專利名稱：用以預(yù)防和/或治療因微生物引起的口腔疾病的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及預(yù)防和/或治療因微生物引起的口腔疾病的組合物及方法。更特別地，本發(fā)明涉及利用中醫(yī)配方以預(yù)防和/或治療因微生物引起的口腔疾病。
背景技術(shù)：
現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為牙周病的發(fā)病主因是(1)口腔局部不良刺激所致，如口腔衛(wèi)生不良形成的菌斑、牙垢、牙石、經(jīng)常性的食物崁塞、不良修復(fù)體刺激。(2)內(nèi)分泌紊亂(如糖尿病、甲狀腺機(jī)能亢進(jìn))、血液疾病及免疫不全疾病(白血病、愛滋病)、營養(yǎng)障礙、慢性全身性消耗性疾病，或過度疲勞致使抵抗力下降，而造成鏈球菌等微生物感染引牙齒周圍組織而發(fā)此病(見，曹采方，牙周病學(xué)人民衛(wèi)生出版社2000；p.29-65，66-80)。常見的自覺性癥狀有牙齦紅、腫、疼痛、出血及牙齒松動等(見，Meitner，S.W.Identification of inflamedgingival surface.J.Clin.Periodontol.1979，(6)，93)。S.S.Socransky于1977年提出五項牙周病致病病原菌的標(biāo)準(zhǔn)(1)此微生物在疾病部位的數(shù)目必須高于非疾病部位。(2)消除此微生物可減緩此疾病進(jìn)展。(3)此微生物應(yīng)與牙周病發(fā)生及進(jìn)展的毒素有關(guān)聯(lián)性。(4)細(xì)胞免疫或體液免疫必須對此微生物有較高的反應(yīng)，足以顯示此菌在疾病中獨(dú)特的地位。(5)從動物的病理產(chǎn)生試驗中，必須能推論出人類牙周病的形成(見，Socransky，S.S.Microbiology of periodontaldisease-Present status and future consideration.J.Periodontol.1977，48，497-504.)。牙菌斑已確認(rèn)是造成牙周病發(fā)生的主因之一，現(xiàn)今人類口腔內(nèi)發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌超過400種，其中最容易引發(fā)或?qū)е卵乐馨l(fā)炎的主要牙菌斑細(xì)菌有牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)、粘放線菌(Actinomyces viscosus)、血鏈球菌(Streptococcus sanguis)、變異鏈球菌(Streptococcus mutans)等(見，凌麗珍，牙周病致病機(jī)轉(zhuǎn)新觀念，J.Dent Sci.2001217-14)。
當(dāng)引起口腔疾病的微生物侵犯牙周組織時，造成牙周組織感染。人類為對抗感染，激活發(fā)炎反應(yīng)以抵抗細(xì)菌入侵的過程中，皆需有細(xì)胞因子的參與。輔助性T淋巴球1(TH1 cells)分泌的白介素-2(IL-2)、輔助性T淋巴球2(TH2 cells)分泌的白介素-4(IL-4)、(見MosmannTR，Coffman RL.Two types of mouse T helper cell clonesimplicationsfor immune regulation.Immunology Today 1987；8223-226.)、巨噬細(xì)胞分泌的腫瘤壞死因子(TNF)等皆為免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。此些細(xì)胞因子皆參與自然的免疫反應(yīng)；調(diào)節(jié)淋巴球生長、分化和細(xì)胞活性；參與免疫發(fā)炎反應(yīng)；刺激未成熟白血球的生長和分化。故與人類對抗感染的機(jī)能息息相關(guān)。
