專(zhuān)利名稱(chēng)：一種新的血管發(fā)生抑制劑的制作方法
本申請(qǐng)是中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?9816907.2、國(guó)際申請(qǐng)日為1999年9月15日、發(fā)明名稱(chēng)為“一種新的血管發(fā)生抑制劑”專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種新的血管發(fā)生抑制劑，LK68，其氨基酸序列與人載脂蛋白(a)kringle結(jié)構(gòu)域IV36、IV37和V38相同，更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種LK68的氨基酸序列，編碼LK68的cDNA序列，包含該cDNA的重組表達(dá)載體，用該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的重組微生物，以及LK68作為抗癌劑的新用途，和治療血管發(fā)生介導(dǎo)的疾病的方法。
現(xiàn)有技術(shù)描述血管發(fā)生是生成新血管進(jìn)而形成組織或器官的生物過(guò)程。在正常生理?xiàng)l件下，人和動(dòng)物僅在非常特殊的限制條件下才進(jìn)行血管發(fā)生。例如，正常情況下在傷口愈合、胎兒和胚胎發(fā)育以及黃體、子宮內(nèi)膜和胎盤(pán)形成時(shí)觀察到血管發(fā)生。據(jù)報(bào)道，一些血管發(fā)生調(diào)節(jié)劑嚴(yán)格控制新血管生長(zhǎng)(參見(jiàn)Folkman，J.，Nature Med.，127-31，1995a)，血管發(fā)生表型的開(kāi)關(guān)依賴(lài)于血管生成刺激物的上調(diào)作用與血管生成抑制物的下調(diào)作用之間的凈平衡。
據(jù)報(bào)道血管生成過(guò)程的不平衡導(dǎo)致病理性疾病例如糖尿病性視網(wǎng)膜病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和牛皮癬(參見(jiàn)Folkman，J.，Nature Med.，127-31，1995a)。尤其是原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤都需要血管生成的血管恢復(fù)生長(zhǎng)(參見(jiàn)Folkman，J.，NewEngl.J.Med.，2851182-1186，1971；Folkman，J.，J.Biol.Chem.，26710931-10934，1992)。如果這種血管發(fā)生活性能夠被抑制或消除，那么腫瘤即使存在，也將停止生長(zhǎng)。一些報(bào)道表明，抑制腫瘤的血管發(fā)生可以提供一種長(zhǎng)期控制疾病的可操作方法。阻斷血管發(fā)生的陽(yáng)性調(diào)控劑或應(yīng)用陰性調(diào)控劑抑制血管發(fā)生導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤的延遲或抑制。如果這種血管發(fā)生活性能夠被抑制或消除，那么腫瘤即使存在，也將停止生長(zhǎng)。而且，在疾病狀態(tài)，防止血管發(fā)生能夠有效轉(zhuǎn)移由于微血管系統(tǒng)的侵害造成的損害。因此，旨在控制血管發(fā)生過(guò)程的治療會(huì)導(dǎo)致這類(lèi)疾病的消除或緩解。
因此，需要一種新的血管發(fā)生抑制劑，其能夠抑制血管的不期望的生長(zhǎng)，特別是生長(zhǎng)成為腫瘤。含有血管發(fā)生抑制劑的抗癌劑應(yīng)該能夠抑制前轉(zhuǎn)移性腫瘤中的內(nèi)源性生長(zhǎng)因子的活性，并防止腫瘤中毛細(xì)血管的形成，由此抑制腫瘤的生長(zhǎng)。這種抗癌劑還應(yīng)該能夠調(diào)節(jié)其它血管發(fā)生過(guò)程，例如傷口愈合和生殖過(guò)程的毛細(xì)血管的形成。最后，這種抗癌劑和抑制血管發(fā)生的方法應(yīng)該優(yōu)選為非毒性的并產(chǎn)生較少副作用。
迄今為止，本領(lǐng)域已經(jīng)鑒定了至少10中內(nèi)源性血管發(fā)生抑制物(參見(jiàn)O′Reilly，M.S.等，Cell，88277-285，1997)。這類(lèi)分子中的一種是制管張素，其由血纖維蛋白溶酶原kringle I到IV構(gòu)成(參見(jiàn)O′Reilly，M.S.等，Cell，79315-328，1994)。當(dāng)系統(tǒng)應(yīng)用時(shí)，制管張素有效抑制原發(fā)性腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，且無(wú)毒性，同時(shí)也抑制由bFGF誘導(dǎo)的血管發(fā)生(參見(jiàn)O′Reilly，M.S.等，Nature Med.，2689-692，1996)。這些抗腫瘤作用伴隨腫瘤塊中微血管密度的顯著降低，表明血管發(fā)生的抑制與腫瘤生長(zhǎng)的抑制有關(guān)。
Kringle是由大約80個(gè)氨基酸和三個(gè)分子內(nèi)二硫鍵構(gòu)成的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。Kringle結(jié)構(gòu)在一些蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)，例如凝血酶原(參見(jiàn)Walz，D.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，741969-1973，1977)、血纖維蛋白溶酶原(參見(jiàn)Ponting，C.P.，Blood Coagul.& Fibrinolysis，3605-614，1992)、尿激酶(參見(jiàn)Pennica，D.等，Nature，301579-582 1983)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(參見(jiàn)Lukker，N.A.等，Protein Eng.，7895903，1994)和載脂蛋白(＂apo＂)(a)(參見(jiàn)McLean，J.W.等，Nature，330132-137，1987)。這些結(jié)構(gòu)域看起來(lái)是一種獨(dú)立折疊單元，但它們的功能作用尚不清楚。以前的報(bào)道指出kringle結(jié)構(gòu)能夠作為血管發(fā)生過(guò)程中內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖的抑制劑。特別是凝血素的kringle 2和血纖維蛋白溶酶原的kringle 1-4、和5已經(jīng)表明抗血管發(fā)生(參見(jiàn)Ji，W.R.等，F(xiàn)ASEB J.，151731-1738，1998a；Ji，W.R.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，247414-419，1998b；Cao，Y.等，J.Biol.Chem.，27129461-29467，1996；Cao，Y.等，J.Biol.Chem.，27222924-22928，1997；Barendsz-Janson，A.F.，J.Vasc.Res.，35109-114，1998；Lee，T.H.等，J.Biol.Chem.，27328805-28812，1998)。
