專利名稱：一種蘇木乙酸乙酯提取物及其作用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種蘇木的乙酸乙酯提取物及其作用，具體是在抗免疫抑制方面的作用。
背景技術(shù)：
隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展和免疫學(xué)研究的不斷深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到免疫系統(tǒng)異常與人類眾多疾病的發(fā)生均有密切的關(guān)系。臨床工作中常常需要使用大量的免疫抑制劑，尤其是接受器官移植的病人，需要終生服用。
臨床開展器官移植已有40余年的歷史，在早期因?yàn)榕懦夥磻?yīng)的困擾進(jìn)展緩慢。自1978年環(huán)孢素A在臨床上應(yīng)用之后，使器官移植發(fā)生了革命性變化?，F(xiàn)在臨床常用的免疫抑制劑有4大類①化學(xué)合成細(xì)胞毒類(抗代謝劑和烷化劑)，主要代表為硫唑嘌呤、霉酚酸酯(MMF)；②抗生素類(微生物產(chǎn)生的制劑)；③腎上腺皮質(zhì)激素類；④生物制劑類，國內(nèi)外應(yīng)用的免疫抑制劑是以環(huán)胞素A(CsA)、雷帕霉素、他克莫司(FK506)為代表的生物制劑類藥物。雖然西藥免疫抑制劑的陸續(xù)開發(fā)上市為器官移植和免疫性疾病的臨床治療開創(chuàng)了新局面，但是目前臨床上應(yīng)用的這些藥物大多缺乏選擇性和特異性，對(duì)正常和異常的免疫反應(yīng)均有抑制作用，對(duì)初次免疫應(yīng)答反應(yīng)抑制作用較強(qiáng)，對(duì)再次免疫應(yīng)答反應(yīng)抑制作用較弱。長期應(yīng)用，一方面容易降低機(jī)體抵抗力而誘發(fā)嚴(yán)重感染及惡性腫瘤；另一方面，免疫抑制劑對(duì)機(jī)體及移植器官本身具有毒性作用，造成相應(yīng)器官或移植器官的功能障礙，甚至喪失其功能。而且常規(guī)免疫抑制劑的劑量難以控制，劑量小不足以保護(hù)移植物不受排斥，劑量大則機(jī)體難以耐受，雖然近期療效大為提高，但遠(yuǎn)期效果仍不理想。此外，有些藥物目前仍需進(jìn)口，價(jià)格昂貴，加重了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
對(duì)祖國醫(yī)學(xué)來講，抗器官移植免疫排斥是個(gè)新課題，在急性排斥反應(yīng)中移植物在被排斥時(shí)常出現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹變性、血管周圍炎性細(xì)胞浸潤、水腫、出血、小血管管壁增厚、管腔狹窄、甚至血栓形成等一系列小血管病理損害和微循環(huán)障礙。這種病變與祖國醫(yī)學(xué)理論中的“瘀血”較為相似。由于我國中草藥資源豐富、價(jià)格低廉、毒副作用低等特點(diǎn)，自70年代末以來，對(duì)中藥復(fù)方和單味藥的抗免疫排斥作用進(jìn)行了大量的研究工作，顯示了一定療效。其中，對(duì)雷公藤多甙的研究比較深入，雖然已經(jīng)證實(shí)雷公藤多甙對(duì)細(xì)胞免疫和體液免疫均有一定的抑制作用，但美中不足的是它同時(shí)帶來的明顯的毒副作用，如胃腸道反應(yīng)、白細(xì)胞及血小板的減少、閉經(jīng)和肝損害等，限制了它的臨床應(yīng)用。對(duì)冬蟲夏草的研究也較深入，其主要表現(xiàn)為不同的提取方法，顯示出不同的藥理作用，因此，應(yīng)用于臨床還需做大量的工作。因此，人們期待能從中草藥中尋找出一種高效低毒、選擇性強(qiáng)的免疫抑制劑，從而達(dá)到代替或部分代替目前應(yīng)用的西藥免疫抑制劑而更好的應(yīng)用于臨床。
研究表明，活血化瘀藥物具有減輕血小板聚集、調(diào)整血管壁通透性的紊亂、擴(kuò)張血管、調(diào)整血液粘度、防止凝血及促進(jìn)纖溶等作用，因而可改善排斥反應(yīng)所導(dǎo)致的移植物微循環(huán)障礙，使移植物的存活期延長。另外，活血化瘀藥物可抑制機(jī)體產(chǎn)生抗體。本發(fā)明可延長移植心臟的存活時(shí)間，減輕排斥反應(yīng)對(duì)器官所致的免疫損傷，且毒副作用小，價(jià)格低廉。蘇木為傳統(tǒng)中藥，具有行血破瘀、消腫止痛的功效。自70年代起，國內(nèi)外學(xué)者開始對(duì)蘇木及其活性成分進(jìn)行研究，證實(shí)其具有較強(qiáng)的體外抑制腫瘤細(xì)胞、抑制血小板和免疫抑制作用。周亞濱教授于1999年完成了蘇木抗大鼠同種異位心臟移植急性排斥反應(yīng)機(jī)理的研究，結(jié)果表明蘇木水提液可以抑制大鼠移植心心肌組織中穿孔素、顆粒酶B mRNA的表達(dá)，降低外周血細(xì)胞因子IL-2、IL-6的水平，調(diào)節(jié)CD4+/CD8+的比值，抑制心肌細(xì)胞的過度凋亡。為進(jìn)一步明確其生物活性成分，在此基礎(chǔ)上又先后進(jìn)行了蘇木乙醇提取物、乙醇提取物進(jìn)一步提取的乙酸乙酯和正丁醇提取物對(duì)小鼠免疫活性細(xì)胞的抑制作用及對(duì)IL-1β、IL-2生成的影響。初步研究結(jié)果表明乙酸乙酯提取物具有較強(qiáng)免疫抑制作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種抗免疫抑制作用的蘇木乙酸乙酯提取物，與現(xiàn)有技術(shù)相比，毒副作用小，作用更為顯著，并且價(jià)格低廉、可以作為常規(guī)用藥。