現(xiàn)今用于治療牙周病的方式為清除牙結(jié)石、牙根面整平術(shù)與口服藥物(見，牛東平，口腔內(nèi)科學(xué)，人民衛(wèi)生出版社1998；p.121-136)。常用于治療牙周病的藥物為化學(xué)抗生素與消炎止痛劑，雖然抗生素與消炎止痛劑能緩解牙周病急性發(fā)炎期的部分癥狀，但抗生素和消炎止痛劑所隱藏的細(xì)菌耐藥性與不良副作用現(xiàn)象卻是不容忽視的一大隱憂。學(xué)者M(jìn)andinier等人于1999年對50株不同的牙周致病菌(伴放線放線桿菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans，A.a菌))作抗生素抗藥性測試，發(fā)現(xiàn)所有A.a菌均對抗生素阿莫西林敏感，4％對紅霉素具抗藥性，4％對四環(huán)素具抗藥性，72％對抗生素甲硝唑具抗藥性(見，Mandinier IM，F(xiàn)osse TB，Hitig C，Charbit Y，Hannoun LR.Resistance profile survey of 50 periodontal strains of Actinobacillusactinomyectomitans.J Periodontol.1999，Aug，70(8)，888-92.)。所以尋求更理想的牙周病口服或外用治療藥物是有其必要性及價值性。

發(fā)明內(nèi)容
中醫(yī)對于牙周病病癥有急、慢之分。急性多屬胃火上攻，牙齦紅腫熱痛、出血溢膿等癥狀歸屬于熱癥，治療先以消炎、止痛、抗菌為主。慢性多屬脾腎之虛，牙齒疏豁、牙齦虛浮萎縮、隱痛或無、牙根宣露，以補(bǔ)益脾腎為治療基礎(chǔ)。中醫(yī)所指的「脾」，包括脾臟與胰臟，與胃相表里。主要功能為運(yùn)化、升氣、統(tǒng)血。除了影響消化系統(tǒng)還包括免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)。故補(bǔ)脾可以強(qiáng)化免疫、消化、內(nèi)分泌、造血、神經(jīng)等系統(tǒng)的功能。本發(fā)明的藥物組合物可用以抑制已知引起口腔疾病的微生物，另可用于提高免疫系統(tǒng)所分泌的細(xì)胞因子的量，以提升自身的免疫系統(tǒng)來達(dá)到預(yù)防的作用。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)中醫(yī)配方清胃散于治療微生物引起的口腔疾病的新用途。在傳統(tǒng)中藥上，清胃散由當(dāng)歸、生地、黃蓮、牡丹皮及升麻組成。本發(fā)明未預(yù)期地發(fā)現(xiàn)清胃散類組合物于治療和/或預(yù)防微生物引起的口腔疾病的新用途。
本發(fā)明具新用途的藥物組合物本發(fā)明提供一種用于預(yù)防和/或治療微生物引起的口腔疾病的藥物組合物，其包含下列中藥(a)當(dāng)歸，(b)生地，(c)選自黃蓮、三角葉黃蓮及云連的中藥，(d)牡丹皮及(e)選自升麻、大三葉升麻及興安升麻的中藥。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，中藥(a)指傘形科植物當(dāng)歸(Angelicasinesis DIELS)的干燥根。中藥(b)指玄蔘科植物地黃(Rehanniaglutinosa LIBOSCH)的干燥根及根莖。中藥(c)指毛莨科植物黃連(Coptis chinesis FRANCH)、三角葉黃連(Coptis beltoidea C.Y.Chenget Hsiao)或云連(Coptis teeta Wall.)的去除須根的干燥根莖。中藥(d)為毛茛科植物牡丹(Pooaeonia suffruticosa ANDR.)植物縱切剝除木部的干燥根皮。中藥(e)為毛莨科植物升麻(Cimicifuga foetidaLINN.)、大三葉升麻(Cimicifuga heraleifolia Kom.)或興安升麻(北升麻)(Cimicifuga dahurica(Turcz.)Maxim.)的干燥根莖。優(yōu)選地，該中藥(c)為黃連，且該中藥(e)為升麻。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，本發(fā)明的藥物組合物中的中藥(a)、中藥(b)、中藥(c)、中藥(d)及中藥(e)的比例為1.5-5.0∶1.5-5.0∶1.5-5.0∶2.5-8.0∶5.0-15.0，優(yōu)選地，該比例為2.5-3.5∶2.5-3.5∶2.5-3.5∶4.5-5.5∶9.5-10.5，最優(yōu)選地，該比例為3.6∶3.6∶3.6∶6∶12。
