專利名稱：具有升高全血功能的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物，具體講是一種以由天然藥物中提取分離或化學(xué)合成方式得到的有效藥物成分制成的具有升高血液中紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板、血紅蛋白功能的藥物。
背景技術(shù)：
茶多酚(tea polyphenols，TP)是一種具有藥理活性的化合物成分，目前的研究表明其主要的藥理活性為對(duì)多種細(xì)菌、真菌、酵母菌都有明顯的的抑制能力。大量實(shí)驗(yàn)表明，TP對(duì)口腔中的變鏈菌和黏放菌，對(duì)胃腸道中螺旋菌、腸炎沙門菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、福氏痢疾桿菌、宋氏痢疾桿菌、傷寒桿菌、副傷寒桿菌、黃色溶血性葡萄球菌、金黃色鏈球菌，以及引起人體皮膚病的發(fā)癬菌、新型隱形球酵母及白癬菌等真菌均具有一定的抑制作用或殺傷作用。具有一定的抗突變和抗腫瘤，癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用。具有良好的降血脂作用，對(duì)大鼠心肌損傷、阿霉素引起的大鼠心肌毒性具有減輕作用，并且對(duì)心肌缺血再灌注損傷(IRI)及腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。同時(shí)TP還具有抗心律失常的作用。具有保肝作用，有減輕化療毒性的作用。(《安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)》2002，21(5)57-60)。
茶多酚的主要有效成分為兒茶素[Catechin，化學(xué)名為2H-1-Benzopyran-3，5，7-triol，2-(3，4-dihydroxyphenyl)-3，4-dihydro-，(2R-trans-)]和表兒茶素[EpiCatechin，化學(xué)名為2H-1-Benzopyran-3，5，7-triol，2-(3，4-dihydroxyphe-nyl)-3，4-dihydro-，(2R-cis-)]。兒茶素類化合物通常可以來(lái)源于薔薇科植物山櫻桃(Prunus tomentosa)木材；銀杏科銀杏葉；樟科紅楠(Ginkgo biloba)心材；胡子科沙棗(Etaeagnus angustifolia)莖皮、枝；科日本產(chǎn)苦(Meliaazedarach var.japonica)韌皮；夾竹桃科植物羅布麻(Apocynum venetum)葉；豆科植物兒茶(Acacia catechu)心材；棕櫚科植物檳榔(Areca catechu)內(nèi)胚乳；楊柳科植物黃花兒柳(Salix caprea)。由目前已有的研究報(bào)道顯示，該成分的藥理活性可以體現(xiàn)在對(duì)心血管系統(tǒng)、抗氧化、血清脂質(zhì)及肝臟保護(hù)等方面。例如，徐敏華等人在“兒茶素對(duì)鵪鶉實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化的影響”(《基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床》2002，22(5)447-450)中曾報(bào)道，兒茶素具有明顯的調(diào)節(jié)血脂、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、減輕脂肪肝、降低果糖胺及抵抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。
林親錄等在“兒茶素對(duì)動(dòng)物血清SOD的影響”(《食品科學(xué)》2001，22(11)53-56)中報(bào)道，兒茶素具有明顯升高小白鼠血清SOD的作用，且不同結(jié)合形式的兒茶素(游離型、脂質(zhì)體型、膠束體型)經(jīng)不同施用途徑(灌胃、靜脈注射)對(duì)血清SOD的影響不同，脂質(zhì)體、膠束體結(jié)合型兒茶素升高血清SOD的作用優(yōu)于游離型(P＜0.05)，靜脈注射效果優(yōu)于口服(P＜0.05)。
葉希韻等人在“兒茶素對(duì)溶血卵磷脂膽堿所致細(xì)胞損傷的保護(hù)作用”(《華東師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)》2001；9(3)97-101)中報(bào)道，兒茶素能通過(guò)抗氧化途徑抵抗LPC(溶血卵磷脂膽堿)與X/XO(黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶)致VEC(血管內(nèi)皮細(xì)胞)的損傷。