載脂蛋白(a)，一種具有kringle結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，是一種新的血管發(fā)生抑制劑的候選物。Apo(a)與apoB-100共價(jià)結(jié)合，是形成脂蛋白(a)的低密度脂蛋白(LDL)的主要蛋白成分(參見(jiàn)Fless，G.M.，J.Biol.Chem.，2618712-8718，1986)。脂蛋白(a)濃度的升高代表動(dòng)脈粥樣硬化的一種主要獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素(參見(jiàn)Armstrong，V.W.等，Artherosclerosis，62249-257，1986；Assmann，G.，Am.J.Cardiol.，771179-1184，1996；Bostom，A.G.等，JAMA，276544-548，1996)。雖然已經(jīng)報(bào)道了apo(a)的幾種病原性活性，但其生理作用還未曾確定(參見(jiàn)Lawn，R.M.等，J.Biol.Chem.，27131367-31371，1996；Scanu，A.M.和Fless，G.M.，J.Clin.Invest.，851709-1715，1990；Utermann，G.，Science，2460904-910，1989)。
Apo(a)含有兩種類(lèi)型的kringle結(jié)構(gòu)域和一種無(wú)活性的蛋白酶樣結(jié)構(gòu)域前37個(gè)kringle結(jié)構(gòu)域與血纖維蛋白溶酶原kringle IV有～75％等同性，最后kringle結(jié)構(gòu)域與血纖維蛋白溶酶原kringle V有90％的等同性。有趣的是，kringle IV樣結(jié)構(gòu)域在不同的人的apo(a)基因的等位基因中存在15-40拷貝。從這一點(diǎn)上說(shuō)，應(yīng)用Apo(a)kringle結(jié)構(gòu)研制一種腫瘤血管發(fā)生和生長(zhǎng)的抑制劑是可行的。
發(fā)明概述按照本發(fā)明，本發(fā)明人克隆和表達(dá)了一種作為重組蛋白LK68的含有IV36，IV37和V38的人apo(a)kringles并發(fā)現(xiàn)LK68蛋白和其單一kringle，LK6，LK7和LK8能夠在體外抑制內(nèi)源性生長(zhǎng)因子例如bFGF的血管發(fā)生活性；并且它們可以用作抗癌制劑的活性成分。
因此，本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種新的LK68蛋白，其由人apo(a)kringle結(jié)構(gòu)域IV36，IV37和V38構(gòu)成，以及編碼LK68蛋白的cDNA。
本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種新的重組載體，其含有編碼人apo(a)kringle結(jié)構(gòu)域IV36，IV37和V38的cDNA。
本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種抗癌劑，其含有LK68蛋白或其單一kringle，LK6，LK7和LK8作為活性成分。
本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供一種通過(guò)應(yīng)用LK68蛋白治療由血管發(fā)生介導(dǎo)的疾病的方法。
附圖簡(jiǎn)述通過(guò)下面結(jié)合附圖的描述，本發(fā)明的上述和其它目的和特征將變得更加清楚，其中

圖1是分析在大腸桿菌中表達(dá)的重組LK68蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的照片。
圖2是顯示LK68對(duì)雞絨毛尿囊膜(CAM)血管發(fā)生的抑制作用的照片。
圖3(A)是顯示CAM中血管生長(zhǎng)的抑制作用隨LK68變化的圖。
圖3(B)是顯示CAM中血管生長(zhǎng)的抑制作用隨單一kringles，LK6，LK7，LK8和對(duì)照變化的圖。
圖4(A)是顯示重組LK68和制管張素對(duì)BCE細(xì)胞增殖的抑制作用的圖。
圖4(B)是顯示重組LK6，LK7和LK8對(duì)BCE細(xì)胞增殖的抑制作用的圖。
圖4(C)是顯示重組LK68和LK8對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖的抑制作用的圖。
圖5(A)是顯示在存在重組LK68和LK8條件下，LLC細(xì)胞的BrdU標(biāo)記指數(shù)的圖。
圖5(B)是顯示在存在重組LK68和LK8條件下，Y1細(xì)胞的BrdU標(biāo)記指數(shù)的圖。
圖5(C)是顯示在存在重組LK68和LK8條件下，TIB74細(xì)胞的BrdU標(biāo)記指數(shù)的圖。
圖5(D)是顯示在存在重組LK68和LK8條件下，CHO細(xì)胞的BrdU標(biāo)記指數(shù)的圖。
圖5(E)是顯示在存在重組LK68和LK8條件下，MSF細(xì)胞的BrdU標(biāo)記指數(shù)的圖。
圖5(F)是顯示在存在重組LK68和LK8條件下，NIH3T3細(xì)胞的BrdU標(biāo)記指數(shù)的圖。
圖6(A)是顯示重組LK68，LK8和PK5對(duì)HUVEC細(xì)胞遷移的抑制作用的圖。
圖6(B)是顯示重組LK68，LK6，LK7和LK8對(duì)HUVEC細(xì)胞遷移的抑制作用的圖。
圖7是顯示制管張素，重組LK68，LK6，LK7，和LK8，以及單一kringle的組合對(duì)BCE細(xì)胞遷移的抑制作用的圖。
圖8以總體積作為時(shí)間的函數(shù)，顯示施用LK68對(duì)已移植Lewis肺癌細(xì)胞的小鼠的影響。
圖9(A)到9(C)是顯示通過(guò)蘇木精和曙紅(H/E)染色的Lewis肺癌細(xì)胞組織學(xué)分析照片。
圖10以總體積作為時(shí)間的函數(shù)，顯示給已移植人肺癌A549細(xì)胞的裸鼠施用LK68的作用。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一種新的蛋白質(zhì)LK68，其可以從人載脂蛋白(＂apo＂)(a)kringle作為重組蛋白克隆和表達(dá)。LK68蛋白由人載脂蛋白(a)kringle結(jié)構(gòu)域IV36(氨基酸8到80)，IV37(氨基酸122到194)和V38(氨基酸226到300)的氨基酸序列以連續(xù)的方式構(gòu)成(參見(jiàn)SEQ ID NO2)。LK68的前兩個(gè)kringle結(jié)構(gòu)域(即IV36和IV37)與人血纖維蛋白溶酶原kringle IV同源，第三個(gè)kringle結(jié)構(gòu)域V38與人血纖維蛋白溶酶原kringle V同源。本發(fā)明還提供了編碼LK68蛋白的cDNA(參見(jiàn)SEQ ID NO1)以及含有所述cDNA和表達(dá)載體例如pET載體系列的重組載體。