根據(jù)本發(fā)明，任何施用中藥的方法均可用于本發(fā)明的藥物組合物的施用。優(yōu)選地，本發(fā)明的藥物組合物的施用是將中藥(a)、中藥(b)、中藥(c)、中藥(d)及中藥(e)混合后，加入適量溶劑，靜置1小時后將其加熱，待其沸騰后轉(zhuǎn)為小火慢煮，過濾收集濾液，如此反復(fù)數(shù)次，合并濾液，即得本發(fā)明藥物組合物的粗提取物。優(yōu)選地，其中該萃取溶劑為水，反復(fù)操作萃取組合物次數(shù)為四次。或者，將中藥(a)、中藥(b)、中藥(c)、中藥(d)及中藥(e)，依上述方式分別萃取個別萃取物。再將所得個別萃取液混合。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的藥物組合物可以漱口水或膠囊口服方式施用。優(yōu)選地，以漱口水配合膠囊口服于預(yù)防和/或治療因微生物引起的口腔疾病可以獲得較佳的效果。漱口水施用，以濃度50毫克/毫升至1500毫克/毫升的本發(fā)明的藥物組合物每日漱口數(shù)次可有效抑制及消滅引起口腔疾病的微生物。優(yōu)選地，該漱口水濃度為250毫克/毫升至1000毫克/毫升。口服施用，每日給予依體重250毫克/千克至750毫克/千克的本發(fā)明的藥物組合物。優(yōu)選地，每日給予依體重500毫克/千克的本發(fā)明的藥物組合物。
本發(fā)明的藥物組合物以稀釋法進(jìn)行定量抗菌實驗，推論可能的最低有效治療劑量(MIC)。本發(fā)明的藥物組合物以牙周病病態(tài)動物模式來確立以中藥治療牙周病的可行性及療效。以ELISA檢測連續(xù)給予28天本發(fā)明及其組成生藥的雌性BALB/c小鼠體內(nèi)白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的變化，以探討本發(fā)明對免疫調(diào)節(jié)能力的影響。
由抑菌研究發(fā)現(xiàn)分煎的清胃散能有較強(qiáng)的抑菌能力，由牙周病態(tài)動物實驗得知合煎清胃散對于發(fā)炎組織有較強(qiáng)的消炎修復(fù)作用，因此在日后制劑使用上，我們建議以分煎清胃散作為外用或含漱的方式來控制牙周病患的口腔環(huán)境，口服治療牙周病仍以合煎方式為優(yōu)。


圖1為誘發(fā)病態(tài)第5日，牙周外觀變化，BALB/c小鼠牙齦出現(xiàn)紅腫及牙斑。
圖2為誘發(fā)病態(tài)第7日，牙周外觀變化，BALB/c小鼠出現(xiàn)與人類牙周組織病變相類似癥狀，如牙齦紅腫、牙齦萎縮、觸碰性出血、齒槽骨吸收、牙齒動搖等。
圖3為給予合煎清胃散1000毫克/千克治療第5日牙周外觀變化，BALB/c小鼠先前的病態(tài)發(fā)炎征狀如牙齦紅腫、牙齦萎縮、觸碰性出血均已出現(xiàn)消失現(xiàn)象。
圖4為給予四環(huán)素250毫克/千克治療第5日牙周外觀變化，BALB/c小鼠先前的病態(tài)發(fā)炎征狀如牙齦紅腫、牙齦萎縮、觸碰性出血均已出現(xiàn)消失現(xiàn)象。
圖5為給予合煎清胃散1000毫克/千克治療第7日的BALB/c小鼠牙周外觀變化，先前的病態(tài)發(fā)炎征狀如牙齦紅腫、牙齦萎縮、觸碰性出血均已完全消失。
圖6為給予四環(huán)素250毫克/千克治療第7日的BALB/c小鼠牙周外觀變化，先前的病態(tài)發(fā)炎征狀如牙齦紅腫、牙齦萎縮、觸碰性出血均已完全消失。