何小解等人在“兒茶素對(duì)腎病大鼠一氧化氮和蛋白尿生成的影響”(《食品科學(xué)》2004；24(1)121-124)中報(bào)道，兒茶素和激素聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同治療作用，能減輕腎臟損害。其可能是通過(guò)上調(diào)腎局部及血漿中一氧化氮(NO)的含量，降低腎病大鼠24h尿蛋白的排泄，以延緩腎臟病理慢性進(jìn)展。
劉湘新等人在“兒茶素和表兒茶素對(duì)小白鼠血清脂質(zhì)的影響”(《湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)》2002；28(3)232-233)中，報(bào)道了對(duì)經(jīng)不同途徑進(jìn)入小白鼠體內(nèi)的兒茶素及經(jīng)同一途徑進(jìn)入，但不同種類的兒茶素對(duì)高血脂小白鼠血清中各種脂質(zhì)影響研究的報(bào)道。其研究結(jié)果表明，無(wú)論是采用灌胃法，還是靜脈注射法，經(jīng)兒茶素和表兒茶素處理，每只小白鼠1.5mg/d的各試驗(yàn)組均具有明顯降低高血脂小白鼠血清TC(血清總膽固醇)，TG(甘油三脂)，LDL-C(低密度脂蛋白膽固醇)，升高HDL-C(高密度脂蛋白膽固醇)的效果，且兒茶素效果優(yōu)于表兒茶素。
李建祥等人在“兒茶素類化合物對(duì)四氯化碳致大鼠慢性肝損傷的保護(hù)作用”(《工業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病》2003；29(1)20-22)報(bào)道，兒茶素類化合物給藥2個(gè)月后，中、高劑量給藥組(100，200mg/kg)均能降低四氯化碳慢性肝損傷模型所致大鼠血清ALT的活力以及脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA和肝組織經(jīng)脯氨酸的含量(p＜0.01或p＜0.05)，其降低肝組織經(jīng)脯氨酸含量的作用與聯(lián)苯雙脂相當(dāng)。肝組織的病理改善情況兩藥相似，而抗膜脂質(zhì)過(guò)氧化作用優(yōu)于聯(lián)苯雙脂。結(jié)論是兒茶素類化合物具有保護(hù)化學(xué)性肝損傷作用，有降低轉(zhuǎn)氨酶活力、減輕肝臟病理?yè)p傷的作用。
李建祥等人在“兒茶素類抗乙型肝炎病毒的效果觀察”(《中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志》2001；35(6)404-407)中報(bào)道，兒茶素類有抗乙肝病毒、降低轉(zhuǎn)氨酶活性、減輕肝臟病理?yè)p傷作用。
在目前的文獻(xiàn)中均尚未見(jiàn)有關(guān)兒茶素、表兒茶素以及茶多酚對(duì)血液成分功能方面的藥理作用和影響的研究，以及將其作為用于升高全血功能藥物的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述情況，本發(fā)明將提供一種以由天然藥物中提取分離或化學(xué)合成方式得到的有效藥物成分兒茶素、表兒茶素或茶多酚種作為有效藥物成分，具有升高血液中包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板、血紅蛋白在內(nèi)的全血功能的藥物。
本發(fā)明具有升高全血功能的藥物，是以兒茶素或表兒茶素中至少一種，特別是同時(shí)含有兒茶素與表兒茶素的茶多酚作為有效藥物成分，與藥物中可以接受的輔助成分共同組成為注射型或口服型的藥物制劑。
其中所說(shuō)的有效藥物成分采用茶多酚時(shí)，以其中兒茶素與表兒茶素的總重量含量≥80％為好。所說(shuō)的藥物中可以接受的輔助成分，可以包括如在口服制劑中常用的崩解劑、賦形劑、潤(rùn)滑劑、粘合劑、填充劑等常用的輔助添加成分，并可按相應(yīng)的常規(guī)口服制劑工藝方法處理，即可制成為片劑、丸劑、膠囊劑或適當(dāng)形式的緩釋劑、控釋劑等固體制劑形式的口服藥物；與常用的增溶劑、乳化劑、潤(rùn)濕劑、起泡或消泡劑等表面活性劑、稀釋劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、矯味劑、增稠劑等混合，按相應(yīng)的常規(guī)工藝方法處理，即可制成為水劑、糖漿等液體制劑形式的口服藥物。此外，該藥物中可以接受的輔助成分，可以還可以是在注射藥物中允許使用的適當(dāng)溶劑和/或附加劑，并可按相應(yīng)的制劑工藝處理后，即可以制備成相應(yīng)的水針或粉針等肌肉或靜脈形式的注射制劑藥物。
下述的相關(guān)試驗(yàn)結(jié)果，可以清楚顯示本發(fā)明上述有效藥物成分兒茶素、表兒茶素、茶多酚對(duì)血液成分的作用和影響。
試驗(yàn)藥物中的茶多酚，由茶葉中提取，為茶多酚商品，其標(biāo)示量為兒茶素總含量80％。
試驗(yàn)藥物中的兒茶素和表兒茶素，除可以由茶葉或是如雞血藤等含有此類成分的植物中提取分離得到外，也可以采用已有市售商品的兒茶素和表兒茶素。