在描述本發(fā)明的kringle結(jié)構(gòu)域時(shí)，人載脂蛋白(a)kringle IV36，IV37和V38分別簡(jiǎn)稱(chēng)為KIV36，KIV37和KV38；應(yīng)用LK68意味著應(yīng)用含有所述三種kringle結(jié)構(gòu)域的重組蛋白；應(yīng)用LK6，LK7和LK8分別意味著應(yīng)用KIV36，KIV37和KV38重組蛋白。
由于載脂蛋白(a)含有血纖維蛋白溶酶原-IV和V型kringle結(jié)構(gòu)域，設(shè)想載脂蛋白(a)可能具有抗血管發(fā)生活性。有一個(gè)實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明載脂蛋白(a)可能具有作為腫瘤血管發(fā)生和生長(zhǎng)抑制劑的生物活性(參見(jiàn)Trieu，V.N.和Uckun，F(xiàn).M.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，257714，1999)。據(jù)報(bào)道LL/2(Lewis肺癌)腫瘤生長(zhǎng)在apo(a)轉(zhuǎn)基因小鼠中延遲，apo(a)轉(zhuǎn)基因小鼠的LL/2腫瘤的微血管密度比作為對(duì)照的野生型小鼠的低。
在這種情況下，本發(fā)明人設(shè)想LK68蛋白，其單一kringle或它們的功能等同物可能具有抗-血管發(fā)生活性。為了證明所述抗-血管發(fā)生活性，研究重組LK68和其單一kringle(即，LK6，LK7和LK8)是否在體外以及在體內(nèi)是有效的抗血管發(fā)生因子。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LK68，LK6，LK7和LK8對(duì)培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移表現(xiàn)抑制活性。LK68和其單一kringle還抑制雞胚絨毛尿囊膜(CAM)中毛細(xì)血管的正常發(fā)育。并且顯示LK68的系統(tǒng)給藥抑制原發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)，其與誘導(dǎo)腫瘤的血管發(fā)生的抑制有關(guān)。既然每個(gè)單一kringle蛋白，LK6，LK7和LK8均表現(xiàn)抗血管發(fā)生活性，料想也抑制原發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移。
因此，LK68蛋白、其單一kringle或它們的功能等同物可以應(yīng)用于開(kāi)發(fā)強(qiáng)效抗癌劑，其對(duì)于由血管發(fā)生介導(dǎo)的疾病，包括類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、或眼血管發(fā)生性疾病等具有高度有效性。
另外，LK68蛋白，其單一kringle或它們的功能等同物還可以與其它組合物和方法聯(lián)合應(yīng)用于治療疾病。例如，可以常規(guī)地用手術(shù)、放療或化療結(jié)合LK68、其單一kringle或它們的功能等同物治療腫瘤，接著可以給患者施用LK68、其單一kringle或它們的功能等同物，以延長(zhǎng)微轉(zhuǎn)移的休眠期，同時(shí)穩(wěn)定和抑制任何殘存原發(fā)性腫瘤的生長(zhǎng)。
下面進(jìn)一步以實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，它們不應(yīng)當(dāng)用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1重組LK68的克隆和表達(dá)為了驗(yàn)證人apo(a)kringle的抗血管發(fā)生活性，本發(fā)明克隆和表達(dá)了含有IV36，IV37和V38的最后三個(gè)kringle，作為一種重組蛋白LK68。從人肝cDNA PCR擴(kuò)增了apo(a)從核苷酸12052到12975的DNA片段(參見(jiàn)McLean J.W.等，Nature，330132，1987)，并將得到的924-bp NdeI-BamHI片段連接到大腸桿菌表達(dá)載體pETlla(Novagen，USA)中。對(duì)于PCR擴(kuò)增，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)PCR方案，使用寡核苷酸引物A(SEQ ID NO9)和F(SEQID NO14)(參見(jiàn)表1)。該克隆命名為＂pETlla/LK68＂，其編碼包括人apo(a)kringle結(jié)構(gòu)域，IV36，IV37和V38在內(nèi)的308個(gè)氨基酸(參見(jiàn)SEQ NOID2)。該克隆的前兩個(gè)kringle結(jié)構(gòu)域，IV36和IV37與人血纖維蛋白溶酶原kringle IV同源，第三個(gè)kringle結(jié)構(gòu)域V38與人血纖維蛋白溶酶原kringle V同源。
該克隆的核苷酸序列在兩個(gè)方向上都得到驗(yàn)證。當(dāng)將該克隆的核苷酸序列與人apo(a)的相同區(qū)域(參見(jiàn)McLean J.W.等，Nature，330132，1987)比較時(shí)，它們的核苷酸序列除了核苷酸554位上發(fā)生一個(gè)堿基改變外其余都相同。我們的克隆在該位置含有一個(gè)胞嘧啶，而McLean等(參見(jiàn)McLean J.W.等，Nature，330132，1987)報(bào)道的序列中為胸腺嘧啶(thymidine)，導(dǎo)致從Met到Thr的一個(gè)氨基酸改變。其它研究組也曾報(bào)道過(guò)該取代(參見(jiàn)Van der-Hoek，Y.Y.等，Hum.Mol.Genet.，2361-366，1993；LoGrasso，P.V.等，J.Biol.Chem.，26921820-21827，1994)，并且看起來(lái)是apo(a)的主要等位基因。