本發(fā)明的技術(shù)方案是通過下述方法制備方法來實(shí)現(xiàn)的采用熱回流提取將蘇木粗粉(40目)用75％乙醇浸泡4h，加熱至85℃，連續(xù)回流提取2h，過濾；反復(fù)2次，將濾液合并，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮，將濃縮液轉(zhuǎn)入真空干燥箱中烘干至恒重，制成乙醇提取物干粉。將乙醇提取物干粉加入雙蒸水混懸，用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，體積比為乙酸乙酯∶水＝1∶1，用力振搖后，靜止2小時(shí)，分出上層乙酸乙酯層，連續(xù)萃取3次，合并乙酸乙酯層。于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓回收乙酸乙酯，溫度為40℃，濃縮液放入真空干燥箱中減壓干燥至恒重，溫度為40℃。得到乙酸乙酯提取物干粉。
此外還可以采用下述方法煎煮法將蘇木粗粉(過40目)用8倍量的水浸泡4h，連續(xù)回流提取兩次，每次2h，過濾，將濾液合并，將濾液濃縮至相對(duì)密度1.00-1.05，用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，體積比為乙酸乙酯∶水＝1∶1，用力振搖后，靜止2小時(shí)，分出上層乙酸乙酯層，連續(xù)萃取3次，合并乙酸乙酯層。于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓回收乙酸乙酯，溫度為40℃，濃縮液放入真空干燥箱中減壓干燥至恒重，溫度為40℃。得到乙酸乙酯提取物干粉。
超聲振蕩提取將蘇木粗粉(過40目)用8倍量的75％乙醇浸泡2h，連續(xù)超聲振蕩提取兩次，＜50℃每次2h，過濾，將濾液合并，減壓回收乙醇，并干燥至恒重，制成75％乙醇提取物。
取75％乙醇提取物，研磨細(xì)粉(過80目)，水混懸后用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，體積比為乙酸乙酯∶水＝1∶1，用力振搖后，靜止2小時(shí)，分出上層乙酸乙酯層，連續(xù)萃取3次，合并乙酸乙酯層。于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓回收乙酸乙酯，溫度為40℃，濃縮液放入真空干燥箱中減壓干燥至恒重，溫度為40℃。得到乙酸乙酯提取物干粉。
滲漉法將蘇木粗粉(過40目)用75％乙醇連續(xù)滲漉提取，收集滲漉液，減壓回收乙醇，并干燥至恒重，制成75％乙醇提取物。
取75％乙醇提取物，研磨細(xì)粉(過80目)，水混懸后用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，體積比為乙酸乙酯∶水＝1∶1，用力振搖后，靜止2小時(shí)，分出上層乙酸乙酯層，連續(xù)萃取3次，合并乙酸乙酯層。于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓回收乙酸乙酯，溫度為40℃，濃縮液放入真空干燥箱中減壓干燥至恒重，溫度為40℃。得到乙酸乙酯提取物干粉。
超臨界萃取法蘇木粗粉(過80目)SFE條件萃取罐溫度40℃，萃取壓力15MPa，CO2流量25m2/h，萃取時(shí)間2.5h，夾帶劑為95％乙醇比例不超過15％。減壓干燥。將提取物研磨至細(xì)粉(過80目)，水混懸后用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，體積比為乙酸乙酯∶水＝1∶1，用力振搖后，靜止2小時(shí)，分出上層乙酸乙酯層，連續(xù)萃取3次，合并乙酸乙酯層。于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓回收乙酸乙酯，溫度為40℃，濃縮液放入真空干燥箱中減壓干燥至恒重，溫度為40℃。得到乙酸乙酯提取物干粉。
本發(fā)明的藥物，可延長移植心臟的存活時(shí)間，減輕排斥反應(yīng)對(duì)器官所致的免疫損傷，毒副作用小，價(jià)格低廉，可以作為常規(guī)用藥。
實(shí)驗(yàn)部分下面通過藥理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)一步說明本發(fā)明的上述效果實(shí)驗(yàn)一蘇木有效部位群免疫抑制作用的篩選研究材料與方法一.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
C57BL/6小鼠，雄性，20～25g；BABL/C小鼠，雄性，20～25g；Wistar大鼠，雄性，160～190g；SD大鼠，雄性，250～300g。Wistar大鼠購自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，其余動(dòng)物購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在通風(fēng)、溫度、濕度適宜的動(dòng)物室內(nèi)飼養(yǎng)。
二.主要儀器2k-828型真空干燥箱，上海醫(yī)療儀器總廠超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備廠300型CO2培養(yǎng)箱，Sheldon Manufacturing.Inc.
Allegna 21R Centrifuge離心機(jī)，Beckman.
