aac ttg388Ala His Leu Gly Arg His Met Glu Ala Leu Glu Ile Ala Ala Asn Leu105 110 115gaa aat aaa gca acc aac aca gac cat tta acc acg gta ctc tac ctc436Glu Asn Lys Ala Thr Asn Thr Asp His Leu Thr Thr Val Leu Tyr Leu120 125 130 135cag ctt gct att tgt tca agt ttg cag aac ttg gag aaa aca att ttc484Gln Leu Ala Ile Cys Ser Ser Leu Gln Asn Leu Glu Lys Thr Ile Phe140 145 150
tgc ctg cag aaa ctg att tct ttg cat cct ttt aat cct tgg aac tgg532Cys Leu Gln Lys Leu Ile Ser Leu His Pro Phe Asn Pro Trp Asn Trp155 160 165ggc aaa ttg gca gag gct tac ctg aat ctg ggg cca gct ctt tca gca580Gly Lys Leu Ala Glu Ala Tyr Leu Asn Leu Gly Pro Ala Leu Ser Ala170 175 180gca ctt gcg tca tct cag aaa cag cac agt ttc acc tca agt gac aaa628Ala Leu Ala Ser Ser Gln Lys Gln His Ser Phe Thr Ser Ser Asp Lys185 190 195act atc aaa tcc ttc ttt cca cac tca gga aaa gac tgt ctt ttg tgt676Thr Ile Lys Ser Phe Phe Pro His Ser Gly Lys Asp Cys Leu Leu Cys200 205 210 215ttt cct gaa acc ttg cct gag agc tct tta ttt tct gtg gaa gcg aat724Phe Pro Glu Thr Leu Pro Glu Ser Ser Leu Phe Ser Val Glu Ala Asn220 225 230agc agt aat agc cag aaa aat gag aaa gct ctg aca aat atc caa aac772Ser Ser Asn Ser Gln Lys Asn Glu Lys Ala Leu Thr Asn Ile Gln Asn235 240 245tgt atg gca gaa aag aga gaa aca gtg ttg ata gag act cag ctg aaa820Cys Met Ala Glu Lys Arg Glu Thr Val Leu Ile Glu Thr Gln Leu Lys250 255 260gca tgt gcc tct ttt ata cga acc agg ctt ctg ctt cag ttt acc caa868Ala Cys Ala Ser Phe Ile Arg Thr Arg Leu Leu Leu Gln Phe Thr Gln265 270 275cct cag caa aca tcg ttt gct ttg gag agg aac tta agg act cag cag916Pro Gln Gln Thr Ser Phe Ala Leu Glu Arg Asn Leu Arg Thr Gln Gln280285 290 295gaa att gaa gat aaa atg aaa ggg ttc agc ttc aaa gaa gac act ttg964Glu Ile Glu Asp Lys Met Lys Gly Phe Ser Phe Lys Glu Asp Thr Leu300 305 310ctg ttg ata gct gag gtt atg gga gaa gat atc cca gaa aaa ata aaa1012Leu Leu Ile Ala Glu Val Met Gly Glu Asp Ile Pro Glu Lys Ile Lys315 320 325gat gaa gtt cac cca gag gtg aag tgt gtt ggc tcc gta gcc ctg act1060Asp Glu Val His Pro Glu Val Lys Cys Val Gly Ser Val Ala Leu Thr
330 335 340gcc ttg gtg act gta tcc tca gaa gaa ttt gaa gac aag tgg ttc aga1108Ala Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Glu Phe Glu Asp Lys Trp Phe Arg345 350 355aag atc aaa gac cat ttc tgt cca ttt gaa aat cag ttc cat aca gag1156Lys Ile Lys Asp His Phe Cys Pro Phe Glu Asn Gln Phe His Thr Glu360 365 370 375ata caa atc ttg gct tag tgggttataa aaaacaaaac cacaaatatc 1204Ile Gln Ile Leu Ala380ttgtactgta ttaattgtcc ttgtttactt cagacaggat ccattgctaa tcatggagta 1264taaatgatta tttatgtttt at 1286<210>6<211>380<212>PRT<213>Homo sapiens<400>6Met Asp Ser Gly Cys Trp Leu Phe Gly Gly Glu Phe Glu Asp Ser Val1 5 10 15Phe Glu Glu Arg Pro Glu Arg Arg Ser Gly Pro Pro Ala Ser Tyr Cys20 25 30Ala Lys Leu Cys Glu Pro Gln Trp Phe Tyr Glu Glu Thr Glu Ser Ser35 40 45Asp Asp Val Glu Val Leu Thr Leu Lys Lys Phe Lys Gly Asp Leu Ala50 55 60Tyr Arg Arg Gln Glu Tyr Gln Lys Ala Leu Gln Glu Tyr Ser Ser Ile65 70 75 80
Ser Glu Lys Leu Ser Ser Thr Asn Phe Ala Met Lys Arg Asp Val Gln85 90 95Glu Gly Gln Ala Arg Cys Leu Ala His Leu Gly Arg His Met Glu Ala100 105 110Leu Glu Ile Ala Ala Asn Leu Glu Asn Lys Ala Thr Asn Thr Asp His115 120 125Leu Thr Thr Val Leu Tyr Leu Gln Leu Ala Ile Cys Ser Ser Leu Gln130 135 140Asn Leu Glu Lys Thr Ile Phe Cys Leu Gln Lys Leu Ile Ser Leu His145 150 155 160Pro Phe Asn Pro Trp Asn Trp Gly Lys Leu Ala Glu Ala Tyr Leu Asn165 170 175Leu Gly Pro Ala Leu Ser Ala Ala Leu Ala Ser Ser Gln Lys Gln His180 185 190Ser Phe Thr Ser Ser Asp Lys Thr Ile Lys Ser Phe Phe Pro His Ser195 200 205Gly Lys Asp Cys Leu Leu Cys Phe Pro Glu Thr Leu Pro Glu Ser Ser210 215 220Leu Phe Ser Val Glu Ala Asn Ser Ser Asn Ser Gln Lys Asn Glu Lys225 230 235 240Ala Leu Thr Asn Ile Gln Asn Cys Met Ala Glu Lys Arg Glu Thr Val245 250 255Leu Ile Glu Thr Gln Leu Lys Ala Cys Ala Ser Phe Ile Arg Thr Arg
