專(zhuān)利名稱(chēng)：用于體內(nèi)預(yù)防或治療呼吸系統(tǒng)疾病的小干擾rna制劑及其篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于體內(nèi)預(yù)防或治療呼吸系統(tǒng)疾病的小干擾RNA制劑及其篩選方法。
背景技術(shù)：
SARS是二十一世紀(jì)出現(xiàn)的第一個(gè)嚴(yán)重和易于流行的新的傳染病。盡管目前全球SARS流行得到控制，但因迅猛流行而曾給全球健康保障、醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)、人民生計(jì)、經(jīng)濟(jì)穩(wěn)定和增長(zhǎng)等造成嚴(yán)重影響。人們至今對(duì)這一疾病的認(rèn)識(shí)還有限。2003年2月26日，在越南河內(nèi)的一位香港居民因原因不明的發(fā)熱和呼吸道癥狀而住進(jìn)醫(yī)院，在隨后的2周內(nèi)，香港、加拿大多倫多、新加坡的相繼發(fā)生了類(lèi)似的傳染病爆發(fā)。通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)這些國(guó)家和地區(qū)的指示病例都曾到過(guò)香港并與廣東已患有SARS的客人同住一層樓。該患者曾經(jīng)在廣東治療SARS病人。SARS病毒隨著人員流動(dòng)散播到香港、越南、新加坡的醫(yī)院系統(tǒng)，以及隨著航空旅行路線擴(kuò)散到多倫多和其他地區(qū)，導(dǎo)致了SARS在世界其他國(guó)家的蔓延。SARS在極短時(shí)間內(nèi)，迅速傳播到眾多國(guó)家和地區(qū)、引發(fā)眾多感染，其傳播速度之快，是人們始料不及的。至2003年6月12日止，累計(jì)報(bào)告病例8445例，死亡790例。在報(bào)告病例的國(guó)家和地區(qū)中，亞洲共14個(gè)國(guó)家報(bào)告8087例，死亡757例。報(bào)告病例較多的國(guó)家和地區(qū)是中國(guó)大陸為5328例，死亡343例；香港為1755例，死亡291例；臺(tái)灣為688例，死亡81例；加拿大為238例，死亡32例；新加坡為206例，死亡31例。
有28個(gè)國(guó)家和地區(qū)出現(xiàn)了SARS病人。SARS的傳染性極強(qiáng)，發(fā)展迅速，以飛沫傳播為主，近距離接觸便可感染；無(wú)性別區(qū)別，任何年齡層次皆可出現(xiàn)，但以輕壯年發(fā)病為主(19-55歲)；且潛伏期短，最短2天，最長(zhǎng)不超過(guò)2周，平均6天。由于醫(yī)護(hù)、保健人員與病人接觸較多而成為該病的高危易感人群，占發(fā)病人數(shù)的40％。SARS的臨床病程和癥狀可大致分為三個(gè)階段病毒體內(nèi)增殖階段有高燒、肌肉疼痛、干咳等癥狀，外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)下降，淋巴細(xì)胞亞群CD3[+]、CD4[+]和CD8[+]細(xì)胞絕對(duì)數(shù)目顯著下降，機(jī)體免疫功能受到嚴(yán)重?fù)p害；免疫風(fēng)暴或免疫過(guò)激階段肺部游移陰影，一般在發(fā)病一周后體內(nèi)可檢測(cè)到IgG抗體產(chǎn)生，鼻咽分泌物、糞便和尿中病毒排出量大約發(fā)病后10天左右達(dá)到高峰；嚴(yán)重呼吸窘迫綜合征和多臟器功能衰竭。
從世界衛(wèi)生組織今年3月12日發(fā)出“SARS″警報(bào)后，通過(guò)全球科研人員的共同努力，排除了支原體、衣原體、鼠疫桿菌、軍團(tuán)菌、流感病毒A型和B型、副粘病毒、呼吸道合胞病毒、Hendra病毒、漢坦病毒、哺乳動(dòng)物腺病毒等20余種病原體，通過(guò)病原體分離、血清學(xué)診斷、基因?qū)W分析和動(dòng)物試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⒌人姆矫娴难芯亢?，WHO于2003年4月16日正式宣布，目前在世界各地廣泛流行的SARS病原體是一種以前從未在人類(lèi)中發(fā)現(xiàn)的新型冠狀病毒，稱(chēng)為SARS冠狀病毒(SARS-CoV)。
SARS-CoV屬巢狀病毒目(OrderNidovirus)，冠狀病毒科(FamilyCoronavirus)，冠狀病毒屬(GenusCoronavirus)。根據(jù)其基因組結(jié)構(gòu)分類(lèi)，它屬于單鏈正鏈RNA病毒。冠狀病毒是一類(lèi)宿主范圍廣泛的RNA病毒。病毒體為六角形狀。組成病毒體衣殼的結(jié)構(gòu)蛋白總共有4～5種。包括S蛋白(Spikeprotein)，M蛋白(Membrane protein)，E蛋白(envelop protein)，N蛋白(nucleoprotein)，在某些冠狀病毒中還有HE蛋白(hemagglutinin esterase)。SARS-CoV中的S、E、M和N蛋白在病毒顆粒進(jìn)入宿主細(xì)胞、形態(tài)發(fā)生及釋放過(guò)程中起到重要作用。其中S蛋白即伸出包膜的棒一球形的糖蛋白，它在病毒與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合及介導(dǎo)膜融合進(jìn)人細(xì)胞的過(guò)程中，起關(guān)鍵性作用，也是冠狀病毒主要的抗原蛋白。M蛋白則是一種跨膜蛋白，在病毒的包膜形成與出芽過(guò)程中起重要作用。E蛋白是一種相對(duì)較小的蛋白質(zhì)，主要散在分布于病毒包膜上。位于病毒顆粒中央的不規(guī)則核酸部分即病毒基因組，其上結(jié)合有核殼體蛋白N蛋白。冠狀病毒基因組RNA是一個(gè)無(wú)分段的，正鏈RNA，長(zhǎng)度一般在27-31kb。具有正鏈RNA病毒特有的重要結(jié)構(gòu)特征即RNA鏈5’端有甲基化帽，3’端有PolyA尾，和真核細(xì)胞的mRNA非常相近。
有來(lái)自不同國(guó)家和地區(qū)的10多個(gè)SARS-CoV分離株基因組全序列已經(jīng)完成。其Gene Bank號(hào)分別為NC004718/AY274119(加拿大TOR 2，29751bp)、AY278488(中國(guó)BJ01，29725bp)、AY278554(香港CUHK-W1，29736bp)、AY278491(香港HKU-39849，29742bp)、AY278741(美國(guó)Urbani，29727bp)、AY283794(新加坡SIN2500，29711bp)、AY283794(新加坡SIN2677，29705bp)、AY283794(新加坡SIN2679，29711bp)、AY283794(新加坡SIN2748，29706bp)、AY283794(新加坡SIN2774，29711bp)等。
SARS-CoV基因組有27～31kb、11個(gè)開(kāi)放閱讀框組成。SARS-CoV RNA聚合酶的編碼區(qū)占用了5’端21.2kb，約全基因組的三分之二；后三分之一的區(qū)域，編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白，按基因組上的排列順序依次為S蛋白、E蛋白、M蛋白、N蛋白；未發(fā)現(xiàn)HE蛋白編碼序列。SARS冠狀病毒基因組不編碼HE蛋白。在結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)可能的開(kāi)放閱讀框中，存在已有蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)中未找到任何同源序列的未知蛋白(predicted unknown protein，PUP)，稱(chēng)為非結(jié)構(gòu)蛋白(X1～X5)。這些蛋白位于S和E，M和N之間，及N蛋白的下游，在冠狀病毒各株中差異很大，且不受冠狀病毒復(fù)制的依賴(lài)，其功能尚不清楚。Gene Bank數(shù)據(jù)經(jīng)BLAST和Fast顯示，這些非結(jié)構(gòu)蛋白與目前已知的任何蛋白無(wú)明顯的序列相似性。而其他蛋白在其他病毒基因組中都能找到同源性很高的序列，說(shuō)明這些蛋白可能是決定SARS冠狀病毒具有病毒行為的物質(zhì)基礎(chǔ)。
