專利名稱：海洋生物抗癌蛋白及其提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為從海洋生物原生泥蚶(Arca granosa L.)中經(jīng)低溫提取、生物技術(shù)純化處理而制備得到的一類能抗癌的活性蛋白及其制劑。它屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前癌癥作為危害人類健康的一大疾患且患病例數(shù)逐年增加，而當(dāng)今對(duì)癌癥的治療現(xiàn)狀頗顯窘迫，患者多以手術(shù)、放化療方法采取對(duì)抗治療，可是這對(duì)機(jī)體損傷嚴(yán)重，對(duì)機(jī)體內(nèi)環(huán)境干擾明顯，化療藥物在直接殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)也抑制了機(jī)體的免疫功能，從而使其毒副作用相當(dāng)明顯；而中成藥物的治療現(xiàn)多處于扶正固本階段。
現(xiàn)在已公開(kāi)有從海洋生物中經(jīng)低溫水解而得到的提取物作為抗癌物質(zhì)，但是低溫水解工藝對(duì)所提蛋白能夠產(chǎn)生一定的破壞和影響，難以保證所提成分的完整性和活性。

發(fā)明內(nèi)容
海洋生物體組織蛋白在一般條件下很容易水解變質(zhì)，在外界環(huán)境條件不宜下易改變其活性或失活，蛋白類制劑也因其溶解性及穩(wěn)定性差而至其水溶液澄明度、澄清度差。
本發(fā)明的目的就是為了克服和避免已有技術(shù)的缺點(diǎn)和不足，而提供一種海洋生物抗癌蛋白及其提取方法，本發(fā)明通過(guò)生物技術(shù)從海洋生物原生泥蚶(Arca granosa L.)的生物體中提取活性蛋白，并且應(yīng)用澄清劑進(jìn)一步純化所提成分，中間過(guò)程不對(duì)所提蛋白產(chǎn)生任何破壞和影響，能夠保證所提成分的完整性及活性，再經(jīng)制劑技術(shù)處理制的符合藥用標(biāo)準(zhǔn)的注射劑供臨床使用。
本發(fā)明為從海洋生物原生泥蚶(Arca granosa L.)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種快速、安全、有效殺傷癌細(xì)胞但不傷害機(jī)體正常細(xì)胞，而且還能提高患者機(jī)體免疫力的活性蛋白類物質(zhì)，并且通過(guò)提取、純化將其進(jìn)一步制成制劑，應(yīng)用于臨床。該組織活性蛋白類制劑的療效確切，能選擇性殺傷癌組織細(xì)胞，且能提高肌體免疫力。
本發(fā)明是通過(guò)以下措施來(lái)實(shí)現(xiàn)其發(fā)明目的的。
一種海洋生物抗癌蛋白，它是由海洋鮮活原生泥蚶(Arca granosa L.)生物體經(jīng)低溫提取和生物澄清劑吸附析出而得到的提取物。
一種海洋生物抗癌蛋白的提取方法，它是將海洋鮮活原生泥蚶(Arcagranosa L.)生物體洗凈、去殼取軟體組織、搗碎后研磨勻漿，粒度為200um-500um；勻漿后的凈料用冷至6℃以下的新鮮制取的注射用水以重量比1∶1提取1～2次，攪拌機(jī)應(yīng)慢速提取4小時(shí)；提取液經(jīng)離心去渣后，按體積比加入生物澄清劑III型按先B后A的順序加入，B的加入量為1％～3％，A的加入量為B加入量的一半，攪拌混勻后，冷藏放置12小時(shí)充分吸附；澄清液經(jīng)冷凍離心機(jī)分離后，分離液入凍干箱進(jìn)行凍干；凍干溫度在-35℃～-40℃，升華溫度30℃～40℃。凍干時(shí)間30小時(shí)左右。以無(wú)菌方式從凍干箱中取出凍干粉即得到海洋生物抗癌蛋白提取物。