用一種表達(dá)質(zhì)粒pETlla/LK68轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，在下面的條件下表達(dá)重組LK68蛋白。用10ml過(guò)夜培養(yǎng)的攜帶pETlla/LK68質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)接種1升含氨芐青霉素的Luria-Bertani肉湯培養(yǎng)基，在37℃振搖培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)物的OD600達(dá)到0.4-0.6時(shí)，加入終濃度為1mM的異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)。細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后再生長(zhǎng)4小時(shí)。在4℃，8000xg離心30分鐘收獲細(xì)胞。將這些細(xì)胞沉淀超聲，通過(guò)SDS-PAGE分析過(guò)表達(dá)的蛋白質(zhì)(參見(jiàn)圖1)。在圖1中，Mr代表分子量標(biāo)記(Boehringer Mannheim，Germany)，1道，無(wú)IPTG誘導(dǎo)的重組LK68蛋白的表達(dá)；2道，有IPTG誘導(dǎo)的重組LK68蛋白的表達(dá)。分子量為37kDa的重組LK68蛋白在大腸桿菌中很好地表達(dá)，通過(guò)掃描凝膠的圖象分析表明，該蛋白累積到總蛋白的約20-30％。由此制備的轉(zhuǎn)化體被命名為′大腸桿菌BL21/LK6-8′，并于1999年6月9日保藏在國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)，韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，#52 Oun-dong，Yusong-ku，Taejon 305-333，韓國(guó)，保藏號(hào)為No.KCTC0633BP。
各單一kringle結(jié)構(gòu)域，IV36，IV37和V38分別如上述克隆到表達(dá)載體pET15b中。用于克隆的寡核苷酸引物在表1中列出即用于克隆KIV36的是A(SEQ ID NO9)和D(SEQ ID NO12)；用于克隆KIV37的是B(SEQID NO10)和E(SEQ ID NO13)；用于克隆KV38的是C(SEQ ID NO11)和F(SEQ ID NO14)。這三對(duì)寡核苷酸引物用于以標(biāo)準(zhǔn)PCR方案進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的克隆命名為＂pET15b/LK6＂、＂pET15b/LK7＂和＂pET15b/LK8＂，它們各自分別包括單一人apo(a)kringle結(jié)構(gòu)域IV36，IV37和V38。用各表達(dá)質(zhì)粒pET15b/LK6，pET15b/LK7和pET15b/LK8轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。如此由質(zhì)粒pET15b/LK6制備的轉(zhuǎn)化體命名為′大腸桿菌BL21(DE3)/LK6′，于1999年9月3日保藏在國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)，韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，#52 Oun-dong，Yusong-ku，Taejon 305-333，韓國(guó)，保藏號(hào)為No.KCTC0655BP。如此用質(zhì)粒pET15b/LK7制備的轉(zhuǎn)化體命名為′大腸桿菌BL21(DE3)/LK7′，于1999年9月3日保藏在國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)，韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，與上述相同地址，保藏號(hào)為No.KCTC0656BP。如此用質(zhì)粒pET15b/LK8制備的轉(zhuǎn)化體命名為′大腸桿菌BL21/LK8′，于1999年6月9日保藏在國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)，韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，與上述相同地址，保藏號(hào)為No.KCTC0634BP。
重組LK6，LK7和LK8蛋白在與含N-末端His-tag的融合蛋白相同的條件下表達(dá)。用pET His-tag系統(tǒng)，在生產(chǎn)商推薦的條件下純化每種過(guò)表達(dá)的重組LK6，LK7和LK8蛋白。
表1.用于PCR克隆的寡核苷酸引物
*限制性位點(diǎn)，為了克隆方便，加入NdeI和BamHI(下化線(xiàn))。
**參見(jiàn)McLean等，Nature，330132，1987，對(duì)于核苷酸序列(登記號(hào)為X06290)。
實(shí)施例2重組LK68的純化為了生產(chǎn)重組LK68，在5L Bioflow III生物反應(yīng)器(New BrunswickScientifics，Edison，USA)中的下列培養(yǎng)基中進(jìn)行高細(xì)胞密度發(fā)酵4％(w/v)酵母提取物，4％(w/v)甘油，1％(w/v)磷酸氫二鈉，0.2％(w/v)磷酸二氫鉀和50μg/ml氨芐青霉素。當(dāng)細(xì)胞在600nm的吸收值達(dá)到100，用1mMIPTG誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)，然后用飼養(yǎng)培養(yǎng)基(29％(w/v)酵母提取物，39％(w/v)甘油和0.5％(w/v)硫酸鎂)進(jìn)行9小時(shí)的DO-stat飼養(yǎng)分批培養(yǎng)(fed-batch)。8000xg離心30分鐘收獲細(xì)胞。每個(gè)發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生約80g細(xì)胞/L(濕重)。
為了評(píng)價(jià)LK68在大腸桿菌細(xì)胞的可溶性細(xì)胞組分還是不溶性細(xì)胞組分中表達(dá)，本發(fā)明人分析了這些組分中LK68的表達(dá)。該分析表明LK68位于不溶性細(xì)胞組分中。因此，必須使LK68變性、重折疊和再氧化二硫鍵。通過(guò)使用去氧膽酸鹽和其它變性劑，不溶性L(fǎng)K68蛋白以包涵體形式純化，純度大于95％。然后，用7M脲使包涵體溶解，通過(guò)快速稀釋法和平衡透析機(jī)制將其折疊成天然構(gòu)型。在折疊緩沖液中，純化的包涵體可以方便地再折疊，且無(wú)可檢測(cè)的蛋白凝聚。透析后，通過(guò)賴(lài)氨酸瓊脂糖凝膠4B親合色譜純化蛋白質(zhì)。結(jié)合到賴(lài)氨酸瓊脂糖凝膠上的蛋白質(zhì)用ε-ACA(ε-氨基-n-己酸)特異性洗脫。這表明定位在重折疊蛋白的KIV37 kringle中的賴(lài)氨酸結(jié)合位點(diǎn)是完全有功能的。用0.1Mε-ACA對(duì)LK68進(jìn)行的親合洗脫產(chǎn)生約3mg蛋白/g細(xì)胞(濕重)。隨后用多粘菌素B小珠(Sigma Chemical Co.，USA)進(jìn)行層析，消除所有內(nèi)毒素，用鱟變形蟲(chóng)狀細(xì)胞裂解物分析試劑盒(Biowhittaker Inc.，USA)確定殘存的內(nèi)毒素活性。通過(guò)SDS-PAGE分析純化的蛋白質(zhì)，然后將其在-20℃儲(chǔ)藏，直到使用。LK68的計(jì)算pI值為6.13。純化的LK68 N-末端氨基酸序列通過(guò)氨基酸測(cè)序證實(shí)。
