專利名稱：豬白細(xì)胞介素－6基因抗感染免疫增強(qiáng)劑的制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
1.生物技術(shù) 2.分子免疫學(xué)具體涉及殼聚糖納米顆粒包裝成華豬白細(xì)胞介素-6基因抗感染免疫增強(qiáng)劑的制備和應(yīng)用技術(shù)。
背景技術(shù)：
現(xiàn)代畜牧業(yè)的發(fā)展日益趨于集約化和規(guī)?；捎诳股卦谥委熀惋暳咸砑觿┑膹V泛應(yīng)用，病原在藥物和免疫壓力下持續(xù)突變(病毒、細(xì)菌表現(xiàn)尤為突出)，抗原不斷漂移，抗藥性日益增強(qiáng)；加之環(huán)境污染，密集的飼養(yǎng)與管理經(jīng)常使動(dòng)物處于應(yīng)激狀態(tài)，使動(dòng)物免疫防御能力下降，對(duì)滅活疫苗接種免疫應(yīng)答抑制或削弱，免疫保護(hù)率降低，造成傳染性疾病在密集的動(dòng)物群體中更易發(fā)生或流行。現(xiàn)代免疫學(xué)研究進(jìn)一步發(fā)展許多病原(病毒、細(xì)菌、寄生蟲等)感染動(dòng)物后，其自身分泌或誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生多種免疫抑制物質(zhì)，使機(jī)體的重要免疫調(diào)節(jié)因子生成減少，補(bǔ)體含量下降。這些均造成宿主免疫功能低下，疫苗免疫失敗或?qū)缁钜呙缃臃N免疫抑制或削弱，免疫保護(hù)率降低，動(dòng)物易并發(fā)或繼發(fā)其它感染，引起重大損失。
增強(qiáng)動(dòng)物抗病防御和免疫應(yīng)答能力，提高疫苗保護(hù)率是當(dāng)前防治傳染性疾病最可靠的簡(jiǎn)便途徑。因此研制和應(yīng)用新型高效動(dòng)物抗感染免疫增強(qiáng)劑對(duì)防治現(xiàn)代畜牧業(yè)的疾病具有十分重要的現(xiàn)實(shí)作用和緊迫性。DNA疫苗免疫實(shí)驗(yàn)的結(jié)果初步證實(shí)細(xì)胞因子DNA基因作為“第三代免疫增強(qiáng)劑”能夠顯著增強(qiáng)病毒和細(xì)菌以及寄生蟲抗原基因的免疫應(yīng)答，提高機(jī)體抗感染免疫力。第三代免疫增強(qiáng)劑是經(jīng)歷了第一代外源性化學(xué)藥物分子和植物源分子的免疫增強(qiáng)劑，以及“細(xì)胞因子”類物質(zhì)的第二代免疫增強(qiáng)劑，發(fā)展起來的一類新型免疫增強(qiáng)劑。第三代免疫增強(qiáng)劑利用現(xiàn)代生物工程技術(shù)，將免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)很強(qiáng)的細(xì)胞因子基因克隆入高效真核表達(dá)載體，構(gòu)建重組真核質(zhì)粒，將其有效轉(zhuǎn)染導(dǎo)入機(jī)體細(xì)胞，使之持久穩(wěn)定表達(dá)出所需的細(xì)胞因子，增強(qiáng)其濃度，從而能夠特異高效而持久地增強(qiáng)機(jī)體免疫防御能力，達(dá)到經(jīng)濟(jì)防治目前難以控制的病毒，細(xì)菌性傳染病和寄生蟲病的目的；并且預(yù)防條件性病原造成難以控制的復(fù)雜感染和疾病。
近年來，人們對(duì)于用細(xì)胞因子表達(dá)性質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染動(dòng)物方面進(jìn)行了研究，取得了許多結(jié)果。其特點(diǎn)是這些細(xì)胞因子可以在動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)，達(dá)到免疫刺激增強(qiáng)作用，并且具有大規(guī)模生產(chǎn)容易，純化簡(jiǎn)便，體內(nèi)活性效應(yīng)持久，理化性質(zhì)穩(wěn)定，易保存等特點(diǎn)。所以，構(gòu)建高效重組細(xì)胞因子表達(dá)質(zhì)粒作為研制新型抗感染制劑是一個(gè)行之有效的方法，必將首先在動(dòng)物醫(yī)學(xué)及保健方面獲得廣泛應(yīng)用，有力推動(dòng)各類動(dòng)物傳染性疾病的預(yù)防和治療，保障畜牧業(yè)的順利發(fā)展和人類健康及食品衛(wèi)生安全。
白細(xì)胞介素-6是迄今發(fā)現(xiàn)的功能最為廣泛的細(xì)胞因子之一，它可以促進(jìn)多種細(xì)胞的增殖和分化。IL-6基因含有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，編碼212個(gè)氨基酸，其信號(hào)肽由21-23個(gè)氨基酸組成。IL-6可由各種淋巴細(xì)胞和非淋巴細(xì)胞所產(chǎn)生，其產(chǎn)生可對(duì)各種刺激應(yīng)答。成纖維細(xì)胞、單核細(xì)胞、某些T細(xì)胞系等都可以產(chǎn)生IL-6。IL-6具有多種細(xì)胞調(diào)節(jié)活性，IL-6是B細(xì)胞刺激因子?；罨腡細(xì)胞產(chǎn)生B細(xì)胞分化因子，這種因子在金黃色葡萄球菌Cowan1刺激下可使未成熟的正常B細(xì)胞或受EB病毒轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞系高速率分泌免疫球蛋白。自然或重組的IL-6可誘導(dǎo)B細(xì)胞分泌IgM和IgG。IL-6的作用方式是它同其它的B細(xì)胞因子或IL-6預(yù)先刺激B細(xì)胞，使其最終成為免疫球蛋白高速率分泌的細(xì)胞，但不刺激其增殖，IL-6也是成熟T細(xì)胞產(chǎn)生IL-2的第二信號(hào)?？乖蕾嘥細(xì)胞的增殖需T細(xì)胞受體復(fù)合物與抗原提呈細(xì)胞(antigen-presenting cell)產(chǎn)生的非特異性細(xì)胞因子。如果提供了這些信號(hào)，T細(xì)胞就會(huì)合成并分泌IL-2或IL-4，接著它們就會(huì)作為自分泌生長(zhǎng)因子而發(fā)揮作用。
