專(zhuān)利名稱(chēng)：生松素在制備防治神經(jīng)細(xì)胞損傷相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生松素和含有生松素的組合物的在制備預(yù)防和治療腦缺血、腦缺血后遺癥、神經(jīng)細(xì)胞損傷和功能改變等相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，醫(yī)療保健水平的提高，老齡人群大幅增加，腦卒中等腦血管疾病已成為嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的重大疾病之一，其發(fā)病率、致殘率和死亡率均很高；病人愈后生活質(zhì)量較差，終生服藥，給患者的生活帶來(lái)不便和較重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。如在2000年，美國(guó)腦卒中患者達(dá)400萬(wàn)人次，每年的醫(yī)療總開(kāi)支達(dá)40億美元，平均每人每年1萬(wàn)美金。
大腦是一個(gè)對(duì)缺血極其敏感的器官，一旦缺血即出現(xiàn)由于能量不足導(dǎo)致的功能障礙。如果缺血的狀況未能改善，則功能障礙繼續(xù)蔓延，導(dǎo)致腦梗塞，即腦缺血的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。目前的腦損傷保護(hù)藥物有鈣通道阻滯劑，如尼莫地平已廣泛應(yīng)用于缺血性腦血管病的治療；自由基清除劑(生育酚、SOD)；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(神經(jīng)生長(zhǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子)；NMDA拮抗劑；神經(jīng)節(jié)苷酯和興奮性氨基酸受體拮抗劑等。
對(duì)急性缺血性腦卒中的治療，國(guó)內(nèi)外尚缺乏較好的治療藥物。目前臨床使用的藥物還不能有效糾正腦缺血的癥狀，改善腦缺血后的愈后。美國(guó)FDA于1996年批準(zhǔn)第一個(gè)治療該病的溶栓藥t-PA，由于有顱內(nèi)出血高的不良反應(yīng)，對(duì)其療效尚有爭(zhēng)議。對(duì)各種類(lèi)型腦保護(hù)劑的研究結(jié)果表明，很多藥物臨床療效不夠好，或有較嚴(yán)重副作用。有幾個(gè)藥物仍在臨床驗(yàn)證階段。藥學(xué)工作者一直在為尋找能從根本上治療心血管疾病的藥物而努力。因此開(kāi)發(fā)有效治療腦卒中的保護(hù)藥物，市場(chǎng)前景廣闊。
生松素屬于黃酮類(lèi)化合物，在自然界中廣泛存在，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下
以前的藥理實(shí)驗(yàn)表明其具有較強(qiáng)的抑菌、抗病毒、抗真菌活性。如中國(guó)傳統(tǒng)的保健食品蜂蜜中就富含生松素，經(jīng)常食用蜜糖，不只對(duì)牙齒無(wú)妨礙，還能在口腔內(nèi)起到殺菌消毒的作用，可以緩解口腔潰瘍，并加速傷口愈合，但其對(duì)腦缺血保護(hù)尚未見(jiàn)有人報(bào)導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供式(I)所示的生松素在制備腦缺血腦損傷保護(hù)、治療腦缺血后遺癥、神經(jīng)細(xì)胞損傷保護(hù)藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明是通過(guò)對(duì)生松素進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)證明其為腦缺血、腦缺血后遺癥及神經(jīng)細(xì)胞損傷保護(hù)的有效藥物。
大鼠腦缺血實(shí)驗(yàn)研究證明，動(dòng)物腦缺血后靜脈注射給予生松素，對(duì)腦缺血引的運(yùn)動(dòng)障礙，學(xué)習(xí)記憶能力減退以及行為學(xué)改變都有明顯的改善作用，改善大鼠行為學(xué)指標(biāo)，顯著延長(zhǎng)大鼠在傾斜板的停留時(shí)間，有利于促進(jìn)動(dòng)物腦缺血后導(dǎo)致的各種癥狀的恢復(fù)。
動(dòng)物腦缺血以后可見(jiàn)腦組織明顯的缺血壞死，缺血組織體積與缺血程度有密切關(guān)系，缺血后給予生松素，可使缺血腦組織損傷程度減輕，腦缺血面積縮小，生松素明顯降低腦梗塞面積的作用說(shuō)明對(duì)缺血腦組織有顯著的保護(hù)作用。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，動(dòng)物腦缺血后給予生松素，可以抑制缺血腦組織LDH釋放，抑制缺血腦組織中Calpain活性升高，抑制血清中C反應(yīng)蛋白水平升高，因此，生松素是一個(gè)極具價(jià)值的腦缺血保護(hù)藥物。
神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示，生松素對(duì)于外源性因素如H2O2處理引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷有明顯的保護(hù)作用，可以提高細(xì)胞存活率，減少細(xì)胞因損傷導(dǎo)致的乳酸脫氫酶的釋放，可以降低細(xì)胞游離鈣離子濃度，是生松素發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的主要機(jī)制。