SXP-1B型雙人雙目顯微鏡，上海光學(xué)儀器廠SSW-3型顯微手術(shù)器械包，上海醫(yī)療儀器廠三.實(shí)驗(yàn)用藥1.蘇木有效部位群的制備將蘇木粗粉(40目)放入4頸燒杯中，加入75％乙醇浸泡4h，加熱至85℃，連續(xù)回流提取2h，過濾；反復(fù)2次，將濾液合并，一部分抽入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中水浴蒸干，轉(zhuǎn)入真空干燥箱中烘干至恒重，制成乙醇提取干粉。
對(duì)剩余的75％乙醇提取物用乙酸乙酯萃取，得到萃取物，連同分離出的水層，分別按照前法制成乙酸乙酯和水溶性成分干粉。
2.蘇木灌服液的制備將乙醇提取干粉60g加入雙蒸水200ml混懸，制成30％的蘇木灌服液備用。
3.實(shí)驗(yàn)試劑NBS-RPMI-1640培養(yǎng)液四.試驗(yàn)方法1.藥品的制備乙醇、乙酸乙酯水溶性成分干粉水溶，濃縮配成每毫升含主藥1g。
2.混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)試驗(yàn)(MLR)2.1脾細(xì)胞懸液的制備①小鼠放血處死，取脾稱重，放入盛有冷的5～10ml HBS平皿中不繡鋼網(wǎng)上，剔除脂肪組織和結(jié)蹄組織。
②將脾剪成兩段，輕輕碾碎，使單個(gè)脾細(xì)胞經(jīng)不銹鋼網(wǎng)進(jìn)入溶液中，再經(jīng)不銹鋼網(wǎng)過濾至離心管。
③離心1500r，5分鐘后棄上清，低滲處理除去紅細(xì)胞。
④用HBSS液洗滌細(xì)胞2～4次，加入10％NBS-RPMI-1640培養(yǎng)液1～2ml，細(xì)胞計(jì)數(shù)及測(cè)定細(xì)胞的存活率。
2.2MLR實(shí)驗(yàn)①刺激淋巴細(xì)胞制備C57BL/6小鼠脾細(xì)胞做刺激細(xì)胞，將淋巴細(xì)胞1×106/ml加入絲裂霉素C處理，最終濃度為25μg/ml，于37℃水浴下作用30min，1000r/min離心10min，棄上清，沉淀細(xì)胞用Hanks液洗滌3次。用BALB/c小鼠脾細(xì)胞做應(yīng)答細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml。
②將4種藥物離心2000rpm，無菌過濾，備用。
③將4種藥液分別用1640培養(yǎng)液作倍比稀釋1∶128、1∶256、1∶512、1∶1024、1∶2048。
④取刺激細(xì)胞和反應(yīng)細(xì)胞各50μl加入96孔培養(yǎng)板上，加入100μl含藥20％NB S-RPMI-1640培養(yǎng)液中，每組均設(shè)3各復(fù)孔。另以不含藥物的1640培養(yǎng)液作為空白對(duì)照組?；旌霞?xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。
⑤收集前4h加入氚標(biāo)記的胸苷2μCi。
⑥反應(yīng)終溶液收集到纖維濾紙上，干燥后用液體閃爍器記cpm值。
結(jié)果一.蘇木有效部位群免疫抑制作用的篩選研究(見表1)蘇木乙醇提取部分經(jīng)有機(jī)溶劑提取后得到乙酸乙酯部分和水部位。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蘇木各部位群均有一定的免疫抑制作用，其中乙醇組和乙酸乙酯組均呈現(xiàn)良好的平行關(guān)系，乙酸乙酯組表現(xiàn)出明顯的免疫抑制作用，水提物組雖然具有一定的作用，但是高濃度組與低濃度組的差異性未能顯示出有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
表1各細(xì)對(duì)單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)的影響(x±s，n＝3)

各組組內(nèi)與1∶2048組相比，*P＜0.05；**P＜0.01由于對(duì)照組未能出結(jié)果，各組之間差異性比較采用同組之間各濃度組與低濃度組比較，方法仍然采用方差分析和Dunnettt檢驗(yàn)(q′檢驗(yàn))進(jìn)行非配對(duì)的顯著性分析。
實(shí)驗(yàn)二蘇木有效成分對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能抑制作用的量效關(guān)系研究材料與方法一.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠，雄性，6～8周齡，體重18～22g。由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(黑)20020002。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在通風(fēng)、溫度、濕度適宜的動(dòng)物室內(nèi)飼養(yǎng)。
二.主要儀器設(shè)備及藥品試劑
RPMI-1640，Gibco公司新生小牛血清(NBS)，上海生物制品所ConA，Sigma公司LPS，Sigma公司MTT，Sigma公司(用0.1mol/L的PBS配成濃度為5mg/ml的MTT液)十二烷基磺酸鈉(SDS)，上海化學(xué)試劑站紅細(xì)胞裂解液(將KHCO30.5g，NH4Cl4.15g，EDTA-Na20.185g溶于蒸餾水500ml中配制而成)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，Biocell 2010，Anthos公司CO2培養(yǎng)箱，5410型Napco公司2k-828型真空干燥箱，上海醫(yī)療儀器廠三.實(shí)驗(yàn)用藥蘇木，購自黑龍江省藥材公司，產(chǎn)地云南，經(jīng)生藥鑒定。