1.有效藥物成分對(duì)復(fù)合貧血模型小鼠外周血象影響的試驗(yàn)將體重18-22g的雌雄各半昆明種小鼠110只，按體重隨機(jī)分為11組，每組10只。除正常對(duì)照組外，其余10組小鼠第4d和第7d注射乙酰苯肼50mg/kg，第5、6、7d注射環(huán)磷酰胺40mg/kg，造成貧血模型。正常對(duì)照組和貧血模型組每日腹腔注射生理鹽水0.1ml/10g，藥物組按劑量每日0.1ml/10g，連續(xù)9d。于末次給藥后1h，各組小鼠自眼眶靜脈采血，測(cè)定血象，結(jié)果如表1所示。
表1 對(duì)復(fù)合模型貧血小鼠血象的影響(x±s)

注茶多酚組、兒茶素組、表兒茶素組與模型組比較，**表示P＜0.01，*表示P＜0.05。
上述結(jié)果顯示，給小鼠以40mg/kg的劑量腹腔注射茶多酚和24mg/kg劑量的兒茶素和表兒茶素，均可有效抵制由于乙酰苯肼和環(huán)磷酰胺所致小鼠外周血象的降低，顯著升高復(fù)合模型貧血小鼠紅細(xì)胞、血紅蛋白含量和血小板數(shù)目。
2.有效藥物成分對(duì)環(huán)磷酰胺所致貧血模型小鼠外周血象影響的試驗(yàn)將體重18-22g的雌雄各半昆明種小鼠110只，按體重隨機(jī)分為11組，每組10只，除正常對(duì)照組外，其余10組小鼠第5，6，7天皮下注射環(huán)磷酰胺(CY)40mg/kg，正常對(duì)照組和貧血模型組每日腹腔注射生理鹽水0.1ml/10g，藥物組按劑量每日0.1ml/10g，連續(xù)9d。于末次給藥后1h，各組小鼠自眼眶靜脈采血，測(cè)定血象，結(jié)果如表2所示。
表2結(jié)果顯示，茶多酚、兒茶素、表兒茶素均可顯著升高環(huán)磷酰胺所致的小鼠外周血白細(xì)胞的降低，且茶多酚在40mg/kg的劑量下，兒茶素和表兒茶素在24mg/kg的劑量下對(duì)環(huán)磷酰胺所致的小鼠外周血白細(xì)胞的降低有良好的拮抗作用，且與模型組相比有顯著性差異。
3.有效藥物成分素對(duì)失血性貧血小鼠紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白影響的試驗(yàn)將體重18-22g的雌雄各半昆明種小鼠110只，按體重隨機(jī)分為11組，每組10只，除正常對(duì)照組外，其余10組小鼠自眼眶放血0.5ml/只，造成失血性貧血模型。正常對(duì)照組和貧血模型組每日腹腔注射生理鹽水0.1ml/10g，藥物組按劑量每日0.1ml/10g，連續(xù)7d。于末次給藥后1h，各組小鼠自眼眶靜脈采血，測(cè)定紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白，結(jié)果如表3所示。
表2 對(duì)Cy貧血小鼠血象的影響(x±s)

注茶多酚組、兒茶素組、表兒茶素組與模型組比較，**表示P＜0.01，*表示P＜0.05。
表3 對(duì)失血性貧血小鼠紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白的影響(x±s)

注茶多酚組、兒茶素組、表兒茶素組與模型組比較，**表示P＜0.01，*表示P＜0.05。
表3結(jié)果顯示，茶多酚、兒茶素、表兒茶素能顯著升高失血性貧血小鼠紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白數(shù)目，具有良好的量效依賴關(guān)系，茶多酚在80mg/kg的劑量與模型組相比有極顯著性差異。兒茶素和表兒茶素在48mg/kg的劑量與模型組相比有極顯著性差異。
4.有效藥物成分對(duì)正常和貧血小鼠骨髓細(xì)胞能力影響的試驗(yàn)取昆明種小鼠，隨機(jī)分為正常組、模型組、茶多酚組、兒茶素組、表兒茶素組、茶多酚模型組、兒茶素模型組、表兒茶素模型組。茶多酚組和茶多酚模型組用腹腔注射40mg/kg，0.1ml/10g，兒茶素組、表兒茶素組、兒茶素模型組、表兒茶素模型組用腹腔注射24mg/kg，0.1ml/10g，正常對(duì)照組和貧血模型組每日腹腔注射生理鹽水0.1ml/10g，每日1次，連續(xù)15d。于第8，11天模型組與給藥組小鼠皮下注射乙酰苯肼50mg·kg-1，從第9天起模型組與給藥組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺50mg·kg-1，連續(xù)3d，正常組小鼠同時(shí)注射等容量NS。末次給藥1.5h后小鼠頸椎脫臼處死，無(wú)菌取雙側(cè)股骨，用6號(hào)針頭吸RPMI-1640培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，混合骨髓細(xì)胞懸液過(guò)4號(hào)針頭，形成單細(xì)胞懸液用含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液體系調(diào)細(xì)胞數(shù)至2×105/mL，取200μl加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，在37℃、5％CO2和完全濕度條件下培養(yǎng)7d，于培養(yǎng)結(jié)束前4h每孔棄去培養(yǎng)上清100μL，加入濃度為5mg/mL的MTT 10μL，培養(yǎng)結(jié)束后每孔加10％SDS(用0.01M的HCl配置)100μL，振蕩混勻，37℃下培養(yǎng)4h，用酶標(biāo)儀在570nm處讀取吸光度值，結(jié)果如表4所示。