抗原MHC的第1信號(hào)可取代絲裂原或抗體與T細(xì)胞抗原受體結(jié)合。這些信號(hào)都能刺激純化T細(xì)胞對(duì)外源性IL-2應(yīng)答，但不產(chǎn)生IL-2。白細(xì)胞介素-6則能夠作為第二信號(hào)刺激純化的T細(xì)胞產(chǎn)生IL-2。IL-6并不作為T細(xì)胞鄰近因子(Proximal factor)發(fā)揮作用，而是通過刺激已被提供了第1信號(hào)的T細(xì)胞起間接作用。
Nijsten等人發(fā)現(xiàn)血清中IL-6水平與急性相反應(yīng)(即急性炎性反應(yīng))之間的關(guān)系。他們觀察到IL-6可對(duì)兔子引起強(qiáng)烈致熱作用。利用對(duì)IL-6極敏感的生物檢測(cè)方法對(duì)嚴(yán)重?zé)裏岵∪说募毙韵喾磻?yīng)的IL-6、CRP(C反應(yīng)蛋白)、ATT(抗胰蛋白)及α2巨球蛋白的監(jiān)測(cè)表明，在損傷后幾小時(shí)內(nèi)IL-6的濃度即升高到正常的2～100倍。雖然沒有CRP、ATT升得高，但I(xiàn)L-6的增加比急性反應(yīng)蛋白相反應(yīng)要早，且與發(fā)熱關(guān)系密切。即IL-6可直接地或通過IL-1或TNF間接地在急性相反應(yīng)里起作用。
近年的研究表明將IL-6基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)入小鼠可以抑制小鼠腫瘤成瘤率并延長(zhǎng)荷瘤小鼠的壽命，IL-6基因?qū)τ谛∈罂共《咀饔梅浅Ｃ黠@，IL-6表達(dá)質(zhì)粒共注射對(duì)流感病毒核蛋白(NP)DNA疫苗可產(chǎn)生極強(qiáng)的保護(hù)性免疫應(yīng)答反應(yīng)，抵抗流感病毒的攻擊。成華豬是四川特有的地方豬種，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前國(guó)內(nèi)外均未見有關(guān)成華豬白細(xì)胞介素-6基因及其應(yīng)用的研究報(bào)道，因此成華豬IL-6基因抗感染DNA制劑的制備及應(yīng)用技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景，可望發(fā)展成新型抗感染分子制劑用于提高豬抗傳染性疾病的免疫應(yīng)答能力，防治動(dòng)物疾病的感染。
因免疫途徑和免疫方式不同，所涉及的抗原呈遞細(xì)胞、抗原呈遞方式均有不同，故可產(chǎn)生不同類型、不同強(qiáng)度的免疫應(yīng)答。當(dāng)今，由于畜牧養(yǎng)殖業(yè)正趨于工業(yè)化生產(chǎn)，對(duì)免疫方式也提出了新的要求。在群體免疫中，口服免疫簡(jiǎn)易安全，尤其對(duì)于腸道疫苗的免疫，口服是一種有效的免疫方式，不需要額外的設(shè)備，可以激發(fā)機(jī)體粘膜免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)出大量分泌性IgA以及有效的局部細(xì)胞免疫，來抵抗某些病原的原發(fā)性感染和再感染。但由于口服經(jīng)消化道所需的DNA量大，效率較低。為了進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)質(zhì)粒DNA的免疫應(yīng)答水平，必須采用有效的免疫投遞系統(tǒng)來增強(qiáng)免疫效果。
殼聚糖是天然生物多糖甲殼質(zhì)的脫乙?；苌?，具有很好的生物相容性、可被體內(nèi)多種酶類降解、降解產(chǎn)物安全無毒，并能被生物體完全吸收；而且由于其具有獨(dú)特的聚陽離子特性，已有的研究結(jié)果顯示它是一種具有很大潛力的緩釋材料。近年來，在基因轉(zhuǎn)染表達(dá)研究領(lǐng)域已出現(xiàn)了基于殼聚糖的納米顆粒系統(tǒng)。大量研究表明，殼聚糖可包裹濃縮DNA，形成小的分散顆粒，將殼聚糖DNA復(fù)合物用于基因運(yùn)載和轉(zhuǎn)染表達(dá)時(shí)，能有效攜帶目的基因進(jìn)入靶細(xì)胞中。包封于殼聚糖顆粒中的物質(zhì)，其釋放率主要取決于殼聚糖的生物降解和溶蝕，因此物質(zhì)釋放明顯延長(zhǎng)。初步研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)基于殼聚糖的顆粒系統(tǒng)在生物醫(yī)學(xué)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。此外，殼聚糖還具有多種生物學(xué)功能，尤其是可作為藥物增效劑。