C-反應(yīng)蛋白(CRP)是一種急性時(shí)相蛋白。CRP在系統(tǒng)發(fā)生上是一種很古老的蛋白質(zhì)，長(zhǎng)期的進(jìn)化中，CRP被保留下來(lái)，表明它有重要的生物學(xué)意義。一般認(rèn)為，CRP是機(jī)體防御系統(tǒng)中的一員。臨床上檢測(cè)CRP主要用于診斷疾病，評(píng)價(jià)療效；它有激活補(bǔ)體、調(diào)節(jié)免疫等多種作用。正常血清中含量極微，在炎癥急性期，風(fēng)濕熱、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、惡性腫瘤、外傷等患者血清中，CRP含量可千倍增加。由于CRP反應(yīng)快、敏感、客觀，臨床上常將CRP作為一項(xiàng)指標(biāo)應(yīng)用于疾病狀況的判估，了解病程經(jīng)過(guò)和指導(dǎo)用藥。CRP增高可以增加缺血性腦卒中的危險(xiǎn)性[11]。研究結(jié)果表明，CRP升高與卒中后炎癥介導(dǎo)物的釋放、心血管合并癥、感染、惡性腫瘤和深靜脈血栓有關(guān)[12]。手術(shù)組CRP的升高，并非因手術(shù)創(chuàng)傷所致，而來(lái)源于梗塞病灶本身的反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)同時(shí)觀察到CRP變化量與神經(jīng)病學(xué)癥狀呈正相關(guān)，提示CRP可作為腦梗塞瞬時(shí)損傷的早期信號(hào)，即CRP升高可作為MCAO模型成功的標(biāo)志之一[13]，這與我們的缺血模型組的結(jié)果很接近，并且研究發(fā)現(xiàn)預(yù)適應(yīng)可以改善缺血引起的CRP升高。CRP是由活化巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子刺激及誘導(dǎo)肝細(xì)胞產(chǎn)生的大量急性反應(yīng)蛋白，在炎癥或組織破壞時(shí)明顯增高，抑制T細(xì)胞和增強(qiáng)T輔助功能；促進(jìn)白細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和吞噬功能。它通過(guò)與脂蛋白結(jié)合，由經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體系統(tǒng)產(chǎn)生大量終末蛋白及復(fù)合物引起血管內(nèi)膜損傷。這可能是預(yù)適應(yīng)減輕了炎癥初期反應(yīng)因此導(dǎo)致CRP水平降低。這對(duì)預(yù)適應(yīng)機(jī)制研究提供一個(gè)新領(lǐng)域。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)生松素高劑量對(duì)血清中C反應(yīng)蛋白水平升高有抑制作用。這提示生松素可能通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)來(lái)發(fā)揮腦缺血保護(hù)作用。
近年來(lái)，有關(guān)Calpain在腦缺血中的作用成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。Calpain是一種需要鈣離子來(lái)活化的中性蛋白酶，廣泛分布于包括腦組織在內(nèi)的不同組織中[14]。在靜息期細(xì)胞中，Calpain的主要部分以無(wú)活性的酶原形式存在。由于細(xì)胞暫時(shí)的或局部的鈣積累作用，小部分被活化，對(duì)某個(gè)靶底物分子產(chǎn)生有限的蛋白水解作用。腦缺血可以升高Calpain活性，并引起以下?lián)p傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)(1)突觸后膜上促離子化谷氨酸受體過(guò)度活化，使Na+和Ca2+持續(xù)流入細(xì)胞；(2)Na+流入誘導(dǎo)膜去極化，隨之開(kāi)啟由電壓控制的Ca2+通道，進(jìn)而增大Ca2+流入；(3)神經(jīng)元內(nèi)Ca2+持續(xù)升高至高濃度；(4)依賴(lài)于Ca2+的系統(tǒng)(包括鈣調(diào)蛋白、蛋白激酶C、磷酸脂酶C和A2、依賴(lài)于鈣調(diào)蛋白的激酶II、一氧化氮合酶和Calpain被過(guò)度活化；(5)這些過(guò)程的某一個(gè)或全部對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生了不可逆的損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[15]。Bartus等報(bào)道，Calpain激活所致的蛋白分解是全腦缺血的一個(gè)潛在的病理過(guò)程，Calpain誘導(dǎo)的蛋白分解在缺血損傷后很快即出現(xiàn)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于病理上可檢測(cè)到的梗死形成。由于Calpain是一種鈣激活的蛋白酶，其激活程度與胞漿游離鈣水平呈正相關(guān)。因此推測(cè)預(yù)適應(yīng)處理、生松素高劑量降低Calpain活性可能與降低胞漿游離鈣水平有關(guān)。Kitagawa等[16]的研究表明大鼠或小鼠腦缺血后，Calpain易于被激活，導(dǎo)致蛋白水解增加，這很可能是神經(jīng)元易損的原因之一。
生理狀態(tài)下一氧化氮(NO)作為一種可逆性彌散的神經(jīng)介質(zhì)或信使物質(zhì)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中起著多方面重要作用，例如擴(kuò)張血管、抑制血小板和白細(xì)胞聚集。同時(shí)NO也是一種自由基和細(xì)胞毒性物質(zhì)，可以通過(guò)NO-鐵復(fù)合物、巰基蛋白氧化形成超氧陰離子產(chǎn)生神經(jīng)毒性。由于我們的前期工作提示生松素可以改善血管張力，而NO可以舒張血管，改善腦組織的血液供應(yīng)，因此我們研究了生松素對(duì)腦缺血大鼠勻漿NO水平的影響。NO在缺血性腦損害中所起的作用一直是研究的重點(diǎn)。盡管迄今尚無(wú)明確的結(jié)論，但有一點(diǎn)是可以肯定的，即腦內(nèi)NO的作用是雙重性的[17]，其腦保護(hù)機(jī)制可通過(guò)以下途徑實(shí)現(xiàn)(1)調(diào)節(jié)rCBF；(2)抗血小板和白細(xì)胞的粘附；(3)下調(diào)NMDA受體；(4)調(diào)控遞質(zhì)釋放；(5)對(duì)自身NO合酶(NOS)的反饋調(diào)節(jié)。其神經(jīng)毒作用機(jī)制有(1)介導(dǎo)興奮性氨基酸毒性；(2)抑制線粒體功能；(3)自由基生成和通過(guò)自由基抑制興奮性氨基酸的再攝取；(4)過(guò)氧化亞硝酸鹽的生成；(5)抑制DNA復(fù)制和修復(fù)。為闡明NO的作用，近年來(lái)，許多學(xué)者應(yīng)用不同的NOS抑制劑治療缺血性腦損害，但所得的結(jié)果不盡相同，或相互矛盾[18]，這可能說(shuō)明了目前我們對(duì)NO的雙重作用機(jī)制和缺血過(guò)程中產(chǎn)生及變化的規(guī)律還缺乏足夠的認(rèn)識(shí)。本研究通過(guò)對(duì)大鼠腦缺血后勻漿檢測(cè)NO水平，發(fā)現(xiàn)腦缺血可以促進(jìn)NO釋放。這可能是由于缺血后細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加，通過(guò)鈣調(diào)蛋白激活cNOS致NO產(chǎn)生增加。但在實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)預(yù)適應(yīng)處理或藥物對(duì)NO的影響，很可能生松素通過(guò)其他擴(kuò)張血管機(jī)制，來(lái)增加組織灌流，減少中風(fēng)損傷。