實(shí)施例3雞絨毛尿囊膜分析為了確定LK68在體內(nèi)是否有抗血管發(fā)生活性，本發(fā)明人考察了它抑制絨毛尿囊膜(＂CAM＂)中毛細(xì)血管發(fā)育的能力(參見(jiàn)Lee，T.H.等，J.Biol.Chem.，27328805-28812，1998)。將受精三天的雞蛋在37℃孵育，提取卵清蛋白后，開(kāi)一個(gè)小口。孵育兩天后，將一個(gè)含有重組LK68蛋白的Thermanox蓋玻片(Nunc Inc.，USA)應(yīng)用于個(gè)體胚的CAM。48小時(shí)后，將20％的脂肪乳注射到胚的絨毛尿囊中，考察Thermanox周?chē)难苄纬?參見(jiàn)圖2)。在圖2中，左照片顯示CAM中毛細(xì)血管的正常發(fā)育；右照片顯示LK68對(duì)CAM血管發(fā)生的抑制作用。
當(dāng)給CAM施用劑量范圍為3-5pg的LK68時(shí)，受測(cè)試的100個(gè)雞蛋中超過(guò)60％在應(yīng)用樣品的周?chē)@示無(wú)血管區(qū)，表明毛細(xì)血管的生長(zhǎng)受到抑制。對(duì)于每種kringle結(jié)構(gòu)域的重組蛋白，例如LK6，LK7或LK8，60-70％受測(cè)試蛋在1g/CAM的劑量范圍時(shí)，顯示抑制作用(參見(jiàn)圖3(A)和3(B))。該體內(nèi)研究顯示apo(a)kringle結(jié)構(gòu)域具有抗-血管發(fā)生活性，并且LK68及單一kringle蛋白是血管發(fā)生的強(qiáng)效抑制劑。在所有受測(cè)試的雞胚中，沒(méi)有任何毒性的證據(jù)。
實(shí)施例4內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制在下述條件下分析重組LK68，LK6，LK7和LK8蛋白對(duì)bFGF刺激的牛毛細(xì)血管內(nèi)皮(BCE)細(xì)胞增殖的抑制活性。BCE細(xì)胞在含10％小牛血清(BCS)和3ng/ml bFGF(Upstate Biotechnology，USA)的DMEM中生長(zhǎng)。將約3000個(gè)細(xì)胞加入96-孔組織培養(yǎng)平板的各個(gè)孔中，在37℃，5％CO2大氣下培養(yǎng)。培養(yǎng)18小時(shí)后，用含0.5％BCS的DMEM替換培養(yǎng)基，并將實(shí)驗(yàn)樣品加到各孔中。30分鐘溫育后，加bFGF至終濃度為1ng/ml。通過(guò)[3H]胸苷摻入法測(cè)定細(xì)胞數(shù)目。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次。
如圖4所示，確定了LK68，LK6，LK7和LK8以劑量依賴(lài)方式特異性抑制BCE細(xì)胞增殖。當(dāng)使用制管張素作為陽(yáng)性對(duì)照時(shí)，所有受測(cè)試的Apo(a)kringle蛋白在該實(shí)驗(yàn)條件下看起來(lái)更為有效。測(cè)定LK68的半數(shù)最大抑制濃度(ED50)約為200-250nM，LK6約為140-170nM，LK7約為10-20nM，LK8約為10-20nM(參見(jiàn)圖4(A)和4(B))。
在下述條件下分析重組LK68和LK8蛋白對(duì)bFGF刺激的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增殖的抑制活性。HUVEC(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，USA)在含10％熱滅活的胎牛血清(＂FBS＂)(Hyclone，USA)，30μg/ml內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑(ECGS)(Sigma Chemical Co.，USA)，和100μg/ml肝素(Sigma Chemical Co.，USA)的F12K培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。將細(xì)胞以2000/孔的密度接種96-孔組織培養(yǎng)平板中。細(xì)胞在37℃，5％CO2溫育18小時(shí)，用無(wú)血清的培養(yǎng)基清洗一次，然后加入含有0.5％FBS的F12培養(yǎng)基。用不同濃度的樣品處理細(xì)胞，并溫育30分鐘。然后，分別將終濃度為30μg/ml，100μg/ml和5ng/ml的ECGS、肝素和bFGF(Upstate Biotechnology，USA)加入細(xì)胞。溫育48小時(shí)后，應(yīng)用5-溴-2′-脫氧尿苷(BrdU)(BoehringerMannheim，USA)通過(guò)細(xì)胞增殖ELISA測(cè)定細(xì)胞數(shù)目。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次。
如圖4(C)所示，確定了LK68以及LK8以劑量依賴(lài)方式特異性抑制HUVEC細(xì)胞增殖。
在存在LK68或單一kringle蛋白例如LK6，LK7和LK8時(shí)，BCE或HUVEC細(xì)胞的形態(tài)看起來(lái)類(lèi)似未處理細(xì)胞的形態(tài)。除此而外，除去LK68后，細(xì)胞增殖可以通過(guò)bFGF刺激恢復(fù)。這些結(jié)果表明LK68以及單一kringle蛋白對(duì)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞毒性。而且，該抑制活性看起來(lái)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞，例如BCE和HUVEC細(xì)胞是特異性的。另外，LK68和LK8未顯示抑制非內(nèi)皮細(xì)胞型細(xì)胞，例如CHO細(xì)胞、小鼠皮膚成纖維細(xì)胞NIH3T3細(xì)胞、小鼠Lewis肺癌細(xì)胞、小鼠腎上腺瘤Y1細(xì)胞和小鼠胎肝/SV40轉(zhuǎn)化細(xì)胞系TIB74的增殖(參見(jiàn)圖5(A)到5(F))。圖5(A)到5(C)代表各種腫瘤細(xì)胞例如LLC、Y1、和TIB74的敏感度，圖5(D)到5(F)分別代表各種正常細(xì)胞系例如CHO，MSF，和NIH3T3的敏感度。
