專利名稱：姜黃素磷脂復合物及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術領域，確切地說涉及一種姜黃素及其衍生物的磷脂復合物及其制備方法。
背景技術：
姜科姜黃屬植物姜黃(CurcumalongaL.)是一種常用的中藥，所含姜黃色素由姜黃素(Cur)、去甲氧基姜黃素(Cur-2)、二去氧基姜黃素(Cur-3)組成，其中姜黃素是主要的藥理活性成分，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、降血脂等廣泛的藥理作用，而且毒性很低，姜黃素小鼠的LD50＞2g·kg-1(陳敏娟，姜黃素研究進展及應用前景，海峽藥學，2003，15(1)4-6)。姜黃素類藥源充足，是一種很有開發(fā)前景的天然化合物，但Cur本身不溶于水，在弱酸(十二指腸及小腸)至強酸性(胃)水介質中不溶解，致使常規(guī)劑型片劑、膠囊劑等在胃中分散性差，吸收存在問題，加上其在體內易被代謝，血藥濃度較低，從而影響其進入臨床應用(Pan MH，Huang TM，Lin JK.Biotransformation of curcuminthrough reduction and glucuronidation in mice.Drug Metab Dispos 1999Apr；27(4)486-94)。
有關姜黃素類成分的進一步研究致力于對其構效關系的研究，衍生物的合成，劑型的開發(fā)等，以期待獲得更大水溶性，更高穩(wěn)定性，藥理活性更強，使之成為更實用的高效、低毒藥物。李劍明等研究探討了羥丙基-β-環(huán)糊精對Cur-3的增溶作用，Cur-3在形成環(huán)糊精飽和物后溶解度可提高近150倍(李劍明，楊和平，羥丙基-β-環(huán)糊精對姜黃素-3的增溶作用，中國新醫(yī)藥，2004，3(7)11-14)。
近年來許多國外文獻報道，將天然活性成分與磷脂在一定條件下進行復合，得到天然活性成分磷脂復合物(phytosomes)，其理化性質和生物特性較原化合物均有不同程度的改變，具有較強的親脂性，通過與磷脂復合而形成載體系統，能改善一些藥物在胃腸道中或經皮吸收，可有效地提高天然活性成分的體內吸收，可獲得較高的血藥濃度且體內消除較慢，使生物利用度顯著提高。關于天然活性成分磷脂復合物生物利用度的研究，有水溶性及脂溶性均不佳的水飛薊素、多萜醇、積雪草苷、黃芩苷磷脂復合物等(吳建梅等，天然活性成分磷脂復合物藥學研究概述，中國藥學雜志，1998，33(1)9-11)。
經文獻檢索，目前尚未見有關利用制備姜黃素磷脂復合物以提高姜黃素類成分生物利用度的報道發(fā)明內容針對現有技術的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種姜黃素的磷脂復合物及其制備方法。以改善姜黃素類成分生物利用度方面的缺陷。
本發(fā)明的姜黃素磷脂復合物，由姜黃素或其衍生物與磷脂復合而成，其中姜黃素或其衍生物與磷脂的摩爾比為1∶1～3。
其中，所述姜黃素或其衍生物與磷脂的摩爾比優(yōu)選為1∶1。
其中，所述姜黃素磷脂復合物優(yōu)選由姜黃素與磷脂復合而成，且姜黃素與磷脂的摩爾比優(yōu)選為1∶1。