由于殼聚糖納米顆粒良好的生物相容性使其在DNA制劑的包裹應(yīng)用中顯示了廣闊的前景，因此利用殼聚糖納米顆粒包裝成華豬白細(xì)胞介素-6基因作為抗感染DNA制劑的制備及應(yīng)用技術(shù)，在科研，動(dòng)物保健，和產(chǎn)業(yè)化方面具有潛在的巨大價(jià)值。
本發(fā)明首次將克隆的成華豬白細(xì)胞介素-6基因構(gòu)建入真核表達(dá)載體，以殼聚糖納米顆粒分子對(duì)成華豬白細(xì)胞介素-6基因真核表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行分子包裝，并將其應(yīng)用于增強(qiáng)動(dòng)物免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)力，發(fā)現(xiàn)對(duì)動(dòng)物免疫機(jī)能和免疫保護(hù)效應(yīng)有顯著的增強(qiáng)作用，可用作高效安全和效應(yīng)持久的新型動(dòng)物免疫增強(qiáng)劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題具體包括藏豬白細(xì)胞介素-6基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、殼聚糖納米顆粒對(duì)藏豬白細(xì)胞介素-6基因真核質(zhì)粒的分子包裝及其增強(qiáng)動(dòng)物免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)力的應(yīng)用技術(shù)。主要包括下列步驟
1、成華豬白細(xì)胞介素-6基因的克隆應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離技術(shù)，分離了成華豬外周血液淋巴細(xì)胸進(jìn)行體外培養(yǎng)，在ConA的刺激下培養(yǎng)24h后，提取培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞總RNA，應(yīng)用RT-PCR擴(kuò)增出成華豬淋巴細(xì)胞白細(xì)胞介素-6基因的cDNA，克隆到pMD18-T載體上，并進(jìn)行了序列分析；將得到的序列在GenBank和EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行了同源比較，證實(shí)本實(shí)驗(yàn)克隆到了成華豬白細(xì)胞介素-6的cDNA。
2、成華豬白細(xì)胞介素-6基因的真核表達(dá)與活性檢測(cè)將成華豬白細(xì)胞介素-6基因克隆到真核分泌型表達(dá)載體VR1020上，命名為VPIL-6；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Cos7細(xì)胞株后，RT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞24小時(shí)總RNA中已含有目的cDNA片段對(duì)應(yīng)的mRNA；豬淋巴母細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)證明VPIL-6在轉(zhuǎn)染Cos7細(xì)胞株后，能夠表達(dá)出有生物活性的豬PIL-6蛋白質(zhì)，對(duì)豬淋巴細(xì)胞具有增殖刺激作用此結(jié)果表明已成功構(gòu)建了能正確表達(dá)成華豬IL-6的真核表達(dá)質(zhì)粒，其表達(dá)產(chǎn)物具有正常的生物學(xué)活性，為研究其體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移表達(dá)的免疫調(diào)節(jié)作用奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
3、納米顆粒的制備以分子量150000，脫乙酰度95％以上的殼聚糖分散在1％醋酸溶液中(A液)將VPIL-6質(zhì)粒溶解于三聚磷酸鹽溶液(B液)。將A、B液置于50℃水浴分別恒溫20min。將DNA溶液按一定比例加入殼聚糖溶液，磁力攪拌使其充分混合，靜置過濾得到粒徑40-60nm的復(fù)合物微粒。即是VPIL-6質(zhì)粒殼聚糖納米顆粒樣品液。
4、納米顆粒的形態(tài)、粒徑及Zeta電位測(cè)定取少量VPIL-6質(zhì)粒殼聚糖納米樣品液于透射電子顯微鏡下觀察納米顆粒形態(tài)并拍照。另取納米顆粒樣品液適量，加雙蒸水稀釋后用Zetasizer3000HS/IHPL納米顆粒度分析儀測(cè)定粒徑、分散度及Zeta電位。
5、成華豬白細(xì)胞介素-6基因抗感染基因制劑的應(yīng)用昆明鼠60只，隨機(jī)分為4組，每組15只。其中2組為非特異性免疫組，2組為疫苗免疫組。采用口服的方法，非特異性免疫組每只小鼠接種劑量為殼聚糖包裝質(zhì)粒30pmol/頭小鼠，疫苗免疫組每只小鼠均按豬免疫劑量1/50接種大腸桿菌、沙門氏菌和支原體疫苗以及殼聚糖納米顆粒包裝的相應(yīng)質(zhì)粒30pmol。五周后每只小鼠口服大腸桿菌K88和K99 0.4ml進(jìn)行攻毒(3×109/ml)。