實(shí)施例5內(nèi)皮細(xì)胞遷移的抑制作用在g-mm孔的Transwells(Costar，USA)中進(jìn)行細(xì)胞遷移分析。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將各孔涂布纖連蛋白(25μg/ml)(Sigma Chemical Co.，USA)過(guò)夜，將HUVEC以2000/孔的密度接種到上層腔中的100μl含有0.4％胎牛血清(FCS)的Dulbecco′s改進(jìn)的Eagle′s培養(yǎng)基中。將500μl含有0.4％FCS的DMEM加到下層腔中，在37℃溫育1小時(shí)。將1μM濃度的實(shí)驗(yàn)樣品加入到上層腔中，將25ng/ml的bFGF加入到下層腔中。溫育5小時(shí)后，用棉簽擦拭掉上層腔中的細(xì)胞后，對(duì)穿過(guò)纖連蛋白鋪板膜的細(xì)胞定量。用Diff-Quik染料(Dade Behring Inc.，USA)按照生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)設(shè)置的方法對(duì)穿過(guò)膜的細(xì)胞染色，然后在100x放大倍數(shù)下記數(shù)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行兩次。
用堿性FGF(25ng/ml)刺激HUVEC細(xì)胞遷移。在劑量為1μM，LK68和單一kringle蛋白例如LK6，LK7和LK8將bFGF-誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞遷移完全抑制到未誘導(dǎo)的對(duì)照水平(參見(jiàn)圖6(A)和6(B))。在圖6中，(-)CON代表未誘導(dǎo)的對(duì)照，(+)CON代表bFGF-誘導(dǎo)的陽(yáng)性對(duì)照。
如上述用BCE細(xì)胞進(jìn)行遷移分析。應(yīng)用兩種不同濃度的LK68或單一kringle蛋白，所有受測(cè)試的Apo(a)kringle蛋白顯示對(duì)BCE細(xì)胞遷移具有抑制作用。另外，LK68和其單一kringle蛋白對(duì)BCE細(xì)胞遷移的抑制比制管張素(AS)更有效(參見(jiàn)圖7)。
實(shí)施例6對(duì)原發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)的抑制實(shí)施例6-1Lewis肺癌對(duì)雄性6到8-周齡的C57BL6/J小鼠移植Lewis肺癌。小鼠背部最接近中線(xiàn)的皮下注射在0.1ml生理鹽水中的1×106細(xì)胞。當(dāng)腫瘤直徑達(dá)到約5mm，對(duì)攜帶腫瘤的小鼠在遠(yuǎn)離腫瘤的部位皮下注射PBS中的LK68(100mg/kg體重)懸浮液。小鼠對(duì)照組僅接受虛擬治療，僅用PBS處理。在治療期間，每天測(cè)量腫瘤大??；用公式寬2×長(zhǎng)×0.52計(jì)算體積，確定最后一個(gè)時(shí)間點(diǎn)處理組對(duì)對(duì)照組腫瘤體積(T/C)的比值。治療進(jìn)行8天，8天后所有小鼠被處死，摘下腫瘤(參見(jiàn)圖8)。如圖8所示，可以很清楚地確定LLC原發(fā)性腫瘤的生長(zhǎng)被系統(tǒng)性L(fǎng)K68治療強(qiáng)烈抑制；劑量為100mg/kg的LK68的僅7天的治療導(dǎo)致腫瘤荷重顯著消退。
為了比較處理小鼠和對(duì)照小鼠的腫瘤，還從血管密度和出血形成，以及形態(tài)外觀方面進(jìn)行了組織學(xué)分析(參見(jiàn)圖9(A)到9(C))。在圖9(A)到9(C)中，9(A)顯示PBS-處理的對(duì)照，9(B)是10mg/kg體重LK68-處理的LLC腫瘤，9(C)是100mg/kg體重LK68-處理的LLC腫瘤。通過(guò)蘇木精和曙紅(H/E)染色，在LK68-處理的腫瘤中觀察到明顯的組織學(xué)差異即腫瘤細(xì)胞不完整，形態(tài)學(xué)上非存活；腫瘤周?chē)鷻z查到帶狀壞死。而且，LK68-處理的腫瘤中血管密度降低。在所有用重組LK68處理的小鼠中，沒(méi)有出現(xiàn)炎癥或出血的證據(jù)。
實(shí)施例6-2人肺癌該實(shí)驗(yàn)中使用的四周齡遠(yuǎn)系繁殖的雌性nu/nu裸鼠在無(wú)菌環(huán)境下養(yǎng)殖。籠子、草墊、食物和水都是高壓滅菌的。小鼠以12-hr光/12-hr暗循環(huán)生長(zhǎng)。人肺癌細(xì)胞(A549，購(gòu)自韓國(guó)細(xì)胞系庫(kù))在添加10％熱滅活的FBS和抗生素的RPMI 1640培養(yǎng)基中維持生長(zhǎng)。將大約2×107個(gè)人肺癌細(xì)胞皮下注射到裸鼠背部近中線(xiàn)部位。當(dāng)腫瘤移植7天后，腫瘤可觸知時(shí)，用劑量為100mg/kg體重的LK68處理小鼠。對(duì)照組僅用PBS處理。治療持續(xù)17天。每隔一天測(cè)量腫瘤尺寸。
LK68的處理減弱了腫瘤生長(zhǎng)即，LK68-處理的A549腫瘤比對(duì)照動(dòng)物的腫瘤小大約57.5％(參見(jiàn)圖10)。在所有處理小鼠中，沒(méi)有顯示任何毒性。只要給藥，連續(xù)治療使腫瘤始終維持在休眠狀態(tài)。這些數(shù)據(jù)充分表明LK68的抗血管發(fā)生作用可以用于靶向多種原發(fā)性惡性腫瘤。
如前面清楚地舉例說(shuō)明和證明的，本發(fā)明提供了一種新的血管發(fā)生抑制劑，LK68，其氨基酸序列與人apo(a)kringle結(jié)構(gòu)域IV36，IV37和V38的一致，一種編碼LK68的DNA序列，一種含有所述DNA的重組表達(dá)載體，一種用所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的重組微生物，LK68作為抗癌劑的用途，及治療血管發(fā)生介導(dǎo)的疾病的方法。
序列表<110>財(cái)團(tuán)法人牧巖生命工學(xué)研究所<120>一種新的血管發(fā)生抑制劑<160>14<170>KOPATIN 1.5<210>1<211>924<212>DNA<213>人<400>1aaaagccctg tggtccagga ttgctaccat ggtgatggac ggagttatcg aggcatatcc60tccaccactg tcacaggaag gacctgtcaa tcttggtcat ctatgatacc acactggcat120cagaggaccc cagaaaacta cccaaatgct ggcctgaccg agaactactg caggaatcca180gattctggga aacaaccctg gtgttacaca accgatccgt gtgtgaggtg ggagtactgc240aatctgacac aatgctcaga aacagaatca ggtgtcctag agactcccac tgttgttcca300gttccaagca tggaggctca ttctgaagca gcaccaactg agcaaacccc tgtggtccgc360cagtgctacc atggcaatgg ccagagttat cgaggcacat tctccaccac tgtcacagga420aggacatgtc aatcttggtc atccatgaca ccacaccggc atcagaggac cccagaaaac480tacccaaatg atggcctgac aatgaactac tgcaggaatc cagatgccga tacaggccct540tggtgtttta ccacggaccc cagcatcagg tgggagtact gcaacctgac gcgatgctca600gacacagaag ggactgtggt cgctcctccg actgtcatcc aggttccaag cctagggcct660ccttctgaac aagactgtat gtttgggaat gggaaaggat accggggcaa gaaggcaacc720actgttactg ggacgccatg ccaggaatgg gctgcccagg agccccatag acacagcacg780ttcattccag ggacaaataa atgggcaggt ctggaaaaaa attactgccg taaccctgat840ggtgacatca atggtccctg gtgctacaca atgaatccaa gaaaactttt tgactactgt900gatatccctc tctgtgcatc ctct 924