蘇木乙酸乙酯提取物的制備采用熱回流提取將蘇木粗粉(40目)用75％乙醇浸泡4h，加熱至85℃，連續(xù)回流提取2h，過濾；反復(fù)2次，將濾液合并，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮，將濃縮液轉(zhuǎn)入真空干燥箱中烘干至恒重，制成乙醇提取物干粉。將乙醇提取物干粉加入雙蒸水混懸，用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，體積比為乙酸乙酯∶水＝1∶1，用力振搖后，靜止2小時(shí)，分出上層乙酸乙酯層，連續(xù)萃取3次，合并乙酸乙酯層。于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓回收乙酸乙酯，溫度為40℃，濃縮液放入真空干燥箱中減壓干燥至恒重，溫度為40℃，得到乙酸乙酯提取物干粉。
此外還可以采用下述方法煎煮法將蘇木粗粉(過40目)用8倍量的水浸泡4h，連續(xù)回流提取兩次，每次2h，過濾，將濾液合并，將濾液濃縮至相對(duì)密度1.00-1.05，用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，體積比為乙酸乙酯∶水＝1∶1，用力振搖后，靜止2小時(shí)，分出上層乙酸乙酯層，連續(xù)萃取3次，合并乙酸乙酯層。于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓回收乙酸乙酯，溫度為40℃，濃縮液放入真空干燥箱中減壓干燥至恒重，溫度為40℃。得到乙酸乙酯提取物干粉。
超聲振蕩提取將蘇木粗粉(過40目)用8倍量的75％乙醇浸泡2h，連續(xù)超聲振蕩提取兩次，＜50℃每次2h，過濾，將濾液合并，減壓回收乙醇，并干燥至恒重，制成75％乙醇提取物。
取75％乙醇提取物，研磨細(xì)粉(過80目)，水混懸后用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，體積比為乙酸乙酯∶水＝1∶1，用力振搖后，靜止2小時(shí)，分出上層乙酸乙酯層，連續(xù)萃取3次，合并乙酸乙酯層。于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓回收乙酸乙酯，溫度為40℃，濃縮液放入真空干燥箱中減壓干燥至恒重，溫度為40℃。得到乙酸乙酯提取物干粉。
滲漉法將蘇木粗粉(過40目)用75％乙醇連續(xù)滲漉提取，收集滲漉液，減壓回收乙醇，并干燥至恒重，制成75％乙醇提取物。
取75％乙醇提取物，研磨細(xì)粉(過80目)，水混懸后用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，體積比為乙酸乙酯∶水＝1∶1，用力振搖后，靜止2小時(shí)，分出上層乙酸乙酯層，連續(xù)萃取3次，合并乙酸乙酯層。于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓回收乙酸乙酯，溫度為40℃，濃縮液放入真空干燥箱中減壓干燥至恒重，溫度為40℃。得到乙酸乙酯提取物干粉。
超臨界萃取法蘇木粗粉(過80目)SFE條件萃取罐溫度40℃，萃取壓力15MPa，CO2流量25m2/h，萃取時(shí)間2.5h，夾帶劑為95％乙醇比例不超過15％。減壓干燥。將提取物研磨至細(xì)粉(過80目)，水混懸后用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，體積比為乙酸乙酯∶水＝1∶1，用力振搖后，靜止2小時(shí)，分出上層乙酸乙酯層，連續(xù)萃取3次，合并乙酸乙酯層。于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓回收乙酸乙酯，溫度為40℃，濃縮液放入真空干燥箱中減壓干燥至恒重，溫度為40℃。得到乙酸乙酯提取物干粉。
四.實(shí)驗(yàn)分組和給藥將104只小鼠隨機(jī)分成13組，每組8只。其中蘇木乙酸乙酯提取物用橄欖油稀釋，以相當(dāng)于原藥蘇木15、25、35、45g/kg的劑量0.2ml/10g灌胃，分成4個(gè)劑量組；乙醇提取物用橄欖油稀釋，以相當(dāng)于原藥蘇木15、25、35、45g/kg的劑量0.2ml/10g灌胃，分成4個(gè)劑量組；蘇木水提組，以相當(dāng)于原藥蘇木15、25、35、45g/kg的劑量0.2ml/10g灌胃；另設(shè)空白對(duì)照組，以0.2ml/10g橄欖油灌胃。連續(xù)灌胃8天。
五.實(shí)驗(yàn)方法小鼠脾臟T、B淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)將小鼠頸椎脫位處死后，置70％乙醇中浸泡3～5min，取出后右側(cè)臥位，消毒左側(cè)背腹交界處皮膚，無菌取脾，放在盛有冷的0.9％生理鹽水平皿的不銹鋼絲網(wǎng)(100目)上，剔除脂肪組織和結(jié)締組織。將脾組織剪成兩段，用注射器的針芯輕輕捻脾組織，使單個(gè)細(xì)胞經(jīng)網(wǎng)進(jìn)入溶液中，再經(jīng)不銹鋼網(wǎng)過濾至離心管中，離心(1500r/min，10min)后棄上清。用紅細(xì)胞裂解液除去紅細(xì)胞，用冷的0.9％生理鹽水洗滌細(xì)胞2～4次，離心。最后加入10％NBS-RPMI-1640培養(yǎng)液1～2ml懸浮脾細(xì)胞，制備成4～6×106/ml的小鼠脾細(xì)胞懸液。以上操作過程，細(xì)胞均放置0～4℃環(huán)境中。
于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100μl脾細(xì)胞懸液。設(shè)T、B細(xì)胞組，每組分別為3個(gè)復(fù)孔。在T細(xì)胞組中加入ConA，終濃度為5μg/ml；B細(xì)胞組中加入LPS，終濃度為10μg/ml。將96孔培養(yǎng)板置于37℃，5％CO2溫箱中培養(yǎng)48h。每孔加入10μlMTT溶液再繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后加入100μl 100g/L酸化的SDS，震蕩3min，溫箱培養(yǎng)3h，室溫20min后用酶標(biāo)儀于波長570nm處測(cè)OD值。
結(jié)果一.一般情況對(duì)照組、15、25、35g/kg蘇木乙酸乙酯提取物組、乙醇提取物組及25、35g/kg水提物組小鼠一般狀態(tài)良好，皮毛光滑，進(jìn)食及體重逐漸增加；45g/kg乙酸乙酯提取物組、乙醇提取物組及15g/kg、45g/kg水提物組小鼠一般狀態(tài)較差，懶動(dòng)，體毛疏松，進(jìn)食及體重逐漸降低。