圖7為給予合煎清胃散500毫克/千克治療第5日BALB/c小鼠牙周外觀變化，牙齦紅腫、觸碰性出血等發(fā)炎癥候均不存在且牙齦外觀回復(fù)。
圖8為給予分煎清胃散500毫克/千克治療第5日BALB/c小鼠牙周外觀變化，牙齦紅腫、觸碰性出血等發(fā)炎癥候均不存在且牙齦外觀回復(fù)。
圖9為給予合煎清胃散250毫克/千克7日后的BALB/c小鼠的病理組織切片鏡檢。
圖10為給予合煎清胃散500毫克/千克7日后的BALB/c小鼠的病理組織切片鏡檢。
圖11為給予分煎清胃散500毫克/千克7日后的BALB/c小鼠的病理組織切片鏡檢。
圖12為給予清胃散1000毫克/千克7日后的BALB/c小鼠的病理組織切片鏡檢。
圖13為給予四環(huán)素250毫克/千克7日后的BALB/c小鼠的病理組織切片鏡檢。
圖14為給予去離子水7日后的BALB/c小鼠的病理組織切片鏡檢。
具體實施例方式
實施例1本發(fā)明的藥物組合物的制備本實驗所用的組成藥材，經(jīng)生藥學(xué)確定基原如下當(dāng)歸(Angelicae Sinensis Radix)本品為傘形科植物當(dāng)歸(Angelica sinesis DIELS)的干燥根。
生地黃(Rehmanniae Radixet Rhizom)本品為玄蔘科植物地黃(Rehannia glutinosa LIBOSCH)的干燥根及根莖。
黃連(Coptidis Rhizoma)本品為毛莨科植物黃連(Coptis chinesisFRANCH)去除須根的干燥根莖。
牡丹皮(Moutan Radicis Cortex)本品為毛莨科植物牡丹(Pooaeonia suffruticosa ANDR.)植物縱切剝除木部的干燥根皮。
升麻(Cimicifuga foetida)本品為毛莨科植物升麻(Cimicifugafoetida LINN.)及同屬近緣植物的干燥根莖。
將上述實驗藥材依行政院衛(wèi)生署中醫(yī)藥委員會清胃散基準(zhǔn)方劑組成比例(當(dāng)歸∶生地∶黃連∶牡丹皮∶升麻＝3.6∶3.6∶3.6∶6∶12)，秤取上述原生藥共288g加入適量純水，靜置1小時后將其加熱，待其沸騰后轉(zhuǎn)為小火慢煮直至體積小于或等于144毫升，趁熱過濾收集濾液，如此反復(fù)四次，合并濾液，再濃縮至144毫升，即得清胃散粗提取物(為2克/毫升清胃散浸膏劑)，此為合煎清胃散。其各單味組成藥物各取100克依上述方法抽取制成50毫升浸膏劑，再依當(dāng)歸萃取液∶生地萃取液∶黃連萃取液∶牡丹皮萃取液∶升麻萃取液的容積比例3.6∶3.6∶3.6∶6∶12混合，此為分煎清胃散。
實施例2對牙周病原菌的作用本抗牙周病致病菌感受性實驗的主要方式為稀釋法和圓盤瓊脂擴(kuò)散試驗(Disc agar diffusion test)，稀釋法的主要目的是為了決定清胃散抗牙周病致病菌的最低抑菌濃度(MIC)，便于日后治療劑量的選擇。圓盤瓊脂擴(kuò)散試驗具有操作簡易與判讀方便的優(yōu)點(diǎn)，我們可由圓盤周圍出現(xiàn)生長抑制圈大小及有無來判定實驗菌種對藥物的感受性。本實驗所使用的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)及大腸桿菌(Escherichia coli)菌株是由中山醫(yī)學(xué)大學(xué)醫(yī)技系林世杰老師提供的ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株，其余菌株均購自財團(tuán)法人食品工業(yè)發(fā)展研究所生物資源保存及研究中心的標(biāo)準(zhǔn)菌株變異鏈球菌ATCC 25175、CCRC10793、血鏈球菌ATCC 49295、CCRC 15273、牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivialis)ATCC 33277、CCRC 14417、金黃色葡萄球菌ATCC 25923及大腸桿菌ATCC 25922。
本實驗所使用的培養(yǎng)基均購自啟欣生物科技有限公司，培養(yǎng)基種類如下