<210>2<211>308<212>PRT<213>人<400>2Lys Ser Pro Val Val Gln Asp Cys Tyr His Gly Asp Gly Arg Ser Tyr1 5 10 15Arg Gly Ile Ser Ser Thr Thr Val Thr Gly Arg Thr Cys Gln Ser Trp20 25 30Ser Ser Met Ile Pro His Trp His Gln Arg Thr Pro Glu Asn Tyr Pro35 40 45Asn Ala Gly Leu Thr Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ser Gly Lys50 55 60Gln Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Cys Val Arg Trp Glu Tyr Cys65 70 75 80Asn Leu Thr Gln Cys Ser Glu Thr Glu Ser Gly Val Leu Glu Thr Pro85 90 95Thr Val Val Pro Val Pro Ser Met Glu Ala His Ser Glu Ala Ala Pro100 105 110Thr Glu Gln Thr Pro Val Val Arg Gln Cys Tyr His Gly Asn Gly Gln115 120 125Ser Tyr Arg Gly Thr Phe Ser Thr Thr Val Thr Gly Arg Thr Cys Gln130 135 140Ser Trp Ser Ser Met Thr Pro His Arg His Gln Arg Thr Pro Glu Asn145 150 155 160Tyr Pro Asn Asp Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala165 170 175Asp Thr Gly Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Ser Ile Arg Trp Glu180 185 190Tyr Cys Asn Leu Thr Arg Cys Ser Asp Thr Glu Gly Thr Val Val Ala195 200 205Pro Pro Thr Val Ile Gln Val Pro Ser Leu Gly Pro Pro Ser Glu Gln210 215 220
Asp Cys Met Phe Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Lys Ala Thr225 230 235 240Thr Val Thr Gly Thr Pro Cys Gln Glu Trp Ala Ala Gln Glu Pro His245 250 255Arg His Ser Thr Phe Ile Pro Gly Thr Asn Lys Trp Ala Gly Leu Glu260 265 270Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ile Asn Gly Pro Trp Cys275 280 285Tyr Thr Met Asn Pro Arg Lys Leu Phe Asp Tyr Cys Asp Ile Pro Leu290 295 300Cys Ala Ser Ser305<210>3<211>273<212>DNA<213>人<400>3aaaagccctg tggtccagga ttgctaccat ggtgatggac ggagttatcg aggcatatcc60tccaccactg tcacaggaag gacctgtcaa tcttggtcat ctatgatacc acactggcat120cagaggaccc cagaaaacta cccaaatgct ggcctgaccg agaaetactg caggaatcca180gattctggga aacaaccctg gtgttacaca accgatccgt gtgtgaggtg ggagtactgc240aatctgacac aatgctcaga aacagaatca ggt 273<210>4<211>91<212>PRT<213>人<400>4Lys Ser Pro Val Val Gln Asp Cys Tyr His Gly Asp Gly Arg Ser Tyr1 5 10 15Arg Gly Ile Ser Ser Thr Thr Val Thr Gly Arg Thr Cys Gln Ser Trp20 25 30Ser Ser Met Ile Pro His Trp His Gln Arg Thr Pro Glu Asn Tyr Pro
35 40 45Asn Ala Gly Leu Thr Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ser Gly Lys50 55 60Gln Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Cys Val Arg Trp Glu Tyr Cys65 70 75 80Asn Leu Thr Gln Cys Ser Glu Thr Glu Ser Gly85 90<210>5<211>267<212>DNA<213>人<400>5gtccgccagt gctaccatgg caatggccag agttatcgag gcacattctc caccactgtc 60acaggaagga catgtcaatc ttggtcatcc atgacaccac accggcatca gaggacccca 120gaaaactacc caaatgatgg cctgacaatg aactactgca ggaatccaga tgccgataca 180ggcccttggt gttttaccac ggaccccagc atcaggtggg agtactgcaa cctgacgcga 240tgctcagaca cagaagggac tgtggtc 267<210>6<211>89<212>PRT<213>人<400>6Val Arg Gln Cys Tyr His Gly Asn Gly Gln Ser Tyr Arg Gly Thr Phe1 5 10 15Ser Thr Thr Val Thr Gly Arg Thr Cys Gln Ser Trp Ser Ser Met Thr20 25 30Pro His Arg His Gln Arg Thr Pro Glu Asn Tyr Pro Asn Asp Gly Leu35 40 45Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp Thr Gly Pro Trp Cys50 55 60Phe Thr Thr Asp Pro Ser Ile Arg Trp Glu Tyr Cys Asn Leu Thr Arg65 70 75 80