二.蘇木有效成分對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能的影響(見表2)表2蘇木有效成分對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能的影響(OD值，x±S)

從表2中可以看出，蘇木乙酸乙酯和乙醇提取物、水提物與對(duì)照組相比均能明顯抑制淋巴細(xì)胞的增殖(P＜0.05)。在對(duì)T或B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能的影響方面，乙酸乙酯35g/kg、45g/kg與其他實(shí)驗(yàn)組相比差異具有顯著性(P＜0.05)。
實(shí)驗(yàn)三蘇木乙酸乙酯提取物對(duì)大鼠同種異位心臟移植急性排斥反應(yīng)心肌FasL mRNA表達(dá)的影響材料與方法一.模型的建立與分組
(一)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康成年雄性，清潔級(jí)近交系封閉群大鼠，供者Wistar大鼠，體重160～200g；受者SD(Sprague-Dawley)大鼠，體重250～300g。均購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在通風(fēng)、溫度、濕度適宜的動(dòng)物室內(nèi)飼養(yǎng)。動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(黑)20020002。
(二)主要儀器設(shè)備及藥品試劑2k-828型真空干燥箱，上海醫(yī)療儀器廠SXP-1B型雙人雙目手術(shù)顯微鏡，上海光學(xué)儀器廠SSW-3型顯微外科手術(shù)器械包，上海醫(yī)療儀器廠9/0帶針醫(yī)用無損傷縫合線，上海醫(yī)用縫合針廠戊巴比妥鈉(以注射用水配制成1％溶液)肝素鈉注射液，2ml12500單位，江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司。(以生理鹽水配制成500u/ml和25u/ml的肝素生理鹽水)心臟停搏液，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院制劑室提供慶大霉素注射液，北京雙鶴制藥廠橄欖油(olive oil)，中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司(三)實(shí)驗(yàn)用藥1.環(huán)孢素A 將環(huán)孢素膠囊(華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，每粒含CsA25mg)溶于橄欖油中，稀釋至3.5mg/ml濃度，室溫保存?zhèn)溆谩?br> 2.蘇木乙酸乙酯提取物、乙醇提取物、水提物制備方法同實(shí)驗(yàn)二(四)模型的制備大鼠同種異位心臟移植術(shù)，采用改良的Ono術(shù)式[141]，將供心的升主動(dòng)脈和肺主動(dòng)脈分別與受體的腹主動(dòng)脈和下腔靜脈行端側(cè)吻合，為移植心臟提供血液循環(huán)。
1.受體手術(shù)將SD大鼠用戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射麻醉，仰臥固定，常規(guī)消毒、鋪巾。從正中線剪開腹壁，將腸袢推向右側(cè)，用濕生理鹽水紗布蓋好。用拉鉤牽引兩側(cè)腹壁切口，在10倍鏡下進(jìn)行操作，打開后腹膜，在腰靜脈以下暴露腹主動(dòng)脈和下腔靜脈，稍加游離，用4/0線結(jié)扎背側(cè)交通支，用無齒鑷提起動(dòng)脈鞘，在選定吻合口部位兩側(cè)分別放置血管夾，完全阻斷腹主動(dòng)脈和下腔靜脈。
2.供心切取將Wistar大鼠按戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射麻醉，固定、消毒、鋪巾后，由正中線剪開腹壁，將腸袢推向右側(cè)，剝離出腹主動(dòng)脈，用注射器注入1ml(500u/ml)肝素生理鹽水。待全身肝素化后，沿雙側(cè)腋前線從肋緣至鎖骨剪開胸腔，暴露心臟，剪開心包，立即向胸腔內(nèi)及心臟表面加入少量0～4℃生理鹽水進(jìn)行供心表面降溫。然后，分離無名動(dòng)脈，以彎曲針頭注射器穿刺主動(dòng)脈至根部，注入預(yù)冷的心臟停跳液15～20ml，心臟迅速停跳。在無名動(dòng)脈起始部剪斷主動(dòng)脈，在肺動(dòng)脈分叉處剪斷肺動(dòng)脈。然后用4/0線一次性集束結(jié)扎剩余血管，提起心臟，在遠(yuǎn)心端剪下心臟。取出心臟，置于0～4℃生理鹽水中，修剪血管。
3.供心移植用尖刀在受體腹主動(dòng)脈前壁挑一個(gè)小口，用彈簧顯微手術(shù)剪稍加擴(kuò)大(2.5～3.0mm)，使之與供心主動(dòng)脈直徑接近。用肝素生理鹽水(25u/ml)沖洗管腔內(nèi)積血，用9/0無損傷線先將供心主動(dòng)脈與受體腹主動(dòng)脈吻合口的兩端采用間斷縫合法吻合，接著分別做右側(cè)壁、左側(cè)壁的連續(xù)縫合。針距、邊距約為0.4～0.5mm，每側(cè)縫合7～8針。然后在行供心肺動(dòng)脈與受體下腔靜脈的吻合，方法同前。手術(shù)期間，每隔4～5min更換冰生理鹽水紗布，覆蓋在供心的表面，以防心臟復(fù)溫。
吻合完畢后，先釋放尾側(cè)端血管夾，檢查靜脈吻合口有無漏血。然后再釋放頭側(cè)端血管夾，檢查動(dòng)脈吻合口，如有出血，可以多次，間斷地放松血管夾，同時(shí)用明膠海綿輕壓吻合口。在去夾1min內(nèi)，供心自動(dòng)復(fù)跳或由纖顫轉(zhuǎn)為正常心搏，心率200～280次/min，顏色有紫紅色轉(zhuǎn)變?yōu)檎ｎ伾?。然后按原位回納腸袢，分二層縫合腹壁。最后，從尾靜脈注射0.5u慶大霉素。供心總?cè)毖獣r(shí)間平均為35min。
