專利名稱：結核轉基因疫苗及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術和醫(yī)學預防學領域。具體地說，本發(fā)明涉及利用卡介苗作為載體，采用自殺載體和整合載體介導的方式將外源基因esat-6和/或cfp10導入卡介苗基因組中，制備了轉基因疫苗，命名為轉基因卡介苗，可用于結核病的預防。
背景技術：
結核病作為一種嚴重危害人類健康的傳染病，是我國重點控制的重大疾病之一，也是全球關注的公共衛(wèi)生問題和社會問題。近年來，隨著人口流動增加、艾滋病的流行和耐多種藥物的結核出現(xiàn)，全球結核病疫情出現(xiàn)回升，引起了國際社會的高度重視，世界衛(wèi)生組織已將結核病作為重點控制的傳染病之一，并宣布全球結核病處于緊急狀態(tài)。目前全世界已有19億人感染結核桿菌，每年新增結核病例1000萬例，死亡300萬，居各種傳染病死亡人數(shù)之首，并且由于結核病多重耐藥現(xiàn)象十分突出，治療困難逐漸顯現(xiàn)。據(jù)2000年第四次全國流行病學抽樣調查結果表明，我國現(xiàn)有活動性肺結核患者約450萬，其他結核病，如腎結核、骨結核、皮膚結核和結核性腦膜炎等尚未納入統(tǒng)計數(shù)據(jù)，初步估計有4～5億人已受過結核桿菌感染。因此，我國結核病的防治任務尤其緊迫。降低結核病發(fā)病率及死亡率的關鍵是安全、高效的結核疫苗的應用。
自從1921年以來，卡介苗一直廣泛應用于結核病的預防，但其對結核病的預防作用十分有限，在不同地區(qū)其免疫保護作用差異很大，效果不穩(wěn)定，給艾滋病等免疫功能受損的患者接種后還可能導致嚴重的播散性結核病。雖然卡介苗存在缺點，但仍具有許多其它疫苗無法比擬的優(yōu)點首先，卡介苗是目前世界上應用最廣泛的疫苗，至今已接種了超過30億人；其次，卡介苗在嬰兒出生后即可接種，且不受來自母體的抗體的影響，是世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的兩種出生時即可接種的活疫苗之一；第三，卡介苗本身是一種極強的免疫佐劑，具有增強人體免疫功能的作用；第四，卡介苗培養(yǎng)簡單、價格低廉、熱穩(wěn)定性強、便于保存；第五，卡介苗是一種減毒多價活疫苗，它可以克服亞單位疫苗和DNA疫苗成分單一的缺點。而且，近年來卡介苗作為腫瘤基因治療和傳染病疫苗載體的研究也取得了重要成果。因此，利用基因工程的方法增強其保護效果，并去除毒力，使其成為安全、高效的新一代結核疫苗，這是新形勢下我國控制結核病的正確策略，對于結核病的預防具有十分重要的科學價值和現(xiàn)實意義。
1998年，英國Sanger中心和法國Pasteur研究所科學家合作完成了結核分枝桿菌H37Rv株的全基因組測序工作，從而徹底改變了長期困擾著人們的結核分枝桿菌遺傳背景不清的傳統(tǒng)觀念，為對結核分枝桿菌進行高水平高層次的研究提供了很好的機遇?，F(xiàn)階段預防結核病的新型疫苗研究主要有蛋白質亞單位疫苗、DNA疫苗、減毒活疫苗和重組卡介苗，綜合分析各項研究結果表明，前三者疫苗免疫保護效果均不及卡介苗，而利用穿梭質粒構建的重組卡介苗，其缺點在無抗生素篩選時不能長期穩(wěn)定地表達外源基因。
esat-6基因是由Anderson等首先發(fā)現(xiàn)的，他們從結核桿菌短期培養(yǎng)液中分離純化出6kDa的分泌型蛋白，命名為esat-6，首次對esat-6基因進行了克隆和DNA序列測定，表明該編碼95個氨基酸的蛋白質能引起強烈的抗結核記憶性T細胞應答。Berthet等將esat-6上游34bp處的一個基因命名為lhp(L45homologous protein)，與esat-6的方向是相同的，位于同一個超縱子內，共同轉錄，編碼蛋白為CFP10，故該基因又名cfp10。Harboe等從基因和蛋白表達的水平對卡介苗和結核分枝桿菌進行了比較分析，結果表明esat-6和cfp10基因普遍存在于人型和牛型結核分枝桿菌中，而不存在于卡介苗和其他環(huán)境分枝桿菌中，他們還通過實驗進一步證明了esat-6蛋白多肽鏈中含多個B淋巴細胞特異性識別表位。此后，Ravin和Skjot等研究表明，ESAT-6蛋白多肽鏈中還存在多個T淋巴細胞特異性識別表位，而CFP10表現(xiàn)出與ESAT-6相當?shù)膹姷腡細胞性免疫反應，誘導的IFN-γ的釋放水平與ESAT-6相當。近來人們又將上述基因通過穿梭載體轉入卡介苗中，發(fā)現(xiàn)重組卡介苗的毒力沒有改變，而免疫原性增加了。綜合以上研究結果，表明esat-6和cfp10基因都是卡介苗體外傳代培養(yǎng)過程中丟失了的具有重要免疫保護作用的抗原基因。