乳酸酸中毒是缺血腦組織的共同特征。鈉氫交換體在較低pH時(shí)被激活。目前的證據(jù)表明鈉氫交換體抑制劑對(duì)腦缺血損傷也有較好的保護(hù)作用顯著減少梗塞面積，改善腦水腫程度，抑制花生四烯酸的釋放，運(yùn)動(dòng)功能加強(qiáng)，興奮性氨基酸釋放減少，神經(jīng)元缺失數(shù)目降低[7-11]。鈉氫交換體可以調(diào)節(jié)膠質(zhì)細(xì)胞的pH，對(duì)病理情況下的pH改善更為顯著。在缺氧時(shí)使用鈉氫交換體抑制劑可以改善膠質(zhì)細(xì)胞的能量供應(yīng)[12]。鈉氫交換體在星形膠質(zhì)細(xì)胞膜表面含量較高[13-15]。并且在體外培養(yǎng)時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞可以連續(xù)傳代。因此選用星形膠質(zhì)細(xì)胞作為鈉氫交換體的供體建立鈉氫交換體抑制劑的高通量篩選模型。
腦耐受的特征是誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)多種特殊基因表達(dá)(如c-fos、c-jun、鋅指基因)，從無(wú)到有合成或增加相關(guān)應(yīng)激蛋白(如Fos蛋白、熱休克蛋白HSP)，而正常蛋白質(zhì)的合成則受到抑制或停止。熱休克蛋白(heat shockproteins，HSP)是應(yīng)激蛋白的一種，分子量在7～200KD之間。HSP又有多種，例如HSP27、HSP47、HSP70、HSP90等。在大多數(shù)生物中，HSP70是含量最豐富、最保守的應(yīng)激蛋白和分子伴娘[19，20]。在真核生物中，有多種HSP70相關(guān)蛋白，其中有些是正常生長(zhǎng)條件下可以組成型表達(dá)，并為正常生長(zhǎng)必不可少的，其余的則只能在應(yīng)激時(shí)才能誘導(dǎo)合成[21，22]。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)下，HSP70 mRNA由于熱休克轉(zhuǎn)變因子(heat shocktranscription factor，HSF)的激活而發(fā)生轉(zhuǎn)變。其機(jī)理是應(yīng)激因素誘導(dǎo)形成HSF，HSF與HSP70基因起動(dòng)子中的熱休克元件結(jié)合開(kāi)始轉(zhuǎn)變，HSP70mRNA轉(zhuǎn)變至胞漿合成HSP70蛋白，并在胞漿中與變性蛋白質(zhì)結(jié)合以維持蛋白質(zhì)自穩(wěn)[23]。HSP70進(jìn)入胞核與核糖體前體及其它核內(nèi)蛋白結(jié)合，防止變性引起細(xì)胞生命信息的紊亂。反之HSP70蛋白合成受抑制，加之興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和DNA自身序列的改變，最終引起神經(jīng)元的遲發(fā)性壞死[24]。熱耐受現(xiàn)象也清楚說(shuō)明了HSP的內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。當(dāng)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)注入抗70kD的HSP抗體時(shí)，細(xì)胞失去熱耐受；當(dāng)細(xì)胞中HSP基因表達(dá)被競(jìng)爭(zhēng)性抑制時(shí)，細(xì)胞同樣失去熱耐受。
實(shí)驗(yàn)性腦缺血中，通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)方法發(fā)現(xiàn)這些HSP主要分布于神經(jīng)元，在膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞也有一些表達(dá)。局灶性缺血處理可以引起皮層海馬CA1區(qū)神經(jīng)元HSP70蛋白的表達(dá)，但其強(qiáng)度弱。研究表明HSP70蛋白在缺血5d內(nèi)在缺血皮質(zhì)中表達(dá)，7d-14d內(nèi)表達(dá)減少以致消失[25]。近年研究表明，正常腦內(nèi)幾乎檢測(cè)不到HSP70 mRNA或HSP70，在短暫腦缺血后，受損細(xì)胞的變性蛋白可誘導(dǎo)HSP70基因表達(dá)，同時(shí)也獲得一個(gè)短暫的對(duì)隨后損傷的抵抗。本研究結(jié)果顯示，同一大鼠自身對(duì)照，缺血側(cè)腦組織中發(fā)現(xiàn)HSP70表達(dá)，非缺血側(cè)腦組織中未見(jiàn)HSP70表達(dá)，表明腦缺血可誘導(dǎo)HSP70表達(dá)，HSP70表達(dá)是可靠的腦缺血受損指標(biāo)，這與有關(guān)報(bào)道是一致的。
Kitagawa等的研究表明HSP70的合成是缺血耐受必需的，而且HSP70的表達(dá)持續(xù)時(shí)間與耐受效應(yīng)的持續(xù)時(shí)間基本一致[26-28]。HSP蛋白的表達(dá)和選擇性腦缺血的易感性一致，首先在CA1，其次在皮質(zhì)和丘腦，后來(lái)在齒狀核粒細(xì)胞等抵抗力較強(qiáng)的區(qū)域。主要為70kD的HSP在缺血耐受腦中持續(xù)上調(diào)，表達(dá)模式和缺血耐受的“劑量反應(yīng)”及時(shí)間窗一致。由于海馬CA1區(qū)神經(jīng)元對(duì)缺血刺激尤其敏感，缺血后容易損傷，因此對(duì)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元缺血耐受現(xiàn)象研究較多[29]。預(yù)適應(yīng)處理后，大腦皮層和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元HSP70蛋白的表達(dá)顯著增加，與腦梗塞面積和行為學(xué)指標(biāo)一致，提示HSP70蛋白表達(dá)與其組織保護(hù)作用密切相關(guān)。
