專利名稱：和厚樸酚在制備抗腫瘤血管形成藥物中的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬天然化合物的用途，涉及從植物提取的和厚樸酚的新用途，尤其涉及和厚樸酚在制備抗腫瘤血管形成藥物中的用途。
背景技術：
近年來，腫瘤生長中的血管新生問題正日益受到重視，積累了一些關于腫瘤血管新生依賴性的證據(jù)，并發(fā)現(xiàn)血管新生受控于一系列正負調控因子。正常細胞是非血管新生性的(nonangiogenic)，無論是在癌前期還是癌變轉化期都必須發(fā)生從非血管新生性到血管新生性的表型轉換，腫瘤才能得以生長。血管新生模型的組織學觀察發(fā)現(xiàn)血管新生有幾個明顯的分期1血管通透性增加引起血漿蛋白外滲(extravasation)及周圍細胞外基質的降解；排列于已存血管腔面的內皮細胞開始從親代母血管向血管新生刺激物方向游走遷移；位于遷移游走前沿后面的內皮細胞增生，而位于最鄰近新毛細血管的內皮細胞開始分化形成新的管腔；新形成的管腔將最終開放與血流相通，繼而一些毛細血管不斷延伸，另一些因回流量較低而收縮消失。
腫瘤組織的另一特點是形成新生血管以保證不斷增殖的需要，血管形成愈豐富，腫瘤生長越旺盛2。血管新生是由許多基因參與調控的整體過程，包括誘導型一氧化氮合成酶基因(iNOS)、血管內皮生長因子(VEGF)、VEGF的II型受體(flt-1)、膠原-4脯氨酸羥化酶(collegen proly-4hydroxydationase)、組織金屬蛋白酶抑制因子(TIMP)、尿激酶型血漿纖溶酶激活子受體(uPA受體)、血小板來源生長因子(PDGF)、血漿纖溶酶原激活抑制因子-1(PAL-1)等，這些基因都是低氧誘導因子-1(HIF-1)的直接靶基因2，它們的表達產物參與新生血管形成的整個過程，因此，HIF-1在腫瘤新生血管形成過程中起著關鍵的作用。
腫瘤組織常處于低氧狀態(tài)，低氧狀態(tài)使腫瘤組織內的HIF-1含量增加，HIF含量增加導致腫瘤血管生成，腫瘤血管豐富，腫瘤得以迅速發(fā)展。反之，若能有效控制腫瘤血管的生成，腫瘤就不能生長。腫瘤血管生成已成為腫瘤治療的最重要的靶點之一2。
和厚樸酚是從植物厚樸中提取的一種天然化合物。其化學結構如下
和厚樸酚在對其抗血栓3、抗焦慮4等體內實驗時，證明能被胃腸道吸收，并具有體內滯留時間較長、沒有明顯毒副作用等特點。至今為止只有一篇報道和厚樸酚能抑制血管生成，但該報道只限于和厚樸酚阻斷血管內皮生長因子(VEGF)對血管內皮生長因子II型受體磷酸化的阻斷作用。而腫瘤血管生成的最關鍵因素是低氧誘導因子-1(HIF-1)及其作用的一系列靶基因的表達，如VEGF，一氧化氮合成酶等5。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種和厚樸酚在制備抗腫瘤血管形成藥物中的用途，該和厚樸酚英文名為honokiol，CAS number35354-74-6，分子量266.33，化學命名為3，5’-diallyl-4，2’-dihydroxybiphenyl，分子式為C18H18O2，對人體毒性小，本發(fā)明制備的和厚樸酚藥物包括制劑允許的藥物賦形劑或載體。
本發(fā)明的另一個目的是提供和厚樸酚在制備臨床抗腫瘤藥物中的應用。
本發(fā)明所述的和厚樸酚藥物可按本制劑領域已知方法制成腸道或非腸道組合藥的劑型。制劑形式主要包括液體制劑、顆粒劑、片劑、沖劑、膠丸、膠囊、緩釋劑、滴丸劑或注射劑。
制劑的給藥形式主要包括口服給藥或注射給藥。
本發(fā)明的關鍵之處是證明了和厚樸酚可抑制低氧誘導因子-1(HIF-1)的表達，促進低氧誘導因子-1的分解；和厚樸酚可抑制血管內皮生長因子和一氧化氮合成酶的表達；證明了和厚樸酚抑制血管生成的作用靶點。
本發(fā)明的有益效果如下(1)和厚樸酚可有效抑制腫瘤的血管形成，實驗證明該化合物可作用于低氧誘導因子-1，血管內皮細胞生長因子，一氧化氮合成酶等，能有效控制腫瘤血管的形成，具有臨床應用前景；(2)和厚樸酚毒性低，而目前所用的臨床抗腫瘤藥物對人體都有較大的毒性；(3)和厚樸酚具有很好的臨床抗腫瘤藥的應用前景。


圖1A為和厚樸酚對人結腸上皮癌細胞系RKO細胞內低氧誘導因子-1mRNA含量的影響。
圖1B為和厚樸酚對RKO細胞內低氧誘導因子-1mRNA含量影響的直方圖。
圖2A為和厚樸酚對RKO細胞內低氧誘導因子-1蛋白質含量的影響。
圖2B為和厚樸酚對RKO細胞內低氧誘導因子-1蛋白質含量影響的直方圖。
圖3A為和厚樸酚對RKO細胞內血管生長因子mRNA含量影響。
圖3B為和厚樸酚對RKO細胞內血管生長因子mRNA含量影響的直方圖。
圖4為和厚樸酚對RKO細胞內血管生長因子蛋白質含量的影響。
圖5A為和厚樸酚對RKO細胞內一氧化氮合成酶的蛋白質含量的影響。
圖5B為和厚樸酚對RKO細胞內一氧化氮合成酶的蛋白質含量影響的直方圖。
圖6A為和厚樸酚對RKO細胞內熱休克蛋白70的mRNA含量的影響。
圖6B為和厚樸酚對RKO細胞內熱休克蛋白70的mRNA含量影響的直方圖。