從整體突變率來(lái)看，不同地區(qū)流行的SARS冠狀病毒的基因組，至少在病毒株采樣期間，保持了相對(duì)穩(wěn)定。來(lái)源于世界不同地區(qū)的11個(gè)SARS冠狀病毒具有99％以上相似性，病毒株之間變異不足1％，全序列比較的相似性評(píng)分達(dá)到5.7×104。雖然變異是存在的，仍然可以推斷，近期世界范圍流行的SARS是同一個(gè)來(lái)源的。從絕對(duì)數(shù)量上看，突變部位主要集中在RNA聚合酶區(qū)域，但是由于突變RNA聚合酶ORF的長(zhǎng)度占基因組三分之二，從突變率來(lái)說(shuō)，結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)的突變率要大大高于聚合酶編碼區(qū)，未知蛋白質(zhì)區(qū)域的突變率高于結(jié)構(gòu)蛋白。這一結(jié)構(gòu)上的突變分布規(guī)律，與病毒功能上的穩(wěn)定性具有一定的一致性。RNA聚合酶的保守性為抗SARS藥物的設(shè)計(jì)提供了重要的思路。
自1998年2月《Nature》發(fā)表了雙鏈RNA(dsRNA)注射入一種線蟲(chóng)后誘導(dǎo)了基因靶向?qū)Ｒ恍缘幕虮磉_(dá)靜寂(gene silencing)，隨后許多研究者先后用RNAi技術(shù)，在線蟲(chóng)、果蠅、植物、動(dòng)物卵細(xì)胞和哺乳類(lèi)細(xì)胞中進(jìn)行了大量研究，采用不同長(zhǎng)度的dsRNA可使不同類(lèi)型細(xì)胞的靶向基因表達(dá)明顯降低，甚至有時(shí)用專(zhuān)一性抗體都檢測(cè)不到靶向基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)或肽類(lèi)。因此，又將RNAi技術(shù)稱(chēng)作基因敲低(knockdown)或使基因靜寂(gene silencing)。21個(gè)核苷酸(21nts)的雙鏈RNA(siRNA)應(yīng)用于培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，使基因表達(dá)明顯降低，這種RNAi技術(shù)比基因敲除(gene knockout)技術(shù)更方便快捷地顯示出基因的功能，有希望用于治療某些由于特定基因表達(dá)過(guò)度引起的疾病，或者可抑制病毒或寄生病原性蛋白表達(dá)引起的疾病。
在AIDS的治療上，RNA干擾可能成為對(duì)抗HIV病毒感染、復(fù)制的最有利方式。人們針對(duì)HIV生活周期的不同階段設(shè)計(jì)了多種siRNA，針對(duì)HIV病毒gag、tat、rev、nef等基因的siRNA可用以控制病毒復(fù)制，針對(duì)宿主細(xì)胞的表面HIV受體基因的siRNA可用以控制病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)，抑制病毒的感染過(guò)程。RNAi技術(shù)除用于抗HIV研究以外，還用于抗其他多種病毒的探索。它們包括乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病毒(influenzavirus)、脊髓灰質(zhì)炎病毒(poliovirus)等。以上研究均取得了另人欣喜的體外病毒抑制作用，但體內(nèi)清除病毒的效果尚須在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭羞M(jìn)一步驗(yàn)證。RNAi技術(shù)可能會(huì)給病毒治療帶來(lái)一場(chǎng)革命。本發(fā)明從大型靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物模型上驗(yàn)證了siRNA藥物對(duì)SARS病毒感染和復(fù)制的抑制能力。
呼吸道給藥能使藥物直接進(jìn)入肺內(nèi)，針對(duì)肺部病變進(jìn)行治療，在肺部聚集較高的藥物濃度，可減少用藥量，快速起效，減少藥物對(duì)全身的影響。與口服和靜脈給藥相比，有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)由于這些優(yōu)點(diǎn)，也可作為肺外疾病治療的一個(gè)系統(tǒng)給藥方式，如霧化吸入嗎啡達(dá)到迅速的鎮(zhèn)痛作用，氣道內(nèi)滴注腎上腺素進(jìn)行心功能搶救。呼吸道給藥方式作為非損傷的給藥技術(shù)，在小分子化合物、蛋白、核酸藥物的導(dǎo)入方面也具有很好的應(yīng)用前景。人肺泡的總表面積大于100m2，肺泡表面至毛細(xì)血管間的距離僅約1μm，是藥物吸收的良好場(chǎng)所。巨大的吸收面積、豐富的毛細(xì)血管和極小的轉(zhuǎn)運(yùn)距離，決定了肺部給藥的迅速吸收，而且吸收后的藥物直接進(jìn)入血液循環(huán)，無(wú)肝臟首過(guò)效應(yīng)，酶活性較低，上皮屏障較薄及膜通透性高。正是由于肺泡的這種特點(diǎn)，有利于提高質(zhì)粒DNA、siRNA等核酸藥物對(duì)肺部的轉(zhuǎn)染效率。
氣道給藥可經(jīng)霧化吸入(Aerosolization)和氣道滴注(instillation)。霧化吸入常用的霧化裝置有定量定壓式氣霧器，干粉吸入器和霧化器，產(chǎn)生的霧粒通過(guò)慣性沉積、重力性沉積和彌散沉積三種方式在氣道沉積。慣性沉積多發(fā)生于上呼吸道；重力性沉積則是直徑較小的霧粒在重力作用下沉積于外周氣道；彌散沉積發(fā)生在末梢氣道，直徑＜1μm的霧粒進(jìn)行彌散運(yùn)動(dòng)，彌散沉積不是霧粒沉積的主要方式。潮氣量、氣流速度和呼吸頻率都會(huì)影響到霧粒在氣道的沉積。另外，霧粒的直徑、形狀、質(zhì)量、體積、攜帶電荷和吸濕性都會(huì)影響到霧粒在氣道的沉積。直徑過(guò)大易沉積于口咽部，過(guò)小會(huì)發(fā)生彌散運(yùn)動(dòng)，都不利于霧粒在氣道內(nèi)沉積。直徑2～3μm的霧粒較為理想。經(jīng)霧化吸入的藥物有抗哮喘藥物，如激素、β2激動(dòng)劑等；改善改善肺循環(huán)藥物，如前列腺素E1(PGE1)；抗生素藥物等。
氣道滴注的方法可使藥物一次性大劑量進(jìn)入肺內(nèi)，療效迅速。氣道滴注過(guò)程中變換體位，可通過(guò)重力作用，使藥物在肺內(nèi)分布較為均勻。機(jī)械通氣中，滴注肺表面活性劑(PS)后短時(shí)間內(nèi)提高氣道峰壓(PIP)，可促進(jìn)PS分布于遠(yuǎn)端肺泡，有助于PS功能的發(fā)揮。在治療肺部病變時(shí)，氣道開(kāi)放和肺泡擴(kuò)張的程度會(huì)影響氣體在肺內(nèi)的分布，嚴(yán)重的肺實(shí)質(zhì)病變會(huì)限制氣體的彌散，降低療效。氣道滴注的藥物有PS、抗生素和氟化碳(perflurocarbon，PFC，尚未成為正式藥物)。siRNA是小分子易于制備成便于吸入的制劑形式，可使用霧化吸入和氣道滴注兩種方式。
呼吸道給藥要解決的問(wèn)題是如何有效地將核酸藥物釋放到靶細(xì)胞而又較少地產(chǎn)生副作用，即載體效率、靶向性和安全性的問(wèn)題，是核酸藥物研究必須解決的問(wèn)題。目前用于核酸藥物導(dǎo)入或基因治療載體的主要有病毒載體系統(tǒng)和非病毒載體系統(tǒng)。
病毒載體主要來(lái)源于鼠和人類(lèi)的DNA、RNA病毒，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒(Ad)、腺相關(guān)病毒(AAV)、慢病毒、單純皰疹病毒(HSV)、牛痘病毒、桿狀病毒、EB病毒(EBV)、水皰性口炎病毒(VSV)和人巨細(xì)胞病毒(CMV)等，并且其中一些已經(jīng)進(jìn)入了臨床試驗(yàn)階段。其他載體，如細(xì)菌載體和人工載體則還處于研究階段。