(五)實(shí)驗(yàn)分組及處理移植術(shù)前1d按分組要求灌胃給藥。術(shù)后將2h內(nèi)清醒能站立，手指稍用力便可觸及心臟跳動(dòng)且24h內(nèi)不停跳者作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，單籠飼養(yǎng)。將上述大鼠隨機(jī)分為5組，每組8只。第一組為模型對(duì)照組，術(shù)后24h灌服橄欖油，劑量為10ml/(kg·d)。第二組環(huán)孢素A組，術(shù)后24h后按35mg/(kg·d)灌服給藥。第三組為蘇木乙酸乙酯組，術(shù)后24h后按生藥22g/(kg·d)灌服給藥。第四組為蘇木乙醇組，術(shù)后24h后按生藥22g/(kg·d)灌服給藥。第五組為蘇木水提組，術(shù)后24h后按生藥22g/(kg·d)灌服給藥。
術(shù)后大鼠腹腔移植心跳滿11d者于當(dāng)天取供心；不滿11d者于腹腔心臟停跳后12h內(nèi)取供心。移植心臟存活時(shí)間以天為計(jì)算單位，手術(shù)當(dāng)天按0天就算，不足24h者采用四舍五入法計(jì)算。
(六)標(biāo)本的采集將動(dòng)物經(jīng)戊巴比妥鈉40mg/kg麻醉，常規(guī)固定、消毒、鋪巾等處理。沿正中線剪開腹壁，快速用180℃、12h處理過的手術(shù)剪(0.1％DEPC水處理后)剪取心肌約400mg左右，分別用液氮速凍，-80℃低溫冰箱保存，待做逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)；余下心肌剪取心尖部組織0.2～0.3mm3，用10％福爾馬林固定，待做光鏡檢測(cè)。
二、病理形態(tài)學(xué)檢查(一)主要試劑(1)甲醛，天津化學(xué)試劑研究所(2)二甲苯，哈爾濱新達(dá)化工廠(3)蘇木精-伊紅生物染色劑(HE)，北京化工廠(二)主要儀器(1)切片機(jī)，LEICA RM 2135，德國制造。
(2)光學(xué)顯微鏡，日本OLYMPUS公司生產(chǎn)(三)光鏡樣品的制備將留取的心肌標(biāo)本在10％福爾馬林常溫固定24h以上，乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟、石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察形態(tài)學(xué)改變。
(四)病理組織學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)采用ISHT[142]標(biāo)準(zhǔn)對(duì)移植心急性排斥反應(yīng)進(jìn)行病理組織學(xué)分級(jí)。
①0級(jí)無排斥反應(yīng)。
②1級(jí)1A級(jí)，局灶性，血管周圍或間質(zhì)內(nèi)有少量散在淋巴細(xì)胞浸潤，無心肌壞死。
1B級(jí)，彌漫性，血管周圍或/及間質(zhì)內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤，無心肌壞死。
③2級(jí)灶性成片淋巴細(xì)胞浸潤，有/無嗜酸性白細(xì)胞，或/及心肌壞死。
④3級(jí)3A級(jí)，多灶性，成片淋巴細(xì)胞浸潤，有/無嗜酸性白細(xì)胞，或/及心肌壞死。
3B級(jí)，大量淋巴細(xì)胞及嗜酸性白細(xì)胞浸潤，偶見中性粒細(xì)胞，約75％的心肌被淋巴細(xì)胞浸潤，心肌壞死。
⑤4級(jí)彌漫性，大量淋巴細(xì)胞、嗜酸性白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等多種炎細(xì)胞浸潤，心肌壞死，間質(zhì)水腫、出血及血管炎。
為便于統(tǒng)計(jì)，將1A和1B級(jí)合計(jì)為1級(jí)；3A和3B級(jí)合計(jì)為3級(jí)。
三、RT-PCR法檢測(cè)心肌FasL mRNA的表達(dá)(一)實(shí)驗(yàn)試劑(1)Trizol RNA提取試劑， Invitrogen公司(2)二乙基焦碳酸酯(DEPC)，Promega公司(3)RT-PCR試劑盒，Promega公司(4)上、下游引物，大連寶生物公司(5)逆轉(zhuǎn)錄酶，Promega公司(6)瓊脂糖， Promega公司(7)GoldView染料 Buffer公司(8)三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)， 大連寶生物公司
(二)實(shí)驗(yàn)儀器(1)低溫高速離心機(jī)， HITACHI公司(2)PCR儀， 北京六一儀器廠(3)紫外分光光度計(jì)， ALPHA INNOTECH公司(4)電泳凝膠圖象分析系統(tǒng)，Backman公司(三)基本操作(1)引物設(shè)計(jì)[143]FasL上游引物5’-ATAGAGCTGTGGCTACCGGTG-3’下游引物5’-CTCCAGAGATCAAAGCAGTTCC-3’目的基因產(chǎn)物長度534bpβ-actin上游引物5’-GGCTTCGCGGGCGACGATG-3’下游引物5’-CTCAGCTGTGGTGGTGAAG-3’目的基因產(chǎn)物長度587bp(2)RNA提取①心肌組織勻漿于冰上進(jìn)行。取100mg心肌組織，放入玻璃勻漿器中，加入Trizol試劑1ml。
②25℃水浴箱中孵育5分鐘。
③將勻漿移入1.5ml離心管中，加入氯仿0.2ml，混搖15秒，室溫放置5分鐘。
④4℃下離心(10000r/min)15分鐘⑤將上層無色液相移入1.5ml離心管中，加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘后混勻。
⑥4℃下離心(10000r/min)15分鐘。
⑦去上清。沉淀中加入75％乙醇1ml。4℃下離心(7500r/min)5分鐘。重復(fù)該步驟2次。
⑧真空干燥10分鐘。
⑨計(jì)算所提RNA量，使A260/A280比值保持在1.8以上。-70℃低溫冰箱保存。(3)RNA逆轉(zhuǎn)錄取上述標(biāo)本RNA2μg，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。
20μl反應(yīng)體系5×緩沖液 5μl10mmol/L dNTP 2μl逆轉(zhuǎn)錄酶 0.5μl上、下游引物 各0.5μl25mmol/L MgSO41.5μlRNA2μg加入去Rnase的蒸餾水至20μl反應(yīng)條件42℃溫育45分鐘合成cDNA；95℃10分鐘滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。