腦心浸出培養(yǎng)液(BHI broth)硫代硫酸鹽培養(yǎng)液(Thioglycollate broth)細(xì)菌堿性磷酸酶瓊脂(BAP Agar)水解酪蛋白瓊脂(Mueller-Hinton Agar)菌種活化下列步驟均在無菌環(huán)境下操作以沾有70％酒精的棉花，擦拭外管，在火焰上加熱外管的隔熱纖維前端。滴水于加熱處，外管龜裂后，再以硬棒敲破。取出隔熱纖維和內(nèi)管，以鑷子取出內(nèi)管的棉塞。以無菌吸管，吸取0.3～0.5毫升指定的液體培養(yǎng)基，滴入內(nèi)管將菌體洗下；吸放數(shù)次，使菌液充分均質(zhì)。盡快吸取此菌體懸浮液，滴入指定的液體培養(yǎng)基內(nèi)，在指定的溫度下培養(yǎng)3～4天。培養(yǎng)液呈混濁即表示菌株生長。
最低抑菌濃度(MIC)肉湯稀釋法將清胃散萃取液2克/毫升，做兩倍連續(xù)稀釋，使其最終濃度各為2×(1000毫克/毫升)、4×(500毫克/毫升)、8×(250毫克/毫升)。將無菌標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基BHI broth做下列配置A管5cc培養(yǎng)液+5cc無菌水，B管5cc培養(yǎng)液+5cc清胃散萃取液2gm/毫升，C管5cc培養(yǎng)液+5cc清胃散萃取液(1000毫克/毫升)，D管5cc培養(yǎng)液+5cc清胃散萃取液(500毫克/毫升)，E管5cc培養(yǎng)液+5cc清胃散萃取液(250毫克/毫升)，F(xiàn)管5cc培養(yǎng)液+5cc相當(dāng)于500毫克/毫升的四環(huán)素。將培養(yǎng)至濁度相當(dāng)于0.5比濁度的菌液加入50μL菌液于A～F管中，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于A管濁度相當(dāng)于0.5比濁度時，以接種環(huán)自A～F管中取1接種環(huán)的菌量，接種于BAP培養(yǎng)基上，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后，計算菌落數(shù)，推算清胃散抑菌濃度。
經(jīng)由預(yù)試驗我們將空白對照組(去離子水)生長菌落數(shù)目調(diào)整于低于200。如下表1所示，清胃散于8X稀釋(相當(dāng)于125毫克/毫升清胃散)可觀察到對變異鏈球菌、血鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等菌具有生長抑制的現(xiàn)象，而對于牙齦卟啉單胞菌則是具有殺菌效果。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌于清胃散8X稀釋(相當(dāng)于250毫克/毫升清胃散)生長可被完全抑制；在清胃散4X稀釋(相當(dāng)于500毫克/毫升清胃散)及2X稀釋(相當(dāng)于1000毫克/毫升清胃散)可觀察到變異鏈球菌及血鏈球菌的生長完全被抑制的現(xiàn)象。對照組四環(huán)素250毫克/毫升對血鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均有完全抑制生長作用，但對變異鏈球菌則無法完全抑制。四環(huán)素250毫克/毫升對變異鏈球菌的抑菌能力與清胃散8X稀釋(相當(dāng)于250毫克/毫升清胃散)不相上下，但清胃散4X稀釋(相當(dāng)于500毫克/毫升清胃散)對變異鏈球菌的抑菌能力則明顯優(yōu)于四環(huán)素250毫克/毫升。
表1

牙齦卟啉單胞菌培養(yǎng)溫度及時間為37℃，72小時；血鏈球菌、變異鏈球菌培養(yǎng)溫度及時間為37℃，24小時；金黃色葡萄球菌、大腸桿菌培養(yǎng)溫度及時間為37℃，12小時。
抑菌率％＝(空白對照組生長菌落數(shù)-實驗組生長菌落數(shù))÷空白對照組生長菌落數(shù)×100％圓盤瓊脂擴(kuò)散試驗將合煎清胃散(500毫克/毫升)、分煎清胃散(500毫克/毫升)及去離子水各10μL加入于6mm直徑圓盤后滅菌消毒。