小鼠免疫前及免疫后每周自尾靜脈采血，分離血清，檢測(cè)了口服VPIL-6質(zhì)粒對(duì)小鼠的體液免疫(IgG、IgA及IgM的含量、特異性抗體的測(cè)定)和細(xì)胞免疫水平(細(xì)胞因子和外周血免疫細(xì)胞數(shù)量)的影響情況，并對(duì)常規(guī)疫苗在殼聚糖包裝的VPIL-6質(zhì)粒分子免疫佐劑協(xié)同作用下細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答的變化，進(jìn)行了較為系統(tǒng)地分析。在小鼠免疫35天后，以大腸桿菌K88/K99口服攻毒實(shí)驗(yàn)小鼠，觀察發(fā)病情況；49天時(shí)對(duì)所有小鼠進(jìn)行解剖，觀察各種器官的生理病變情況，檢測(cè)免疫保護(hù)效應(yīng)。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)以VPIL-6質(zhì)粒殼聚糖納米顆粒作為免疫增強(qiáng)劑時(shí)，小鼠的IgG、IgA、IgM含量和血清IL-2、IL-4、IL-6等細(xì)胞因子水平比對(duì)照組顯著升高；同時(shí)，白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞數(shù)量也明顯增加；與常規(guī)疫苗聯(lián)合使用，同樣可以顯著提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的IgG、IgA、IgM含量，IL-2、IL-4、IL-6等細(xì)胞因子水平，免疫細(xì)胞數(shù)量，特異性抗體水平，對(duì)疫苗的特異性免疫應(yīng)答顯著加強(qiáng)。
這些結(jié)果表明殼聚糖納米顆粒包裝VPIL-6質(zhì)粒能顯著提高小鼠的免疫應(yīng)答水平，增強(qiáng)體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。提示殼聚糖納米顆粒包裹VPIL-6質(zhì)?？商岣邫C(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫水平，增強(qiáng)免疫應(yīng)答及免疫保護(hù)力，可望作為有效的新型抗感染免疫調(diào)節(jié)劑，具有潛在的廣泛應(yīng)用前景。


表1非特異性免疫小鼠分組(CNP殼聚糖納米顆粒)表2疫苗免疫小鼠分組(CNP殼聚糖納米顆粒)表3VPIL-6重組質(zhì)粒真核表達(dá)產(chǎn)物對(duì)豬淋巴細(xì)胞增殖刺激活性檢測(cè)結(jié)果(0D570)圖1PIL-6 RT-PCR電泳圖譜(1.0％瓊脂糖凝膠)1PIL-6 cDNA 2λDNA/EcoRI+HindIII圖2重組VPIL-6質(zhì)粒的菌落PCR篩選1λDNA/EcoRI+HindIII 2、3陽性菌落圖3VPIL-6 BamHI酶切電泳圖譜(1.2％瓊脂糖凝膠)1λDNA/EcoRI+HindIII2VR1020/BamHI 3VR10204VPIL-6/BamHI 5VPIL-6圖4PIL-6在VR1020插入方向酶切電泳圖譜(1.2％瓊脂糖凝膠)1DNA Mark2、4、5、7、8、9pVPIL-6/PstI，反向重組子3、6pVPIL-6/PstI，正向重組子圖5VPIL-6 PstI酶切電泳圖譜(1.2％瓊脂糖凝膠)1λDNA/EcoRI+HindIII 2VR1020 3 VR1020/PstI4VPIL-6 5VPIL-6/PstI圖6真核表達(dá)RT-PCR電泳圖譜(1.0％瓊脂糖凝膠)1λDNA/EcoRI+HindIII 224h 372h圖7VPIL-6質(zhì)粒殼聚糖納米顆粒透射電鏡圖(放大倍數(shù)50000)圖8殼聚糖納米顆粒粒徑分布圖9非特異性免疫組小鼠血清中IgG含量圖10非特異性免疫組小鼠血清中IgA含量圖11非特異性免疫組小鼠血清中IgM含量圖12非特異性免疫組小鼠血清中IL-2含量圖13非特異性免疫組小鼠血清中IL-4含量圖14非特異性免疫組小鼠血清中IL-6含量圖15非特異性免疫組小鼠白細(xì)胞數(shù)量變化圖16非特異性免疫組小鼠單核細(xì)胞數(shù)量變化圖17非特異性免疫組小鼠淋巴細(xì)胞數(shù)量變化圖18非特異性免疫組小鼠中性粒細(xì)胞數(shù)量變化圖19疫苗免疫組小鼠血清中IgG含量圖20疫苗免疫組小鼠血清中IgA含量圖21疫苗免疫組小鼠血清中IgM含量圖22疫苗免疫組小鼠血清中沙門氏菌特異性抗體含量圖23疫苗免疫組小鼠血清中支原體特異性抗體含量圖24疫苗免疫組小鼠血清中大腸桿菌特異性抗體含量圖25疫苗免疫組小鼠血清中IL-2含量圖26疫苗免疫組小鼠血清中IL-4含量圖27疫苗免疫組小鼠血清中IL-6含量圖28疫苗免疫組小鼠白細(xì)胞數(shù)量變化圖29疫苗免疫組小鼠單核細(xì)胞數(shù)量變化圖30疫苗免疫組小鼠淋巴細(xì)胞數(shù)量變化圖31疫苗免疫組小鼠中性粒細(xì)胞數(shù)量變化
具體實(shí)施例方式
1、成華豬IL-6基因(PIL-6基因)的克隆從健康成華豬前腔靜脈取血10mL，分離藏豬外周血淋巴細(xì)胞，加入10ug/ml ConA刺激，在C02培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)72h，分時(shí)段(24、48、70h)提取藏豬總RNA，設(shè)計(jì)一對(duì)成華豬IL-6基因cDNA擴(kuò)增引物。引物序列如下引物1CGG GAT CCA CCA GGA ACG AAA GAG AG引物2CGG GAT CCA GGT TTC TGA CCA GAG GAG以總RNA為模板，在50μl反應(yīng)體系中加24、5ul的ddH2O，4ul 10mM dNTP，1ulRNase Inhibitor(40units/ul)2.5ul DTT solution，IL-6上游、下游引物各1ul(15pmol/L)，豬淋巴細(xì)胞總RNA 1ul，10ul 5*RT-PCR Buffer，1ul RT-PCR酶混合液。RT-PCR循環(huán)參數(shù)為50℃，30min；94℃，2min，然后進(jìn)行30個(gè)PCR循環(huán)(94℃變性60s，58℃退火30s，72℃延伸60s)后繼續(xù)在72℃延伸10min，4℃保存。