表4對(duì)正常和貧血小鼠骨髓有核細(xì)胞增殖的影響(x±s，n＝6)

注茶多酚組、兒茶素組、表兒茶素組與正常組比較，茶多酚模型組、兒茶素模型組、表兒茶素模型組與模型組比較，**表示P＜0.01，*表示P＜0.05。
表4的的結(jié)果顯示，造型后骨髓抑制-溶血性貧血小鼠骨髓細(xì)胞增殖能力較正常對(duì)照組下降了34.78％，茶多酚、兒茶素、表兒茶素不僅能有效提高正常小鼠的骨髓細(xì)胞增殖能力(P＜0.01)，而且能對(duì)抗貧血小鼠骨髓細(xì)胞增殖能力的降低。
5.經(jīng)有效藥物成分誘導(dǎo)制備的脾細(xì)胞、腹腔巨噬細(xì)胞、肺和骨骼肌條件培養(yǎng)液對(duì)正常和貧血小鼠骨髓有核細(xì)胞增殖的影響試驗(yàn)5.1脾細(xì)胞、腹腔巨噬細(xì)胞、肺與骨骼肌條件培養(yǎng)液的制備小鼠分四組，每組6只，每只腹腔注射茶多酚、兒茶素、表兒茶素0.1ml/10g或等量生理鹽水，每天1次，共15天，末次藥后1.5小時(shí)頸椎脫臼處死小鼠。
5.1.1脾細(xì)胞條件培養(yǎng)液(SCM)制備無(wú)菌取小鼠脾，用RPMI-1640洗滌，在200目鋼絲網(wǎng)剪碎，用滅菌玻璃注射芯輕磨、過(guò)濾，0.83％Tris-NH4Cl破壞紅細(xì)胞，冰浴靜置10分鐘，1500r/min離心，去上清，用RPMI-1640洗滌細(xì)胞兩次。經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定細(xì)胞活率大于95％，再以RPMI-1640制成1×107/ml脾淋巴細(xì)胞懸液，加ConA 5μg/ml，分裝于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，在5％CO2潮濕大氣中37℃溫育2天。離心收獲上清即為SCM。青霉素小瓶分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 5.1.2肺條件培養(yǎng)液(LCM)制備無(wú)菌取雙側(cè)肺，用RPMI-1640液洗去血液，去除結(jié)締組織，在RPMI-164中混合剪碎成3-5mm的小塊，按每只小鼠肺加2ml培養(yǎng)液計(jì)算，加入含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液制成肺組織懸液，分裝于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，在5％CO2潮濕大氣中37℃溫育7天。篩網(wǎng)過(guò)濾組織塊，離心收獲上清，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，青霉素小瓶分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 5.1.3腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液(PMφCM)制備頸椎脫臼處死小鼠，用75％的酒精浸泡后，用預(yù)冷的5ml D-Hank’s液充分洗出腹腔細(xì)胞，1500rpm/min離心5min，用RPMI-1640洗滌兩次，調(diào)細(xì)胞至2×106/ml加入24孔板中貼壁2h，棄培養(yǎng)液，洗滌細(xì)胞，加入10μg/ml的LPS和培養(yǎng)液，37℃，5％CO2潮濕大氣中溫育48h，收集上清液，-20℃保存。
5.1.4骨骼肌條件培養(yǎng)液(SMCM)制備無(wú)菌取股骨肌肉，RMPI1640洗滌，剪成3-5mm的小塊，1640中浸泡2h后，每個(gè)細(xì)胞瓶中加入0.3g處理后肌肉，并補(bǔ)充培養(yǎng)液(含有10％小牛血清的RMPI-1640)3ml。37℃，5％CO2飽和濕度培養(yǎng)7天。篩網(wǎng)過(guò)濾組織塊，離心收獲上清，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，青霉素小瓶分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 5.1.5CSFs活性測(cè)定無(wú)菌取正常和貧血小鼠(造模方法同2.1)的雙側(cè)股骨，用6號(hào)針頭吸培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，混合骨髓細(xì)胞懸液過(guò)4號(hào)針頭，形成單細(xì)胞懸液，以RPMI-1640培養(yǎng)液制成2×106/ml有核細(xì)胞懸液，作為測(cè)定CSFs活性的反應(yīng)細(xì)胞。取-20℃保存的SCM或LCM，分別作1/4，1/8和1/32系列稀釋，用骨髓細(xì)胞測(cè)定其CSFs活性。即在96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板(美國(guó)Falcon 3072)中，每孔加2×105/0.1ml骨髓細(xì)胞懸液和0.1ml 1/4、1/8、1/32稀釋的SCM或LCM，對(duì)照孔加等量培養(yǎng)液。在5％CO2潮濕大氣中37℃培養(yǎng)7天，MTT比色法測(cè)定結(jié)果。