圖7A為和厚樸酚對RKO細胞內熱休克蛋白70的蛋白質含量的影響。
圖7B為和厚樸酚對RKO細胞內熱休克蛋白70的蛋白質含量影響的直方圖。
圖8為和厚樸酚對荷人大腸癌RKO細胞異種移植物的Balb/C裸鼠的治療作用。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述實施例1和厚樸酚對腫瘤細胞內低氧誘導因子-1(HIF-1)mRNA的抑制HIF-1是腫瘤血管生成的最關鍵因子之一，HIF-1含量減少，腫瘤組織中的血管生成就會受阻，反之，腫瘤組織中的血管就會增生而促進腫瘤生長。
(1)實驗材料細胞株大腸癌細胞株RKO來源于美國American Type CultureCollection(ATCC)公司。
試劑和厚樸酚，中國藥品與生物制品鑒定所；逆轉錄試劑盒(Promage，美國)，逆轉錄多聚酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒，熱穩(wěn)定DNA合成酶(Taq酶上海生工)。
儀器培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)板，二氧化碳培養(yǎng)箱，PCR儀，F(xiàn)CM儀。
(2)實驗方法細胞培養(yǎng)分組根據(jù)不同和厚樸酚濃度分為5組，分別以1、2、3、4、5表示。1組為對照；2組加氯化鈷(CoCl2)(150uM)；3組CoCl2(150uM)+和厚樸酚0.1ug/ml；4組CoCl2(150uM)+和厚樸酚0.5ug/ml；5組CoCl2(150uM)+和厚樸酚1ug/ml。
藥物誘導RKO細胞2×104每孔接種于24孔板，每組3個復孔；用含3％小牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基稀釋和厚樸酚儲存液(5mg/ml)，充分混勻，配成所需濃度，并以此更換細胞培養(yǎng)液；藥物作用1小時后加入CoCl2(對照組除外)，使其終濃度為150uM，繼續(xù)培養(yǎng)3小時。收集細胞，提取RNA或蛋白質，做相應的RT-PCR。
RT-PCR收集細胞，棄去培養(yǎng)液，冰生理鹽水洗3次后用RNA提取試劑Trizol(每孔400ul)提取細胞RNA(按Trizol試劑說明進行)。RNA逆轉錄成cDNA按逆轉錄試劑盒方案進行，引物為寡核苷酸脫氧胸腺嘧啶(OligodT)。PCR的引物如表1。
表1引物序列PrimersUpstream primer(5’-3’)Downstream primer(5’-3’)Size(bp)HIF-1α CCAGTTACGTTCCTTCGATCAG TCACCAAACAGAGCAGGAAAAG143PCR的反應體系按照PCR試劑盒方案進行。
PCR條件如下HIF-194℃ 5分鐘→35循環(huán){94℃30秒→54℃30秒→72℃30秒}→72℃5分鐘。
PCR產物電泳用1×TAE三羥甲基氨基甲烷(tris)-冰醋酸-二乙胺四乙酸(EDTA)電泳緩沖液配制1.5％瓊脂糖凝膠，加0.1％溴化乙啶(EB)按說明制成水平DNA電泳膠塊。加2×上樣緩沖液，加樣于加樣孔，100V恒壓電泳約20分鐘。紫外成像儀上攝像。
(3)實驗結果參見圖1A和圖1B，圖1A用RT-PCR法檢測，細胞在化學低氧環(huán)境下用不同濃度和厚樸酚處理4小時?？梢婋S著和厚樸酚濃度增加，HIF-1mRNA含量減小。泳道1常氧對照；泳道2CoCl2；泳道3CoCl2+0.1μg/ml和厚樸酚；泳道4CoCl2+0.5μg/ml和厚樸酚；泳道4CoCl2+1.0μg/ml和厚樸酚。β-actin為內對照。圖1B各組HIF-1αRT-PCR產物的條帶灰度值分別除去相應β-actin條帶的影響因子。圖中組別1-5分別代表常氧對照、CoCl2低氧對照、CoCl2+0.1μg/ml和厚樸酚、CoCl2+0.5μg/ml和厚樸酚和CoCl2+1.0μg/ml和厚樸酚。CoCl2(150uM)誘導3hrs對RKO細胞HIF-1αmRNA表達有微弱的上調。和厚樸酚濃度依賴性下調RKO細胞HIF-1αmRNA表達，0.1、0.5和1ug/ml三個濃度分別比CoCl2對照組下調7.6％、15.9％和46.7％，說明和厚樸酚0.1-1ug/ml之間濃度時抑制HIF-1α基因轉錄。
實施例2和厚樸酚對腫瘤細胞內低氧誘導因子-1(HIF-1)蛋白質的抑制實施例1表明和厚樸酚可抑制HIF-1的基因轉錄，但并沒有證明和厚樸酚可使腫瘤細胞中的HIF-1蛋白質含量也下降。該實施例證明和厚樸酚有此作用。
(1)實驗材料細胞株大腸癌細胞株RKO來源于美國ATCC公司。
試劑和厚樸酚，中國藥品與生物制品鑒定所；聚偏氟乙烯膜(PVDF)膜(Bio-Rad公司)，辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠抗體(KPL，美國)，鼠抗人HIF-1α(NeoMarkers，美國)，化學發(fā)光檢測系統(tǒng)ECL反應液(SantaCruz公司)，蛋白質測定試劑盒(DC Protein Assay Kit，Bio-Rad公司)，免疫組織化學試劑盒(福州邁新公司)。