回收cDNA片段，克隆到pMD-T18載體中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，篩選和鑒定含重組質(zhì)粒的菌落，小規(guī)模提取質(zhì)粒DNA，酶切及電泳觀察質(zhì)粒DNA，確定重組質(zhì)粒中的插入片段的大小同目的片段的大小一樣后(附圖1)，進(jìn)行序列測(cè)定。序列測(cè)定結(jié)果采用DNAtools5.1進(jìn)行分析(基因序列見說明書13頁)。
用M13通用引物對(duì)含有目的基因片斷的pMPIL-6質(zhì)粒進(jìn)行正反向測(cè)序，通過重疊序列的拼接，得到了完整的PIL-6基因的cDNA序列，并用DNAtools 5.1對(duì)其編碼氨基酸進(jìn)行了分析，cDNA長(zhǎng)度為675個(gè)堿基，開放閱讀框?yàn)?45個(gè)堿基，編碼215個(gè)氨基酸，分子量為24.0kD。
2、成華豬IL-6基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)活性檢測(cè)將pMPIL-6質(zhì)粒用BamHI酶切后，將PIL-6片段與BamHI酶切、脫磷酸化的VR1020質(zhì)粒DNA在T4 DNA連接酶作用下進(jìn)行連接反應(yīng)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化子經(jīng)菌落PCR鑒定，得到含有目的PIL-6片段的重組質(zhì)粒的菌落，菌落PCR圖見附圖2。
得到含PIL-6的重組質(zhì)粒后，利用BamHI酶切可見675bp片段；根據(jù)PIL-6片段的測(cè)序結(jié)果，PIL-6片段片段上有2個(gè)PstI位點(diǎn)，為580-586和649-654bp，VR1020載體上有1個(gè)PstI位點(diǎn)，位于1862bp，因此，用PstI酶切重組質(zhì)粒DNA，通過觀察其酶切片段的大小來判定PIL-6片段的插入方向，其正向插入PIL-6 cDNA應(yīng)切出180bp的片段，反向插入切出670bp的片段。將正確方向插入的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為VPIL-6，其BamHI酶切及PstI酶切電泳圖譜見附圖3、4、5。
使用Life Technology公司Lipofect AMINETMReagent進(jìn)行Cos7細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，參照試劑說明書進(jìn)行。培養(yǎng)48小時(shí)，檢測(cè)基因表達(dá)產(chǎn)物活性。以RT-PCR檢測(cè)基因在真核細(xì)胞中表達(dá)，結(jié)果顯示，只有VPIL-6轉(zhuǎn)染的Cos7細(xì)胞總RNA出現(xiàn)PIL-6的特征帶，表明VPIL-6重組質(zhì)粒在Cos7細(xì)胞中能表達(dá)基因的片段相應(yīng)的mRNA。RT-PCR結(jié)果見附圖6。
制備豬淋巴母細(xì)胞，MTT比色法檢測(cè)PIL-6生物學(xué)活性，分別使用轉(zhuǎn)染后24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)液上清進(jìn)行分析，結(jié)果見附圖表3。此結(jié)果表明VPIL-6轉(zhuǎn)染后24小時(shí)、36小時(shí)和72小時(shí)的細(xì)胞培養(yǎng)液上清中表達(dá)了具有生物學(xué)活性的PIL-6，對(duì)豬淋巴細(xì)胞具有增殖刺激作用。
3、納米顆粒的制備以分子量150000，脫乙酰度95％以上的殼聚糖分散在1％醋酸溶液中(A液)；將質(zhì)粒DNA溶解于三聚磷酸鹽溶液(B液)。將A液、B液置于50℃水浴分別恒溫20min，將DNA溶液按一定比例加入殼聚糖溶液，磁力攪拌使其充分混合，靜置過濾得到粒徑40-60nm的復(fù)合物微粒。即是質(zhì)粒殼聚糖納米顆粒樣品液。
4、納米顆粒的形態(tài)、粒徑及Zeta電位測(cè)定取少量質(zhì)粒殼聚糖納米樣品液于透射電子顯微鏡下觀察納米顆粒形態(tài)并拍照。另取納米顆粒樣品液適量，加雙蒸水稀釋后用Zetasizer3000HS/IHPL納米顆粒度分析儀測(cè)定粒徑、分散度及Zeta電位。
透射電鏡觀察結(jié)果表明殼聚糖納米顆粒多呈球形(見說明書附圖7)。納米顆粒度分析儀測(cè)定結(jié)果為平均粒徑為45nm；多分散度為0.190(見說明書附圖8)；zeta電位為+25.6mV，說明納米顆粒表面帶有正電荷。