5.2SCM對(duì)正常和貧血小鼠骨髓有核細(xì)胞增殖的影響經(jīng)茶多酚、兒茶素、表兒茶素體內(nèi)誘導(dǎo)制備的SCM，無(wú)論對(duì)正?；蜇氀蟮墓撬栌泻思?xì)胞的增殖均有明顯的促進(jìn)作用(表5)。在稀釋度1∶8下對(duì)正常小鼠的骨髓細(xì)胞的增殖作用與對(duì)照組相比有極顯著差異，在稀釋度1∶32下對(duì)模型小鼠的骨髓細(xì)胞的增殖作用與模型組相比有極顯著差異，和1∶32(p＜0.01)。結(jié)果如表5所示表5對(duì)小鼠脾條件培養(yǎng)液(SCM)中CSFs活力的影響(x±s，n＝6)

注茶多酚組、兒茶素組、表兒茶素組與正常組比較，茶多酚模型組、兒茶素模型組、表兒茶素模型組與模型組比較，**表示P＜0.01，*表示P＜0.05。
5.3LCM對(duì)正常和貧血小鼠骨髓有核細(xì)胞增殖的影響經(jīng)茶多酚、兒茶素、表兒茶素體內(nèi)誘導(dǎo)制備的LCM，對(duì)正常鼠的骨髓有核細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響，而對(duì)貧血鼠的骨髓有核細(xì)胞的增殖均有明顯的促進(jìn)作用，且在1/32稀釋度有最強(qiáng)的促進(jìn)作用，分別較模型組提高了34.12％、31.76％、31.76％。結(jié)果如表6所示。
表6 兒茶素對(duì)小鼠肺條件培養(yǎng)液(LCM)中CSFs活力的影響(x±s，n＝6)

注茶多酚組、兒茶素組、表兒茶素組與正常組比較，茶多酚模型組、兒茶素模型組、表兒茶素模型組與模型組比較，**表示P＜0.01，*表示P＜0.05。
5.4PMφCM對(duì)正常和貧血小髓有核細(xì)胞增殖的影響經(jīng)茶多酚、兒茶素、表兒茶素體內(nèi)誘導(dǎo)制備的PMφCM，對(duì)貧血鼠的骨髓有核細(xì)胞的增殖均有極明顯的促進(jìn)作用，但對(duì)正常鼠的骨髓有核細(xì)胞的增殖僅在1/8稀釋度下有明顯影響，并有極顯著性差異(P＜0.01)。結(jié)果如表7所示。
5.5SMCM對(duì)正常和貧血小鼠骨髓有核細(xì)胞增殖的影響經(jīng)茶多酚、兒茶素、表兒茶素體內(nèi)誘導(dǎo)制備的SMCM在1/32稀釋度下對(duì)貧血鼠的骨髓有核細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用，對(duì)正常鼠的骨髓有核細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響。結(jié)果如表8所示。
表7 對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液條件培養(yǎng)液(PMφCM)中CSFs活力的影響(x±s，n＝6)

注茶多酚組、兒茶素組、表兒茶素組與正常組比較，茶多酚模型組、兒茶素模型組、表兒茶素模型組與模型組比較，**表示P＜0.01，*表示P＜0.05。
表8 兒茶素對(duì)小鼠肌條件培養(yǎng)液(SMCM)中CSFs活力的影響(x±s，n＝6)

注茶多酚組、兒茶素組、表兒茶素組與正常組比較，茶多酚模型組、兒茶素模型組、表兒茶素模型組與模型組比較，**表示P＜0.01，*表示P＜0.05。
6.有效藥物成分對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1的影響試驗(yàn)取昆明小鼠雌雄各半，按體重隨機(jī)分為八組空白組，模型組，茶多酚對(duì)照組，兒茶素對(duì)照組，表兒茶素對(duì)照組，茶多酚模型組，兒茶素模型組，表兒茶素模型組。空白組和模型組小鼠每日按0.1ml/10g體重以生理鹽水腹腔注射；茶多酚對(duì)照組，兒茶素對(duì)照組，表兒茶素對(duì)照組，茶多酚模型組，兒茶素模型組，表兒茶素模型組小鼠每日按0.1ml/10g體重分別以茶多酚、兒茶素、表兒茶素腹腔注射，持續(xù)10天。在第5、6、7天時(shí)，空白組和茶多酚對(duì)照組，兒茶素對(duì)照組，表兒茶素對(duì)照組小鼠按0.1ml/10g體重以生理鹽水皮下注射；模型組和茶多酚模型組，兒茶素模型組，表兒茶素模型組小鼠按O.1ml/10g體重以環(huán)磷酰胺皮下注射。以上小鼠于第11天，處死備用。