體外實(shí)驗(yàn)證明HSP70和HSP27增加可以保護(hù)細(xì)胞[30]?？赡艿淖饔脵C(jī)理抑制熱休克過(guò)程中蛋白的合成，使真核細(xì)胞中未折疊的蛋白的量減少，從而減弱對(duì)細(xì)胞的破壞作用。真核生物蛋白合成需形成起始帽復(fù)合物eLF4F，HSP27可以與eLF4F的結(jié)構(gòu)成分eLF4G相結(jié)合，阻止mRNA的翻譯，對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用[31]；HSP27可以防止Actin的破壞，維護(hù)細(xì)胞骨架的穩(wěn)定，增加對(duì)熱的耐受性[32]；在熱休克后刺激RNA及蛋白質(zhì)的合成，協(xié)助細(xì)胞在死亡之前修復(fù)熱休克造成的損傷，使細(xì)胞盡快恢復(fù)正常生理功能。我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)預(yù)處理后熱休克蛋白27在缺血后帶皮層表達(dá)有所上升。有報(bào)道稱(chēng)熱休克蛋白27在星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)增加，可能是膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元受損的反應(yīng)，有助于鄰近神經(jīng)元的存活[33]。
前人的研究發(fā)現(xiàn)使用擬交感藥物安非他明可以誘導(dǎo)HSP27，HSP70，和HSP89在心臟、肺、肝臟、腎臟和大腦的表達(dá)，有望用于預(yù)適應(yīng)的誘導(dǎo)[34]。腦內(nèi)注射低劑量的凝血酶可以誘導(dǎo)HSP27的大量表達(dá)，并發(fā)揮保護(hù)作用[35]。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)生松素的高劑量可以誘導(dǎo)大腦皮層和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元HSP70蛋白的表達(dá)顯著增加，同時(shí)HE染色結(jié)果顯示細(xì)胞形態(tài)和數(shù)目均得到保護(hù)；提示生松素有可能通過(guò)誘導(dǎo)HSP70蛋白表達(dá)而發(fā)揮保護(hù)作用。其機(jī)理可能是生松素加速缺血細(xì)胞HSP70基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達(dá)，從而使HSP70合成增多，使神經(jīng)細(xì)胞對(duì)缺血產(chǎn)生耐受，起到對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。生松素誘導(dǎo)內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制啟動(dòng)的機(jī)理有待進(jìn)一步研究，同時(shí)對(duì)HSP70蛋白表達(dá)的時(shí)間模式/空間模式的研究將有助于對(duì)其保護(hù)機(jī)制的理解。
鈣離子是體內(nèi)廣泛存在的細(xì)胞內(nèi)信息物質(zhì)，通過(guò)一個(gè)有效的外排和內(nèi)部封閉系統(tǒng)來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)鈣環(huán)境的穩(wěn)定。80年代以來(lái)，鈣的細(xì)胞功能研究引起人們的普遍關(guān)注，人們逐漸認(rèn)識(shí)到Ca2+幾乎影響細(xì)胞各方面的生理活動(dòng)。Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)信使觸發(fā)許多重要的細(xì)胞活動(dòng)，如細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、分裂、胞飲、胞吐過(guò)程，環(huán)腺苷酸的合成和分解及神經(jīng)遞質(zhì)和某些激素的合成和釋放等等。
細(xì)胞的功能有賴(lài)于細(xì)胞內(nèi)、外鈣離子濃度維持在一適當(dāng)比例。實(shí)驗(yàn)證明鈣離子的異?？缒?nèi)流和細(xì)胞內(nèi)鈣離子在時(shí)間分布和時(shí)間轉(zhuǎn)運(yùn)的異常最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度不僅有助于對(duì)細(xì)胞損傷過(guò)程中病理生理機(jī)制的認(rèn)識(shí)、疾病的診斷、治療，也為探索有效的治療藥物提供的新途徑。闡明藥物作用機(jī)制和環(huán)節(jié)。現(xiàn)已證明許多藥物的治療作用是通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)鈣而實(shí)現(xiàn)的。
綜上所述，生松素可以改善腦缺血所造成神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞的損傷，并可能通過(guò)Calpain、NO、CRP以及過(guò)啟動(dòng)大腦內(nèi)熱休克蛋白的表達(dá)，發(fā)揮對(duì)缺血腦組織、神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。
本發(fā)明因此還涉及含有作為活性成份的本發(fā)明化合物和常規(guī)藥物賦形劑或輔劑的藥物組合物。通常本發(fā)明藥物組合物含有0.1-95重量％的本發(fā)明化合物。