其中，所述姜黃素的衍生物是去甲氧基姜黃素或二去甲氧基姜黃素。
其中，所述磷脂是平均分子量700～800的磷脂，且磷脂主要指大豆磷脂、蛋黃磷脂。
本發(fā)明的姜黃素磷脂復合物的制備方法，包括下述順序的步驟(1)取姜黃素或其衍生物溶于40℃～60℃的脂溶性溶劑中，得紅色澄明液體；(2)在40℃～70℃條件下保溫，加入相當于姜黃素或其衍生物1～3倍摩爾量的磷脂，攪拌，直至溶液澄明；(3)5～15分鐘后，接回流裝置，以上述條件加熱保溫的同時不斷振蕩反應1～2小時；(4)拆除回流裝置，60℃常規(guī)減壓蒸餾濃縮至反應體積為200～300ml時，立即傾入1500～2500ml正己烷中，溶液上層呈黃色渾濁液體，下層呈紅色油狀物；(5)取紅色油狀物，真空干燥，得磚紅色干燥物，即為姜黃素磷脂復合物。
其中，步驟(1)所述脂溶性溶劑是指丙酮、乙醇、氯仿、甲醇。
其中，步驟(1)所述脂溶性溶劑優(yōu)選是指無水乙醇。
其中，步驟(2)所述磷脂是指平均分子量為700～800的磷脂，且磷脂主要指大豆磷脂、蛋黃磷脂。優(yōu)選平均分子量為750的大豆卵磷脂，平均分子量為780的蛋黃卵磷脂，平均分子量為700的卵磷脂；最優(yōu)選平均分子量為750的大豆卵磷脂。
其中，步驟(2)所述保溫溫度優(yōu)選55℃。
本發(fā)明所得復合物在薄層層析上顯示與姜黃素相同比移值的斑點，說明形成的是復合物，而不是新生成的化合物，該復合物與姜黃色素與磷脂的物理混合物在差熱分析(DSC)、紅外光譜(IR)與氫核磁共振圖譜(1HNMR)中存在明顯的差別DSC中混合物在125℃附近有一較弱的吸熱凹處，160℃附近有明顯的吸熱現象，而復合物熱量變化溫度在151℃附近；IR中姜黃色素本身OH吸收峰在3416cm-1左右，在與磷脂物理混合物后移至3505cm-1左右，形成復合物后在3223cm-1左右，磷脂本身P＝O吸收位置在1234cm-1左右，與姜黃色素物理混合物后移至1283cm-1左右，形成復合物后在1292cm-1左右，表明姜黃色素的OH可能與磷脂的P＝O鍵發(fā)生了一定程度的締合；復合物的1HNMR圖譜中，所出現的峰為姜黃色素與磷脂的加合，磷脂氫質子部分與單獨的磷脂信號相比呈現強峰，姜黃色素氫質子部分與單獨的姜黃色素信號相比的峰較弱，但各峰化學位移值和裂分亦清晰可見。這說明所制備的姜黃色素磷脂復合物不是新生成的化合物，但也的確不同于其二者簡單的混合，而是以一種復合物的形式存在的。
試驗表明形成復合物后改善了生物利用度。取雄性大白鼠鼠隨機組，禁食12h后分別用姜黃素和姜黃素的磷脂復合物灌胃，給藥劑量均相當于姜黃素500mg/kg。于各藥灌胃前及服藥后0.5、1、2、4、8、16h由頸動脈取血0.5ml，置經肝素處理的試管中，離心分離血漿，血漿樣品處理后，以沙本胺醇為內標，采用液質聯用的方法分析姜黃素磷脂復合物和姜黃素的血藥濃度-時間數據，分別用3P87藥代動力程序經計算機擬合，用平均血藥濃度-時間擬合后的AIC值和F檢驗來選擇模型，計算藥代動力學參數。結果表明形成復合物后并不改變姜黃色素的葡萄糖醛酸結合率與代謝比率，但血藥濃度-時間曲線表明姜黃色素磷脂復合物組的的血藥濃度明顯高于姜黃色素組，復合物的Cmax約提高了3倍，說明姜黃色素的磷脂復合物的確能促進姜黃色素在大鼠體內的吸收。