IL-1樣品的制備小鼠頸椎脫頸處死，75％乙醇浸泡5分鐘，用預(yù)冷的D-Hank’s液5ml注射入小鼠腹腔，輕揉數(shù)十次，充分洗出腹腔細(xì)胞，2000rpm離心10分鐘，用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌兩次，用含5％小牛血清的RPMI-1640調(diào)細(xì)胞數(shù)至2×106/ml加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中貼壁2小時(shí)。棄上清，洗滌細(xì)胞，去除非粘附性細(xì)胞。加入10μg/ml的LPS和含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37℃，5％CO2潮濕大氣中溫育48小時(shí)；收集上清液，-20℃保存，即為IL-1待測(cè)樣品。
IL-1樣品的檢測(cè)以C57BL/6J純種小鼠胸腺細(xì)胞作為檢測(cè)IL-1的靶細(xì)胞。頸椎脫臼處死小鼠，無(wú)菌取胸腺，用滅菌玻璃注射器芯擠壓過(guò)200目鋼絲網(wǎng)，2000rpm離心10分鐘，洗滌兩次，臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)活細(xì)胞數(shù)，用含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)至1×106/ml，將細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μl(1×105個(gè)細(xì)胞)。用RPMI-1640培養(yǎng)液以1/4、1/8、1/32比例稀釋IL-1待測(cè)樣品，每孔加50μl稀釋液，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。每孔加入亞劑量有絲分裂原ConA至終濃度為2μg/ml。每孔總?cè)萘繛?00μl。在37℃，5％CO2潮濕大氣中培養(yǎng)48小時(shí)。用MTT比色法測(cè)定結(jié)果，如表9所示。
表9 對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1的影響

注茶多酚組、兒茶素組、表兒茶素組與正常組比較，茶多酚模型組、兒茶素模型組、表兒茶素模型組與模型組比較，**表示P＜0.01，*表示P＜0.05。
從以上結(jié)果可看出正常和模型小鼠腹腔注射茶多酚、兒茶素、表兒茶素藥液后，腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1的能力有一定的提高，其中1/4和1/8稀釋比的空白給藥組與空白組相比有極顯著差異。
7.有效藥物成分對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-2的影響試驗(yàn)取昆明小鼠雌雄各半，按體重隨機(jī)分為八組空白組，模型組，茶多酚對(duì)照組，兒茶素對(duì)照組，表兒茶素對(duì)照組，茶多酚模型組，兒茶素模型組，表兒茶素模型組?？瞻捉M和模型組小鼠每日按0.1ml/10g體重以生理鹽水腹腔注射；茶多酚對(duì)照組，兒茶素對(duì)照組，表兒茶素對(duì)照組，茶多酚模型組，兒茶素模型組，表兒茶素模型組小鼠每日按0.1ml/10g體重分別以茶多酚、兒茶素、表兒茶素腹腔注射，持續(xù)10天。在第5、6、7天時(shí)，空白組和茶多酚對(duì)照組，兒茶素對(duì)照組，表兒茶素對(duì)照組小鼠按0.1ml/10g體重以生理鹽水皮下注射；模型組和茶多酚模型組，兒茶素模型組，表兒茶素模型組小鼠按0.1ml/10g體重以環(huán)磷酰胺皮下注射。以上小鼠于第11天，處死備用。
IL-2樣品的制備實(shí)驗(yàn)小鼠頸椎脫臼處死，75％乙醇浸泡5分鐘，無(wú)菌取脾，用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌，在200目鋼絲網(wǎng)上剪碎，用滅菌玻璃注射芯輕磨、過(guò)濾，分別制成脾細(xì)胞懸液，0.83％Tris-NH4Cl破壞紅細(xì)胞，冰浴靜置10分鐘，2000rpm離心10分鐘，用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞兩次，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定細(xì)胞活率大于95％。再以含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液制成1×107/ml脾淋巴細(xì)胞懸液，加ConA5μg/ml，培養(yǎng)于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在5％CO2潮濕大氣中37℃溫育24小時(shí)；離心收集上清液，-20℃保存，即為IL-2待測(cè)樣品。