Cys Ser Asp Thr Glu Gly Thr Val Val85<210>7<211>258<212>DNA<213>人<400>7gaacaggact gcatgtttgg gaatgggaaa ggataccggg gcaagaaggc aaccactgtt60actgggacgc catgccagga atgggctgcc caggagcccc atagacacag cacgttcatt120ccagggacaa ataaatgggc aggtctggaa aaaaattact gccgtaaccc tgatggtgac180atcaatggtc cctggtgcta cacaatgaat ccaagaaaac tttttgacta ctgtgatatc240cctctctgtg catcctct 258<210>8<211>86<212>PRT<213>人<400>8Glu Gln Asp Cys Met Phe Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Lys1 5 10 15Ala Thr Thr Val Thr Gly Thr Pro Cys Gln Glu Trp Ala Ala Gln Glu20 25 30Pro His Arg His Ser Thr Phe Ile Pro Gly Thr Asn Lys Trp Ala Gly35 40 45Leu Glu Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ile Asn Gly Pro50 55 60Trp Cys Tyr Thr Met Asn Pro Arg Lys Leu Phe Asp Tyr Cys Asp Ile65 70 75 80Pro Leu Cys Ala Ser Ser85<210>9<211>29
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈寡核苷酸<400>9tccatatgaa aagccctgtg gtccaggat 29<210>10<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈寡核苷酸<400>10cagtccatat ggtccgccag tgctaccatg gca33<210>11<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈寡核苷酸<400>11ggaattccat atggaacagg actgcatgtt t 31<210>12<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈寡核苷酸<400>12cgggatcctt aacctgattc tgtttc26<210>13<211>26<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>單鏈寡核苷酸<400>13cgggatcctt agaccacagt cccttc 26<210>14<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈寡核苷酸<400>14cgggatcctt aagaggatgc aca 23權(quán)利要求
1.具有SEQ ID NO8序列的LK8蛋白，其由人載脂蛋白(a)kringle結(jié)構(gòu)域V38的氨基酸序列組成。
2.一種具有SEQ ID NO7序列的cDNA序列，其編碼權(quán)利要求1的LK8蛋白。
3.一種重組表達(dá)載體pET15b/LK8，其含有權(quán)利要求2的cDNA，其表達(dá)權(quán)利要求1的LK8蛋白。
4.保藏號(hào)為KCTC 0634BP的大腸桿菌BL21/LK8，其用權(quán)利要求3的重組表達(dá)載體pET15b/LK8轉(zhuǎn)化。
5.一種用于抗癌劑的藥物組合物，其含有活性成分LK8蛋白。
6.LK8蛋白用于制備用于治療血管發(fā)生-介導(dǎo)的疾病的藥物中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求6的LK8蛋白的應(yīng)用，其中所述血管發(fā)生-介導(dǎo)的疾病是癌癥，類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、或眼血管發(fā)生性疾病。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的血管發(fā)生抑制劑，LK68，其氨基酸序列與人載脂蛋白(a)kringle結(jié)構(gòu)域IV36，IV37和V38的一致，一種編碼LK68的cDNA序列，一種含有所述cDNA的重組表達(dá)載體，一種用所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的重組微生物，以及LK68作為抗癌劑的新用途和治療血管發(fā)生介導(dǎo)的疾病的方法。LK68，LK6，LK7和LK8對(duì)培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖和內(nèi)皮細(xì)胞遷移表現(xiàn)抑制活性。LK68和其單一kringle還抑制雞胚絨毛尿囊膜(CAM)中毛細(xì)血管的正常發(fā)育。還顯示LK68的系統(tǒng)給藥抑制原發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)，其與誘導(dǎo)腫瘤的血管發(fā)生的抑制有關(guān)。因此，LK68蛋白，其單一kringle或它們的功能等同物可以用于開(kāi)發(fā)有效的抗癌劑，該抗癌劑對(duì)血管發(fā)生介導(dǎo)的疾病，包括癌癥、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、眼血管形成性疾病等高度有效。
文檔編號(hào)A61K38/17GK1535983SQ20041003426
公開(kāi)日2004年10月13日 申請(qǐng)日期1999年9月15日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月15日
發(fā)明者張志勛, 金章性, 樸恩正, 廉晶善, 鄭守一 申請(qǐng)人:財(cái)團(tuán)法人牧巖生命工學(xué)研究所