5、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的免疫昆明鼠60只，隨機(jī)分為4組，每組15只。其中2組為非特異性免疫組，2組為疫苗免疫組。采用口服的方法，非特異性免疫組每只小鼠接種劑量為殼聚糖包裝質(zhì)粒30pmol/頭小鼠，疫苗免疫組每只小鼠均按豬免疫劑量1/50接種大腸桿菌、沙門氏菌和支原體疫苗以及殼聚糖納米顆粒包裝的相應(yīng)質(zhì)粒30pmol。五周后每只小鼠口服大腸桿菌K88和K990.4ml進(jìn)行攻毒(3×109/ml)。
動(dòng)物免疫分組見說明書附圖表1，表2。表1為非特異性免疫組分組情況，表2為疫苗免疫組分組情況。
6、殼聚糖納米顆粒包裝VPIL-6質(zhì)粒對(duì)小鼠非特異性免疫應(yīng)答的影響小鼠免疫前及免疫后每周自尾靜脈采血，分離血清，用以檢測(cè)各項(xiàng)免疫指標(biāo)。
(1)IgG、IgA及IgM的測(cè)定含量實(shí)驗(yàn)鼠血清分別作105(IgG)和104(IgM、IgA)稀釋包被Costar酶標(biāo)板，用特異性的兔抗鼠IgG、IgM和IgA重鏈抗體(美國(guó)Bethyl公司生產(chǎn))作一抗，酶標(biāo)羊抗兔IgG為二抗(華美生物工程公司)，TMB(四甲基聯(lián)苯胺)為底物，測(cè)定小鼠血清中IgG、IgM和IgA含量。
結(jié)果見說明書附圖9、10、11。從圖可見，小鼠在口服殼聚糖納米顆粒包裝VPIL-6質(zhì)粒后，其血清中IgG、IgA、IgM含量比對(duì)照組有顯著增高；與對(duì)照組差異顯著(P＜0.05)。第6周大腸桿菌攻毒后，免疫組小鼠IgG、IgA、IgM較對(duì)照組血清中IgG、IgA、IgM含量有顯著增加。
(2)細(xì)胞因子的檢測(cè)小鼠免疫前及免疫后每周自尾靜脈采血，實(shí)驗(yàn)鼠血清100倍稀釋包被Costar酶標(biāo)板，兔抗鼠IL-2、IL-4、IL-6IgG抗體(武漢博士德生物工程公司提供)為一抗，TMB(四甲基聯(lián)苯胺)為底物，SABC法檢測(cè)血清中IL-2、IL-4及IL-6含量，觀測(cè)小鼠細(xì)胞免疫應(yīng)答情況。
結(jié)果見說明書附圖12、圖13、圖14。由圖可知，殼聚糖納米顆粒包裝VPIL-6質(zhì)粒免疫組小鼠血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量均較對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)。
(3)免疫小鼠外周血免疫細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化小鼠免疫前及免疫后每周自尾靜脈采血，常規(guī)法計(jì)白細(xì)胞總數(shù)；血涂片Giemsa染色，鏡檢分類計(jì)數(shù)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞核、淋巴細(xì)胞。
結(jié)果見說明書附圖15、16、17、18。免疫小鼠外周血免疫細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化是考察小鼠細(xì)胞免疫應(yīng)答的一個(gè)重要指標(biāo)。從圖可見口服殼聚糖納米顆粒包裝VPIL-6質(zhì)粒后，免疫小鼠外周血白細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組都有顯著增加，中性粒細(xì)胞在攻毒前也較對(duì)照組明顯升高，但攻毒后中性粒細(xì)胞數(shù)量則較對(duì)照組低。
7、殼聚糖納米顆粒包裝VPIL-6質(zhì)粒對(duì)疫苗特異性免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)(1)IgG、IgA及IgM的測(cè)定含量實(shí)驗(yàn)鼠血清分別作105(IgG)和104(IgM、IgA)稀釋包被Costar酶標(biāo)板，用特異性的兔抗鼠IgG、IgM和IgA重鏈抗體(美國(guó)Bethyl公司生產(chǎn))作一抗，酶標(biāo)羊抗兔IgG為二抗(華美生物工程公司)，TMB(四甲基聯(lián)苯胺)為底物，測(cè)定小鼠血清中IgG、IgM和IgA含量。
結(jié)果見說明書附圖19、20、21。圖19、20、21顯示了殼聚糖納米顆粒包裝VPIL-6質(zhì)粒與支原體疫苗、傷寒疫苗及大腸桿菌疫苗聯(lián)合免疫小鼠后，小鼠血清中免疫球蛋白的變化情況。結(jié)果表明在同時(shí)口服了殼聚糖納米顆粒包裝VPIL-6質(zhì)粒后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的IgG、IgA、IgM含量比對(duì)照組有顯著提高，可以協(xié)同疫苗免疫。
(2)特異性抗體的測(cè)定制備支原體抗原、沙門氏菌抗原、大腸桿菌抗原包被Costar酶標(biāo)板，實(shí)驗(yàn)鼠血清100倍稀釋為一抗，TMB(四甲基聯(lián)苯胺)為底物，SABC法測(cè)定小鼠血清中支原體特異性抗體、傷寒特異性抗體、大腸桿菌特異性抗體含量。
結(jié)果見說明書附圖22、23、24。圖22、23、24顯示了支原體疫苗、傷寒疫苗及大腸桿菌疫苗與質(zhì)粒聯(lián)合免疫動(dòng)物后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物特異性抗體變化情況。結(jié)果顯示動(dòng)物在免疫一周后，就檢測(cè)到特異性抗體的產(chǎn)生；在同時(shí)口服殼聚糖納米顆粒包裝VPIL-6質(zhì)粒后，實(shí)驗(yàn)小鼠的上述特異性抗體比對(duì)照組顯著提高(P＜0.05)。