基因打靶(Gene Targeting)又叫基因同源重組(HomologousRecombination)技術，是20世紀80年代發(fā)展起來的一項重要的分子生物學技術，也是研究基因功能最直接最有效的手段之一。早在1990年，Husson等就用基因定點同源重組技術對分枝桿菌進行分子遺傳學操作，成功地將麻風分枝桿菌65kDa的熱休克蛋白編碼基因導入恥垢分枝桿菌基因組DNA中進行表達。Mederle等把猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的基因nef和gag整合到卡介苗基因組，與多拷貝質粒表達外源基因相比，克服了染色體外質粒易丟失的缺點，即使在染色體上是單拷貝，表達水平和介導細胞免疫的程度，也絲毫不遜色，從而為我們采用基因定點同源重組技術改造卡介苗提供了科學依據(jù)。
轉基因技術是利用物理、化學和生物學的方法把重組基因轉移給動物、植物和微生物并使之表達、穩(wěn)定地傳給后代。Gordon等1980年首次將外源基因通過顯微注射法導入小鼠受精卵原核中，成功地獲得了轉基因小鼠。此后，轉基因技術就用在了動物、植物和微生物的改造中，在醫(yī)學中的應用也十分廣泛，比如轉基因植物生產疫苗、遺傳病的治療、惡性腫瘤的治療、傳染病的治療和藥用蛋白的生產等。隨著同源重組技術的發(fā)展，轉基因技術在微生物中的研究也是目前研究的熱點之一。也為本發(fā)明的研究技術奠定了基礎。
本發(fā)明的構思是利用傳統(tǒng)卡介苗的種種優(yōu)點，將其缺失的esat-6和cfp10基因轉入體內表達，在不改變其毒力的基礎上增加其免疫原性和免疫保護性，采用轉基因技術，克服穿梭載體表達外源基因不穩(wěn)定的缺點，制備了轉基因卡介苗，達到了優(yōu)于傳統(tǒng)卡介苗的效果，可用于結核病的預防。

發(fā)明內容
本發(fā)明一方面，通過基因工程手段，將卡介苗缺失的基因esat-6和cfp10從結核分枝桿菌標準株H37Rv基因組中擴增出來，裝載在合適的載體中，將其轉化入宿主菌，表達并純化相應的蛋白，制備抗體。
本發(fā)明另一方面，以卡介苗基因組為模板，擴增α-Ag信號肽序列，插入T-Vector中，轉化宿主菌，備用。
本發(fā)明的又一方面，采用重疊延伸剪接技術，將α-Ag信號肽序列分別與esat-6和cfp10連接，通過自殺載體或整合載體，轉入卡介苗基因組中。
本發(fā)明的再一方面，將esat-6和cfp10的融合基因通過自殺載體或整合載體，轉入卡介苗基因組中。
將上述制備的轉基因疫苗進行動物實驗，檢測其毒性、免疫原性和免疫保護性，用于結核病的預防。
具體實施例方式
1)以結核分枝桿菌標準株H37Rv基因組為模板，設計esat-6和cfp10基因引物，并加上合適的酶切位點，克隆esat-6和cfp10基因。
2)通過基因工程手段，將esat-6和cfp10基因轉入合適載體，并將其轉化宿主菌，如大腸桿菌，測序證實序列正確后，用IPTG誘導蛋白表達，純化目的蛋白，制備相應的抗體。
3)以卡介苗基因組為模板，擴增α-Ag信號肽序列，插入T-Vector中，轉化宿主菌，提取質粒備用。
4)采用重疊延伸剪接技術(splicing by overlap extension，SOE)，將α-Ag信號肽序列分別與esat-6和cfp10連接，通過自殺載體或整合載體，轉入卡介苗基因組中，應用PCR、Southern blot、Northern blot、Western blot和ELISA等方法檢測外源基因的定點轉入和表達情況。