稱取一定量的凍干粉，加入適量的新鮮制備的注射用水，冷卻至10℃以下，用1％鹽酸調(diào).pH3.0±0.5，經(jīng)粗濾后再經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾即得到海洋生物抗癌蛋白制劑。
本發(fā)明克服和避免了已有技術(shù)的缺點(diǎn)和不足，本發(fā)明通過(guò)生物技術(shù)從海洋生物原生泥蚶(Arca granosa L.)的生物體中提取活性蛋白，并且應(yīng)用澄清劑進(jìn)一步純化所提成分，中間過(guò)程不對(duì)所提蛋白產(chǎn)生任何破壞和影響，能夠保證所提成分的完整性及活性，再經(jīng)制劑技術(shù)處理制的符合藥用標(biāo)準(zhǔn)的注射劑供臨床使用。應(yīng)用本發(fā)明的制備工藝可使提得的生物組織蛋白純度高、生物活性高，其制劑澄明度、澄清度、微生物等指標(biāo)均能符合藥用注射劑標(biāo)準(zhǔn)，高效液相指紋圖譜穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，且臨床應(yīng)用藥效明顯、安全、可靠。
本發(fā)明工藝制備過(guò)程的具體描述1、海洋中捕取的鮮活原生泥蚶(Arca granosa L.)生物體洗凈、去殼取軟體組織洗凈、搗碎后用膠體磨研磨勻漿，粒度為200um-500um。
2、勻漿后的凈料用冷至6℃以下的新鮮制取的注射用水以重量比1∶1提取1～2次，所用攪拌機(jī)應(yīng)慢速提取4小時(shí)。
本發(fā)明應(yīng)用新鮮的注射用水從而減少提取過(guò)程中的污染，低溫提取為保證成分的完整性。
慢速攪拌為避免提取過(guò)程中產(chǎn)熱而使提取液變質(zhì)3、提取液經(jīng)離心去渣后，按體積比加入生物澄清劑III型按先B后A的順序加入(B的加入量為1％～3％，A的加入量為B加入量的一半)攪拌混勻后，冷藏放置12小時(shí)充分吸附。
本發(fā)明重在應(yīng)用了生物澄清劑，它既不會(huì)破壞提取成分，且能通過(guò)吸附，而使大分子雜蛋白與之形成大粒子而至溶解度降低，被析出。澄清劑還能吸附處去微生物及熱源物質(zhì)，保證制劑安全性，這種除熱源方法不影響制劑成分的完整性及濃度。
4、澄清液經(jīng)冷凍離心機(jī)分離后，分離液入凍干箱進(jìn)行凍干。
凍干溫度在-35℃～-40℃，升華溫度30℃～40℃。凍干時(shí)間30小時(shí)左右。以無(wú)菌方式從凍干箱中取出凍干粉。凍干粉經(jīng)真空包裝低溫保存(0℃～8℃)。
本制品凍干粉經(jīng)尤斯夫共晶儀測(cè)定其共晶點(diǎn)為-2.0℃因此選擇凍干升華溫度低于40℃。
5、稱取一定量的凍干粉，加入適量的新鮮制備的注射用水(冷卻至10℃以下)，用1％鹽酸(分析純)調(diào).pH3.0±0.5，經(jīng)粗濾后再經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾灌裝于2ml安瓿備用。
經(jīng)分析該制劑成分為堿性蛋白在微酸性條件下穩(wěn)定，所以調(diào)pH(3.0±0.5)的目的在于使其偏離本類活性蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)增加溶解度，使溶解完全，確保療效。
濾過(guò)過(guò)程在于除去大粒子不溶物及細(xì)菌等影響質(zhì)量的因素，本工藝的進(jìn)行均在萬(wàn)級(jí)潔凈間溫控在10℃以下進(jìn)行灌裝要求在百級(jí)無(wú)菌間進(jìn)行制劑組分分析本制劑成分為蛋白類物質(zhì)，經(jīng)檢測(cè)其主要為堿性蛋白在pH2.5-3.5微酸性溶液中穩(wěn)定，中性及堿性中不穩(wěn)定易析出蛋白質(zhì)，本類成分遇蛋白酶、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、光、熱條件易被破壞，因此采取低溫、避光存放。
