專利名稱：天然脫落酸用于制備腫瘤細胞“分化誘導劑”藥物的新用途的制作方法
一.所屬領域本發(fā)明涉及一種天然物質的新用途，具體涉及天然脫落酸的新用途。
背景技術：
長期以來，人們同威脅人民健康的主要疾病之一的腫瘤進行了不懈的斗爭，手術、放療、化療成為腫瘤治療的三大手段。但這三種手段毒副作用大，選擇性差。近年來，腫瘤分化誘導和分化治療在世界各地廣泛開展，國際上先后召開了4次專題討論會，并且已把腫瘤細胞的分化誘導治療從基礎推向臨床，從而為腫瘤的治療開辟了新途徑。
大量的研究證實，應用一些化學物質可以使惡性腫瘤細胞逆轉，向正常細胞分化；這些能使惡性細胞向正常細胞轉化的物質，被稱為“分化誘導劑”。在“分化誘導劑”作用下，去分化的腫瘤細胞可被誘導向正常細胞方向分化，從而表現(xiàn)出正常細胞的生物學特征，甚至可完全轉變成為正常細胞。這種“分化誘導治療”與傳統(tǒng)的治療措施最大的不同在于，不是通過殺傷瘤細胞，而是通過引導惡性腫瘤細胞向正常細胞轉化來達到治療腫瘤的目的。
腫瘤細胞自發(fā)分化及在某些化學物質的作用下被誘導分化的發(fā)現(xiàn)，使人們努力尋找腫瘤細胞的分化誘導劑。自1971年發(fā)現(xiàn)二甲亞砜(DMSO)能使Frind紅白血病細胞分化以來，先后發(fā)現(xiàn)多種腫瘤細胞能被某些化合物誘導分化。如r-干擾素100-1000μ/ml濃度下抑制視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞的增殖并誘導分化；神經(jīng)節(jié)苷脂GM3可以誘導早幼粒白血病HL-60細胞向單核細胞分化；丁酸在1400μM濃度下誘導K562細胞向紅細胞方向分化；六甲撐二乙酰胺(HMBA)在5×10-3M濃度下可誘導90％以上的Frind紅白血病細胞分化；人參皂甙Rh2具有明顯誘導小鼠B16細胞分化的功能，細胞被阻斷在G1期而不能增殖；維甲類化合物主要由環(huán)己乙烯側鏈及極性基團組成，能誘導早幼粒白血病HL-60細胞向成熟粒細胞分化，使U937細胞向巨噬細胞分化，最近的臨床研究證明，維甲酸對急性早幼粒白血病有明顯療效。
天然脫落酸[(+)-cis，trans-Abscisic Acid，ABA]是一種植物內(nèi)源抗逆物質，在植物的生長、發(fā)育中起著非常重要的作用，其微量天然存在于各種植物體內(nèi)，包括各種糧食作物，蔬菜、瓜果、堅果等，目前主要由真菌規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)獲得。ABA的分子式為C15H20O4，分子量264.33，其化學名稱為5-(1’-羥基-2’，6”，6”-三甲基-4’-氧代-2’-環(huán)己烯-1’-甲基)-3-甲基-2-順-4-反-戊二烯酸，化學結構式如下 ABA是一種以異戊二烯為基本單位的倍半萜羧酸，與維甲酸化學結構極為相似，都是由環(huán)己烯、側鏈和一個極性基團構成；ABA是類胡蘿卜素的一種衍生物，類胡蘿卜素在人體內(nèi)可代謝為維甲酸。眾所周知，維甲類化合物是人類發(fā)現(xiàn)的最為有效的、作用機理研究最為深刻的一類分化誘導劑，但由于明顯的毒副作用而限制了其開發(fā)應用。ABA在結構和功能上與維甲酸有極高的相似性，而且經(jīng)嚴格的毒理學試驗證明，在極大劑量(SD大鼠LD50＞5000mg/Kg)時，對生物和環(huán)境無任何毒副作用，因而有望成為治療人類惡性腫瘤的有效分化誘導劑。