IL-2檢測(cè)細(xì)胞的制備BalB/C小鼠頸椎脫臼處死，75％乙醇浸泡5分鐘，無(wú)菌取脾，用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌，在200目鋼絲網(wǎng)上剪碎，用滅菌玻璃注射芯輕磨、過(guò)濾，制成脾細(xì)胞懸液，0.83％Tris-NH4Cl破壞紅細(xì)胞，冰浴靜置10分鐘，2000rpm離心10分鐘，用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞兩次，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定細(xì)胞活率大于95％。再以含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液制成5×106/ml脾淋巴細(xì)胞懸液，加ConA2.5μg/ml，置25ml的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中溫育96小時(shí)。細(xì)胞用10mg/mlα-甲基甘露糖甙(α-mm)的Hank’s液洗兩次，含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液洗一次，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×106/ml，作為測(cè)定IL-2的反應(yīng)靶細(xì)胞。
IL-2樣品的檢測(cè)取-20℃保存的各組IL-2上清液，均作1/4、1/8、和1/32稀釋，分別用ConA活化的小鼠脾淋巴細(xì)胞測(cè)定其IL-2水平。即在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加反應(yīng)細(xì)胞0.1ml(1×105個(gè))和等量的稀釋后IL-2上清液，每樣均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。每孔加100mg/ml的α-甲基甘露糖甙(α-mm)20μl。在37℃，5％CO2潮濕大氣中溫育48h。用MTT比色法測(cè)定結(jié)果，如表10所示。
從以上結(jié)果可看出正常和模型小鼠腹腔注射茶多酚、兒茶素、表兒茶素藥液后，脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-2的能力有較大的提高。綜合各稀釋比數(shù)據(jù)顯示，可能在1/8稀釋比時(shí)IL-2樣品有最好的刺激靶細(xì)胞增殖的能力。
8.有效藥物成分對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-3的影響試驗(yàn)取昆明小鼠雌雄各半，按體重隨機(jī)分為八組空白組，模型組，茶多酚對(duì)照組，兒茶素對(duì)照組，表兒茶素對(duì)照組，茶多酚模型組，兒茶素模型組，表兒茶素模型組?？瞻捉M和模型組小鼠每日按0.1ml/10g體重以生理鹽水腹腔注射；茶多酚對(duì)照組，兒茶素對(duì)照組，表兒茶素對(duì)照組，茶多酚模型組，兒茶素模型組，表兒茶素模型組小鼠每日按0.1ml/10g體重分別以茶多酚、兒茶素、表兒茶素腹腔注射，持續(xù)10天。在第5、6、7天時(shí)，空白組和茶多酚對(duì)照組，兒茶素對(duì)照組，表兒茶素對(duì)照組小鼠按0.1ml/10g體重以生理鹽水皮下注射；模型組和茶多酚模型組，兒茶素模型組，表兒茶素模型組小鼠按0.1ml/10g體重以環(huán)磷酰胺皮下注射。以上小鼠于第11天，處死備用。
表10對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-2的影響

注茶多酚組、兒茶素組、表兒茶素組與正常組比較，茶多酚模型組、兒茶素模型組、表兒茶素模型組與模型組比較，**表示P＜0.01，*表示P＜0.05。
IL-3樣品的制備實(shí)驗(yàn)小鼠頸椎脫臼處死，75％乙醇浸泡5分鐘，無(wú)菌取脾，用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌，在200目鋼絲網(wǎng)上剪碎，用滅菌玻璃注射芯輕磨、過(guò)濾，分別制成脾細(xì)胞懸液，0.83％Tris-NH4Cl破壞紅細(xì)胞，冰浴靜置10分鐘，2000rpm離心10分鐘，用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞兩次，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定細(xì)胞活率大于95％。再以含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液制成1×107/ml脾淋巴細(xì)胞懸液，加ConA5μg/ml，培養(yǎng)于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在5％CO2潮濕大氣中37℃溫育72小時(shí)；離心收集上清液，-20℃保存，即為IL-3待測(cè)樣品。