本發(fā)明突破通過增加姜黃色素的水溶性來增加姜黃色素的生物利用度的模式，而是選擇了以磷脂為載體的方法改變其生物利用度，制備了姜黃色素磷脂復合物，薄層層析、DSC、IR、NMR分析均表明是形成了復合物，而不是單純的物理混合或生成新的化合物，通過液質聯用的方法對姜黃色素及其磷脂復合物在大鼠體內的代謝以及藥代動力學特點進行分析，發(fā)現姜黃素制成磷脂復合物后其在有機體內的吸收極大的提高。這將有效地解決姜黃素在人體及動物體內生物利用度不高的問題，非常有利于這一具有多種生物活性的天然產物姜黃素作為藥物進一步走向臨床。


圖1姜黃素磷脂復合物與混合物的薄層層析結果比較(a，姜黃素對照；b，復合物c，物理混合物；d，磷脂對照；自左至右的展開條件依次為①乙酸乙酯∶甲醇＝20∶1；②乙酸乙酯∶丙酮＝2∶1；③乙酸乙酯∶環(huán)己烷＝1∶2)圖2姜黃素磷脂復合物與混合物的差熱分析結果比較(a，姜黃素；b，磷脂；c，復合物；d，物理混合物)圖3姜黃素磷脂復合物與混合物的紅外譜圖比較(a，姜黃素；b，磷脂；c，復合物；d，物理混合物)圖4姜黃素磷脂復合物與混合物的1HNMR譜圖比較(a，姜黃素；b，磷脂；c，復合物；d，物理混合物)具體實施方式
實施例1取姜黃素37g(約相當于0.1mol)，溶于45℃～55℃的無水乙醇1000ml中，得紅色澄明液體，55℃下保溫，加入75g大豆卵磷脂(平均分子量750)，攪拌，直至溶液澄明，約10min后，接回流裝置，邊加熱保溫邊振蕩反應1小時，拆除回流裝置，60℃常規(guī)減壓濃縮至反應體積為250ml時，立即傾入正己烷2000ml中，溶液上層為黃色渾濁液體，下層為紅色油狀物，取紅色油狀物，常規(guī)方法真空干燥，得磚紅色干燥物102g，即為姜黃素磷脂復合物。
分別采用如下展開系統①乙酸乙酯∶甲醇＝20∶1；②乙酸乙酯∶丙酮＝2∶1；③乙酸乙酯∶環(huán)己烷＝1∶2，將姜黃素，姜黃素磷脂復合物，姜黃素磷脂混合物，卵磷脂分別展開，其薄層色譜圖附圖1所示。結果表明，姜黃素和姜黃素磷脂復合物三種展開系統中的Rf值均一致，分別為0.4、0.35、0.2，這說明磷脂與姜黃素形成的是一種復合物，而不是化合物。
以AL2O3為參比物，升溫速率10℃/min，掃描范圍30～400℃，N2流速為0.2ml/min，分別稱取姜黃素，大豆磷脂，復合物及物理混合物10～20mg進行差熱分析，結果見附圖2。從DSC圖譜可看出，姜黃素的熔點為185.3℃。大豆磷脂為一混合物，沒有明顯的熔點吸熱峰，只是在119.5和168.6℃出現了2個凹線，可能表示其不同組分隨外界溫度的升高而呈現的相應熱量變化。與姜黃素和磷脂相比，二者混合物和復合物的DSC圖譜均發(fā)生了明顯變化姜黃素的熔點峰消失，磷脂的吸熱峰位(凹處)改變。復合物與混合物相比較DSC圖譜呈現較明顯的不同在125℃附近混合物有一較弱的吸熱凹處，在159.8℃表現出明顯的吸熱現象，單位吸熱量為137.77J/g；而復合物的DSC圖譜中熱量變化的溫度在151.3℃，單位吸熱量為242.89J/g。從以上試驗結果可知，1.在復合物或混合物中由于磷脂的存在，姜黃素的熱力學性質被完全掩蓋；2.與混合物相比，復合物隨外界溫度的升高吸熱峰位的溫度值低于混合物，單位吸熱量明顯大于混合物即姜黃素與大豆磷脂之間作用力的破壞需要較大的能量，說明復合物中姜黃素與大豆磷脂分子更均勻地分散且二者之間存在著一定的作用力。