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體這類(lèi)載體主要來(lái)源于莫洛尼鼠白血病病毒(MLV)，其優(yōu)點(diǎn)是導(dǎo)入的核酸穩(wěn)定整合入宿主細(xì)胞，并持久表達(dá)，感染細(xì)胞范圍廣，基因容量較大(＜8kb)，機(jī)體對(duì)載體產(chǎn)生的免疫反應(yīng)較低。缺點(diǎn)是載體的整合是隨機(jī)的，插入基因的表達(dá)受兩側(cè)宿主DNA序列影響，并可導(dǎo)致插入突變，而且只感染分裂細(xì)胞。體內(nèi)有效的基因治療需要有足夠高的感染率，大部分逆轉(zhuǎn)錄病毒載體都很難達(dá)到，臨床上用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)移基因的研究正在逐漸減少。腺病毒載體腺病毒2型和5型對(duì)人類(lèi)沒(méi)有大的致病性，常用作基因治療載體。腺病毒載體的優(yōu)點(diǎn)是導(dǎo)入效率明顯高于逆轉(zhuǎn)錄病毒，可制備的病毒滴度高，對(duì)分裂和非分裂細(xì)胞都有感染性。缺點(diǎn)是無(wú)靶向性，而且能引起機(jī)體較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，外源基因不能在體內(nèi)長(zhǎng)期表達(dá)。腺相關(guān)病毒載體(AAV載體)無(wú)致病性，免疫原性低，不存在插入突變或致癌的危險(xiǎn)，能感染分裂和不分裂細(xì)胞。AAV的基因組結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，僅包含兩端的LTR序列和2個(gè)編碼基因(rep和cap)，易于操作，缺點(diǎn)是僅能攜帶4.0kb左右的外源基因。由慢病毒改造而來(lái)的慢病毒載體能用于感染不分裂細(xì)胞如神經(jīng)細(xì)胞、造血細(xì)胞、肌纖維細(xì)胞等。慢病毒能穩(wěn)定整合入宿主染色體，因此能持久穩(wěn)定表達(dá)外源基因。研究發(fā)現(xiàn)慢病毒載體在基因治療卵巢癌的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)染效率比逆轉(zhuǎn)錄病毒載體高10倍，表達(dá)效率高近100多倍。慢病毒用作基因治療載體有毒力恢復(fù)、垂直感染等安全問(wèn)題，而安全性是基因治療載體的首要條件，因此慢病毒載體要應(yīng)用于臨床還有待于更多的深入研究。單純皰疹病毒載體HSV載體能攜帶30kb～50kb的外源基因，可在多種細(xì)胞中復(fù)制，能感染分裂和不分裂細(xì)胞。近年來(lái)出現(xiàn)了更多的基因治療病毒載體，如桿狀病毒、EBV、牛痘病毒、VSV和CMV等。庚型肝炎病毒(HGV)對(duì)人沒(méi)有明顯的致病性，對(duì)肝細(xì)胞、淋巴細(xì)胞有親嗜性，復(fù)制機(jī)制與HCV相似，也有研究嘗試將其改造成肝細(xì)胞和(或)淋巴細(xì)胞靶向基因治療的載體。
經(jīng)過(guò)改造的病毒載體，轉(zhuǎn)染效率較高，但在于制備復(fù)雜，有免疫原性，體內(nèi)不能反復(fù)應(yīng)用，安全性存在隱患以及非導(dǎo)向性，在臨床應(yīng)用上存在一些困難。非病毒載體是核酸藥物，尤其是反義核酸、質(zhì)粒DNA以及siRNA核酸藥物的重要途徑。通常利用親水或疏水的多價(jià)陽(yáng)離子聚合物來(lái)凝聚重組質(zhì)?；蚍戳x寡核苷酸，形成微粒，被細(xì)胞內(nèi)吞。盡管非病毒載體轉(zhuǎn)染效率仍低于病毒性載體，但非病毒載體由于具有低毒、低免疫反應(yīng)、靶向性和易于組裝等優(yōu)點(diǎn)。
將目的基因連接在表達(dá)的質(zhì)?；蚴删w中，以及一些核酸片斷直接注射而不依賴(lài)其它物質(zhì)的介導(dǎo)，是最簡(jiǎn)單的非病毒載體系統(tǒng)。已知皮膚細(xì)胞、某些腫瘤細(xì)胞、肺泡細(xì)胞及免疫細(xì)胞等對(duì)裸DNA較為敏感。直接給藥后可直接誘導(dǎo)相應(yīng)的免疫反應(yīng)，也可檢測(cè)到DNA的明顯表達(dá)以及對(duì)基因的抑制效果。常用的有電穿孔和基因槍法等。目前使用的DNA疫苗，就是用編碼病毒抗原的質(zhì)粒直接肌內(nèi)注射，可獲得有效的抗病毒免疫。雖然將裸DNA或RNA直接用于病變組織是可行的基因轉(zhuǎn)移策略，但是，對(duì)于解剖學(xué)上不能進(jìn)入的部位如器官里的實(shí)體瘤，顯然給予裸核酸是無(wú)效的。
脂質(zhì)體是將藥物包封于類(lèi)脂雙分子層形成的單層或多層球形微粒，類(lèi)似細(xì)胞結(jié)構(gòu)，有生物膜的特性和功能。它可以包裹水溶性和脂溶性?xún)煞N類(lèi)型的藥物。應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因脂質(zhì)體DNA復(fù)合物分為陽(yáng)性、中性脂質(zhì)體、陰性脂質(zhì)體以及pH-敏感的脂質(zhì)體。還不斷有新型的脂質(zhì)體被推出，如雙四銨化合物等。脂質(zhì)體經(jīng)聚乙二醇(PEG)修飾后，可降低脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物顆粒之間的相互聚集，降低了與血液成分的相互作用，使脂質(zhì)體DNA復(fù)合物顆粒由大顆粒變成小顆粒，同時(shí)不影響脂質(zhì)體與細(xì)胞的親和力。RNA/DNA寡核苷鏈嵌合分子曾被用于修復(fù)DNA基因中的單個(gè)堿基突變。
陽(yáng)離子多聚物可濃縮富含陰離子的DNA，然后粘附到細(xì)胞表面的硫酸粘多糖上，被細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而使質(zhì)粒表達(dá)。陽(yáng)離子多聚物種類(lèi)很多，如聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI)，聚丙烯亞胺樹(shù)突狀物(polypropyleniminedendrimers)，聚酰胺樹(shù)突狀物(polyamidoamine dendrimer)，多聚賴(lài)氨酸、多聚組氨酸、多聚精氨酸、魚(yú)精蛋白、聚氨基葡萄糖(chitosan)等以及上述聚合物的聚乙二醇修飾物。其中研究較早的是多聚賴(lài)氨酸，后來(lái)發(fā)現(xiàn)聚乙烯亞胺性能更佳。PEI可抑制溶酶體，在吞噬泡酸性環(huán)境中質(zhì)子化、正電荷增加，對(duì)DNA提供更大的保護(hù)作用，有利于核酸逃離吞噬泡。由于DNA與陽(yáng)離子多聚物形成的轉(zhuǎn)移復(fù)合物是通過(guò)內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，易被溶酶體降解，因此加入吞噬泡釋放劑有利于提高轉(zhuǎn)染效率。最常用的吞噬泡釋放劑是氯喹和兩性分子肽。
多肽基因釋放系統(tǒng)中最早使用的是二油酰蜂毒肽(dioleoylmelittin)，與質(zhì)粒DNA形成環(huán)形顆粒，可有效地轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，建立了多肽轉(zhuǎn)基因載體的方法。堿性氨基酸多肽長(zhǎng)度16～18氨基酸足以轉(zhuǎn)移DNA至細(xì)胞內(nèi)。陽(yáng)離子多聚賴(lài)氨酸或精氨酸肽鏈壓縮DNA分子，最少需6到8個(gè)陽(yáng)離子氨基酸殘基；添加半胱氨酸和組氨酸后可以增加轉(zhuǎn)染效率，如Cys-His-(Lys)(6)-His-Cys寡肽等。多肽載體是配體區(qū)、結(jié)合DNA的陽(yáng)離子區(qū)、核定位信號(hào)區(qū)、兩性分子功能區(qū)，是四位一體的合成短肽。如THALWHT寡肽可特異結(jié)合氣道上皮，共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)標(biāo)記的THALWHT寡肽與細(xì)胞結(jié)合后，被吞入細(xì)胞內(nèi)；包含CTHALWHTC序列和DNA結(jié)合部分的合成多肽，能有效地將基因轉(zhuǎn)移到氣道上皮細(xì)胞內(nèi)。添加吞噬泡釋放劑、陽(yáng)離子聚合物以及病毒的表面蛋白顆粒有助于提高轉(zhuǎn)染效率。多肽載體的優(yōu)勢(shì)在于可用多肽合成儀合成，便于體內(nèi)應(yīng)用和基因工程法生產(chǎn)，克服了配體寡肽與多聚賴(lài)氨酸或PEI偶聯(lián)制備的復(fù)雜性、不均一性以及系統(tǒng)誤差大的缺陷。多肽載體是非病毒載體小型化的趨勢(shì)。不足之處在于陽(yáng)離子負(fù)荷相對(duì)偏少。