本發(fā)明化合物的藥物組合物可根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法制備。用于此目的時(shí)，如果需要，可將本發(fā)明化合物與一種或多種固體或液體藥物賦形劑和/或輔劑結(jié)合，制成可作為人藥或獸藥使用的適當(dāng)?shù)氖┯眯问交騽┝啃问健?br> 本發(fā)明化合物或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮膚、腹膜或直腸等。
本發(fā)明化合物或含有它的藥物組合物的給藥途徑可為注射給藥。注射包括靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、皮內(nèi)注射和穴位注射等。
給藥劑型可以是液體劑型、固體劑型。如液體劑型可以是真溶液類(lèi)、膠體類(lèi)、微粒劑型、乳劑劑型、混懸劑型。其他劑型例如片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、栓劑、凍干粉針劑等。
本發(fā)明化合物可以制成普通制劑、也可以是緩釋制劑、控釋制劑、靶向制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。
為了將單位給藥劑型制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如淀粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、硅酸鋁等；濕潤(rùn)劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、紫膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，例如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐藻淀粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等；崩解抑制劑，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；吸收促進(jìn)劑，例如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤(rùn)滑劑，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進(jìn)一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。
例如為了將給藥單元制成丸劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、高嶺土、滑石粉等；粘合劑，如阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂粉、干燥淀粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。
例如為了將給藥單元制成膠囊，將有效成分本發(fā)明化合物與上述的各種載體混合，并將由此得到的混合物置于硬的明膠膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分本發(fā)明化合物制成微囊劑，混懸于水性介質(zhì)中形成混懸劑，亦可裝入硬膠囊中或制成注射劑應(yīng)用。
例如，將本發(fā)明化合物制成注射用制劑，如溶液劑、混懸劑溶液劑、乳劑、凍干粉針劑，這種制劑可以是含水或非水的，可含一種和/或多種藥效學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑、防腐劑、表面活性劑或分散劑。如稀釋劑可選自水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，為了制備等滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規(guī)的助溶劑、緩沖劑、pH調(diào)節(jié)劑等。這些輔料是本領(lǐng)域常用的此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、甜味劑或其它材料。
為達(dá)到用藥目的，增強(qiáng)治療效果，本發(fā)明的藥物或藥物組合物可用任何公知的給藥方法給藥。
本發(fā)明化合物藥物組合物的給藥劑量取決于許多因素，例如所要預(yù)防或治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，患者或動(dòng)物的性別、年齡、體重、性格及個(gè)體反應(yīng)，給藥途徑、給藥次數(shù)、治療目的，因此本發(fā)明的治療劑量可以有大范圍的變化。一般來(lái)講，本發(fā)明中藥學(xué)成分的使用劑量是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明化合物組合物中最后的制劑中所含有的實(shí)際藥物數(shù)量，加以適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，以達(dá)到其治療有效量的要求，完成本發(fā)明的預(yù)防或治療目的。本發(fā)明化合物的每天的合適劑量范圍優(yōu)選為0.1-100mg/kg體重，進(jìn)一步優(yōu)選為1-20mg/kg體重，更優(yōu)選為0.1-100mg/天/人。上述劑量可以單一劑量形式或分成幾個(gè)，例如二、三或四個(gè)劑量形式給藥這受限于給藥醫(yī)生的臨床經(jīng)驗(yàn)以及包括運(yùn)用其它治療手段的給藥方案。
每一種治療所需總劑量可分成多次或按一次劑量給藥。本發(fā)明的化合物或組合物可單獨(dú)服用，或與其他治療藥物合并使用并調(diào)整劑量。


圖1.神經(jīng)癥狀評(píng)分實(shí)驗(yàn)中各組的休克指數(shù)。(***P＜0.001vs.梗塞組)圖2.在傾斜板實(shí)驗(yàn)中各組在傾斜板上停留時(shí)間。(***P＜0.001，**P＜0.01vs.梗塞組)圖3.生松素對(duì)缺血大鼠腦梗塞面積的影響。
圖4.生松素對(duì)缺血大鼠腦組織內(nèi)LDH活性的影響。(*P＜0.05vs.梗塞組)圖5.生松素對(duì)缺血大鼠腦組織內(nèi)Calpain活性的影響(*P＜0.05vs.梗塞組)
圖6.生松素對(duì)缺血大鼠血清中的CRP含量的影響。(*P＜0.05vs.梗塞組)圖7.生松素對(duì)平滑肌細(xì)胞NHE的抑制作用。