儀器培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)板，二氧化碳培養(yǎng)箱，電泳儀，電轉膜儀。
(2)實驗方法細胞培養(yǎng)分組根據(jù)不同和厚樸酚濃度分為5組，分別以1、2、3、4、5表示。1組為對照；2組加CoCl2(150uM)；3組CoCl2(150uM)+和厚樸酚0.1ug/ml；4組CoCl2(150uM)+和厚樸酚0.5ug/ml；5組CoCl2(150uM)+和厚樸酚1ug/ml。
藥物誘導RKO細胞2×104每孔接種于24孔板，每組3個復孔；用含3％小牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基稀釋和厚樸酚儲存液(5mg/ml)，充分混勻，配成所需濃度，并以此更換細胞培養(yǎng)液；藥物作用1小時后加入CoCl2(對照組除外)，使其終濃度為150uM，繼續(xù)培養(yǎng)3小時。收集細胞，提取RNA或蛋白質，做西部印跡法(Western Blot)檢測細胞內的HIF一1蛋白質含量。
Western blot收集培養(yǎng)細胞，用生理鹽水洗兩次，細胞沉淀加入1×蛋白提取緩沖液(protein extract buffer)，吹散，沸水中煮15min，13000轉速(rpm)離心20分鐘，取上清測定蛋白質濃度(按DC Protein Assay Kit說明書進行)。取蛋白提取物50ug，加入等量的2×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5分鐘，做SDS-PAGE電泳，積層膠恒壓50V，分離膠恒壓100V，電泳至溴酚藍染料到達凝膠最前沿，停止電泳。
轉膜電泳結束后揭膠，并將凝膠浸于適量的轉膜緩沖液(Transfer buffer)中，平衡30分鐘。同時截取適當大小的PVDF膜和2張3M濾紙，將PVDF膜先在無水甲醇中浸濕，然后同濾紙一同浸于Transfer buffer中，平衡10～15分鐘，膜放陽極、膠放陰極，兩面各墊2張3M濾紙，恒流110mA，4℃層析柜中轉膜過夜。
封閉將轉有蛋白的膜浸于含10％脫脂奶粉的緩沖液(TBST)中封閉1hr。雜交取出已封閉的膜，然后浸于1400-500稀釋的鼠抗人HIF-1(用含5％脫脂奶粉的TBST、pH7.4配制)中，4℃過夜，TBST漂洗5min×5次，再浸于1∶10000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG抗體(用含5％脫脂奶粉的TBST、pH 7.4配制)中，TBST漂洗5分鐘×5次。
壓片、洗片取出膜，配制顯色液(ECLA液0.7ml+ECL B液0.7ml)，加在膜上，5分鐘后吸去多余液體，保鮮膜封膜，固定在暗盒內，壓片，洗片。
(3)實驗結果參見圖2A和圖2B，圖2A細胞在化學低氧環(huán)境下用不同濃度和厚樸酚處理4小時。用Western Blot方法檢測，可見隨著和厚樸酚濃度增加，HIF-1蛋白質含量A表達減小，泳道1常氧對照；泳道2CoCl2；泳道3CoCl2+0.1μg/ml和厚樸酚；泳道4CoCl2+0.5μg/ml和厚樸酚；泳道4CoCl2+1.0μg/ml和厚樸酚。β-actin為內對照)。圖2B各組HIF-1α蛋白條帶的灰度值分別去除相應β-actin條帶的影響因子。圖中組別1-5分別代表常氧對照、CoCl2低氧對照、CoCl2+0.1μg/ml和厚樸酚、CoCl2+0.5μg/ml和厚樸酚和CoCl2+1.0μg/ml和厚樸酚。RKO細胞基礎水平HIF-1α蛋白表達較低，不易檢測到。CoCl2150uM誘導3小時顯著上調RKO細胞HIF-1α蛋白表達。和厚樸酚濃度依賴性下調CoCl2(150uM)所致的RKO細胞HIF-1α蛋白積聚(參見圖2A)。把western blot結果用圖像軟件(Scion Image)換算成灰度值，并作直方圖(參見圖2B)，可以看出，CoCl2(150uM)誘導的HIF-1α蛋白積聚比1組(空白對照組)增加約13倍。和厚樸酚0.1ug/ml濃度時，對CoCl2所致的HIF-1α蛋白積聚沒有明顯影響，而0.5和1ug/ml濃度時，梯度抑制CoCl2所致的HIF-1α蛋白上調，與2組(CoCl2對照組)相比分別下調28％和63.9％。和厚樸酚三個濃度對RKO細胞HIF-1mRNA及蛋白水平的影響趨勢基本一致。此結果說明和厚樸酚可使細胞內的HIF-1α蛋白質含量下降。
實施例3和厚樸酚對RKO細胞血管生長因子(VEGF)mRNA表達的影響HIF-1可上調血管生長因子VEGF，后者刺激腫瘤血管生成。和厚樸酚可下調HIF-1，腫瘤細胞內HIF-1下降，VEGF也理應下降。以此推理，和厚樸酚處理腫瘤細胞，VEGF也應該下調。
(1)實驗材料細胞大腸癌細胞株RKO來源于美國ATCC公司。
試劑逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒為美國Promega公司產品。和厚樸酚，中國藥品與生物制品鑒定所。