(4)PCRPCR以cDNA為模板行體外擴(kuò)增。
25μl反應(yīng)體系模板cDNA10μl5×緩沖液 5μl10mmol/L dNTP 2μlTaq酶 1μl上、下游引物 各0.5μl加入雙蒸水至 25μl反應(yīng)條件變性94℃30秒退火55℃60秒延伸68℃60秒共做30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5分鐘。
(5)RT-PCR產(chǎn)物分析取10μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μl以1.5％瓊脂糖凝膠、100V電壓電泳60min，GoldView染料染色，在紫外燈下觀察結(jié)果、拍照。應(yīng)用凝膠圖象分析系統(tǒng)測(cè)定PCR產(chǎn)物電泳條帶的密度積分，計(jì)算FasL產(chǎn)物的相對(duì)量。計(jì)算公式FasL相對(duì)量＝FasL產(chǎn)物電泳條帶密度/β-action電泳條帶密度×100％。
四.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(x±SD)，用SPSS10.0軟件計(jì)算。結(jié)果之間多樣本比較用F檢驗(yàn)進(jìn)行方差分析，兩兩比較用q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有顯著性。
結(jié)果一.手術(shù)成功率正式實(shí)驗(yàn)43例，成功40例，失敗3例，其中血管吻合口出血過多致死2例；血管吻合口狹窄致死1例。成功率93.0％。
二.一般情況術(shù)后大鼠多在2～4h內(nèi)清醒，呼吸平穩(wěn)，心臟搏動(dòng)規(guī)則、有力。4h左右可以進(jìn)食、飲水。3～4d后刀口愈合。模型對(duì)照組一般情況及食欲較差，懶動(dòng)，體毛疏松，易脫落，移植心存活時(shí)間(5.87±0.83)天。環(huán)孢素組進(jìn)食較少，皮毛無光澤。各蘇木組一般情況逐日好轉(zhuǎn)，進(jìn)食及活動(dòng)量逐漸增加。環(huán)孢素組與各蘇木組移植心存活時(shí)間均超過11天。
三.移植心肌組織病理學(xué)改變模型對(duì)照組心臟腫大，呈花斑狀，質(zhì)硬色暗，心室肌切面可見心臟壁增厚，松弛。4×鏡下可見心肌細(xì)胞水腫明顯，彌漫性大量淋巴細(xì)胞浸潤；40×鏡下可見心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，肌絲斷裂，間質(zhì)大量淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤，血管炎性病變，大量心肌細(xì)胞壞死。
環(huán)孢素組心臟表面光滑，色紅質(zhì)軟。4×鏡下可見心內(nèi)膜下見有局灶性淋巴細(xì)胞浸潤，周圍無明顯水腫。40×鏡下可見心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，肌絲無斷裂，部分心肌橫紋模糊。間質(zhì)少量淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤，無心肌壞死。
蘇木各組心臟表面光滑紅潤，質(zhì)地柔軟，體積略有增大。4×鏡下可見心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)輕微改變，有彌漫性淋巴細(xì)胞細(xì)胞浸潤。40×鏡下可見部分心肌橫紋模糊或消失，間質(zhì)少量淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤，個(gè)別心肌細(xì)胞壞死。各組移植心臟排斥反應(yīng)病理組織學(xué)分級(jí)見表3表3移植心臟排斥反應(yīng)病理組織學(xué)分級(jí)

注與對(duì)照組比較△P＜0.01，與環(huán)孢素組比較#P＞0.05。
從表3中可以看出，環(huán)孢素組和各蘇木組的病理改變情況與模型組相比具有顯著性差異(P＜0.05)，環(huán)孢素組與各蘇木組相比差異無顯著性(P＞0.05)，其中蘇木乙酸乙酯組病理片提示排斥反應(yīng)最輕。
2.各組心肌組織FasL mRNA相對(duì)量表達(dá)水平(見表4)表4各組心肌組織FasL mRNA相對(duì)量表達(dá)水平比較

注與對(duì)照組比較△P＜0.01從表4中可以看出，環(huán)孢素組和各蘇木組FasL mRNA相對(duì)量表達(dá)水平與模型組相比具有顯著性差異(P＜0.05)，環(huán)孢素組與各蘇木組相比差異無顯著性，(P＞0.05)。其中蘇木乙酸乙酯組FasL mRNA相對(duì)量表達(dá)水平較蘇木乙醇組、水提組低。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論1.大鼠同種異位心臟移植模型是研究心臟移植急性排斥反應(yīng)理想的動(dòng)物模型。
2.蘇木乙酸乙酯提取物可延長心臟移植供心的存活時(shí)間，對(duì)心肌損傷具有一定的保護(hù)作用。
3.蘇木乙酸乙酯提取物可明顯抑制移植心肌中FasL mRNA的表達(dá)水平，在某種程度上抑制細(xì)胞毒細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷進(jìn)程，具有一定的抗免疫排斥作用。
4.蘇木乙酸乙酯提取物可能是一種很有前途的具有免疫抑制作用的新藥。