5)采用重疊延伸剪接技術(splicing by overlap extension，SOE)，將esat-6與cfp10連接，并將融合基因通過自殺載體或整合載體，轉入卡介苗基因組中，同樣用上述方法檢測外源基因的定點轉入和表達情況。
6)轉基因卡介苗的毒力檢測以豚鼠作為實驗對象，將豚鼠隨機分成兩組，一組注射轉基因卡介苗，另一組注射傳統(tǒng)卡介苗作為對照，觀察豚鼠的成活時間。將轉基因卡介苗加入體外培養(yǎng)的巨噬細胞中，顯微鏡下觀察轉基因卡介苗侵入巨噬細胞的能力及其在巨噬細胞內的增殖能力。
7)轉基因卡介苗的體液免疫反應檢測轉基因卡介苗體外培養(yǎng)至OD600達1-1.5，收集菌體用于免疫動物，以BALB/c小鼠作為實驗對象，將小鼠隨機分成三組，第一組注射生理鹽水，第二組注射傳統(tǒng)卡介苗，第三組注射轉基因卡介苗，4周后小鼠斷尾取血，用PPD作為已知抗原通過ELISA檢測小鼠體內的特異性抗體水平。
8)轉基因卡介苗的細胞免疫反應檢測仍以BALB/c小鼠為實驗對象，按上述方法免疫接種，末次免疫6-16周后，分離小鼠脾淋巴細胞體外培養(yǎng)，然后加入PPD刺激，用3H-TdR摻入法檢測淋巴細胞的增殖程度，進一步可作IFN-γ，IL-2等細胞因子含量測定。
9)轉基因卡介苗動物免疫保護性實驗以BALB/c小鼠作為實驗對象，仍按上述方法免疫接種，末次免疫4周后，通過霧化吸入或腹腔注射結核桿菌H37Rv株進行攻擊實驗，4周后取肺、肝、脾等臟器組織作鏡檢，觀察組織有無病變及其病變程度，病變組織進一步作結核桿菌培養(yǎng)，以檢測病變組織的含菌量，并將實驗組與對照組進行比較。
實施例實施例1基因克隆及蛋白表達結核分枝桿菌標準株H37Rv接種Sauton液體培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)28天收集細菌，1×TE(10mmol/L Tris.HCl，lmmol/L EDTA，pH8.0)重懸細菌后置100℃水浴煮沸30分鐘滅活，將滅活的菌體置潔凈研磨器中進行適當研磨，將研磨后的菌液轉入EP管中，加溶菌酶(50mg/ml)使其終濃度為5μg/ml，37℃水浴放置8小時，然后加入蛋白酶K(20mg/ml)至終濃度為100μg/ml，并加入10％的SDS使其終濃度為4.0％，37℃孵育過夜，次日以12000轉/分4℃離心5分鐘，將上清轉入另一潔凈EP管中，加等體積酚∶氯仿(1∶1)混勻，12000轉/分離心5分鐘，取上清加入RNase至終濃度為20μg/ml，37℃孵育1小時，再用酚∶氯仿抽提1次，上清轉入另一潔凈EP管中，加入2倍體積的冰冷無水乙醇，-20℃放置2小時，4℃以12000轉/分離心10分鐘，沉淀用70％乙醇洗滌2次，真空干燥后，溶于50μl 1×TE，-20℃貯存?zhèn)溆谩?br> 根據(jù)GenBank上公布的esat-6和cfp10基因序列，設計引物，引物的兩端分別加上BamH I和EcoR I的酶切位點，以上述提取的基因組為模板，PCR擴增后純化，再用BamH I和EcoR I酶切，同時酶切融合表達載體pGEX-1λT(Invitrogen公司)，將目的基因重組到載體中，轉化大腸桿菌JMl09，用IPTG誘導表達后進行SDS-PAGE電泳，再用GST融合蛋白專用純化試劑盒(Bulk and RediPack GST Purification Modules，Amersham Biosciences)純化，凍干，得到目的蛋白。
實施例2esat-6轉基因卡介苗的制備根據(jù)卡介苗基因組α-Ag信號肽、結核分枝桿菌標準株H37Rv基因組esat-6基因前后序列設計引物，引物兩端加上合適的酶切位點，以卡介苗基因組為模板，分別擴增卡介苗α-Ag信號肽和hsp60下游3kb片段、以結核分枝桿菌標準株基因組為模板，擴增esat-6基因。
利用重疊延伸剪接術(splicing by overlap extension，SOE)，將卡介苗α-Ag信號肽序列與esat-6分別連接起來，同時通過反向PCR的方法，將卡介苗hsp60下游3kb片段從中分開，并加上合適的酶切位點，經酶切后，其間插入卡介苗α-Ag信號肽-esat-6基因，將該基因片段插入自殺載體p2NIL，再插入來源于pGOAL的含有標志基因(hygromycin，Ag85-LacZ，Phsp60-sacB)的插入片斷(Marker genecassette)，構建用于基因打靶(基因重組)的載體。