對姜黃素，大豆磷脂，二者復合物及物理混合物進行紅外掃描，結果見附圖3。對圖中相應基團的振動峰位進行歸納，結果見表1。
表1姜黃素，大豆磷脂及其二者復合物、混合物主要基團振動峰位

由圖表中數據對姜黃素，卵磷脂，姜黃素卵磷脂物理混合物，姜黃素磷脂復合物進行紅外光譜分析如下姜黃素的特征吸收峰(1)OH，3416.28cm-1，其紅外吸收位置較游離羥基(3610-3640cm-1)移向較低波數，且峰形較寬而鈍，這說明姜黃素存在著分子間的締合，而形成了以氫鍵相連的多聚體。(2)C＝C，1627.56cm-1，1510.45cm-1。卵磷脂的特征吸收峰(1)CH2，2923.57cm-1；(2)C＝O，1738.18cm-1；(3)CH3，1463.34cm-1；(4)P＝O，1234.45cm-1；(5)P-O-C，1059.02cm-1；(6)OH，2923.57cm-1，2853.50cm-1。物理混合物中，有OH，3505.51cm-1，而在復合物中OH，3223.83cm-1，姜黃素的羥基明顯移向較低波數，這表明在形成姜黃素磷脂復合物時，姜黃素的羥基發(fā)生的分子間的締合明顯減弱。物理混合物中P＝O 1283.44cm-1，復合物中在1292.83cm-1，P＝O的吸收位置比磷脂本身向高波數移動，這表明姜黃素的OH可能與大豆卵磷脂的P＝O鍵發(fā)生了一定程度的締合。混合物C＝O的吸收位置1739.27cm-1及復合物的1739.21cm-1與磷脂本身的1738.18cm-1相差不大，這表明大豆卵磷脂中的羰基并沒有參與姜黃素磷脂復合物的形成。姜黃素磷脂復合物的紅外光譜不同于姜黃素卵磷脂的物理混合物的光譜，這說明所制備的姜黃素磷脂復合物的確不同于其二者簡單的混合，而是以一種復合物的形式存在的。
以CDCl3(氘代氯仿)為溶劑，對姜黃素，卵磷脂，姜黃素卵磷脂物理混合物，姜黃素磷脂復合物，分別進行核磁共振分析(1HNMR，600MHz)，見附圖4。姜黃素磷脂復合物所出現的峰為姜黃素與磷脂的加合，表明其為復合物(1∶1)，而未形成化合物。姜黃素磷脂復合物1HNMR圖譜中磷脂部分氫質子呈現強峰，姜黃素部分氫質子的峰較弱，但各峰化學位移值和裂分亦清晰可見，這進一步說明姜黃素與磷脂形成了磷脂復合物。
實施例2取去甲氧基姜黃素(Cur-2)37g(約相當于0.1mol)，溶于60℃的丙酮1000ml中，得紅色澄明液體，70℃下保溫，加入約相當于姜黃素或其衍生物2倍摩爾量的蛋黃卵磷脂(平均分子量780)，攪拌，直至溶液澄明，約5min后，接回流裝置，邊加熱保溫邊振蕩反應2小時，拆除回流裝置，真空濃縮至反應體積為300ml時，立即傾入正己烷2500ml中，溶液上層為黃色渾濁液體，下層為紅色油狀物，取紅色油狀物，真空干燥，得磚紅色干燥物160g，即為姜黃素磷脂復合物。
實施例3取二去氧基姜黃素(Cur-3)37g(約相當于0.1mol)，溶于40℃的甲醇1000ml中，得紅色澄明液體，40℃下保溫，加入約相當于姜黃素或其衍生物3倍摩爾量的卵磷脂(平均分子量700)，攪拌，直至溶液澄明，約15min，接回流裝置，邊加熱保溫邊振蕩反應1.5小時，拆除回流裝置，60℃常規(guī)減壓濃縮至反應體積為200ml時，立即傾入正己烷1500ml中，溶液上層為黃色渾濁液體，下層為紅色油狀物，取紅色油狀物，真空干燥，得磚紅色干燥物230g，即為姜黃素磷脂復合物。