發(fā)明內(nèi)容
我們在研究過程中發(fā)現(xiàn)，天然脫落酸對多種腫瘤細胞具有分化誘導劑的功能，即可以誘導惡性細胞向正常細胞轉化，于是完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的目的在于公開一種天然脫落酸用于制備腫瘤細胞“分化誘導劑”藥物的新用途。
天然脫落酸用于制備腫瘤細胞“分化誘導劑”藥物的有效使用濃度，一般在5g/L-1×10-6g/L，較好為2g/L-1×10-3g/L，最佳為1g/L-5×10-2g/L，可通過在低于50℃的溫度下，常規(guī)制劑方法制備；其制備的藥物可為口服劑型、外用劑型和滴注劑型，作用方式可以為活體注射或內(nèi)服，在體內(nèi)進行誘導分化；也可以外敷外涂等或用于腫瘤細胞組織培養(yǎng)，進行體外誘導分化。
研究表明，ABA可使癌細胞向正常細胞方向轉變，其作用機理為ABA使大量增殖期細胞停滯在S期，使其無法實現(xiàn)細胞分裂而有效地抑制了腫瘤細胞的增殖，同時誘導腫瘤細胞凋亡；ABA可以作用于腫瘤細胞內(nèi)細胞骨架結構，改變癌細胞的惡性增殖能力，誘導其向正常細胞方向發(fā)展，起到抑制癌細胞增殖的作用；應用動物模型研究，發(fā)現(xiàn)ABA能較好地抑制腫瘤癌周血管的生成，從而起到抑制腫瘤生長的作用；同時發(fā)現(xiàn)，ABA能降低腫瘤細胞Ki67的表達，使其增殖活性減低，因此證實ABA具有體內(nèi)誘導腫瘤細胞向正常細胞轉化和抑制其增殖的作用。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點1、分化誘導效果好，能很好的抑制癌細胞和腫瘤的生長；2、天然脫落酸屬天然藥物，對正常細胞損傷小，毒副作用很??；3、使用方便，操作簡單。
具體實施例方式實施例1天然脫落酸對前列腺癌細胞的分化誘導研究將處于對數(shù)生長期的前列腺癌DU-145細胞分為實驗組、對照組兩組，實驗組加入20ul2×10-2g/L ABA(溶于無水乙醇)，使培養(yǎng)液中ABA終濃度為I0-2g/L，對照組加入20ul無水乙醇，培養(yǎng)液中小牛血清濃度為130mI/L，常規(guī)方法培養(yǎng)細胞。加藥48h后常規(guī)更換培養(yǎng)液，維持相同的藥物濃度(ABA濃度為I0-2g/L)。培養(yǎng)過程中，倒置光學顯微鏡動態(tài)觀察DU-145細胞形態(tài)上的改變。
結果細胞形態(tài)及超微結構的觀察離心收集培養(yǎng)及ABA作用36h的DU-145細胞，0.01mol·L-1PH7.4PBS洗滌兩次，用3％戊二醛固定，鋨酸固定后，脫水，包埋，超薄切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，透射電子顯微鏡觀察腫瘤細胞形態(tài)及結構的改變。結果發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞出現(xiàn)生長狀態(tài)不佳，核固縮現(xiàn)象增多，細胞器數(shù)量減少，張力原纖維消失，細胞間隔變大，并出現(xiàn)小片狀無細胞生長區(qū)等現(xiàn)象。對照組細胞分布均勻，大小一致，未見明顯異常。