以電穿孔法將構建的重組載體轉入卡介苗中，用潮霉素選擇培養(yǎng)基進行第一步篩選，所得陽性克隆再用蔗糖選擇培養(yǎng)基進行第二步篩選，再用酶切、PCR和Southern blot進一步證實，陽性克隆即為轉基因卡介苗。經熱休克誘導后，通過SDS-PAGE和Western blot進一步證實轉基因卡介苗能高效表達esat-6基因編碼產物。
實施列3轉基因卡介苗動物免疫保護性實驗1、動物免疫取BALB/c小鼠36只，隨機分為3組，每組12只。第一組為空白對照組，每只小鼠于后背部皮下注射生理鹽水100μl；第二組為卡介苗組，每只鼠皮下注射卡介苗100μl(106CFU)；第三組為轉基因卡介苗組，每只鼠皮下注射轉基因卡介苗100μl(106CFU)。
2、攻擊試驗疫苗接種8周后，各組行結核分枝桿菌H37Rv株攻擊，即腹膜內注射100μl菌液(105CFU)。
3、脾重量指數(shù)及臟器活菌計數(shù)在結核分枝桿菌攻擊后第4、8周時，每組取3只小鼠斷頸致死，無菌操作下，解剖后肉眼觀察肺、脾、肝變化，脾稱重，將右肺和脾置于5ml含0.05％吐溫80的PBS中，剪碎后勻漿，取50μl勻漿液分別稀釋5倍、10倍、20倍后，取100μl涂布于Sauton平板上(其中卡介苗、轉基因卡介苗的平板中加入2μg/ml thiophene carboxamic hydrazide以抑制殘存卡介苗的生長)，37℃培養(yǎng)3-4周，計數(shù)菌落。結果接種轉基因卡介苗組脾重量低于卡介苗組，肺脾含菌量轉基因組也低于卡介苗組，實驗組均低于對照組，統(tǒng)計學分析差異有顯著性。
4、肺部病理改變在攻擊后第4、8周時，每組取3只小鼠處死，取左肺于10％甲醛中固定，常規(guī)石蠟切片，HE染色后進行組織形態(tài)學觀察。結果顯示轉基因卡介苗組肺組織病變也輕于卡介苗組和陰性對照組，證明轉基因卡介苗具有抗結核的保護作用，但其效力較之傳統(tǒng)卡介苗有提高。
權利要求
1.結核轉基因疫苗，其特征在于，以卡介苗作為載體，將外源基因轉入卡介苗基因組內制備結核疫苗，可用于預防結核病。
2.如權利要求1所述的新型疫苗，以卡介苗為載體，命名為轉基因卡介苗。
3.如權利要求1所述的轉基因疫苗，其特征在于，作為載體的卡介苗基因組中導入編碼分泌蛋白ESAT-6和CFP10的多核苷酸或與之互補的多核苷酸。
4.如權利要求3所述的轉入卡介苗基因組的分泌蛋白編碼基因可以是單獨的esat-6或cfp10，也可以是二者連在一起的融合基因。
5.如權利要求3所述的分泌蛋白編碼基因可以是單獨的esat-6或其前端連接促分泌的修飾基因(如α-Ag信號肽序列等)。
6.如權利要求3所述的分泌蛋白編碼基因可以是單獨的cfp10或其前端連接促分泌的修飾基因(如α-Ag信號肽序列等)。
7.如權利要求4所述的融合基因可以是esat-6在前，也可以是cfp10在前，二者的前端也可加促分泌的修飾基因(如α-Ag信號肽序列等)。
8.如權利要求1所述的轉基因疫苗，可由特殊的自殺載體(如p2NIL等)通過同源重組技術定點整合入卡介苗的基因組中。
9.如權利要求1所述的轉基因疫苗，可由特殊的整合載體(如pMV361等)通過整合酶的作用定點整合入卡介苗的基因組中。
全文摘要
結核轉基因疫苗及其制備方法屬于生物技術和醫(yī)學領域，本發(fā)明涉及一種用于結核病預防的轉基因疫苗及其制備方法。本發(fā)明用于結核病預防的轉基因疫苗是在卡介苗的基礎上，利用特殊載體，采用定點同源重組技術和整合酶定點插入技術將外源基因片段esat－6和cfp10插入卡介苗基因組中，命名為轉基因卡介苗，該方法在不改變卡介苗毒力的情況下增加了免疫原性和免疫保護性，同時克服了利用穿梭載體表達外源基因容易丟失的缺點，作用優(yōu)于傳統(tǒng)的卡介苗，可用于結核病的預防。
文檔編號A61P31/00GK1748796SQ20041004068
公開日2006年3月22日 申請日期2004年9月15日 優(yōu)先權日2004年9月15日
發(fā)明者鮑朗, 趙明才 申請人:四川大學