SiRNA可通過(guò)以下幾種方法合成?？梢酝ㄟ^(guò)化學(xué)合成法能夠獲得高純度、高質(zhì)量、序列特定的siRNA，不會(huì)污染長(zhǎng)的dsRNA，避免了可能的非特異性干擾。此外，也可以通過(guò)以下方法合成siRNA，這些方法具有經(jīng)濟(jì)、快速的特點(diǎn)，但獲得的siRNA質(zhì)量不高，純度不夠，會(huì)受到不同長(zhǎng)度的dsRNA的干擾，有時(shí)會(huì)導(dǎo)致非特異性免疫和干擾a.體外轉(zhuǎn)錄，以DNA Oligo為模版，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄合成siRNAs；b.選擇通常是200-1000堿基的靶mRNA模版，用體外轉(zhuǎn)錄的方法制備長(zhǎng)片斷雙鏈dsRNA，然后用RNase III(or Dicer)在體外消化，得到一種混合的siRNAs，通常能夠保證目的基因被有效地抑制。C.通過(guò)siRNA表達(dá)載體或者病毒載體制備。多數(shù)的siRNA表達(dá)載體依賴(lài)三種RNA聚合酶III啟動(dòng)子(pol III)中的一種，操縱一段小的發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。這三類(lèi)啟動(dòng)子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動(dòng)子和人H1啟動(dòng)子。之所以采用RNA pol III啟動(dòng)子是由于它可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)更多的小分子RNA，而且它是通過(guò)添加一串(3到6個(gè))U來(lái)終止轉(zhuǎn)錄的。d.PCR制備的siRNA表達(dá)框在細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生siRNA。siRNA表達(dá)框架(siRNA expressioncassettes，SECs)是一種由PCR得到的siRNA表達(dá)模版，包括一個(gè)RNA pol III啟動(dòng)子，一段發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNA，一個(gè)RNA pol III終止位點(diǎn)，能夠直接導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)而無(wú)需事前克隆到載體中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于體內(nèi)預(yù)防或治療呼吸系統(tǒng)疾病的小干擾RNA制劑，使用體外細(xì)胞水平篩選到的siRNA，通過(guò)裸siRNA、病毒載體(如腺病毒等)或非病毒載體(如多肽、陽(yáng)離子聚合物)等方式，以氣道吸入和滴注的途徑將siRNA導(dǎo)入呼吸道細(xì)胞內(nèi)，并通過(guò)非人靈長(zhǎng)類(lèi)的動(dòng)物模型，驗(yàn)證了siRNA制劑對(duì)動(dòng)物模型呼吸道細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率和siRNA對(duì)呼吸系統(tǒng)疾病的治療效果。本發(fā)明還提供了用于呼吸系統(tǒng)疾病的藥物篩選方法，尤其是核酸類(lèi)藥物。
本發(fā)明用于體內(nèi)預(yù)防或治療呼吸系統(tǒng)疾病的小干擾RNA制劑，是由小干擾RNA和小干擾RNA導(dǎo)入載體組成、或由小干擾RNA組成。
所述的小干擾RNA可以是化學(xué)合成的21-23堿基對(duì)的雙鏈RNA；也可以是載體或表達(dá)框架表達(dá)的21-23堿基對(duì)的雙鏈RNA。
所述的小干擾RNA可以是由作用于一個(gè)靶序列的單一小干擾RNA組成，也可以由作用于一個(gè)基因的多個(gè)靶序列或多個(gè)基因上的靶序列的多個(gè)小干擾RNA組成。
所述的靶序列可以是SARS冠狀病毒的序列，或呼吸道合胞病毒的序列，或禽流感病毒，或其它呼吸道病毒的序列，或發(fā)病宿主自身的內(nèi)源基因的序列。
作用于SARS冠狀病毒靶序列的小干擾RNA的序列可以由至少一個(gè)以下的序列組成①5’aacgagtaactcgtccctctt 3’；②5’aattgcataccgcaatgttct 3’；③5’aacctttggagaagatactgt 3’；④5’aatcacatttgagcttgatga 3’；⑤5’aatgttacagggtttcatact 3’；⑥5’aaggatgaggaaggcaattta 3’；⑦5’aagagactatttataacttgg 3’；⑧5’aaggataagtcagctcaatgc 3’；⑨5’aactggcacactacttgtcga 3’；⑩5’aagctcctaattacactcaac 3’；所述的載體或表達(dá)框架為RNA聚合酶III啟動(dòng)子和RNA聚合酶III終止子調(diào)控小干擾RNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)；所述RNA聚合酶III啟動(dòng)子包括人源和鼠源的U6啟動(dòng)子和人H1啟動(dòng)子。
所述的小干擾RNA導(dǎo)入載體可以是陽(yáng)離子聚合物，包括聚乙烯亞胺(PEI)，多聚賴(lài)氨酸、多聚組氨酸，及其聚乙二醇修飾物；也可以是聚丙烯亞胺樹(shù)突狀物，聚酰胺樹(shù)突狀物，及其聚乙二醇修飾物；所述的小干擾RNA導(dǎo)入載體也可以是脂質(zhì)體，包括卵磷脂、磷脂酰乙醇胺，N-[1-(2，3-Dioleoyloxy)]-N，N，N-三甲銨離子與丙烷甲基硫酸鹽(DOTAP)/二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)(W∶W，3∶1)，也可以是其聚乙二醇的修飾物；所述的小干擾RNA導(dǎo)入載體也可以是多肽，其序列特征為N端-KKACLLALAHHLAHHHHLALHLACLALKKA-C端，可以是直線型或分枝型的的多肽化合物；所述的小干擾RNA導(dǎo)入載體也可以是核酸保護(hù)劑，包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、生理鹽水、葡萄糖溶液。
本發(fā)明的篩選方法為將待篩選的小干擾RNA與小干擾RNA導(dǎo)入載體混合后，在病毒感染前和病毒感染后導(dǎo)入大型靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物模型的呼吸道，通過(guò)病毒基因組拷貝數(shù)和病毒感染性顆粒滴度的降低篩選出能有效防治SARS疾病的小干擾RNA；通過(guò)大型靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物模型的肺部損傷減輕篩選出能有效防治SARS疾病的小干擾RNA；通過(guò)大劑量和重復(fù)導(dǎo)入小干擾RNA到大型靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物模型呼吸道篩選出不影響心臟、肝臟、脾臟、腎臟、淋巴結(jié)以及血液系統(tǒng)正常功能的小干擾RNA。
所述的導(dǎo)入小干擾RNA的劑量為5mg-50mg；導(dǎo)入的小干擾RNA可以是一次導(dǎo)入也可以?xún)纱位騼纱我陨现貜?fù)導(dǎo)入。所述的大型靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，可以是恒河猴或食蟹猴或黑猩猩。
呼吸系統(tǒng)疾病如哮喘、肺癌等發(fā)病率逐年提高，迫切需要新特藥物。在呼吸系統(tǒng)疾病中，以呼吸系統(tǒng)病毒性傳染病對(duì)生命健康和社會(huì)發(fā)展的影響最大。在2003年初爆發(fā)的SARS疾病，由于具有很強(qiáng)的近距離傳染性和較高的致死率，在全國(guó)乃至世界迅速傳播，給經(jīng)濟(jì)和人們的生活帶來(lái)很大的損失。我國(guó)政府高度重視SARS疾病所帶來(lái)的影響。需要一種有效的防治SARS疾病的特效藥。SARS疾病是由冠狀病毒引起的，與流感病毒和艾滋病病毒一樣同屬RNA病毒。哺乳動(dòng)物的RNAi(RNA干涉)技術(shù)是最近兩年才發(fā)展起來(lái)的，能夠特異的降解目標(biāo)RNA和抑制目標(biāo)基因的表達(dá)，根據(jù)RNAi技術(shù)開(kāi)發(fā)的siRNA(小分子雙鏈RNA)藥物具有特異地降解目的RNA的作用。siRNA藥物具有以下優(yōu)點(diǎn)1、特異性強(qiáng)，安全性高，還未見(jiàn)有毒性和副作用的研究報(bào)道。2、用量少，具有放大效應(yīng)，即少量的siRNA藥物進(jìn)入細(xì)胞后，降解病毒RNA或致病基因的mRNA，被降解的RNA又可以作為新的藥物。3、能夠引起基因水平的免疫，有效預(yù)防病毒病。4、能在分子水平有效治療病毒病和基因表達(dá)不正常所引起的疾病。我們采用RNAi技術(shù)發(fā)明了以下在非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物模型中篩選防治呼吸系統(tǒng)疾病新藥的新策略，尤其使用于防治SARS等呼吸系統(tǒng)病毒性傳染疾病藥物的篩選。