實(shí)施例實(shí)施例1煎煮法將蘇木粗粉，過40目篩，用8倍量的水浸泡4h，連續(xù)回流提取，兩液合并，將濾液濃縮，每次2h，過濾，將濾液濃縮至相對(duì)密度1.00-1.05，用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，體積比為乙酸乙酯∶水＝1∶1，用力振搖后，靜止2小時(shí)，分出上層乙酸乙酯層，連續(xù)萃取3次，合并乙酸乙酯層，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓回收乙酸乙酯，溫度為40℃，濃縮液放入真空干燥箱中減壓干燥至恒重，溫度為40℃，得到乙酸乙酯提取物干粉；實(shí)施例2超聲振蕩提取將蘇木粗粉，過40目篩，用8倍量的75％乙醇浸泡2h，連續(xù)超聲振蕩提取兩次，＜50℃每次2h，過濾，將濾液合并，減壓回收乙醇，并干燥至恒重，制成75％乙醇提取物；取75％乙醇提取物，研磨至細(xì)粉，過80目篩，水混懸后用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，體積比為乙酸乙酯∶水＝1∶1，用力振搖后，靜止2小時(shí)，分出上層乙酸乙酯層，連續(xù)萃取3次，合并乙酸乙酯層，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓回收乙酸乙酯，溫度為40℃，濃縮液放入真空干燥箱中減壓干燥至恒重，溫度為40℃；得到乙酸乙酯提取物干粉；
實(shí)施例3滲漉法將蘇木粗粉，過40目篩，用75％乙醇連續(xù)滲漉提取，收集滲漉液，減壓回收乙醇，并干燥至恒重，制成75％乙醇提取物；取75％乙醇提取物，研磨至細(xì)粉，過80目篩，，水混懸后用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，體積比為乙酸乙酯∶水＝1∶1，用力振搖后，靜止2小時(shí)，分出上層乙酸乙酯層，連續(xù)萃取3次，合并乙酸乙酯層，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓回收乙酸乙酯，溫度為40℃，濃縮液放入真空干燥箱中減壓干燥至恒重，溫度為40℃；得到乙酸乙酯提取物干粉；實(shí)施例4蘇木粗粉，過80目篩；SFE條件萃取罐溫度40℃，萃取壓力15MPa，CO2流量25m2/h，萃取時(shí)間2.5h，夾帶劑為95％乙醇比例不超過15％。減壓干燥。將提取物研磨至細(xì)粉(過80目)，水混懸后用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，體積比為乙酸乙酯∶水＝1∶1，用力振搖后，靜止2小時(shí)，分出上層乙酸乙酯層，連續(xù)萃取3次，合并乙酸乙酯層，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓回收乙酸乙酯，溫度為40℃，濃縮液放入真空干燥箱中減壓干燥至恒重，溫度為40℃，得到乙酸乙酯萃取物干粉。
權(quán)利要求
1.一種蘇木的乙酸乙酯提取物的制備方法，其特征在于該方法包括下述四種方法(1)煎煮法將蘇木粗粉，過40目篩，用8倍量的水浸泡4h，連續(xù)回流提取，兩液合并，將濾液濃縮，每次2h，過濾，將濾液濃縮至相對(duì)密度1.00-1.05，用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，體積比為乙酸乙酯∶水＝1∶1，用力振搖后，靜止2小時(shí)，分出上層乙酸乙酯層，連續(xù)萃取3次，合并乙酸乙酯層，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓回收乙酸乙酯，溫度為40℃，濃縮液放入真空干燥箱中減壓干燥至恒重，溫度為40℃，得到乙酸乙酯提取物干粉。(2)超聲振蕩提取將蘇木粗粉，過40目篩，用8倍量的75％乙醇浸泡2h，連續(xù)超聲振蕩提取兩次，＜50℃每次2h，過濾，將濾液合并，減壓回收乙醇，并干燥至恒重，制成75％乙醇提取物。取75％乙醇提取物，研磨至細(xì)粉，過80目篩，水混懸后用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，體積比為乙酸乙酯∶水＝1∶1，用力振搖后，靜止2小時(shí)，分出上層乙酸乙酯層，連續(xù)萃取3次，合并乙酸乙酯層，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓回收乙酸乙酯，溫度為40℃，濃縮液放入真空干燥箱中減壓干燥至恒重，溫度為40℃；得到乙酸乙酯提取物干粉。(3)滲漉法將蘇木粗粉，過40目篩，用75％乙醇連續(xù)滲漉提取，收集滲漉液，減壓回收乙醇，并干燥至恒重，制成75％乙醇提取物；取75％乙醇提取物，研磨至細(xì)粉，過80目篩，，水混懸后用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，體積比為乙酸乙酯∶水＝1∶1，用力振搖后，靜止2小時(shí)，分出上層乙酸乙酯層，連續(xù)萃取3次，合并乙酸乙酯層，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓回收乙酸乙酯，溫度為40℃，濃縮液放入真空干燥箱中減壓干燥至恒重，溫度為40℃；得到乙酸乙酯提取物干粉。(4)超臨界萃取法蘇木粗粉，過80目篩；SFE條件萃取罐溫度40℃，萃取壓力15MPa，CO2流量25m2/h，萃取時(shí)間2.5h，夾帶劑為95％乙醇比例不超過15％。減壓干燥。將提取物研磨至細(xì)粉(過80目)，水混懸后用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，體積比為乙酸乙酯∶水＝1∶1，用力振搖后，靜止2小時(shí)，分出上層乙酸乙酯層，連續(xù)萃取3次，合并乙酸乙酯層，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓回收乙酸乙酯，溫度為40℃，濃縮液放入真空干燥箱中減壓干燥至恒重，溫度為40℃，得到乙酸乙酯萃取物干粉。
2.一種如權(quán)利要求1所述的制備方法制成的蘇木的乙酸乙酯提取物。
3.如權(quán)利要求2所述的蘇木的乙酸乙酯提取物在制備抗免疫抑制的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種蘇木乙酸乙酯提取物，該提取物在抗免疫抑制方面有很好的效果。將中藥蘇木用乙酸乙酯進(jìn)行提取，得到其乙酸乙酯提取物，經(jīng)過大量試驗(yàn)研究證明，該提取物能夠顯著消除器官移植所產(chǎn)生的免疫排斥反應(yīng)。
文檔編號(hào)A61P37/00GK1785227SQ20041004411
公開日2006年6月14日 申請(qǐng)日期2004年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月9日
發(fā)明者周亞濱 申請(qǐng)人:周亞濱, 王振月