儀器PCR儀。
(2)實驗方法藥物誘導RKO細胞2×105接種于6孔板，用含10％小牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)24小時，使貼壁；用含3％小牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基稀釋和厚樸酚儲存液(5mg/ml)，充分混勻，配成所需濃度，并以此更換細胞培養(yǎng)液；藥物作用1小時后加入CoCl2(對照組除外)，使其終濃度為150uM，培養(yǎng)4小時后更換培養(yǎng)液，以除去CoCl2，繼續(xù)用不同濃度的和厚樸酚作用3小時。收集細胞，提取RNA，逆轉錄成cDNA，做PCR檢測VEGF的豐度。PCR引物如下引物 上游引物(5’-3’) 下游引物(5’-3’)產物(bp)VEGF-AGCAGAATCATCACGAAGTGGGCATGGTGATGTTGGACTCC212反應條件如下VEGF-A95℃5分鐘→35循環(huán){95℃30秒，56℃30秒，72℃1分鐘}→72℃7分鐘。
PCR產物電泳用1×TAE電泳緩沖液配制1.5％瓊脂糖凝膠，加0.1％EB按說明制成水平DNA電泳膠塊。加2×上樣緩沖液，加樣于加樣孔，100V恒壓電泳約20分鐘。紫外成像儀上攝像。
(3)實驗結果不同濃度和厚樸酚作用于常氧或CoCl2(150uM)模擬低氧組RKO細胞4hrs，取總RNA逆轉錄為cDNA，作PCR分析。參見圖3A和圖3B，圖3A細胞在化學低氧環(huán)境下用不同濃度和厚樸酚處理4小時，用RT-PCR方法檢測，可見隨著和厚樸酚濃度增加，VEGF的mRNA含量減小。泳道1常氧對照；泳道2CoCl2；泳道3CoCl2+0.1μg/ml和厚樸酚；泳道4CoCl2+0.5μg/ml和厚樸酚；泳道4CoCl2+1.0μg/ml和厚樸酚，β-actin為內對照。圖3B各組VEGFRT-PCR產物的條帶分別除去其相應β-actin條帶的影響因子，其中組別1-5分別代表常氧對照、CoCl2低氧對照、CoCl2+0.1μg/ml和厚樸酚、CoCl2+0.5μg/ml和厚樸酚和CoCl2+1.0μg/ml和厚樸酚。CoCl2(150uM)顯著上調RKO細胞VEGF mRNA表達，PCR產物條帶的灰度值是對照組的1.7倍。和厚樸酚0.1-1ug/ml濃度時，劑量依賴性下調模擬低氧引起的VEGF mRNA表達上調。1ug/ml濃度時灰度值比低氧對照組下調44％，具有顯著差異，說明和厚樸酚可抑制VEGF的表達。
實施例4和厚樸酚對RKO細胞VEGF蛋白質表達的影響實施例3證明和厚樸酚處理腫瘤細胞后，細胞內VEGF mRNA水平下降，但不表明細胞內VEGF的蛋白質水平下降。檢測細胞內VEGF蛋白質的水平是必需的。
(1)實驗材料細胞大腸癌細胞株RKO來源于美國ATCC公司。
試劑鼠抗人VEGF和免疫熒光試劑盒為福州邁新公司產品。和厚樸酚，中國藥品與生物制品鑒定所。
儀器德國蔡氏熒光顯微鏡。
(2)實驗方法藥物誘導RKO細胞2×105接種于6孔板，用含10％小牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)24小時，使貼壁；用含3％小牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基稀釋和厚樸酚儲存液(5mg/ml)，充分混勻，配成所需濃度，并以此更換細胞培養(yǎng)液；藥物作用1小時后加入CoCl2(對照組除外)，使其終濃度為150uM，培養(yǎng)4小時后更換培養(yǎng)液，以除去CoCl2，繼續(xù)用不同濃度的和厚樸酚作用3小時。收集細胞，用鼠抗人VEGF與細胞溫育，再用熒光素FITC標記兔抗鼠IgG標記細胞，在熒光顯微鏡下觀察細胞的熒光強度。熒光越強表示VEGF含量越高。
(3)實驗結果RKO細胞經(jīng)150uM CoCl2作用4小時，并用不同濃度和厚樸酚處理8小時，檢測細胞內高分子量VEGF(34-50kDa)的表達量。34-50kDa蛋白是細胞內非分泌形式的VEGF，當被剪接成189kDa、165kDa、121kDa等活性分子后，即被分泌出細胞，產生血管內皮生長因子的生理作用。我們用FITC熒光標記的二抗結合經(jīng)VEGF一抗作用的細胞涂片，在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)150uM CoCl2作用后的RKO細胞高分子量VEGF陽性細胞數(shù)明顯增加，熒光主要分布在細胞質，不同濃度和厚樸酚(0.1-1ug/ml)作用8小時明顯減少模擬低氧引起的陽性細胞增加。每組隨機取150個細胞進行統(tǒng)計，結果參見圖4，細胞在化學低氧環(huán)境下用不同濃度和厚樸酚處理8小時，用熒光免疫組織化學法檢測RKO細胞內的熒光強度，熒光值反映VEGF的表達量，可見隨著和厚樸酚濃度增加，高分子量VEGF的蛋白表達量減少，組別1-5分別代表常氧對照、CoCl2低氧對照、CoCl2+0.1μg/ml和厚樸酚、CoCl2+0.5μg/ml和厚樸酚和CoCl2+1.0μg/ml和厚樸酚，“**”表示與常氧對照組相比P＜0.01；“+”表示與低氧對照組相比P＜0.05；“++”表示與低氧對照組相比P＜0.01。