IL-3樣品的檢測(cè)BalB/C小鼠頸椎脫臼處死，75％乙醇浸泡5分鐘，無(wú)菌取雙側(cè)股骨，用6號(hào)針頭吸預(yù)冷的RPMI-1640培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，混合骨髓細(xì)胞懸液過(guò)4號(hào)針頭，形成單細(xì)胞懸液，用含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞數(shù)至2×106個(gè)/ml。取-20℃保存的各組IL-3上清液，均作1/4、1/8、和1/32稀釋。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加反應(yīng)細(xì)胞0.1ml(2×105個(gè))和等量的稀釋后IL-3上清液，每樣均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。在37℃，5％CO2潮濕大氣中溫育7d，用MTT比色法測(cè)定結(jié)果，如表11所示。
從以上結(jié)果可看出正常和模型小鼠在腹腔注射茶多酚、兒茶素、表兒茶素藥液后，脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-3的能力有顯著性的提高。1/4和1/8稀釋比時(shí)，空白給藥組與空白組相比有極顯著差異，模型給藥組與模型組相比有顯著性差異。1/32稀釋比時(shí)，空白給藥組與空白組，模型給藥組與模型組之間都存在顯著性差異。
表11 有效藥物成分兒茶素對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-3的影響

注茶多酚組、兒茶素組、表兒茶素組與正常組比較，茶多酚模型組、兒茶素模型組、表兒茶素模型組與模型組比較，**表示P＜0.01，*表示P＜0.05。
以下通過(guò)具體實(shí)施方式
的實(shí)例再對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。在不脫離本發(fā)明上述技術(shù)思想情況下，根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段做出的各種替換或變更，均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 口服液制劑取茶多酚10公斤，用水100公斤溶解，加入蔗糖和苯甲酸鈉(或其他容許的甜味劑)，濾過(guò)，灌裝，即得。
實(shí)施例2 顆粒劑取茶多酚10公斤，蔗糖5公斤，淀粉5公斤(或其他容許的黏合劑幾矯味劑)，一步制粒機(jī)制粒，整粒，分裝，即得。
實(shí)施例3 片劑取茶多酚10公斤，蔗糖5公斤，淀粉5公斤(或其他容許的黏合劑幾矯味劑)，一步制粒機(jī)制粒(或其他方法制粒)，干燥，整粒，加入硬脂酸鎂(或其他可用的潤(rùn)滑劑)，壓片分裝，即得。
以上口服制劑的茶多酚原料可以為1～50公斤。
實(shí)施例4 注射劑取茶多酚10公斤，用注射用水100公斤溶解，加入氯化鈉0.9公斤，加入溶液總量的0.01～1％的活性炭或醫(yī)藥行業(yè)規(guī)定的其他方法除去熱原，于70～90℃保溫10～60分鐘，濾過(guò)，用鹽酸、枸鹽酸、氫氧化鈉(鉀)及醫(yī)藥行業(yè)規(guī)定的其他方法調(diào)pH4～9。為了防止本品氧化變色，可在本品中加入抗氧劑，如焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉或其他醫(yī)藥行業(yè)規(guī)定抗氧劑。灌封，熔封，滅菌，即得。
權(quán)利要求
1.具有升高全血功能的藥物，其特征是以兒茶素或表兒茶素中至少一種為有效藥物成分，與藥物中可以接受的輔助成分共同組成。
2.如權(quán)利要求1所述的具有升高全血功能的藥物，其特征是所說(shuō)有效藥物成分為同時(shí)含有兒茶素與表兒茶素的茶多酚。
3.如權(quán)利要求2所述的具有升高全血功能的藥物，其特征是所說(shuō)有效藥物成分茶多酚中的兒茶素與表兒茶素的總重量含量≥80％。
4.如權(quán)利要求1至3之一所述的具有升高全血功能的藥物，其特征是所說(shuō)的藥物為注射型制劑。
5.如權(quán)利要求1至3之一所述的具有升高全血功能的藥物，其特征是所說(shuō)的藥物為口服型制劑。
全文摘要
本發(fā)明為一種具有升高全血功能的藥物，以兒茶素或表兒茶素中至少一種為有效藥物成分，與藥物中可以接受的輔助成分共同組成為注射型或口服型的藥物制劑。該藥物能具有滿意的升高血液中紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板、血紅蛋白功能的效果。
文檔編號(hào)A61P7/00GK1723888SQ20041004026
公開(kāi)日2006年1月25日 申請(qǐng)日期2004年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月21日
發(fā)明者羅霞, 陳幸, 陳東輝, 余夢(mèng)瑤, 李彬, 趙弋清, 黎萬(wàn)壽, 吳燕 申請(qǐng)人:四川省中藥研究所