由于圓盤瓊脂擴(kuò)散試驗不適合生長速度較緩慢的牙齦卟啉單胞菌，因此在圓盤瓊脂擴(kuò)散試驗我們僅選擇變異鏈球菌、血鏈球菌二株牙周病致病菌研究。
將培養(yǎng)至濁度相當(dāng)于0.5比濁度的變異鏈球菌、血鏈球菌菌液，加入50μL菌液于培養(yǎng)基上，以無菌棉棒在三個方向平均涂抹于瓊脂表面，使接種原平均分布。蓋上瓊脂的蓋子，約3～5分鐘后依序?qū)⑸狭泻巿A盤平貼于瓊脂表面，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后，測量其抑制圈大小。無菌圓盤直徑為6mm，抑制圈直徑大于6mm表示此藥物具有抑菌效果(+)；抑制圈直徑小于6mm表示此藥物不具抑菌效果(-)。培養(yǎng)溫度及時間為37℃，24小時，控制組為含無菌水的圓盤，抑制圈的數(shù)值以Mean±SD表示(n＝3)。如下表2所示分煎清胃散抑菌能力明顯優(yōu)于合煎清胃散。
表2

實施例3牙周病治療效果的評估選用八周齡的雌性BALB/c小鼠60只，每組10只，分為6組。本實驗所使用的動物均購自國科會實驗動物研究及繁殖中心SPF級實驗鼠，雄性八周齡ICR系小鼠，雌性八周齡ICR系小鼠及雌性6周齡BALB/c小鼠。飼育于室溫25±1℃，相對濕度55±5％，照光與黑暗各12小時的中山醫(yī)學(xué)大學(xué)動物中心。
第1日于其下顎前牙扎上齒列矯正用鋼線，并于牙周組織接種牙周病致病菌。第5日，如圖1所示，BALB/c小鼠牙齦出現(xiàn)紅腫及牙斑。第7日，如圖2所示，BALB/c小鼠出現(xiàn)與人類牙周組織病變相類似癥狀，如牙齦紅腫、牙齦萎縮、觸碰性出血、齒槽骨吸收、牙齒動搖等。此時解除束縛，開始以口服方式依體重給予下列的藥物合煎清胃散250毫克/千克、合煎清胃散500毫克/千克、合煎清胃散1000毫克/千克、分煎清胃散500毫克/千克、四環(huán)素250毫克/千克及去離子水2毫升/千克。如表3所示，于給藥后第三日，可明顯發(fā)現(xiàn)給予合煎清胃散(250毫克/千克、500毫克/千克、1000毫克/千克)、分煎清胃散(500毫克/千克)及四環(huán)素(250毫克/千克)的BALB/c小鼠均可在發(fā)炎處發(fā)現(xiàn)再生上皮的出現(xiàn)。于給藥后第五日觀察，如圖3所示給予合煎清胃散1000毫克/千克和如圖4所示給予四環(huán)素250毫克/千克的BALB/c小鼠先前的病態(tài)發(fā)炎征狀如牙齦紅腫、牙齦萎縮、觸碰性出血均已出現(xiàn)消失現(xiàn)象。于給藥后第七日觀察，如圖5所示，給予合煎清胃散1000毫克/千克的BALB/c小鼠先前的病態(tài)發(fā)炎征狀如牙齦紅腫、牙齦萎縮、觸碰性出血均已完全消失；如圖6所示，給予四環(huán)素250毫克/千克的BALB/c小鼠先前的病態(tài)發(fā)炎征狀如牙齦紅腫、牙齦萎縮、觸碰性出血均已完全消失；如圖7所示給予合煎清胃散500毫克/千克與如圖8所示分煎清胃散500毫克/千克的BALB/c小鼠的牙齦紅腫、觸碰性出血等發(fā)炎癥候均不存在且牙齦外觀回復(fù)。由給予清胃散250毫克/千克的BALB/c小鼠和給予去離子水的BALB/c小鼠相比較可發(fā)現(xiàn)BALB/c小鼠的牙齦紅腫等發(fā)炎癥候均較給予去離子水的的BALB/c小鼠和緩許多。于給藥治療后第7日，由病理組織切片鏡檢可見到，如圖9所示，給予合煎清胃散250毫克/千克的BALB/c小鼠的病理組織切片鏡檢；如圖10所示，給予合煎清胃散500毫克/千克的BALB/c小鼠的病理組織切片鏡檢；如圖11所示，給予分煎清胃散500毫克/千克的BALB/c小鼠的病理組織切片鏡檢；如圖12所示給予清胃散1000毫克/千克的BALB/c小鼠的病理組織切片鏡檢亦或是如圖13所示給予四環(huán)素250毫克/千克的BALB/c小鼠的病理組織切片鏡檢均可見發(fā)炎部位縮小及組織修復(fù)，與如圖14所示，給予去離子水的BALB/c小鼠的組織發(fā)炎情況有明顯差異。