260 265 270Leu Leu Leu Gln Phe Thr Gln Pro Gln Gln Thr Ser Phe Ala Leu Glu275 280 285Arg Asn Leu Arg Thr Gln Gln Glu Ile Glu Asp Lys Met Lys Gly Phe290 295 300Ser Phe Lys Glu Asp Thr Leu Leu Leu Ile Ala Glu Val Met Gly Glu305 310 315 320Asp Ile Pro Glu Lys Ile Lys Asp Glu Val His Pro Glu Val Lys Cys325 330 335Val Gly Ser Val Ala Leu Thr Ala Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Glu340 345 350Phe Glu Asp Lys Trp Phe Arg Lys Ile Lys Asp His Phe Cys Pro Phe355 360 365Glu Asn Gln Phe His Thr Glu Ile Gln Ile Leu Ala370 375 380<210>7<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<223>引物
<400>11ggccacacct atgaagagga 20<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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權(quán)利要求
1.一種蛋白多肽在制備治療原發(fā)性肝癌的藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述蛋白多肽具有與SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4及SEQ ID NO.6中所示任一種氨基酸序列至少70％同源性的序列。
2.如權(quán)利要求1所述的一種蛋白多肽在制備治療原發(fā)性肝癌的藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的蛋白多肽是含有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4及SEQ IDNO.6中任一序列的多肽。
3.一種多核苷酸序列在制備治療原發(fā)性肝癌的藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的多核苷酸是具有SEQ ID NO1、SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.5中所示的任一編碼序列；或者與SEQ ID NO1中的110-1456位核苷酸序列、SEQ ID NO3中的228-971位核苷酸序列及SEQ ID NO5中的32-1174位核苷酸序列中任一序列具有至少70％同源性的序列；或者在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO1、SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.5中所示的任一序列雜交的序列。
4.如權(quán)利要求3所述的一種多核苷酸序列在制備治療原發(fā)性肝癌的藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2、SEQ ID NO.4及SEQ ID NO.6中所示的任一氨基酸序列的多肽。
5.一種用于診斷和治療肝癌的試劑盒，其特征在于所述試劑盒含有下列(I)-(V)中任一所示的序列或者它們的連續(xù)片段，(I)SEQ ID NO1、SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.5中任一所示的編碼序列；(II)與SEQ ID NO1中的110-1456位核苷酸序列、SEQ ID NO3中的228-971位核苷酸序列及SEQ ID NO5中的32-1174位核苷酸序列中任一序列具有至少70％同源性的序列；(III)在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO1、SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.5中所示的任一序列雜交的序列；(IV)具有與SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4及SEQ ID NO.6中所示任一種氨基酸序列至少70％同源性的序列；(V)含有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4及SEQ ID NO.6中任一序列的多肽。
6.一種用于診斷和治療肝癌的生物芯片，其特征在于所述生物芯片的載體上含有下列(i)-(v)的序列或者它們的連續(xù)片段，(i)SEQ ID NO1、SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.5中任一所示的編碼序列；(ii)與SEQ ID NO1中的110-1456位核苷酸序列、SEQ ID NO3中的228-971位核苷酸序列及SEQ ID NO5中的32-1174位核苷酸序列中任一序列具有至少70％同源性的序列；(iii)在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO1、SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.5中所示的任一序列雜交的序列；(iv)具有與SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4及SEQ ID NO.6中所示任一種氨基酸序列至少70％同源性的序列；(v)含有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4及SEQ ID NO.6中任一序列的多肽。
全文摘要
本發(fā)明公開了三種人類基因LLC2、LLC3、LLC4及它們編碼的蛋白在診治肝癌方面的應(yīng)用。在正常組織和癌組織里的表達(dá)比較，該三種基因在基因組水平中均為拷貝數(shù)上升，同時(shí)其在人體內(nèi)多種組織均有表達(dá)。LLC2基因是甲基化酶，對(duì)某些基因起修飾作用，影響他們的表達(dá)。LLC3基因是DNA修復(fù)蛋白，與DNA的復(fù)制，重組，修復(fù)有關(guān)。根據(jù)本發(fā)明公開的人類肝癌相關(guān)基因LLC2、LLC3、LLC4及它們的編碼蛋白的應(yīng)用，對(duì)其進(jìn)行深入的研究有可能發(fā)現(xiàn)肝癌發(fā)病的新機(jī)制，同時(shí)，這些基因也可能作為肝癌治療的新的靶點(diǎn)，并且可為進(jìn)一步開發(fā)后續(xù)診治肝癌的藥物提供重要的參考價(jià)值。
文檔編號(hào)A61K38/16GK1706491SQ200410025018
公開日2005年12月14日 申請(qǐng)日期2004年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月9日
發(fā)明者黃健, 於莉, 韓澤廣 申請(qǐng)人:上海人類基因組研究中心