圖1為本發(fā)明所設(shè)計(jì)并使用的針對(duì)SARS的siRNA的靶序列在SARS RNA基因組上的分布情況。
圖2為聚乙二醇修飾的PEI。
圖3為實(shí)驗(yàn)5組肺部染色的病理切片。
圖4為實(shí)驗(yàn)4組肺部染色的病理切片。
圖5為實(shí)驗(yàn)3組肺部染色的病理切片。
圖6為實(shí)驗(yàn)2組肺部染色的病理切片。
圖7為實(shí)驗(yàn)1組肺部染色的病理切片。
圖8為熒光標(biāo)記的siRNA經(jīng)呼吸道給藥技術(shù)成功導(dǎo)入呼吸系統(tǒng)。
圖9高效導(dǎo)入siRNA到小鼠呼吸道成功敲低SARS靶序列。
具體實(shí)施例方式
首先設(shè)計(jì)了針對(duì)SARS病毒的RNA基因組，設(shè)計(jì)了48條siRNA，其中包括靶向5’UTR、ORF1a(nsp-1、nsp-3、nsp-6)、ORF1b(nsp-12、nsp-13、nsp-14、nsp-16)、ORF2(spike)、ORF3a、ORF4(E-protein)、ORF5(M-protein)、ORF7和ORF9a(N-protein)的siRNA(見(jiàn)圖1)。并采用化學(xué)方法和體外轉(zhuǎn)錄的合成了這48條siRNA。采用脂質(zhì)體方法在SARS冠狀病毒感染猴胚腎細(xì)胞(FRhk-4)之前和之后分別對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的siRNA雙鏈分子。通過(guò)實(shí)時(shí)定量RT-PCR評(píng)價(jià)siRNA分子對(duì)降低細(xì)胞內(nèi)病毒基因組拷貝數(shù)的抑制作用；通過(guò)以CPE為基礎(chǔ)的病毒滴定技術(shù)來(lái)評(píng)價(jià)siRNA分子減少細(xì)胞培養(yǎng)基病毒滴度的作用，通過(guò)這些指標(biāo)評(píng)價(jià)siRNA雙鏈分子的抑制效果。從中發(fā)現(xiàn)四條siRNA雙鏈分子能有效抑制SARS冠狀病毒的感染和復(fù)制。并觀察到siRNA雙鏈分子在至少72小時(shí)內(nèi)對(duì)預(yù)防SARS冠狀病毒的抑制效果達(dá)到90％以上。針對(duì)冠狀病毒不同區(qū)域的有明顯抑制效果的siRNA雙鏈分子聯(lián)合使用可使治療效果達(dá)到80％以上。將這四條siRNA的序列克隆進(jìn)哺乳動(dòng)物表達(dá)載體或表達(dá)框架，含siRNA序列的哺乳動(dòng)物重組表達(dá)載體或表達(dá)框感染FRhk-4，可獲得與上述類(lèi)似的結(jié)果。
以上結(jié)果表明，通過(guò)合理設(shè)計(jì)siRNA分子，siRNA藥物在體外預(yù)防和治療呼吸系統(tǒng)疾病是切實(shí)可行。
為了在模式動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)一步考察siRNA的藥效，需要對(duì)siRNA藥物進(jìn)行前處理。我們先后采用陽(yáng)離子化合物、脂質(zhì)體化合物、多肽核酸釋放體系以及核酸保護(hù)劑對(duì)體外篩選來(lái)的siRNA進(jìn)行處理，從而達(dá)到保護(hù)siRNA避免被酶降解，提高siRNA的穩(wěn)定性。這些化合物富含陽(yáng)離子正電荷的特點(diǎn)或具有兩親性(有疏水親水兩性)的特點(diǎn)能夠結(jié)合或保護(hù)siRNA，所形成的復(fù)合物能夠與細(xì)胞膜發(fā)生相互作用或有助于細(xì)胞膜對(duì)siRNA的攝取。陽(yáng)離子化合物有聚乙烯亞胺(PEI)、聚丙烯亞胺樹(shù)突狀物(polypropylenimine dendrimers)、聚酰胺樹(shù)突狀物(polyamidoamine dendrimer)、陽(yáng)離子聚酯(PAGA)、多聚賴(lài)氨酸、多聚組氨酸、多聚精氨酸等與一定量的siRNA制備成復(fù)合物；脂質(zhì)體或經(jīng)聚乙二醇修飾的脂質(zhì)體分別與siRNA形成復(fù)合物；含有H1組蛋白的部分序列或富含組氨酸、賴(lài)氨酸的多肽與一定量的siRNA制備成復(fù)合物；核酸保護(hù)制劑有聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)與生理鹽水、葡萄糖溶液等形成的非離子兩親性高分子，其親水性部分通過(guò)氫鍵、范德華力等和siRNA分子相互作用，疏水性部分覆蓋在siRNA分子周?chē)?，?dǎo)致siRNA表面具有一定疏水性，可以在一定程度上增加siRNA的穩(wěn)定性，減少核酸酶的降解，siRNA的疏水性增加有助于細(xì)胞膜通過(guò)疏水相互作用攝取siRNA。上述制備的復(fù)合物分別經(jīng)鼻噴霧和滴注的方式導(dǎo)入小鼠和恒和猴的呼吸系統(tǒng)。
首先，在小鼠體內(nèi)驗(yàn)證了上述陽(yáng)離子聚合物、脂質(zhì)體化合物、多肽化合物以及核酸保護(hù)劑對(duì)siRNA的穩(wěn)定、保護(hù)和提高體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率的作用(見(jiàn)圖8所示)。
研究結(jié)果表明，30ug的熒光標(biāo)記的siRNA與50ul(含5％葡萄糖和12ug的核酸保護(hù)制劑)混合制備成復(fù)合物，經(jīng)鼻導(dǎo)入呼吸道和肺部細(xì)胞中。4小時(shí)后將動(dòng)物安樂(lè)死，對(duì)呼吸系統(tǒng)器官取樣，在熒光顯微鏡下檢測(cè)熒光標(biāo)記的siRNA在體內(nèi)的穩(wěn)定性和分布情況。從圖8中可看出，在呼吸道和肺部分布著大量的表現(xiàn)出熒光的siRNA，即使用磷酸緩沖液(PBS)洗去吸附在細(xì)胞表面的siRNA后，仍可檢測(cè)到大量的發(fā)出熒光的siRNA。
在成功將siRNA高效導(dǎo)入呼吸系統(tǒng)后，我們?cè)O(shè)計(jì)了SARS基因序列和螢火蟲(chóng)熒光素酶基因(Luc基因)的融合基因，并將融合基因克隆到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pCI，夠建成PCI-SC-Luc重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄出的mRNA含有SARS的mRNA并且能夠翻譯出有活性的螢火蟲(chóng)熒光素酶，如果SARS特異的siRNA能夠降解該融合基因的mRNA，就檢測(cè)不到螢火蟲(chóng)熒光素酶。從圖9中可知，SARS特異的siRNA能有效抑制螢火蟲(chóng)熒光素酶的表達(dá)。
在建立了siRNA藥物呼吸系統(tǒng)給藥方法后，我們將進(jìn)一步在非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物體內(nèi)評(píng)價(jià)siRNA對(duì)呼吸系統(tǒng)疾病的防治作用，重點(diǎn)研究siRNA對(duì)SARS疾病的防治效果。
首先建立了SARS病毒感染的恒河猴動(dòng)物模型。恒河猴SARS疾病動(dòng)物模型接種來(lái)自病人的SARS病毒后能表現(xiàn)出與SARS疾病類(lèi)似的癥狀和類(lèi)似的血液學(xué)方面的表現(xiàn)。SARS病毒經(jīng)鼻腔接種后，2-3天后出現(xiàn)發(fā)燒的癥狀；感染病毒7-10天內(nèi)，可以通過(guò)RT-PCR檢測(cè)出病毒的復(fù)制，并且在組織樣本中鑒定和分離出SARS病毒；感染病毒17天左右，可以檢測(cè)出SARS病毒特異的抗體；感染病毒30天左右，可以觀察到肺部的損傷。
設(shè)計(jì)了一系列試驗(yàn)評(píng)價(jià)SARS特異siRNA在動(dòng)物體內(nèi)藥效和安全性。將權(quán)力要求中的siRNA混合使用或取其中3條、或兩條混合使用，與siRNA轉(zhuǎn)染試劑配制成siRNA體內(nèi)導(dǎo)入制劑，也可從表1所示的序列選擇多條序列單獨(dú)或混合使用。配制好的siRNA在病毒攻擊前后不同時(shí)間把不同劑量的siRNA制劑通過(guò)鼻腔噴霧和滴注的方式導(dǎo)入到恒河猴的呼吸道和肺部細(xì)胞中。SiRNA處理時(shí)間為SARS病毒攻擊恒河猴4-72小時(shí)前(每隔24-48小時(shí)給藥一次)、SARS病毒攻擊恒河猴后4-144小時(shí)(每隔24小時(shí)-48小時(shí)給藥一次)。