CoCl2(150uM)作用4小時明顯上調RKO細胞內VEGF蛋白表達，其熒光值比對照組增加5.6倍，T檢驗兩組間差異非常顯著(P＜0.01)。和厚樸酚0.1-1ug/ml均表現(xiàn)為下調CoCl2引起的VEGF表達增加，其中H0.1組比單獨低氧組減少29.5％(P＜0.01)，H0.5組和H1組分別減少76.4％和80％，與單獨低氧組相比均有顯著差異(P＜0.05)。該實驗證明，和厚樸酚處理腫瘤細胞后，細胞內VEGF蛋白質含量下降。
實施例5和厚樸酚對誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)的影響iNOS是HIF-1調控的一個重要的下游基因，該基因的表達可促經(jīng)腫瘤組織中的血管生成。由于和厚樸酚可下調HIF-1，因此也會引起iNOS表達的下調。
(1)實驗材料細胞細胞RKO細胞來源于美國ATCC公司。
試劑和厚樸酚，中國藥品與生物制品鑒定所；鼠抗人iNOS(NeoMarkers，美國)，HRP標記的羊抗鼠抗體(Santa Cruz，美國)?；瘜W發(fā)光檢測系統(tǒng)ECL反應液(Santa Cruz，美國)儀器電泳儀，電轉膜儀(2)實驗方法藥物誘導RKO細胞2×104每孔接種于24孔板，每組3個復孔；用含3％小牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基稀釋和厚樸酚儲存液(5mg/ml)，充分混勻，配成所需濃度，并以此更換細胞培養(yǎng)液；藥物作用1小時后加入CoCl2(對照組除外)，使其終濃度為150uM，繼續(xù)培養(yǎng)3小時。收集細胞，提取RNA或蛋白質，做Western Blot檢測細胞內的HIF-1蛋白質含量。
Western blot收集培養(yǎng)細胞，用生理鹽水洗兩次，細胞沉淀加入1×proteinextract buffer，吹散，沸水中煮15分鐘，13000轉/分鐘(rpm)離心20分鐘，取上清測定蛋白質濃度(按DC Protein Assay Kit說明書進行)。取蛋白提取物50ug，加入等量的2×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5分鐘，做SDS-PAGE電泳，積層膠恒壓50V，分離膠恒壓100V，電泳至溴酚藍染料到達凝膠最前沿，停止電泳。
轉膜電泳結束后揭膠，并將凝膠浸于適量的Transfer buffer中，平衡30分鐘。同時截取適當大小的PVDF膜和2張3M濾紙，將PVDF膜先在無水甲醇中浸濕，然后同濾紙一同浸于Transfer buffer中，平衡10～15分鐘，膜放陽極、膠放陰極，兩面各墊2張3M濾紙，恒流110mA，4℃層析柜中轉膜過夜。
封閉將轉有蛋白的膜浸于含10％脫脂奶粉的TBST中封閉1小時。雜交取出已封閉的膜，然后浸于1400-500稀釋的鼠抗人iNOS(用含5％脫脂奶粉的TBST、pH7.4配制)中，4℃過夜，TBST漂洗5分鐘×5次，再浸于110000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG抗體(用含5％脫脂奶粉的TBST、pH7.4配制)中，TBST漂洗5分鐘×5次。壓片、洗片取出膜，配制顯色液(ECLA液0.7ml+ECL B液0.7ml)，加在膜上，5分鐘后吸去多余液體，保鮮膜封膜，固定在暗盒內，壓片，洗片。
(3)實驗結果參見圖5A和圖5B，圖5A細胞在化學低氧環(huán)境下用不同濃度和厚樸酚處理4小時，用Western Blot法檢測，可見隨著和厚樸酚濃度增加，HSP70蛋白含量減小，β-actin為內對照。圖5B各組iNOS蛋白條帶分別除去其相應β-actin條帶的影響因子，圖中組別分別代表常氧(N)和低氧(H)時不同和厚樸酚(0-1ug/ml)作用濃度。每組取50ug蛋白進行Western blot檢測，RKO細胞基礎水平iNOS蛋白表達豐度較高。CoCl2(150uM)模擬低氧時，輕度上調RKO細胞iNOS蛋白表達，其Western blot條帶的灰度值與常氧對照組相比增強了21.4％。常氧組和厚樸酚0.1-1ug/ml之間濃度表現(xiàn)為劑量依賴性iNOS蛋白表達下降，但0.1ug/ml濃度與對照組相比反而微弱上調，這可能由實驗誤差造成，也可能表示該濃度對常氧時iNOS蛋白表達無明顯影響?；瘜W低氧時，和厚樸酚0.1-1ug/ml之間濃度也表現(xiàn)為劑量依賴性iNOS蛋白表達下降，0.1ug/ml濃度與CoCl2單獨作用組相比無明顯差別，說明該濃度對常氧和化學低氧RKO細胞iNOS蛋白表達無明顯影響。比較常氧組與低氧組Westernblot條帶的灰度值，發(fā)現(xiàn)相同劑量和厚樸酚對RKO細胞iNOS蛋白表達的影響與環(huán)境氧含量無明顯相關，說明和厚樸酚對RKO細胞iNOS蛋白的調節(jié)不受氧分壓影響。