本制劑經(jīng)高效液相色譜分析，其特征指紋圖譜穩(wěn)定、重現(xiàn)性好。
凍干粉原料經(jīng)高效凝膠電泳測(cè)定分子量在15000左右。
該發(fā)明創(chuàng)造經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示有明顯的抗癌作用，本品制劑對(duì)小鼠S-180實(shí)體瘤、肝癌實(shí)體瘤、EAC腹水瘤、Lweis肺癌轉(zhuǎn)移模型的預(yù)防、治療作用抑瘤率均在50％以上，延命率達(dá)60％以上有的高達(dá)90％以上(均高于新藥臨床前藥理研究要求的30％)。本制劑對(duì)小鼠免疫功能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其對(duì)小鼠免疫功能均有不同程度增加。
體外實(shí)驗(yàn)顯示其對(duì)不同癌細(xì)胞殺傷率不同，其中對(duì)肺癌細(xì)胞殺傷率達(dá)94％，乳癌細(xì)胞殺傷率達(dá)70％，胃癌細(xì)胞殺傷率達(dá)55.2％，對(duì)15種癌細(xì)胞平均殺傷率達(dá)50％以上。與五種化療藥品(環(huán)磷酰胺、卡氮芥、甲氨喋呤、絲裂霉素、鹽酸阿霉素)比較，除環(huán)磷酰胺在乳癌細(xì)胞與胃癌細(xì)胞殺傷率與本制劑相近外，其它四種效果均較差；病理組織切片電鏡亞微結(jié)構(gòu)觀察顯示癌細(xì)胞普遍壞死，而淋巴細(xì)胞卻仍正常存活，說(shuō)明其在殺傷癌細(xì)胞同時(shí)，不傷害正常細(xì)胞。毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示未見(jiàn)其引起的毒性反映；一般藥理實(shí)驗(yàn)顯示其對(duì)肌體各組織器官無(wú)明顯影響。
本制劑據(jù)多年來(lái)臨床應(yīng)用觀察顯示患者在應(yīng)用本品制劑后精神狀況明顯好轉(zhuǎn)、飲食量增加、體重增加、腫塊相對(duì)減小或消失，對(duì)術(shù)后放、化療患者用藥后嘔吐現(xiàn)象減少或停止，白細(xì)胞升高。其不但對(duì)中早期癌癥患者有非常顯著的療效，而且對(duì)轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的晚期癌癥患者用藥后能迅速減輕痛苦，延長(zhǎng)壽命，提高生存質(zhì)量，多年應(yīng)用的臨床統(tǒng)計(jì)表明本制劑對(duì)各種癌癥效果顯著，尤其對(duì)肺癌、腎癌的治療效果尤佳，在幾年收治的患者病例當(dāng)中對(duì)肺癌患者有效率達(dá)52.28％，對(duì)腎癌患者的有效率高達(dá)51.68％以上，均高于目前其他藥物治療的有效率。對(duì)300例患者用藥后跟蹤觀察2年生存率占91％，3年以上生存率占83％，5年以上生存率占66％，7年以上生存率占51％。
具體實(shí)施例方式
稱取新鮮捕取的原生泥蚶(Arca granosa L.)原料600g，自來(lái)水洗凈污泥，移至萬(wàn)級(jí)潔凈間，溫控10℃以下，撥去貝殼取出軟體部分，純化用水洗至無(wú)血污后，新鮮制取的注射用水，要求冷至10℃以下，洗滌三次，瀝干水分，將軟體組織用搗碎機(jī)進(jìn)行搗碎，粒度為1mm，搗碎的凈料經(jīng)膠體磨研磨勻漿，粒經(jīng)為200um-500um，勻漿凈料按1∶1(w/w) 比例加入新鮮制取的注射用水，冷至10℃以下，低溫條件下慢速攪拌4小時(shí)，60轉(zhuǎn)/分保持提取液溫度4℃左右，冷凍離心機(jī)(2000轉(zhuǎn)/分)離心去渣收集分離液，分離液再經(jīng)管式離心機(jī)(16000轉(zhuǎn)/分)離心，分離液收集于不銹鋼桶中，用1％鹽酸(分析純)適量調(diào)pH5.5，加入澄清劑III型，按先B后A的順序加入[B加入量為3％(v/v)，A加入量為1.5％(v/v)]攪拌混合均勻，于冷藏箱(4℃)靜置12小時(shí)，使之充分吸附大分子雜質(zhì)蛋白、微生物及熱源，澄清液經(jīng)冷凍離心機(jī)分離后，分離液入凍干箱，經(jīng)-30℃，凍干30小時(shí)后，升華溫度為35℃，以無(wú)菌方式從凍干箱中取出凍干粉。