(3)細(xì)胞因子的檢測(cè)小鼠免疫前及免疫后每周自尾靜脈采血，實(shí)驗(yàn)鼠血清100倍稀釋包被Costar酶標(biāo)板，兔抗鼠IL-2、IL-4、IL-6IgG抗體(武漢博士德生物工程公司提供)為一抗，TMB(四甲基聯(lián)苯胺)為底物，SABC法檢測(cè)血清中IL-2、IL-4及IL-6含量，觀測(cè)小鼠細(xì)胞免疫應(yīng)答情況。
結(jié)果見說明書附圖25、26、27。圖結(jié)果顯示殼聚糖納米顆粒包裝VPIL-6質(zhì)粒與支原體疫苗、傷寒疫苗及大腸桿菌疫苗聯(lián)合免疫小鼠后，小鼠血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量較對(duì)照組高，對(duì)免疫小鼠血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量的提升作用差異顯著(P＞0.05)。
(4)免疫小鼠外周血免疫細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化小鼠免疫前及免疫后每周自尾靜脈采血，常規(guī)法計(jì)白細(xì)胞總數(shù)；血涂片Giemsa染色，鏡檢分類計(jì)數(shù)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞核、淋巴細(xì)胞。
結(jié)果見說明書附圖28、29、30、31。用支原體疫苗、傷寒疫苗及大腸桿菌疫苗聯(lián)合殼聚糖納米顆粒包裝VPIL-6質(zhì)粒免疫小鼠，小鼠外周血免疫細(xì)胞數(shù)量的變化情況結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)口服殼聚糖納米顆粒包裝VPIL-6質(zhì)粒對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠外周血免疫細(xì)胞有較好的提升能力；只是攻毒后小鼠中性粒細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組低。
8、實(shí)驗(yàn)小鼠免疫保護(hù)檢測(cè)小鼠免疫35天后，以大腸桿菌K88和K99口服攻毒實(shí)驗(yàn)小鼠，觀察小鼠的生長(zhǎng)情況；49天時(shí)用常規(guī)方法對(duì)所有小鼠進(jìn)行解剖，觀察各種器官的生理病變情況。攻毒3周后剖解實(shí)驗(yàn)小鼠發(fā)現(xiàn)，VPIL-6質(zhì)粒接種小鼠均健康存活，肝、脾、十二指腸、等消化道和呼吸道組織器官未出現(xiàn)明顯病變，而對(duì)照小鼠均發(fā)病，精神萎靡，被毛聳立，糞便稀軟，帶棕褐色；解剖觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組小鼠均出現(xiàn)以胃、十二指腸、空腸粘膜等處出血、肝脾腫大等為主的病變。
成華豬白細(xì)胞介素-6基因序列<110>四川大學(xué)<120>豬白細(xì)胞介素-6基因抗感染免疫增強(qiáng)劑的制備和應(yīng)用<160>1<210>1<211>675<212>DNA<213>成華豬(Sus scrofa，Chenghua，China)<220>
<400>1atgaactccc tctccacaag cgccttcagt ccagtcgcct tctccctggg gctgcttctg 60gtgatggcta ctgccttccc taccccggga cgcctggaag aagatgccaa aggtgatgcc 120acctcagaca aaatgctctt cacctccccg gacaaaactg aagaactcat taagtacatc 180ctcggcaaaa tctctgcaat gagaaaggag atgtgtgaga agtatgagaa gtgtgaaaac 240agcaaggagg tactggcaga aaacaacctg aaccttccaa aaatggcaga aaaagacgga 300tgcttccaat ctgggttcaa tcaggagacc tgcttgatga gaatcaccac cggtcttgtg 360gagtttcaga tatacctgga ctacctccag aaagagtatg agagcaataa gggaaatgtc 420gaggctgtgc agattagtac caaagcactg atccagaccc tgaggcaaaa gggaaagaat 480ccagacaaag ccaccacccc taaccccacc acaaatgccg gcctgctgga taagctgcag 540tcacagaacg agtggatgaa ggtttctgac cagaggaggg aatgcccgtg gacggcatca 600atctcaggtg ccccagctac attatccgaa tggccctcag gctgaactgc aggaaatcct 660caaggctgcg cagga 675
表1非特異性免疫小鼠分組

注CNP殼聚糖納米顆粒表2疫苗免疫小鼠分組

注CNP殼聚糖納米顆粒表3VPIL-6重組質(zhì)粒真核表達(dá)產(chǎn)物對(duì)豬淋巴細(xì)胞增殖刺激活性檢測(cè)結(jié)果OD570