該實驗結果說明和厚樸酚可抑制iNOS的表達。
實施例6和厚樸酚對RKO細胞HSP70mRNA的影響。
(1)實驗材料細胞RKO細胞來源于美國ATCC公司。
試劑和厚樸酚，中國藥品與生物制品鑒定所；逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒為美國Promega公司產品。
儀器PCR儀。
(2)實驗方法藥物誘導RKO細胞2×105接種于6孔板，用含10％小牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)24小時，使貼壁；用含3％小牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基稀釋和厚樸酚儲存液(5mg/ml)，充分混勻，配成所需濃度，并以此更換細胞培養(yǎng)液；藥物作用1小時后加入CoCl2(對照組除外)，使其終濃度為150uM，培養(yǎng)4小時后更換培養(yǎng)液，以除去CoCl2，繼續(xù)用不同濃度的和厚樸酚作用3小時。收集細胞，提取RNA，逆轉錄成cDNA，做PCR檢測VEGF的豐度。PCR引物如下引物 上游引物(5’-3’) 下游引物(5’-3’) 產物(bp)HSP70CAAGATCAGCGAGGCTGACAAGAACTGTACACAGGGTGGCAGTG500反應條件如下HSP7095℃5分鐘→35個循環(huán){95℃30秒，56℃30秒，72℃1分鐘}→72℃7分鐘PCR產物電泳用1×TAE電泳緩沖液配制1.5％瓊脂糖凝膠，加0.1％EB按說明制成水平DNA電泳膠塊。加2×上樣緩沖液，加樣于加樣孔，100V恒壓電泳約20分鐘。紫外成像儀上攝像。
(3)實驗結果參見圖6A和圖6B，圖6A細胞在化學低氧環(huán)境下用不同濃度和厚樸酚處理4小時，用RT-PCR法檢測，可見隨著和厚樸酚濃度增加，HSP70 mRNA含量減小，泳道1常氧對照；泳道2CoCl2；泳道3CoCl2+0.1μg/ml和厚樸酚；泳道4CoCl2+0.5μg/ml和厚樸酚；泳道4CoCl2十1.0μg/ml和厚樸酚。β-actin為內對照。圖6B各組HSP70RT-PCR產物條帶分別除去其相應β-actin條帶的影響因子，圖中組別1-5分別代表常氧對照、CoCl2低氧對照、CoCl2+0.1μg/ml和厚樸酚、CoCl2+0.5μg/ml和厚樸酚、CoCl2+1.0μg/ml和厚樸酚。CoCl2(150uM)上調RKO細胞HSP70mRNA表達，其PCR產物條帶的灰度值比對照組上調224％。和厚樸酚濃度依賴性下調化學低氧所致的RKO細胞HSP70mRNA上調，PCR產物條帶的灰度值與CoCl2單獨作用組相比分別減少了73.1％、76.5％和87.8％。這個結果說明和厚樸酚可抑制HSP70的表達，由于HSP70可阻止HIF-1的降解，HSP70的表達下降可導致HIF-1的降解。
實施例7和厚樸酚對RKO細胞HSP70蛋白質的影響。
(1)實驗材料細胞RKO細胞來源于美國ATCC公司。
試劑和厚樸酚，中國藥品與生物制品鑒定所；鼠抗人HSP70(NeoMarkers，美國)，HRP標記的羊抗鼠抗體(Santa Cruz，美國)?；瘜W發(fā)光檢測系統(tǒng)ECL反應液(Santa Cruz，美國)儀器電泳儀，電轉膜儀。
(2)實驗方法藥物誘導RKO細胞2×104每孔接種于24孔板，每組3個復孔；用含3％小牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基稀釋和厚樸酚儲存液(5mg/ml)，充分混勻，配成所需濃度，并以此更換細胞培養(yǎng)液；藥物作用1小時后加入CoCl2(對照組除外)，使其終濃度為150uM，繼續(xù)培養(yǎng)3小時。收集細胞，提取RNA或蛋白質，做Western Blot檢測細胞內的HIF-1蛋白質含量。
Western blot收集培養(yǎng)細胞，用生理鹽水洗兩次，細胞沉淀加入1×proteinextract buffer，吹散，沸水中煮15min，13000rpm離心20min，取上清測定蛋白質濃度(按DC Protein Assay Kit說明書進行)。取蛋白提取物50ug，加入等量的2×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5min，做SDS-PAGE電泳，積層膠恒壓50V，分離膠恒壓100V，電泳至溴酚藍染料到達凝膠最前沿，停止電泳。轉膜電泳結束后揭膠，并將凝膠浸于適量的Transfer buffer中，平衡30min。同時截取適當大小的PVDF膜和2張3M濾紙，將PVDF膜先在無水甲醇中浸濕，然后同濾紙一同浸于Transfer buffer中，平衡10～15min，膜放陽極、膠放陰極，兩面各墊2張3M濾紙，恒流110mA，4℃層析柜中轉膜過夜。封閉將轉有蛋白的膜浸于含10％脫脂奶粉的TBST中封閉1hr。雜交取出已封閉的膜，然后浸于1∶400-500稀釋的鼠抗人HSP70(用含5％脫脂奶粉的TBST、pH7.4配制)中，4℃過夜，TBST漂洗5min×5次，再浸于1∶10000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG抗體(用含5％脫脂奶粉的TBST、pH7.4配制)中，TBST漂洗5min×5次。壓片、洗片取出膜，配制顯色液(ECL A液0.7ml+ECL B液0.7ml)，加在膜上，5min后吸去多余液體，保鮮膜封膜，固定在暗盒內，壓片，洗片。