稱取凍干粉10g，加新鮮制備并冷卻至6℃注射用水100ml充分溶解，用1％鹽酸(分析純)調(diào)節(jié)pH3.5，經(jīng)無(wú)菌濾紙粗濾，再經(jīng)G6型垂熔玻璃漏斗過(guò)濾，濾液最后用0.22um微孔濾膜濾過(guò)后，無(wú)菌分裝于2ml安瓿，經(jīng)含量測(cè)定(按總氮計(jì))、熱源實(shí)驗(yàn)、微生物檢驗(yàn)及澄明度、澄清度、pH值檢驗(yàn)合格后使用。
權(quán)利要求
1.一種海洋生物抗癌蛋白，其特征在于它是由海洋鮮活原生泥蚶(Arcagranosa L.)生物體經(jīng)低溫提取和生物澄清劑吸附析出而得到的提取物。
2.一種海洋生物抗癌蛋白的提取方法，其特征在于它是將海洋鮮活原生泥蚶(Arca granosa L.)生物體洗凈、去殼取軟體組織、搗碎后研磨勻漿，粒度為200um-500um；勻漿后的凈料用冷至6℃以下的新鮮制取的注射用水以重量比1∶1提取1～2次，攪拌機(jī)應(yīng)慢速提取4小時(shí)；提取液經(jīng)離心去渣后，按體積比加入生物澄清劑III型按先B后A的順序加入，B的加入量為1％～3％，A的加入量為B加入量的一半，攪拌混勻后，冷藏放置12小時(shí)充分吸附；澄清液經(jīng)冷凍離心機(jī)分離后，分離液入凍干箱進(jìn)行凍干；凍干溫度在-35℃～-40℃，升華溫度30℃～40℃。凍干時(shí)間30小時(shí)左右。以無(wú)菌方式從凍干箱中取出凍干粉即得到海洋生物抗癌蛋白提取物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種海洋生物抗癌蛋白的提取方法，其特征在于稱取一定量的凍干粉，加入適量的新鮮制備的注射用水，冷卻至10℃以下，用1％鹽酸調(diào).pH3.0±0.5，經(jīng)粗濾后再經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾即得到海洋生物抗癌蛋白制劑。
全文摘要
本發(fā)明為一種海洋生物抗癌蛋白及其提取方法，它屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)生物技術(shù)從海洋生物原生泥蚶(Arca granosa L.)的生物體中提取活性蛋白，并且應(yīng)用澄清劑進(jìn)一步純化所提成分，中間過(guò)程不對(duì)所提蛋白產(chǎn)生任何破壞和影響，能夠保證所提成分的完整性及活性，再經(jīng)制劑技術(shù)處理制的符合藥用標(biāo)準(zhǔn)的注射劑供臨床使用。應(yīng)用本發(fā)明的制備工藝可使提得的生物組織蛋白純度高、生物活性高，其制劑澄明度、澄清度、微生物等指標(biāo)均能符合藥用注射劑標(biāo)準(zhǔn)，高效液相指紋圖譜穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，且臨床應(yīng)用藥效明顯、安全、可靠。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1752100SQ20041003582
公開(kāi)日2006年3月29日 申請(qǐng)日期2004年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月23日
發(fā)明者陳守國(guó) 申請(qǐng)人:青島海生腫瘤醫(yī)院