實施例4姜黃素磷脂復合物人體藥動學及制劑生物利用度研究實驗動物雄性大白鼠8只，6-7周齡，體重350g左右。給藥方案8只大白鼠隨機分為甲乙兩組，禁食12h后兩組分別用姜黃素和姜黃素的磷脂復合物灌胃，給藥劑量均相當于姜黃素500mg/kg。樣品采集于各藥灌胃前及服藥后0.5、1、2、4、8、16h由頸動脈取血0.5ml，置經肝素處理的試管中，離心分離血漿，于-20℃冰箱中保存直至分析。血漿樣品處理取大鼠血漿樣品100μl，加入甲醇50μl，渦流振蕩1min，然后加入內標溶液(1μg/ml的沙本胺醇流動相溶液)50μl，渦流1min，加入1ml乙酸乙酯，渦流振蕩3min，超聲提取15min，離心(5000r/min)7min，取上層有機相至于5ml尖底具塞試管中，于室溫下空氣流下吹干，殘留物加入100μl流動相溶液，超聲溶解，離心(5000r/min)7min，將上清液移如尖底小瓶中備用。
血漿樣品分析色譜條件色譜柱Phenomenex Luna 5u C18不銹鋼柱(5μm粒徑，250mm×46mmID，美國菲尼克斯公司生產)；流動相乙腈-水-乙酸(30∶70∶1)；流速0.2ml·min-1；柱溫25℃；進樣量10μl。質譜條件正離子檢測；離子源噴射電壓4.25kv；毛細管溫度350℃；毛細管電壓30V；鞘氣(N2)流量1.05L·min-1；輔助氣(N2)流量0.15L·min-1；碰撞氣(He)流量0.2L·min-1；用選擇離子全掃描一級質譜(Fullscan MSn)方式進行檢測。
方法評價以姜黃素和其主要的代謝產物四氫姜黃素考察線性關系，姜黃素線性范圍0.5～500ng/ml(r＝0.9962)；四氫姜黃素線性范圍5～5000ng/ml(r＝0.9968)。專屬性考察表明血漿中內源性物質并不干擾測定結果，內標與標準品分離度良好。該方法姜黃素和四氫姜黃素的回收率分別為73.11±3.97和69.3±5.02，姜黃素的日內、日間RSD分別為2.76％～6.17％、3.92％～9.76％、四氫姜黃素的日內、日間RSD分別為2.36％～7.01％、3.67％～10.16％。
血藥濃度測定結果見表2，表3表2姜黃素大鼠經胃給藥在不同時間的血藥濃度(mean±s，n＝4)

表3姜黃素磷脂復合物大鼠經胃給藥在不同時間的血藥濃度(mean±s，n＝4)

藥動學參數計算姜黃素磷脂復合物和姜黃素的血藥濃度-時間數據分別用3P87藥代動力程序經計算機擬合，用平均血藥濃度-時間擬合后的AIC值和F檢驗來選擇模型，計算藥代動力學參數。大鼠經胃給藥姜黃素磷脂復合物和姜黃素的藥代動力學過程均符合單室模型，經3p97藥代動力學軟件計算主要藥代動力學參數見表4和表5。
表4姜黃素大鼠灌胃給藥的藥代動力學參數(mean±s，n＝4)

表5姜黃素磷脂復合物大鼠灌胃給藥的藥代動力學參數(mean±s，n＝4)

將兩組主要藥代動力學參數進行雙測t檢驗，結果顯示T1/2Ka(h)、T1/2Ke(h)、Tpeak(h)均無顯著性差異，Cmax(ng/ml)、AUC(ng/ml)*h存在顯著性差異(P＜0.05)，可認為姜黃素磷脂復合物能夠明顯提高姜黃素在大鼠體內的生物利用度，其相對生物利用度為205.47％。