(3)實驗結果每組取10ug蛋白進行western blot檢測。結果參見圖7A和圖7B，圖7A細胞在化學低氧環(huán)境下用不同濃度和厚樸酚處理4小時，用Western Blot法檢測，可見隨著和厚樸酚濃度增加，HSP70蛋白含量減小，泳道1常氧對照；泳道2CoCl2；泳道3CoCl2+0.1μg/ml和厚樸酚；泳道4CoCl2+0.5μg/ml和厚樸酚；泳道4CoCl2+1.0μg/ml和厚樸酚。β-actin為內對照。圖7B各組HSP70蛋白條帶分別除去其相應β-actin條帶的影響因子，圖中組別1-5分別代表常氧對照、CoCl2低氧對照、CoCl2+0.1μg/ml和厚樸酚、CoCl2+0.5μg/ml和厚樸酚、CoCl2+1.0μg/ml和厚樸酚。CoCl2(150uM)模擬低氧上調RKO細胞HSP70蛋白表達，western blot條帶的灰度值與對照組相比增強了195.4％，具有顯著差異。和厚樸酚0.1-1ug/ml濃度時劑量依賴性抑制CoCl2對RKO細胞HSP70蛋白表達的影響，抑制率分別為22.8％、35.8％和75.2％。這個結果與實施例5共同說明和厚樸酚可抑制細胞內HSP70的表達，使細胞內HSP70的含量降低，后者含量的降低可導致HIF-1α的降解。
實施例8和厚樸酚在體對人結腸癌細胞系RKO細胞所致實體瘤及腹水瘤的抑制作用(1)實驗材料細胞系人結腸癌細胞系RKO來源于美國ATCC公司；和厚樸酚，中國藥品與生物制品鑒定所。
動物Babl/c小鼠(上海動物中心)
無菌飼養(yǎng)室及飼料(浙江省中醫(yī)學院提供)(2)實驗方法腹水瘤模型取對數(shù)生長期RKO細胞→0.25％胰酶消化片刻→離心、生理鹽水洗3次，徹底去除胰酶→細胞沉淀溶于無血清RPIMl640培養(yǎng)基，使成2×106/ml→每鼠腹腔接種100ul(含2×105細胞)→觀察腹部膨隆情況。
實體瘤模型取腹水瘤鼠一只→引頸處死→碘酊消毒皮膚，75％乙醇浸泡片刻→剪開腹壁皮膚，無菌生理鹽水1000ul沖淋腹腔→收集沖洗液→每鼠50ul(約含2×105細胞)接種于腋部皮下→隔天稱量體重，卡尺測量瘤體體積。
分組及用藥腹水瘤及實體瘤各分為3組空白對照組、溶劑組、用藥組。和厚樸酚溶于PEG400/蔗糖(體積比7∶3)溶液，使成25mg/ml，放置37℃搖床振蕩2小時，分裝備用。用藥組隔天每鼠灌胃5mg(100ul)和厚樸酚溶液，溶劑組給予等體積PEG400/蔗糖溶液，對照組給予等體積生理鹽水，隔天一次，連續(xù)用藥至對照組死亡。隔天稱量體重及測量瘤體大小或腹部膨隆情況。
(3)實驗結果<1>和厚樸酚對RKO細胞成腹水瘤的抑制作用腹水瘤組在腹腔接種當天開始用藥，每天觀測腹部膨隆，隔天記錄體重。比較各組平均生存時間。結果如表1所示，溶劑組和對照組的平均壽命分別是28.8天和29.7天，兩組之間無顯著差異，說明PEG400/蔗糖溶液對Babl/c小鼠無明顯毒副作用。和厚樸酚用藥組平均壽命50.9天，比對照組延長22.18天，最大生存時間是對照組的176.7％，兩組之間有顯著差異(P＜0.05)，說明和厚樸酚能有效抑制RKO細胞形成腹水瘤，并延長荷瘤鼠的生存時間。
表1 和厚樸酚對荷人RKO腹水瘤Balb/C裸鼠的平均生存時間盒生存延長時間的影響實驗分組動物數(shù)MST(天)T/C(％)對照組728.8 100溶劑組629.7 104.5和厚樸酚 750.9 176.7*平均生存時間(mean survival time，MST)。生存時間延長率(The survivalrate，T/C％)，T/C(％)＝[試驗組的平均生存時間/對照組的平均生存時間]×100％.*∶P＜0.01，與溶劑組相比。
<2>和厚樸酚對RKO細胞成實體瘤的抑制作用取Babl/c小鼠10只，待瘤體增長至約5×5mm時，隨機分為對照組(3只)、溶劑組(3只)與用藥組(4只)。用藥組每次灌胃5mg和厚樸酚，隔天一次，持續(xù)21天。溶劑組給予等體積溶劑(PEG400/蔗糖)，對照組給予等體積生理鹽水。隔天稱重及測量瘤體大小，以每周最后一次的數(shù)據(jù)作圖，結果參見圖8，Y軸代表腫瘤體積，X-軸代表藥物治療天數(shù)，可見和厚樸酚可顯著遏制腫瘤的生長，“*”表示與對照組相比P＜0.05。