如圖3所示，實(shí)驗(yàn)5組(SARS病毒感染恒和猴動(dòng)物模型組)病變范圍廣，表現(xiàn)為以肺泡間隔增厚，局部增厚的肺間隔相互融合實(shí)變，肺泡間隔內(nèi)出現(xiàn)多少不等的單核樣細(xì)胞浸潤(rùn)為特征的肺間質(zhì)性炎，部分肺間隔充血出血，肺泡上皮增生，病變較單一，局部肺泡腔內(nèi)有滲出，未見(jiàn)明顯的壞死。
如圖4所示，實(shí)驗(yàn)4組(感染SARS的恒和猴經(jīng)SARS不相關(guān)的Luc-siRNA給藥)表現(xiàn)為肺泡間隔明顯增厚伴大量單核樣細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，病變嚴(yán)重區(qū)增厚的肺間隔相互融合實(shí)變伴大量的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，其中可見(jiàn)單核樣細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、組織細(xì)胞及少量的嗜酸性粒細(xì)胞等多種炎細(xì)胞，實(shí)變區(qū)殘留肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)明顯的蛋白性滲出，肺泡上皮增生，有的肺泡腔內(nèi)還可見(jiàn)多個(gè)組織細(xì)胞如圖5所示，實(shí)驗(yàn)3組(感染SARS的恒和猴經(jīng)SARS特異的siRNA給藥治療組)肺組織結(jié)構(gòu)、形態(tài)大致正常。肺間隔局灶狀輕度增寬伴少量單核細(xì)胞浸潤(rùn)。
如圖6所示，實(shí)驗(yàn)2組(感染SARS的恒和猴經(jīng)SARS特異的siRNA給藥治療組)肺間隔局灶狀輕度增寬伴少量單核細(xì)胞浸潤(rùn)，肺間隔充血，銀染色示病變肺泡壁彈力纖維有局限斷裂。
如圖7所示，實(shí)驗(yàn)1組(感染SARS的恒和猴經(jīng)SARS特異的siRNA給藥預(yù)防組)病變輕，呈局灶性肺間質(zhì)性炎肺間隔局灶狀輕度增寬伴少量單核細(xì)胞浸潤(rùn)，肺間隔充血。
其中在SARS病毒攻擊恒河猴4小時(shí)前給藥(30mg/次，預(yù)防組)，與對(duì)照組1(SARS病毒感染的恒河猴模型只給與生理鹽水)和對(duì)照組2(SARS病毒感染的恒河猴模型只給予非SARS病毒相關(guān)的siRNA)相比，肺部排放到鼻咽部位的SARS病毒的RNA基因組的拷貝數(shù)檢測(cè)陽(yáng)性率為25％(見(jiàn)表2)，而且檢測(cè)到的病毒拷貝數(shù)也分別比對(duì)照組1和對(duì)照組2分別減少了94.72％和98.88％，而且能明顯減輕SARS病毒所引起的肺部損傷，肺部結(jié)構(gòu)和形態(tài)明顯好于未經(jīng)siRNA藥物處理的對(duì)照組(圖3-圖7、表1)。而對(duì)照組的陽(yáng)性率為100％。
表2上述實(shí)驗(yàn)各組病毒的RNA基因組的拷貝數(shù)檢測(cè)

其中在SARS病毒攻擊恒河猴后4小時(shí)、36小時(shí)、72小時(shí)給藥三次(30mg/次，治療組)，與對(duì)照組1(SARS病毒感染的恒河猴模型只給與生理鹽水)和對(duì)照組2(SARS病毒感染的恒河猴模型只給予非SARS病毒相關(guān)的siRNA)相比，肺部排放到鼻咽部位的SARS病毒的RNA基因組的拷貝數(shù)檢測(cè)陽(yáng)性率為25％，而且檢測(cè)到的病毒拷貝數(shù)也分別比對(duì)照組1和對(duì)照組2分別減少了85.96％和97.07％(表2)，而且能明顯減輕SARS病毒所引起的肺部損傷，肺部結(jié)構(gòu)和形態(tài)明顯好于未經(jīng)siRNA藥物處理的對(duì)照組(圖3-圖7、表1)。而對(duì)照組的陽(yáng)性率為100％。
本發(fā)明還提供了siRNA的劑量范圍5-50mg，在此范圍內(nèi)siRNA能有效抑制細(xì)胞內(nèi)的mRNA，從而有效降解外源或內(nèi)源的siRNA。其中在SARS病毒攻擊恒河猴后4小時(shí)、36小時(shí)、72小時(shí)給藥三次(10mg/次，治療組)，與對(duì)照組1(SARS病毒感染的恒河猴模型只給與生理鹽水)和對(duì)照組2(SARS病毒感染的恒河猴模型只給予非SARS病毒相關(guān)的siRNA)相比，肺部排放到鼻咽部位的SARS病毒的RNA基因組的拷貝數(shù)檢測(cè)陽(yáng)性率為25％，而且檢測(cè)到的病毒拷貝數(shù)也分別比對(duì)照組1和對(duì)照組2分別減少了78.86％和84.49％，而且能明顯減輕SARS病毒所引起的肺部損傷，肺部結(jié)構(gòu)和形態(tài)明顯好于未經(jīng)siRNA藥物處理的對(duì)照組(圖3-圖7、表1)。而對(duì)照組的陽(yáng)性率為100％。
在本發(fā)明所使用的siRNA制劑及其劑量范圍內(nèi)，尚未有毒理反應(yīng)。
這類(lèi)siRNA物質(zhì)組成和應(yīng)用方法不僅適用呼吸道的感染性疾病的治療，而且適用于其他呼吸道的疾病的治療，如哮喘，COPD，RSV和ARS，等。在大型靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物模型中有效利用小干擾RNA來(lái)治療傳染性肺病的實(shí)踐也將適用與其他類(lèi)型的疾病，如代謝疾病、自免疫疾病和癌癥。大型靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物模型為小干擾RNA藥物的毒性和有效性實(shí)驗(yàn)提供了一個(gè)最接近人類(lèi)的檢測(cè)方法。
實(shí)施例1陽(yáng)離子聚合物/siRNA制劑的制備。根據(jù)我們?cè)诩?xì)胞水平的研究結(jié)果，通過(guò)化學(xué)方法合成(由德國(guó)QIAGENE公司提供合成服務(wù))siRNA(見(jiàn)序列表)。琥珀酰亞胺基PEG3400(PEG3400-N-hydroxy succinimide，購(gòu)自ShearwaterPolymers公司)(圖2)溶于100mM HEPES(pH8)緩沖液中，緩慢加入PEI溶液，在室溫下不停攪拌5-9小時(shí)，檢測(cè)PH值為9.5，在室溫下放置4-6天，凍干反應(yīng)產(chǎn)物，重新溶于5mM HEPES配制的150mM NaCl(pH 7)溶液中，經(jīng)凝膠柱純化、透析后待用。PEG-PEI和PEI按1∶1的比例混合溶于5mM HEPES(pH8)緩沖液.合成的siRNA也溶于5mM HEPES(pH8)緩沖液。兩者按2∶1的比例混合，振蕩混勻30秒。
實(shí)施例2陽(yáng)離子多肽/siRNA制劑的制備。
適量的siRNA溶于不含RNA酶的無(wú)菌水中，輕輕混勻，因?yàn)轶w積有限，可采用高濃度的siRNA，一般siRNA為8-15μg/μL。
取適量的siRNA與陽(yáng)離子多肽(見(jiàn)序列表)混合。SiRNA與陽(yáng)離子多肽按1∶4-8的比例混合，在室溫下溫育30分鐘，以形成siRNA/陽(yáng)離子多肽復(fù)合物。制備的siRNA/陽(yáng)離子多肽復(fù)合物可用于體內(nèi)(包括呼吸系統(tǒng))導(dǎo)入siRNA。本方法也適用于DNA或DNA/siRNA復(fù)合物體內(nèi)導(dǎo)入。
實(shí)施例3核酸保護(hù)劑/siRNA制劑的制備。
取適量的siRNA(5-50mg)溶于無(wú)RNA酶的無(wú)菌雙蒸水配制的聚乙烯吡咯烷和葡萄糖溶液中，在4℃混勻，制成siRNA/核酸保護(hù)劑的復(fù)合物，用于siRNA的呼吸道給藥操作。
實(shí)施例4脂質(zhì)體/siRNA制劑的制備。
將磷脂、膽固醇等類(lèi)脂質(zhì)及脂溶性藥物溶于氯仿(或其他有機(jī)溶劑中)然后將氯仿溶液在一玻璃瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，在瓶?jī)?nèi)壁上形成一薄膜；將水溶性藥物溶于磷酸鹽緩沖液中，加入燒瓶中不斷攪拌，即得脂質(zhì)體。制備好的脂質(zhì)體按照4-8∶1的比例與siRNA混勻，室溫下放置30分鐘，就可制成脂質(zhì)體/siRNA制劑。
實(shí)施例5應(yīng)用SARS病毒恒河猴感染模型評(píng)價(jià)siRNA抑制SARS病毒感染與復(fù)制的的藥效及安全性。
(一)建立SARS疾病動(dòng)物模型。