圖8.生松素對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞NHE的抑制作用。
圖9.缺血區(qū)皮層HE染色(400×)(A假處理組；B溶劑對(duì)照組；C預(yù)處理組；D大腦中動(dòng)脈梗塞組；E生松素低劑量組；F生松素高劑量組)圖10.缺血區(qū)海馬CA1區(qū)HE染色(200×)(A假處理組；B溶劑對(duì)照組；C預(yù)處理組；D大腦中動(dòng)脈梗塞組；E生松素低劑量組；F生松素高劑量組)圖11.生松素HSP70在缺血皮層的表達(dá)(200×)(A假處理組；B溶劑對(duì)照組；C預(yù)處理組；D大腦中動(dòng)脈梗塞組；E生松素低劑量組；F生松素高劑量組)圖12.生松素HSP70在海馬CA1區(qū)的表達(dá)(200×)(A假處理組；B溶劑對(duì)照組；C預(yù)處理組；D大腦中動(dòng)脈梗塞組；E生松素低劑量組；F生松素高劑量組)圖13.生松素HSP27在缺血皮層的表達(dá)(200×)(A假處理組；B溶劑對(duì)照組；C預(yù)處理組；D大腦中動(dòng)脈梗塞組；E生松素低劑量組；F生松素高劑量組)圖14、生松素對(duì)神經(jīng)細(xì)胞系PC12細(xì)胞H2O2處理后細(xì)胞存活的影響。
圖15、生松素對(duì)神經(jīng)細(xì)胞系PC12細(xì)胞H2O2處理后釋放乳酸脫氫酶的影響圖16.生松素對(duì)PC12神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)H2O2處理后細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度的影響具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、生松素對(duì)大鼠中動(dòng)脈梗塞的大鼠腦缺血保護(hù)作用模型的建立采用插線法制備大腦中動(dòng)脈梗塞模型。SD大鼠沿頸部正中切開(kāi)，分離右側(cè)頸總、頸內(nèi)及頸外動(dòng)脈。于頸總、頸內(nèi)動(dòng)脈處用動(dòng)脈夾夾閉，頸外動(dòng)脈近心端及遠(yuǎn)心端結(jié)扎，中間剪斷。將頸外動(dòng)脈游離端拉至與頸內(nèi)動(dòng)脈成一條直線，將尼龍線由頸外動(dòng)脈插入，插入后用0號(hào)絲線結(jié)扎，以防止出血，打開(kāi)頸內(nèi)動(dòng)脈處動(dòng)脈夾，將尼龍線插入頸內(nèi)動(dòng)脈，繼續(xù)插入至顱內(nèi)，當(dāng)有輕微阻力時(shí)停止，插入深度約為2cm。
分組與給藥分為5組，每組10只，分別為1)假處理組，2)溶劑對(duì)照組；3)梗塞組；4)低劑量組，生松素0.3mg·kg-1尾靜脈注射；5)高劑量組，生松素3mg·kg-1尾靜脈注射。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠進(jìn)行神經(jīng)癥狀評(píng)分及傾斜板實(shí)驗(yàn)；隨后動(dòng)物斷頭立即取腦，以大體染色法檢測(cè)缺血面積。
神經(jīng)行為評(píng)分方法和標(biāo)準(zhǔn)如下，分?jǐn)?shù)越高，說(shuō)明動(dòng)物的行為障礙越嚴(yán)重。

在神經(jīng)癥狀評(píng)分實(shí)驗(yàn)中，假處理組的神經(jīng)癥狀指數(shù)為0，梗塞組為8.8，出現(xiàn)明顯的神經(jīng)缺陷，生松素3，0.3mg·kg-1iv。能明顯的改善術(shù)后的神經(jīng)癥狀，其休克指數(shù)降為2.40±1.14，4.40±1.14(P＜0.001vs.梗塞組)(圖1)。
在傾斜板實(shí)驗(yàn)中，腦缺血大鼠在傾斜板上停留時(shí)間明顯短于假手術(shù)組動(dòng)物，而生松素3，0.3mg·kg-1iv能明顯延長(zhǎng)動(dòng)物在傾斜板上停留時(shí)間，其停留時(shí)間分別為236.00±73.95，105.33±66.83(P＜0.001，P＜0.01vs.梗塞組)。以上結(jié)果說(shuō)明，生松素高低劑量組可以明顯改善由腦缺血引起的行為學(xué)異常(圖2)。
腦缺血6h后，大鼠大腦經(jīng)TTC染色后，可觀察到右側(cè)缺血區(qū)出現(xiàn)大面積的梗塞性壞死，呈現(xiàn)白色。假手術(shù)組動(dòng)物大腦呈現(xiàn)均勻的玫瑰紅色，表明未出現(xiàn)缺血性壞死。高劑量組能使腦缺血造成的梗塞面積縮小(圖3)。
實(shí)施例2、生松素對(duì)大鼠中動(dòng)脈梗塞的大鼠腦勻漿生化指標(biāo)的影響采用插線法制備大腦中動(dòng)脈梗塞模型(同上)，取缺血區(qū)大腦組織以冰冷的生理鹽水制成1∶10(W/V)勻漿液，-20℃分裝保存，進(jìn)行生化檢測(cè)。
與假手術(shù)組比較，缺血大鼠腦組織內(nèi)LDH活性明顯增加。生松素低劑量組能顯著抑制組織內(nèi)LDH活性(P＜0.05vs.梗塞組)，(圖4)。
與假手術(shù)組比較，缺血大鼠腦組織內(nèi)Calpain活性明顯增加。生松素高劑量組能顯著抑制組織內(nèi)Calpain活性(P＜0.05vs.梗塞組)，抑制率是22.38％(圖5)。
與假手術(shù)組比較，缺血大鼠血清中的CRP含量顯著增高。生松素高劑量組顯著抑制血清中CRP含量(P＜0.05vs.梗塞組)(圖6)。
實(shí)施例3、生松素對(duì)平滑肌細(xì)胞鈉氫交換(NHE)的抑制作用在無(wú)菌條件下，取胸主動(dòng)脈，在Hank′s液中沖洗血污，去除脂肪組織、外膜和內(nèi)膜，將中膜置于含培養(yǎng)液的小燒杯中，剪成1mm2組織小塊，接種于培養(yǎng)瓶中，按等距排列，加入含10％胎牛血清的培養(yǎng)基，塞緊瓶口，使組織塊位于培養(yǎng)瓶上方，置于37℃，5％CO2孵箱中，5h后輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織塊浸入培養(yǎng)液中，然后靜置培養(yǎng)，每3d換液一次，一般在4-7d可見(jiàn)細(xì)胞從組織塊邊緣長(zhǎng)出，2周后長(zhǎng)出致密的細(xì)胞層，取培養(yǎng)10-20代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。