流式細胞儀檢測及分析ABA作用前列腺癌DU-145細胞72h后，收集腫瘤細胞的實驗組及對照組細胞，以0.01mol·L-1PH7.4PBS洗滌兩次，用70％冰乙醇固定，置于4℃冰箱，檢測前再次離心，棄上清液，PBS洗滌兩次，4℃下溴化丙錠染色30min，用流式細胞儀測定DNA含量的變化，分析細胞凋亡及細胞周期紊亂情況。
ABA作用后腫瘤細胞流式細胞儀檢測結果顯示實驗組ABA作用DU-145細胞72h后，DU-145細胞經(jīng)流式細胞儀檢測出現(xiàn)典型的亞二倍體“凋亡小峰”，腫瘤細胞凋亡率高達32％，大量增殖期細胞停滯在S期，使其無法實現(xiàn)細胞分裂，阻斷細胞周期的進行，從而抑制DU-145細胞的增殖，誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡。對照組流式細胞儀檢測結果無明顯異常發(fā)現(xiàn)。
實施例2天然脫落酸對早幼粒白血病HL-60細胞的分化誘導研究將處于對數(shù)生長期的早幼粒白血病HL-60細胞分為實驗組、對照組兩組，實驗組加入10ul 5×10-1g/L ABA(溶于無水乙醇)，使培養(yǎng)液中ABA終濃度為1×10-1g/L，對照組加入10ul無水乙醇，培養(yǎng)液中小牛血清濃度為130mI/L，常規(guī)方法培養(yǎng)細胞。加藥48h后常規(guī)更換培養(yǎng)液，維持相同的藥物濃度(ABA濃度為1×10-1g/L)。培養(yǎng)過程中，透射電子顯微鏡動態(tài)觀察HL-60細胞形態(tài)上的改變。
細胞形態(tài)及超微結構的觀察 離心收集培養(yǎng)及ABA作用24h的HL-60細胞，用0.01mol·L-1PH7.4PBS洗滌兩次，用3％戊二醛固定，鋨酸固定后，脫水，包埋，超薄切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，透射電子顯微鏡觀察腫瘤細胞形態(tài)及結構的改變。
ABA作用HL-60細胞24h后，透射電子顯微鏡觀察顯示腫瘤細胞核膜的微絨毛消失，細胞器數(shù)量減少，張力原纖維消失，可能與腫瘤細胞惡性表型減輕有關；而部分腫瘤細胞出現(xiàn)典型的凋亡超微結構特征。而電鏡觀察顯示相應的對照組細胞核內(nèi)染色質分布均勻，核仁存在，未見明顯異常。
流式細胞儀檢測及分析 收集ABA作用12h和24h的HL-60實驗組及對照組腫瘤細胞，以0.01mol·L-1PH7.4PBS洗滌兩次，用70％冰乙醇固定，置于4℃冰箱，檢測前再次離心，棄上清液，PBS洗滌兩次，4℃下溴化丙錠染色30min，用流式細胞儀測定DNA含量的變化，分析細胞凋亡及細胞周期紊亂情況。
檢測結果表明ABA作用HL-60細胞后，能夠通過影響腫瘤細胞的DNA合成，使大量增殖期細胞停滯在S期，使其無法實現(xiàn)細胞分裂，阻斷細胞周期的進行，從而抑制細胞的增殖；同時，通過上調(diào)cAMP/PKA途徑，誘導癌細胞分化，進入細胞程序化死亡，有效地誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡。對照組流式細胞儀檢測結果均無明顯異常發(fā)現(xiàn)。
實施例3.
3.天然脫落酸對裸鼠移植瘤成瘤能力的影響1).材料(1)3周齡Balb/c.nu裸小鼠，平均體重約20g左右，均為雄性。
(2)裸鼠SPF飼養(yǎng)用屏障系統(tǒng)。
(3)人口腔癌Tca8113細胞株2.