恒河猴SARS疾病動(dòng)物模型接種來(lái)自病人的SARS病毒后能表現(xiàn)出與SARS疾病類(lèi)似的癥狀和類(lèi)似的血液學(xué)方面的表現(xiàn)。SARS病毒經(jīng)鼻腔接種后，2-3天后出現(xiàn)發(fā)燒的癥狀；感染病毒7-10天內(nèi)，可以通過(guò)RT-PCR檢測(cè)出病毒的復(fù)制，并且在組織樣本中鑒定和分離出SARS病毒；感染病毒17天左右，可以檢測(cè)出SARS病毒特異的抗體；感染病毒30天左右，可以觀察到肺部的損傷。
(二)藥物劑量通過(guò)一定的配比制成siRNA藥物；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的給藥劑量分為5-50mg。
(三)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的給藥時(shí)間盡量選擇性別、年齡一致的純種動(dòng)物，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行隨機(jī)分組。實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物分組情況見(jiàn)表1。
其中SARS-siRNA由分別等劑量的針對(duì)SARS病毒的nsp12(5’-aaggatgaggaaggcaattta-3’)和spike(5’-aagctcctaattacactcaac-3’)基因的siRNA組成，這兩種siRNA在細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)中都表現(xiàn)出強(qiáng)的抑制SARS病毒的能力。Luc-siRNA(5’-aagctatgaaacgatatgggc-3’)作為陰性siRNA對(duì)照設(shè)置。
病理切片及肺部病變判斷見(jiàn)表1，表2、圖3-圖7。
(四)病毒接種方法一定滴度的病毒(TCID50為103-105)稀釋到5ml的磷酸緩沖液中其中0.5ml通過(guò)鼻腔接種，0.5ml通過(guò)氣管接種。
(五)siRNA的導(dǎo)入方法5-50mg的siRNA制劑溶于0.5ml體積中，通過(guò)鼻腔給藥。
(六)通過(guò)以下各種相關(guān)指標(biāo)客觀評(píng)價(jià)siRNA新藥的藥效。
通過(guò)客觀指標(biāo)，如生理、生化的化驗(yàn)指標(biāo)，X線檢查，病理切片等來(lái)評(píng)價(jià)SARS特異siRNA藥物的藥效，重點(diǎn)觀察體溫、胸部影象學(xué)、鼻咽分泌物病毒復(fù)制水平、實(shí)驗(yàn)后期處死動(dòng)物的肺及其它臟器的病理異常情況。
1、肺臨床表現(xiàn)及功能指標(biāo)。主要包括臨床癥狀和體征的觀察，經(jīng)SARS-siRNA給藥的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的精神狀態(tài)、食欲明顯好于對(duì)照組。
2、病毒復(fù)制水平指標(biāo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物局部麻醉后，用鼻腔和咽部拭子采樣，可通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)SARS病毒，并從肺及鼻咽分泌物中分離病毒并盲傳三代鑒定感染性病毒顆粒。經(jīng)SARS-siRNA給藥的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中的陽(yáng)性率為25％，而對(duì)照組的陽(yáng)性率為100％。(表2)3、組織形態(tài)學(xué)指標(biāo)鏡下可見(jiàn)肺泡腔狹窄甚至不張，肺泡間隔增寬等形態(tài)變化。經(jīng)SARS-siRNA給藥的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肺部損傷與對(duì)照相比，明顯減輕。猴肺間質(zhì)性炎病變程度粗略判斷標(biāo)準(zhǔn)(見(jiàn)表1，表2、圖3-圖7)-肺組織結(jié)構(gòu)、形態(tài)正常。
± 肺組織結(jié)構(gòu)、形態(tài)大致正常。肺間隔局灶狀輕度增寬伴少量單核細(xì)胞浸潤(rùn)。
+肺間隔局灶狀輕度增寬伴少量單核細(xì)胞浸潤(rùn)，肺間隔充血，銀染色示病變肺泡壁彈力纖維有局限斷裂。
++ 肺間隔多灶狀增寬伴多量單核細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡受壓變形變小，并有局灶性肺泡間隔增寬后相互融合，肺間隔充血，病變肺泡壁彈力纖維有斷裂。局灶肺泡腔內(nèi)可出現(xiàn)少量滲出。
+++ 肺間隔廣泛增寬伴大量單核細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡受壓變形變小，并有局限性肺泡間隔增寬后相互融合，肺間隔充血出血明顯，病變肺泡壁彈力纖維有明顯斷裂。局限肺泡腔內(nèi)可出現(xiàn)少量滲出。
++++ 肺間隔彌漫性增寬伴大量單核細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡受壓變形變小，肺泡內(nèi)滲出明顯并有大片狀肺泡間隔增寬后相互融合，病變肺泡壁彈力纖維有明顯斷裂，肺間隔充血出血明顯并可見(jiàn)灶狀壞死，肺泡腔內(nèi)有多量滲出并可見(jiàn)較多的細(xì)胞成份。
4、肝功能指標(biāo) 血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、血清膽紅素、凝血酶原時(shí)間等指標(biāo)的監(jiān)測(cè)。重復(fù)導(dǎo)入大劑量的siRNA未見(jiàn)對(duì)肝功能指標(biāo)有不良影響。
5、血液系統(tǒng)指標(biāo) 白細(xì)胞相關(guān)項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果全血白細(xì)胞(WBC)和白細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)(DC)；紅細(xì)胞相關(guān)項(xiàng)目檢測(cè)，全血紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(HB)、紅細(xì)胞比積(HCT)、平均紅細(xì)胞體積(MCV)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量(MCH)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC)、紅細(xì)胞體積分布寬度(RDW)等。重復(fù)導(dǎo)入大劑量的siRNA未見(jiàn)對(duì)血液系統(tǒng)指標(biāo)有不良影響。
序列表<110>廣州拓譜基因技術(shù)有限公司<120>用于預(yù)防和治療呼吸系統(tǒng)疾病的小干擾RNA及其篩選方法<160>12<210>1<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1，2)<223>a為脫氧核糖核苷<400>11 aacgagtaac tcgtccctct t 21<210>2<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1，2)<223>a為脫氧核糖核苷<400>21 aattgcatac cgcaatgttc t 21<210>3
<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1，2)<223>a為脫氧核糖核苷<400>31 aacctttgga gaagatactg t 21<210>4<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1，2)<223>a為脫氧核糖核苷<400>41 aatcacattt gagcttgatg a 21<210>5<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1，2)<223>a為脫氧核糖核苷<400>51 aatgttacag ggtttcatac t 21<210>6<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1，2)<223>a為脫氧核糖核苷<400>61 aaggatgagg aaggcaattt a 21<210>7<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1，2)<223>a為脫氧核糖核苷<400>7