表3 當(dāng)小鼠出現(xiàn)下列三種癥狀時(牙齦紅腫、觸碰性出血、牙齦萎縮、牙齦化膿、牙菌斑)即定義為牙周病表癥出現(xiàn)。當(dāng)下列癥狀消失時(牙齦紅腫、觸碰性出血、牙齦萎縮、牙齦化膿、牙菌斑)即定義為牙周發(fā)炎表癥消失。將牙周發(fā)炎表癥消失程度分為10級，以n表示，當(dāng)n＝10時，表示牙周發(fā)炎表癥完全消失。
實施例4對BALB/c小鼠血清細(xì)胞因子的影響選用六周齡的雌性BALB/c小鼠36只，每組12只，分為3組。小鼠來源如實施例2所述。每日以口服方式依體重給予下列藥物合煎清胃散500毫克/千克，分煎清胃散500毫克/千克及去離子水2毫升/千克。分別于給藥后7日、14日、21日、28日頸動脈采血，在3000r.p.m.，于4℃的條件下離心10分鐘后，取上層血清偵測IL-2、IL-4、TNF-α濃度變化。
ELISA培養(yǎng)皿制備與流程將100μl已稀釋好的抗鼠細(xì)胞因子捕獲抗體(anti-mouse cytokinecapture antibody)加入微量滴盤(microwell)并且在4℃環(huán)境下靜置一晚。隔日，以沖洗緩沖液(wash buffer)(0.005％Tween 20，在1X PBS中，pH 7.4)將涂覆(coating)好的微量滴盤沖洗3次，以便將多余或未固定的捕獲抗體(capture antibod)清除。接著將200μl實驗稀釋液(assay diluent)加入微量滴盤并且于室溫下靜置1小時后，以沖洗緩沖液沖洗3次。再將100μl標(biāo)準(zhǔn)或樣品加入微量滴盤，于室溫下靜置2小時后，以沖洗緩沖液沖洗5次。然后，加入100μl操作檢測液(working detector)(檢測抗體+親和素-辣根過氧化物酶(avidin HRP))于微量滴盤，于室溫下靜置1小時后，以沖洗緩沖液沖洗7次。于微量滴盤中加入100μl底物溶液(3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)+過氧化氫)做為發(fā)色劑，遮光靜置經(jīng)過30分鐘樣品由透明轉(zhuǎn)為水藍(lán)色。最后將50μl終止液(2N H2SO4)加入，樣品由水藍(lán)色轉(zhuǎn)為黃色，以微盤分析儀(microplate reader)在450nm波長測吸光值。每次實驗均經(jīng)過三重復(fù)并與標(biāo)準(zhǔn)檢量線比較，以測得樣品濃度計算。本次研究，實驗數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。
如表4所示，給予合煎清胃散500毫克/千克與分煎清胃散500毫克/千克的BALB/c小鼠血清IL-2于給藥后7日急遽升高，隨后趨于緩和。IL-2是T細(xì)胞的增殖因子而TCR的活化也能誘發(fā)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，大部分的CD4+Th細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞會在1-2天內(nèi)短暫的制造出IL-2，在這段期間內(nèi)IL-2和高親合力IL-2受器的交互作用及導(dǎo)致T細(xì)胞的活化和生長。這種高親合力IL-2受器大約只出現(xiàn)1周左右，之后即刺激TCR限制T細(xì)胞的增殖。因此我們見到給予合煎清胃散500毫克/千克與分煎清胃散500毫克/千克的BALB/c小鼠的IL-2值在第2周出現(xiàn)下降的情況。但給予合煎清胃散500毫克/千克與分煎清胃散500毫克/千克于IL-2調(diào)節(jié)增加的能力皆較給予去離子水的BALB/c小鼠明顯增加。
表4

IL-2的數(shù)值以Mean±SD表示，單位pg/毫升如表5所示，當(dāng)BALB/c小鼠服用合煎清胃散500毫克/千克7日血清中IL-4數(shù)值較給予分煎清胃散500毫克/千克7日的BALB/c小鼠高，甚至高出二倍之多，第2周起兩者即趨于一致，但與給予去離子水的BALB/c小鼠比較則有顯著增加。
表5