2)方法2.1)接種細胞制備按照試驗一方法培養(yǎng)Tca8113細胞至對數(shù)生長期，將貼壁生長的腫瘤細胞用消化液使之脫壁、分散，用無血清培養(yǎng)液離心洗滌2次，計數(shù)活細胞，用PBS液調(diào)整為2×107/ml細胞懸液。用帶6號針頭的注射器抽取適量的瘤細胞懸液接種裸鼠，每只動物接種1個部位(接種于裸鼠的腋下)，每個部位注射0.2ml瘤細胞懸液，含活細胞4×106。
2.2)藥物處理待腫瘤增殖至可清楚摸到瘤結(瘤結Φ2-4mm)時，將動物隨機分為對照組和治療組，對照組3只，治療組4只。分組給藥ABA治療組，經(jīng)腹腔注射給藥，2次/周、20mg/kg/次；對照組，PBS液代替ABA，給藥方法與實驗組相同。連續(xù)給藥4周，共8次，脫頸處死裸鼠，終止試驗。切取瘤塊稱重后，將腫瘤組織分為數(shù)塊，用福爾馬林固定者，用于HE染色組織學觀察、診斷及免疫組化檢測；用3％戊二醛固定者，用于透射電鏡觀察超微結構改變。
2.3)計算腫瘤生長抑制率(％)處死動物進行瘤體解剖，電子天平(精度0.0001g)稱取并記錄瘤重，計算抑瘤率，公式如下腫瘤生長抑制率(％)＝對照組平均瘤重-治療組平均瘤重/對照組平均瘤重×100％2.4)組織學觀察觀察瘤組織組織學特點及癌周血管變化情況3)結果(1).組織學觀察結果裸鼠瘤組織塊中，細胞特點與原細胞株完全一致，可明確診斷為人口腔癌Tca8113細胞株所致的移植瘤。對照組瘤周組織中，有大量新生血管形成，而實驗組則比對照組明顯減少。
(2).實驗結束時，發(fā)現(xiàn)ABA實驗組動物的轉移瘤瘤塊明顯小于PBS對照組動物的瘤塊(圖4-1、圖4-2)。實驗組4只裸鼠移植瘤瘤重分別為1.9890g、2.3515g、2.4053g、2.6804g，平均瘤重為2.3565g；PBS對照組3只裸鼠瘤重分別為4.5420g、4.6053g、4.8734g，平均瘤重為4.6736g。實驗組動物的平均瘤重明顯大于對照組動物的平均瘤重，經(jīng)統(tǒng)計學分析，兩者間的差異有明顯著性(P＜0.05)；計算ABA對移植瘤的生長抑制率為49.6％。
(3).對照組大量細胞的細胞核中布滿棕褐色陽性顆粒，顆粒分布不均，細胞核深淺不一，每個高倍視野中約有多于2/3的細胞呈Ki67陽性表達；實驗組的每個高倍視野中，僅有約1/4的細胞核呈現(xiàn)棕褐色陽性表達，陽性顆粒分布較一致。
權利要求
1.天然脫落酸用于制備腫瘤細胞“分化誘導劑”藥物的新用途。
2.根據(jù)權利要求1所述的天然脫落酸用于制備腫瘤細胞“分化誘導劑”藥物的新用途，其特征為制備的腫瘤細胞“分化誘導劑”藥物中天然脫落酸的有效使用濃度一般在5g/L-1×10-6g/L。
3.根據(jù)權利要求2所述的天然脫落酸用于制備腫瘤細胞“分化誘導劑”藥物的新用途，其特征為制備的腫瘤細胞“分化誘導劑”藥物中天然脫落酸的有效使用濃度較好為2g/L-1×10-3g/L，最佳為1g/L-5×10-2g/L。
4.根據(jù)權利要求1所述的天然脫落酸用于制備腫瘤細胞“分化誘導劑”藥物的新用途，其特征為其制備的藥物可為口服劑型、外用劑型和滴注劑型。
5.根據(jù)權利要求1所述的天然脫落酸用于制備腫瘤細胞“分化誘導劑”藥物的新用途，其特征為在低于50℃的溫度下，常規(guī)制劑方法制備。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種天然物質的新用途，具體涉及天然脫落酸的新用途。針對目前腫瘤發(fā)生率高，本發(fā)明公開了一種天然脫落酸用于制備腫瘤細胞“分化誘導劑”藥物的新用途，即采用5g/L－1×10
文檔編號A61P35/00GK1748674SQ20041004068
公開日2006年3月22日 申請日期2004年9月14日 優(yōu)先權日2004年9月14日
發(fā)明者譚紅, 雷寶良, 李志東, 周金燕, 楊杰, 鐘娟 申請人:中國科學院成都生物研究所