使用生松素不同的濃度(10-8，10-7，10-6和10-5mol/L)與大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞孵育，其中生松素在10-7mol/L對(duì)NHE的抑制作用最強(qiáng)，為80.79％，(n＝5)。結(jié)果如圖7所示。
實(shí)施例4、生松素對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞鈉氫交換(NHE)的抑制作用熒光指示劑BCECF/AM可以反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)氫離子的變化。BCECF/AM(無(wú)熒光)易于穿過(guò)細(xì)胞膜，被胞內(nèi)的酯酶水解成為BCECF(有熒光)。BCECF的熒光是pH依賴(lài)的，pH值不同熒光強(qiáng)度也不同。在一定pH下，F(xiàn)490/F450與pH成線性關(guān)系[16-18]。
細(xì)胞負(fù)載BCECF/AM后，通過(guò)使用NH4Cl刺激誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)酸化，并使用高鈉緩沖液誘導(dǎo)pH恢復(fù)。由于細(xì)胞內(nèi)無(wú)HCO3-離子，所以pH的恢復(fù)僅由鈉氫交換體介導(dǎo)。測(cè)定不同條件下，細(xì)胞內(nèi)BCECF的熒光變化。由于鈉氫交換體的作用在細(xì)胞酸化后恢復(fù)2min內(nèi)呈線性，所以選用如下公式計(jì)算鈉氫交換體抑制率。
pH恢復(fù)率＝(R恢復(fù)-R酸化)/R酸化*100％(R＝F490/F450)NHE抑制率＝藥物pH恢復(fù)率/正常對(duì)照組pH恢復(fù)率*100％新生1d大鼠于超凈臺(tái)中短頭取腦，置冰冷的D-hank’s液(g/L KCl0.4 KH2PO40.06 NaCl 8.0 NaHCO30.35 Na2HPO4·7H2O0.06酚紅0.02)中分取皮層，剪碎消化15min，冰冷的完全培養(yǎng)基終止消化，過(guò)200目細(xì)胞篩，1500rpm離心，種植于預(yù)先鋪有100μg/ml多聚賴(lài)氨酸的培養(yǎng)瓶中，5％CO2、37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每3天換液一次。于Day10將培養(yǎng)瓶放入恒溫震蕩水浴中，200rpm震蕩18hr以去除神經(jīng)原及小膠質(zhì)細(xì)胞。此時(shí)培養(yǎng)基中懸浮著眾多雜細(xì)胞，將培養(yǎng)基洗去，換以新鮮完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。純化的細(xì)胞種植入24孔或96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)48hr，進(jìn)行GFAP細(xì)胞化學(xué)鑒定和實(shí)驗(yàn)處理。
實(shí)驗(yàn)前24小時(shí)去除星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中的血清，PBS洗滌后，換以無(wú)血清培養(yǎng)基。所有試劑37℃預(yù)熱。在培養(yǎng)基中加入BCECF/AM1.5μg/ml 10μL，37℃孵育15min。繼續(xù)加入50mM NH4Cl刺激10min.無(wú)Na+HEPES(mM氯化膽堿140，KCl 3，MgCl21，葡萄糖10，Hepes20)液沖洗以去除胞外BCECF/AM，平衡5min，450nm/490nm激發(fā)，530nm發(fā)射測(cè)熒光，計(jì)算R＝F490/450，R值越高，pH值越高。高鈉HEPES液(mM NaCl 140，KCl 3，MgCl21，葡萄糖10，Hepes 20)沖洗以誘導(dǎo)鈉離子依賴(lài)的pH恢復(fù)，測(cè)定熒光，計(jì)算R＝F490/F450。以nigericin校準(zhǔn)pH值。
使用生松素不同的濃度(10-8，10-7，10-6和10-5mol/L)與大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞孵育。生松素對(duì)NHE的抑制作用具有良好的劑量效應(yīng)關(guān)系，其IC50為2.95×10-10mol/L，遠(yuǎn)低于DMA的IC50(n＝5)，是一個(gè)較有潛力的NHE抑制劑。如圖8所示。
實(shí)施例5、生松素對(duì)缺血大鼠皮層和海馬CA1區(qū)HE染色的影響假處理組皮層HE染色未見(jiàn)明顯損傷，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。溶劑對(duì)照組和大腦中動(dòng)脈梗塞組皮層細(xì)胞散在，細(xì)胞間隙擴(kuò)大，神經(jīng)元腫脹。預(yù)處理組和藥物高劑量組均可以顯著改善缺血神經(jīng)元損傷。結(jié)果如圖9所示。
假處理組海馬CA1區(qū)HE染色細(xì)胞層次較多，分布均勻，，排列緊密，染色清晰均勻，細(xì)胞形態(tài)完整，無(wú)異常改變。溶劑對(duì)照組和大腦中動(dòng)脈梗塞組細(xì)胞缺失明顯，細(xì)胞排列松散，僅見(jiàn)個(gè)別神經(jīng)細(xì)胞胞漿深染，胞核固縮。藥物高劑量組均可以顯著改善缺血神經(jīng)元損傷，神經(jīng)元密度增加，染色較均勻，細(xì)胞形態(tài)較完整。結(jié)果如圖10，表1。
表.1.生松素對(duì)腦缺血后皮層、海馬顆粒染色的影響。