結果為對照組和用藥組開始時的平均瘤體體積分別為0.185cm3和0.171cm3，一周后兩組的增長率分別是361％和198％，相差1.8倍，但統(tǒng)計表明無組間差異(P＝0.055＞0.05)。第2周時對照組14天平均增長1182％，而用藥組只增長710％，前者與后者的比值為1.66，但統(tǒng)計表明有組間差異(P＝0.011＜0.05)。第3周時用藥組的增長明顯減慢，21天平均增長率是901％，而對照組達到1626％，兩組間差異顯著(P＜0.05)。第4周時對照組動物陸續(xù)死亡，而用藥組也停止給藥，但瘤體增長未見明顯增快，反而其中一只出現(xiàn)瘤體脫落現(xiàn)象。溶劑組與對照組無組間差異。以上結果表明，和厚樸酚對RKO細胞所致實體瘤具有顯著的抑瘤效果。
這些結果充分說明和厚樸酚可通過抑制腫瘤血管生成而抑制腫瘤生長。
綜上所述，和厚樸酚可有效抑制腫瘤血管生成的最關鍵的靶點HIF-1，HIF-1被抑制后，血管生長因子(VEGF)、一氧化氮合成酶等促血管生長的關鍵因子也被抑制。我們進而用動物證明和厚樸酚可有效抑制腫瘤生長。說明和厚樸酚通過抑制HIF-1可有效遏制腫瘤生長。
無需進一步詳細闡述，相信采用前面所公開的內容，本領域技術人員可最大限度地應用本發(fā)明。因此，前面的實施方案應理解為僅是舉例說明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明涉及的部分參考文獻1.Folkman J.Fundamental concepts of the angiogenic process.Curr Mol Med.2003 Nov；3(7)643-512.Christopher W Pugh，Peter J Ratcliffe.Regulation of angigogenesis by hypoxiarole of the HIF system.Nature Medicine，volume 9，number 6，June 2003，677-843.Teng CM，Chen CC，Ko FN，Lee LG，Huang TF，Chen YP，Hsu HY.Two antiplatlet agents from Magnoliaofficinalis.Thromb Res.1988；50757-7654.Watanabe K，Watanabe H，Goto Y，Yamaguchi M，Yamamoto N，Hagino K.Pharmacological properties ofmagnolol and honokiol extracted from Magnolia officinaliscentral depressant effects.Planta Med.1983；49103-1085.Bai X，Cerimele F，Ushio-Fukai M，Waqas M，Campbell PM，Govindarajan B，Der CJ，Battle T，F(xiàn)rankDA，Ye K，Murad E，Dubiel W，Soff G，Arbiser JL.Honokiol，a small molecular weight natural product，inhibits angiogenesis in vitro and tumor growth in vivo.J Biol Chem.2003 Sep 12；278(37)35501-3550權利要求
1.和厚樸酚在制備抗腫瘤血管形成藥物中的用途，和厚樸酚，英文名為honokiol，CAS number35354-74-6，分子量266.33，化學命名為3，5’-diallyl-4，2’-dihydroxybiphenyl，分子式為C18H18O2，其特征是和厚樸酚與藥物賦形劑或載體組合，在制備抗腫瘤血管形成藥物中的應用。
2.根據(jù)權利要求1所述的和厚樸酚在制備抗腫瘤血管生成藥物中的用途，其特征是在制備抗腫瘤化療藥物中的應用。
3.根據(jù)權利要求1-2所述的和厚樸酚在制備抗腫瘤血管形成藥物中的用途，其特征是和厚樸酚的藥物組合物，制劑形式主要包括液體制劑、顆粒劑、片劑、沖劑、膠丸、膠囊、緩釋劑、滴丸劑或口崩制劑。
4.根據(jù)權利要求3所述的和厚樸酚藥物組合物的制劑，其特征是所述制劑的給藥形式主要包括口服給藥或注射給藥。
全文摘要
本發(fā)明提供一種和厚樸酚在制備抗腫瘤血管形成藥物中的用途，該和厚樸酚英文名為honokiol，CAS number35354－74－6，分子量266.33，本發(fā)明制備的和厚樸酚藥物包括制劑允許的藥物賦形劑或載體。本發(fā)明提供的和厚樸酚也在制備臨床腫瘤化療藥物中的應用。劑型主要包括腸道或非腸道組合藥的劑型。制劑形式主要包括液體制劑、顆粒劑、片劑、沖劑、膠丸、膠囊、滴丸劑或注射劑。本發(fā)明提供的和厚樸酚藥物組合物可促進低氧誘導因子－1的分解、抑制血管內皮生長因子和一氧化氮合成酶的表達，可有效抑制腫瘤的血管形成，且毒性低，具有很好的臨床抗腫瘤藥的應用前景。
文檔編號A61K31/05GK1593390SQ20041002565
公開日2005年3月16日 申請日期2004年6月23日 優(yōu)先權日2004年6月23日
發(fā)明者胡汛, 陳菲, 王弢 申請人:浙江大學