權(quán)利要求
1.豬白細(xì)胞介素-6基因抗感染免疫增強(qiáng)劑的制備和應(yīng)用，其特點(diǎn)包括成華豬白細(xì)胞介素-6基因的克隆及其真核表達(dá)質(zhì)粒(VPIL-6)的構(gòu)建，殼聚糖納米顆粒對(duì)成華豬白細(xì)胞介素-6基因真核表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行分子包裝制備基因納米顆粒制劑，并將此基因制劑應(yīng)用于增強(qiáng)豬機(jī)體免疫應(yīng)答及抗感染免疫力的應(yīng)用技術(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的成華豬白細(xì)胞介素-6基因抗感染免疫增強(qiáng)劑的制備和應(yīng)用，其特征在于所述的基因制劑的基質(zhì)是以分泌型質(zhì)粒VR1020為載體構(gòu)建的成華豬白細(xì)胞介素-6基因真核表達(dá)質(zhì)粒VPIL-6。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的成華豬白細(xì)胞介素-6基因抗感染免疫增強(qiáng)劑的制備和應(yīng)用，其特征在于所述的基因制劑的包裹材料是分子量為150000，脫乙酰度95％以上的殼聚糖，用離子交聯(lián)法制備的殼聚糖納米顆粒分子，粒徑為40-60nm。
4.使用權(quán)利要求1要求的殼聚糖包裝成華豬白細(xì)胞介素-6基因真核表達(dá)質(zhì)粒VPIL-6納米顆粒作為豬用新型抗感染分子免疫調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用技術(shù)，其特征在于以下幾方面(1)以小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，將制備的殼聚糖VPIL-6質(zhì)粒納米顆粒以口服的投遞方式免疫小鼠，檢測(cè)了殼聚糖包裝VPIL-6質(zhì)粒對(duì)小鼠的體液免疫(IgG、IgA及IgM的含量、特異性抗體的測(cè)定)和細(xì)胞免疫水平(細(xì)胞因子和外周血免疫細(xì)胞數(shù)量)的影響情況，并對(duì)常規(guī)疫苗在殼聚糖包裝VPIL-6質(zhì)粒分子免疫佐劑協(xié)同作用下細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答的變化，進(jìn)行了較為系統(tǒng)的分析；(2)以制備的殼聚糖VPIL-6質(zhì)粒納米顆粒單獨(dú)免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，結(jié)果表明殼聚糖VPIL-6質(zhì)粒納米顆粒能有效提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)胞和體液免疫水平，增強(qiáng)其非特異性免疫力；(3)以制備的殼聚糖VPIL-6質(zhì)粒納米顆粒聯(lián)合疫苗(支原體疫苗、傷寒疫苗及大腸桿菌疫苗)共免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，結(jié)果表明殼聚糖VPIL-6質(zhì)粒納米顆粒可顯著增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)疫苗的特異性細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答反應(yīng)。
全文摘要
該發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域1.生物技術(shù)，2.分子免疫學(xué)。本發(fā)明克隆了成華豬白細(xì)胞介素－6基因，并構(gòu)建了其真核表達(dá)質(zhì)粒(VPIL－6)，以分子量為150000、脫乙酰度95％以上的殼聚糖制備了殼聚糖納米顆粒，提供了利用殼聚糖納米顆粒對(duì)質(zhì)粒VPIL－6進(jìn)行分子包裝以制備抗感染基因制劑的方法，公開了該納米顆?；蛑苿┳鳛樾滦涂垢腥痉肿用庖咴鰪?qiáng)劑的應(yīng)用技術(shù)。該方法包括殼聚糖納米顆粒分子包裝VPIL－6質(zhì)粒，將此制備的基因納米顆粒制劑以肌注、口服方式單獨(dú)或協(xié)同疫苗免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的特異性和非特異性細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，提供了殼聚糖納米顆粒包裝VPIL－6質(zhì)粒作為新型動(dòng)物抗感染分子免疫增強(qiáng)劑提高動(dòng)物非特異性和特異性免疫力的應(yīng)用技術(shù)。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1692941SQ200410040699
公開日2005年11月9日 申請(qǐng)日期2004年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月17日
發(fā)明者高榮, 孟民杰, 武梅, 王澤州, 李江凌, 呂學(xué)斌, 李惠, 吳凱源, 付滿良, 楊毅, 章歡 申請(qǐng)人:四川大學(xué)