IL-4的數(shù)值以Mean±SD表示，單位pg/毫升如表6所示，BALB/c小鼠的TNF-α濃度變化中觀察到BALB/c小鼠血清TNF-α濃度似乎有隨著周齡增加而升高的情況出現(xiàn)，且不論是合煎清胃散500毫克/千克或分煎清胃散500毫克/千克，都會刺激BALB/c小鼠血清TNF-α濃度升高并較給予去離子水的BALB/c小鼠顯著增加。
表6

TNF-α的數(shù)值以Mean±SD表示，單位pg/毫升
權(quán)利要求
1.一種用于預(yù)防和/或治療微生物引起的口腔疾病的藥物組合物，其包含下列中藥(a)當(dāng)歸，(b)生地，(c)選自黃蓮、三角葉黃蓮及云連的中藥，(d)牡丹皮及(e)選自升麻、大三葉升麻及興安升麻的中藥。
2.如權(quán)利要求1的藥物組合物，其中該中藥(c)為黃連，且該中藥(e)為升麻。
3.如權(quán)利要求1的藥物組合物，其中該中藥(a)、中藥(b)、中藥(c)、中藥(d)及中藥(e)的比例為1.5-5.0∶1.5-5.0∶1.5-5.0∶2.5-8.0∶5.0-15.0。
4.如權(quán)利要求3的藥物組合物，其中該中藥(a)、中藥(b)、中藥(c)、中藥(d)及中藥(e)的比例為3.6∶3.6∶3.6∶6∶12。
5.如權(quán)利要求1的藥物組合物，其為萃取物。
6.如權(quán)利要求5的藥物組合物，其中該萃取物由下列方法制得將當(dāng)歸、生地、黃蓮、牡丹皮及升麻混合，并以溶劑萃取該混合物。
7.如權(quán)利要求5的藥物組合物，其中該萃取物由下列方法制得將當(dāng)歸、生地、黃蓮、牡丹皮及升麻分別以溶劑萃取，將個別萃取物混合。
8.如權(quán)利要求1的藥物組合物，其中該微生物選自變異鏈球菌、血鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌、金黃色葡萄球菌及埃希氏菌屬(Escherichia)及其混合。
9.如權(quán)利要求1的藥物組合物，其中該口腔疾病為牙周病或齟齒。
10.如權(quán)利要求1的藥物組合物，其可以漱口水型式或口服方式來預(yù)防和/或治療微生物引起的口腔疾病。
11.一種用于調(diào)節(jié)免疫功能的藥物組合物，其包含下列中藥(a)當(dāng)歸，(b)生地，(c)選自黃蓮、三角葉黃蓮及云連的中藥，(d)牡丹皮及(e)選自升麻、大三葉升麻及興安升麻的中藥。
12.如權(quán)利要求11的藥物組合物，其中該中藥(c)為黃連，且該中藥(e)為升麻。
13.如權(quán)利要求11的藥物組合物，其中該中藥(a)、中藥(b)、中藥(c)、中藥(d)及中藥(e)的比例為1.5-5.0∶1.5-5.0∶1.5-5.0∶2.5-8.0∶5.0-15.0。
14.如權(quán)利要求13的藥物組合物，其中該中藥(a)、中藥(b)、中藥(c)、中藥(d)及中藥(e)的比例為3.6∶3.6∶3.6∶6∶12。
15.如權(quán)利要求11的藥物組合物，其為萃取物。
16.如權(quán)利要求15的藥物組合物，其中該萃取物由下列方法制得將當(dāng)歸、生地、黃蓮、牡丹皮及升麻混合，并以溶劑萃取該混合物。
17.如權(quán)利要求15的藥物組合物，其中該萃取物由下列方法制得將當(dāng)歸、生地、黃蓮、牡丹皮及升麻分別以溶劑萃取，將個別萃取物混合。
18.如權(quán)利要求6、7、16或17的藥物組合物，其中該溶劑包括水。
19.如權(quán)利要求11的藥物組合物，其可以口服方式來調(diào)節(jié)免疫功能。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用以預(yù)防和/或治療因微生物引起的口腔疾病的藥物組合物，其包含當(dāng)歸、生地、黃連、牡丹皮及升麻。
文檔編號A61P1/00GK1666773SQ200410028679
公開日2005年9月14日 申請日期2004年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月12日
發(fā)明者楊繼江 申請人:楊繼江