**P＜0.01，***P＜0.001vs.MCAO組，n＝3.(平均值±S.D)實(shí)施例6、生松素對(duì)腦缺血大鼠皮層和海馬CA1區(qū)HSP70表達(dá)的影響熱休克蛋白(HSP)70染色假處理組未見(jiàn)皮層染色。溶劑對(duì)照組，大腦中動(dòng)脈梗塞組缺血皮層邊緣區(qū)神經(jīng)元呈陽(yáng)性表達(dá)；預(yù)處理組皮層染色增加，胞漿深染。生松素高劑量組也可以升高陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目及著色深度。如圖11所示HSP70染色假處理組未見(jiàn)海馬區(qū)染色。溶劑對(duì)照組，大腦中動(dòng)脈梗塞組陽(yáng)性細(xì)胞著色預(yù)處理組可見(jiàn)海馬CA1區(qū)染色增加，棕黃色顆粒多見(jiàn)于神經(jīng)元的細(xì)胞體及軸突的胞漿。生松素可以增加陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目，著色強(qiáng)度增加。如圖12，表2所示表.2.生松素對(duì)腦缺血大鼠皮層和海馬CA1區(qū)HSP70表達(dá)的影響

以假處理組作為平均透射率測(cè)定的空白樣本。*P＜0.05vs.MCAO組，n＝3.(平均值±S.D)實(shí)施例7、生松素對(duì)缺血大鼠缺血皮層、海馬區(qū)HSP27表達(dá)假處理組在整個(gè)大腦未見(jiàn)明顯染色，而大腦中動(dòng)脈梗塞組HSP27染色增強(qiáng)，預(yù)處理組在神經(jīng)元細(xì)胞體有較強(qiáng)染色，著色細(xì)胞顯著增加。生松素高低劑量組染色細(xì)胞與大腦中動(dòng)脈梗塞組數(shù)目相當(dāng)。如圖13，表3所示。
表.3.生松素對(duì)缺血大鼠缺血皮層、海馬區(qū)HSP27表達(dá)。

以假處理組作為平均透射率測(cè)定的空白樣本。*P＜0.05vs.MCAO組，n＝3.(平均值±S.D)實(shí)施例8、生松素對(duì)過(guò)氧化氫致PC12神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用在37℃、5％CO2恒溫培養(yǎng)箱中，用1640培養(yǎng)基(含10％胎牛血清，青霉素100U/ml，鏈霉素100ug/ml)培養(yǎng)PC12細(xì)胞。細(xì)胞鋪成單層后，吸除原培養(yǎng)基，加入終濃度200uM的H2O2100ul，24h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用MTT法定細(xì)胞活力；采用LDH測(cè)定試劑盒測(cè)定培養(yǎng)液中LDH含量的測(cè)定。結(jié)果表明10-5mol/L生松素、10-6mol/L生松素能明顯抑制過(guò)氧化氫所致的PC12細(xì)胞活力的下降，10-5mol/L生松素能減少過(guò)氧化氫所致的LDH的釋放，對(duì)過(guò)氧化氫致PC12細(xì)胞損傷有保護(hù)作用。結(jié)果見(jiàn)圖14、圖15。
實(shí)施例9、生松素對(duì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度的影響于96孔板加入PC12細(xì)胞懸液90μl孔，與5μmol.L-1Fura-2/AM在37℃恒溫震蕩35min。負(fù)載結(jié)束后，分別以含0.2％ BSA Hanks、不含Mg2+的0.2％ BSA Hanks及D-Hanks液洗兩次，調(diào)細(xì)胞懸液為2×106個(gè)/ml，預(yù)先加入10-5mol/L生松素溫孵5分鐘后，測(cè)定靜息狀態(tài)細(xì)胞內(nèi)鈣。Fura-2的最大激發(fā)波長(zhǎng)是380nm，與Ca2+結(jié)合后的最大激發(fā)波長(zhǎng)是340nm，發(fā)射波長(zhǎng)是500nm。用FLUO-STAR熒光計(jì)進(jìn)行熒光檢測(cè)。加入Triton X-100破碎細(xì)胞膜，震蕩混勻后測(cè)定熒光，此時(shí)為Ca2+飽和時(shí)熒光強(qiáng)度。加入EGTA絡(luò)合細(xì)胞內(nèi)鈣，震蕩混勻后測(cè)定熒光，此時(shí)為零Ca2+時(shí)熒光強(qiáng)度。
按下式計(jì)算Ca2+濃度[Ca2+]＝KDa*(R-Rmin)/(Rmax-R)*(Ff2/Fb2) (R＝F340/F380)藥物處理細(xì)胞負(fù)載結(jié)束后，預(yù)先加入10-5mol/L生松素溫孵5分鐘后，分別加入刺激劑KCl，谷氨酸(Glu)和去甲腎上腺素(NE)，立即測(cè)定熒光變化。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明10-5mol/L生松素對(duì)細(xì)胞外液為D-Hanks的[Ca2+]i沒(méi)有影響，當(dāng)細(xì)胞外液為Hanks液時(shí)，10-5mol/L生松素有降低靜息狀態(tài)細(xì)胞內(nèi)鈣的作用，見(jiàn)表1。10-5mol/L生松素對(duì)KCL、NE引起的鈣內(nèi)流有抑制作用，對(duì)谷氨酸引起的鈣內(nèi)流沒(méi)有影響，見(jiàn)圖16。
表4.生松素對(duì)靜息狀態(tài)細(xì)胞內(nèi)鈣的影響

權(quán)利要求
1.如通式(I)所示的生松素化合物在制備預(yù)防或治療腦缺血、腦缺血后遺癥、神經(jīng)細(xì)胞損傷和功能改變等相關(guān)疾病的藥物的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述藥物的給藥劑量為每天0.1-100mg/kg體重的生松素化合物。
3.一種預(yù)防或治療腦缺血、腦缺血后遺癥、神經(jīng)細(xì)胞損傷和功能改變等相關(guān)疾病的藥物組合物，其特征在于，含有治療有效劑量的如通式(I)所示的生松素化合物及可藥用載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物被制成片劑、膠囊、丸劑、注射劑、緩釋制劑、控釋制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)的形式。
全文摘要
本發(fā)明涉及如通式(I)所示的生松素化合物在制備預(yù)防和治療腦缺血、腦缺血后遺癥、神經(jīng)細(xì)胞損傷和功能改變等相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K31/352GK1695608SQ200410037860
公開(kāi)日2005年11月16日 申請(qǐng)日期2004年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月12日
發(fā)明者杜冠華, 張海霞, 于德泉, 李玉娟, 王嗣 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所