1 aagagactat ttataacttg g 21<210>8<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1，2)<223>a為脫氧核糖核苷<400>81 aaggataagt cagctcaatg c 21<210>9<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1，2)<223>a為脫氧核糖核苷<400>91 aactggcaca ctacttgtcg a 21<210>10<211>21<212>RNA
<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1，2)<223>a為脫氧核糖核苷<400>101 aagctcctaa ttacactcaa c 21<210>11<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1，2)<223>a為脫氧核糖核苷<400>111 aagctatgaa acgatatggg c 21<210>12<211>30<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>富含Lys、His和Leu的多肽序列
<400>12Lys Lys Ala Cys Leu Leu Ala Leu Ala His His Leu Ala His His15 10 15His His Leu Ala Leu His Leu Ala Cys Leu Ala Leu Lys Lys Ala20 25 30
權(quán)利要求
1.一種用于體內(nèi)預(yù)防或治療呼吸系統(tǒng)疾病的小干擾RNA制劑，其特征在于小干擾RNA制劑由小干擾RNA和小干擾RNA導(dǎo)入載體組成、或由小干擾RNA組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于體內(nèi)預(yù)防或治療呼吸系統(tǒng)疾病的小干擾RNA，其特征在于所述的小干擾RNA可以是化學(xué)合成的21-23堿基對(duì)的雙鏈RNA；也可以是載體或表達(dá)框架表達(dá)的21-23堿基對(duì)的雙鏈RNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于體內(nèi)預(yù)防或治療呼吸系統(tǒng)疾病的小干擾RNA制劑，其特征在于所述的小干擾RNA可以是由作用于一個(gè)靶序列的單一小干擾RNA組成，也可以由作用于一個(gè)基因的多個(gè)靶序列或多個(gè)基因上的靶序列的多個(gè)小干擾RNA組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于體內(nèi)預(yù)防或治療呼吸系統(tǒng)疾病的小干擾RNA制劑其特征在于所述的靶序列可以是SARS冠狀病毒的序列，或呼吸道合胞病毒的序列，或禽流感病毒，或其它呼吸道病毒的序列，或發(fā)病宿主自身的內(nèi)源基因的序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于體內(nèi)預(yù)防或治療呼吸系統(tǒng)疾病的小干擾RNA制劑，其特征在于作用于SARS冠狀病毒靶序列的小干擾RNA的序列可以由至少一個(gè)以下的序列組成①5’aacgagtaactcgtccctctt 3’；②5’aattgcataccgcaatgttct 3’；③5’aacctttggagaagatactgt 3’；④5’aatcacatttgagcttgatga 3’；⑤5’aatgttacagggtttcatact 3’；⑥5’aaggatgaggaaggcaattta 3’；⑦5’aagagactatttataacttgg 3’；⑧5’aaggataagtcagctcaatgc 3’；⑨5’aactggcacactacttgtcga 3’；⑩5’aagctcctaattacactcaac 3’；
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于預(yù)防或治療呼吸系統(tǒng)疾病的小干擾RNA制劑，其特征在于所述的載體或表達(dá)框架為RNA聚合酶III啟動(dòng)子和RNA聚合酶III終止子調(diào)控小干擾RNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)；所述RNA聚合酶III啟動(dòng)子包括人源和鼠源的U6啟動(dòng)子和人H1啟動(dòng)子。
7.根據(jù)權(quán)力要求1所述的用于預(yù)防或治療呼吸系統(tǒng)疾病的小干擾RNA制劑，其特征在于所述的小干擾RNA導(dǎo)入載體可以是陽(yáng)離子聚合物，包括聚乙烯亞胺(PEI)，多聚賴(lài)氨酸、多聚組氨酸，及其聚乙二醇修飾物；也可以是聚丙烯亞胺樹(shù)突狀物，聚酰胺樹(shù)突狀物，及其聚乙二醇修飾物；所述的小干擾RNA導(dǎo)入載體也可以是脂質(zhì)體，包括卵磷脂、磷脂酰乙醇胺，N-[1-(2，3-Dioleoyloxy)]-N，N，N-三甲銨離子與丙烷甲基硫酸鹽(DOTAP)/二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)(W∶W，3∶1)，也可以是其聚乙二醇的修飾物；所述的小干擾RNA導(dǎo)入載體也可以是多肽，其序列特征為N端-KKACLLALAHHLAHHHHLALHLACLALKKA-C端，可以是直線型或分枝型的的多肽化合物；所述的小干擾RNA導(dǎo)入載體也可以是核酸保護(hù)劑，包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、生理鹽水、葡萄糖溶液。
8.權(quán)力要求1所述的用于預(yù)防或治療呼吸系統(tǒng)疾病的小干擾RNA制劑的篩選方法，其特征在于待篩選的小干擾RNA與小干擾RNA導(dǎo)入載體混合后，在病毒感染前和病毒感染后導(dǎo)入大型靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物模型的呼吸道，通過(guò)病毒基因組拷貝數(shù)和病毒感染性顆粒滴度的降低篩選出能有效防治SARS疾病的小干擾RNA；通過(guò)大型靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物模型的肺部損傷減輕篩選出能有效防治SARS疾病的小干擾RNA；通過(guò)大劑量和重復(fù)導(dǎo)入小干擾RNA到大型靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物模型呼吸道篩選出不影響心臟、肝臟、脾臟、腎臟、淋巴結(jié)以及血液系統(tǒng)正常功能的小干擾RNA。
9.根據(jù)權(quán)力要求9所述的用于預(yù)防或治療呼吸系統(tǒng)疾病的小干擾RNA制劑的篩選方法，其特征在于所述的導(dǎo)入小干擾RNA的劑量為5mg-50mg；導(dǎo)入的小干擾RNA可以是一次導(dǎo)入也可以?xún)纱位騼纱我陨现貜?fù)導(dǎo)入。
10.根據(jù)權(quán)力要求9所述的用于預(yù)防或治療呼吸系統(tǒng)疾病的小干擾RNA制劑的篩選方法，其特征在于所述的大型靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，可以是恒河猴或食蟹猴或黑猩猩。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用于體內(nèi)預(yù)防或治療呼吸系統(tǒng)疾病的siRNA制劑及其篩選方法，將siRNA制劑高效導(dǎo)入到非人靈長(zhǎng)類(lèi)的呼吸道，抑制SARS冠狀病毒的復(fù)制和表達(dá)，篩選到有預(yù)防或治療SARS疾病作用的siRNA。提供了siRNA制劑的組成和有效抑制SARS病毒感染和復(fù)制的方法，適用于呼吸道感染性疾病防治藥物的篩選以及其他呼吸道的疾病藥物的篩選，如哮喘，COPD，RSV和ARS，等。也適用于其他疾病的防治藥物篩選，如代謝疾病、自免疫疾病和癌癥。為siRNA藥物的毒性和藥效性實(shí)驗(yàn)提供了一個(gè)最接近人類(lèi)的方法。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1704123SQ20041002739
公開(kāi)日2005年12月7日 申請(qǐng)日期2004年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月1日
發(fā)明者李寶健, 陸陽(yáng), 唐清泉, 程度, 謝岳峰 申請(qǐng)人:廣州拓譜基因技術(shù)有限公司