葡萄糖醛酸結合率在大鼠血漿中，姜黃素和四氫姜黃素主要是以葡萄糖醛酸結合物的形式存在的，其二者與葡萄糖醛酸的結合率分別為99.54％和95.52％，以磷脂復合物的形式給藥時，二者的葡萄糖醛酸結合率分別為99.07％和93.49％。通過F-檢驗，P＜0.05，姜黃素和四氫姜黃素之間存在顯著性差異，推斷姜黃素比四氫姜黃素更易葡萄糖醛酸化，其結合率情況如表6所示。
表6姜黃素與葡萄糖醛酸結合率

姜黃素代謝比率通過實驗，對姜黃素在大鼠體內代謝比率進行研究，通過F-檢驗，P＞0.05，姜黃素組和姜黃素磷脂復合物組大鼠體內的姜黃素代謝比率與給藥劑型無關，其代謝比率如表7所示。
表7姜黃素在大鼠血漿中的代謝比率

*該處酶為β-葡萄糖醛酸水解酶
權利要求
1.一種姜黃素磷脂復合物，由姜黃素或其衍生物與磷脂復合而成，其中姜黃素或其衍生物與磷脂的摩爾比為1∶1～3。
2.如權利要求1所述的姜黃素磷脂復合物，其特征是，所述姜黃素或其衍生物與磷脂的摩爾比為1∶1。
3.如權利要求1或2所述姜黃素磷脂復合物，其特征是，所述復合物由姜黃素與磷脂復合而成，其中姜黃素與磷脂的摩爾比為1∶1。
4.如權利要求1或2所述姜黃素磷脂復合物，其特征是，所述姜黃素的衍生物是去甲氧基姜黃素或二去甲氧基姜黃素。
5.如權利要求1或2所述姜黃素磷脂復合物，其特征是，所述磷脂是平均分子量700～800的磷脂。
6.權利要求1或2所述姜黃素磷脂復合物的制備方法，包括下述順序的步驟(1)取姜黃素或其衍生物溶于40℃～60℃的脂溶性溶劑中，得紅色澄明液體；(2)在40℃～70℃條件下保溫，加入相當于姜黃素或其衍生物1～3倍摩爾量的磷脂，攪拌，直至溶液澄明；(3)5～15分鐘后，接回流裝置，以上述條件加熱保溫的同時不斷振蕩反應1～2小時；(4)拆除回流裝置，60℃常規(guī)減壓蒸餾濃縮至反應體積為200～300ml時，立即傾入1500～2500ml正己烷中，溶液上層呈黃色渾濁液體，下層呈紅色油狀物；(5)取紅色油狀物，真空干燥，得磚紅色干燥物，即為姜黃素磷脂復合物。
7.如權利要求6所述姜黃素磷脂復合物的制備方法，其特征是，步驟(1)所述脂溶性溶劑是指丙酮、乙醇、氯仿、甲醇。
8.如權利要求7所述姜黃素磷脂復合物的制備方法，其特征是，步驟(1)所述脂溶性溶劑是指無水乙醇。
9.如權利要求6所述姜黃素磷脂復合物的制備方法，其特征是，步驟(2)所述磷脂是指平均分子量為750的大豆卵磷脂。
10.如權利要求6所述姜黃素磷脂復合物的制備方法，其特征是，步驟(2)所述保溫溫度是55℃。
全文摘要
本發(fā)明公開一種姜黃素磷脂復合物，由姜黃素或其衍生物與磷脂復合而成，其中姜黃素或其衍生物與磷脂的摩爾比為1∶1～3。本發(fā)明還公開了該姜黃素磷脂復合物的制備方法，利用本發(fā)明的方法制備的姜黃素磷脂復合物可有效提高姜黃素類成分生物利用度。
文檔編號A61P35/00GK1657040SQ20041003640
公開日2005年8月24日 申請日期2004年11月22日 優(yōu)先權日2004年11月22日
發(fā)明者婁紅祥, 劉安昌, 范培紅 申請人:山東大學