專利名稱：接種有用于治療糖尿病的產(chǎn)胰島素細(xì)胞的可植入式囊的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及接種有用于治療糖尿病的胰島素分泌細(xì)胞的可植入式囊。特別地，本發(fā)明提供含有用于載有治療糖尿病的胰島素分泌細(xì)胞的開口的可植入式多孔囊，該開口隨后可被封閉，如果需要，則密封。
背景技術(shù)：
胰腺組織由三部分組成外分泌部、內(nèi)分泌部和導(dǎo)管。內(nèi)分泌胰腺包括負(fù)責(zé)分泌四種特殊激素的胰島細(xì)胞，這樣的胰島由四種不同細(xì)胞類型組成α、β、δ和多肽細(xì)胞，它們分別產(chǎn)生高血糖素、胰島素、生長抑素和胰多肽。據(jù)涉及內(nèi)分泌細(xì)胞鑒定的現(xiàn)有技術(shù)，已經(jīng)鑒定出了數(shù)個在β細(xì)胞發(fā)育過程中很重要的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，包括Pdx1、Ngn3、Hlxb9、Nkx6、Isl1、Pax6、Neurod、Hnfla、Hnf6及其它。例如，參見Nature Reviews Genetics，Vol3，524～632，2002。
內(nèi)分泌胰腺的一種常見疾病，糖尿病(diabetes mellitus，DM)，是由β細(xì)胞破壞(I型DM)或肌肉或脂肪組織對胰島素不敏感(II型DM)造成的?，F(xiàn)有治療I型和II型DM的方法包括飲食治療、運(yùn)動、口服型降糖劑、胰島素注射、胰島素泵療法，以及完整胰腺或胰島移植。
最常見的治療方法包括每天注射外源胰島素，如豬、?；蛉艘葝u素。病人通常遵循包括血糖水平自我監(jiān)控的方案，此時，胰島素的注射根據(jù)基于這一血液分析結(jié)果制定的計(jì)劃進(jìn)行。
另一種不太常見的治療方法是移植整個胰腺器官。這樣的整個成熟胰腺的移植是技術(shù)復(fù)雜的大手術(shù)，并需要大膽使用免疫抑制劑以避免對新移植器官的排斥。這些器官主要獲得自死亡的人供體，尸體胰腺的有限可獲得性限制了該方法的廣泛使用。
移植領(lǐng)域中，許多人建議從殘余胰腺組織中分離分泌胰島素的胰島將會比較有利。這些益處包括由于移植的組織塊較小而需要較少的侵入性外科手術(shù)。此外，可以提高免疫操作、移植物工程化的使用。
直到近期，由于對胰島的強(qiáng)烈免疫排斥胰島移植還不成功。近期的報道(N.Eng.J. Med.343230-238，2000；Diabetes，50710-719，2001)表明無糖皮質(zhì)激素免疫抑制方案明顯有益于脆弱的I型糖尿病的病人。然而，采用這種治療方法的病人易于出現(xiàn)腎臟并發(fā)癥、口腔潰瘍，并需要大量胰島(～9000胰島當(dāng)量/kg病人體重)以誘導(dǎo)血糖量正常。因此，人們已經(jīng)付出大量努力來設(shè)計(jì)避免大劑量免疫抑制劑并可利用商業(yè)活性胰島細(xì)胞的胰島細(xì)胞移植策略。由此產(chǎn)生了免疫隔離的概念(Diabetologia，45159-173，2002)，這一概念包括用選擇性透性膜屏蔽胰島。該膜允許諸如營養(yǎng)素、氧、葡萄糖和胰島素的小分子通過，但限制更大的體液免疫分子和免疫細(xì)胞通過。理論上，人們可以利用免疫隔離裝置和豐富的動物，例如豬，的胰島細(xì)胞來源治療DM。然而，實(shí)踐中由于裝置纖維變性、裝置有限的氧供應(yīng)以及導(dǎo)致胰島丟失的小體液免疫分子的透過使得這一方法在大動物模型或醫(yī)療中都沒有獲得成功，另一免疫隔離的備選方法是通過在哺乳動物(US5849285，US6149907，US5958404)的非睪丸部位移植支持細(xì)胞來創(chuàng)造免疫豁免部位。這一部位允許隨后的產(chǎn)胰島素胰島的移植。免疫豁免部位允許人或動物來源的胰島的移植。此方法的一個缺陷是，移植的支持細(xì)胞和胰島細(xì)胞并非被物理限制于移植部位。這會導(dǎo)致這些細(xì)胞向不希望的組織部位遷移。如果胰島從支持細(xì)胞遷移就可能最終導(dǎo)致由于喪失支持細(xì)胞免疫抑制效應(yīng)而使胰島丟失，因?yàn)楫?dāng)胰島處于與之最接近的位置時支持細(xì)胞創(chuàng)造的免疫豁免環(huán)境才是最有效的。
近來出現(xiàn)的組織工程為糖尿病的治療提供了備選方法。為開發(fā)最終可以恢復(fù)或者提高組織功能的生物替代物，組織工程策略已經(jīng)開發(fā)了對不同生物材料與細(xì)胞和/或生長因子組合的利用。例如，支架材料已經(jīng)被廣泛研究用作可用于組織修復(fù)的組織導(dǎo)板、導(dǎo)管、阻擋物和儲器。尤其，泡沫、海綿、膠、水凝膠、紡織和非紡織形式的合成和天然材料已經(jīng)被用于體外和體內(nèi)重建和/或再生生物組織，以及運(yùn)送誘導(dǎo)組織生長的趨化劑(US5770417，US6022743，US5567612，US5759830)。
對支架的一個關(guān)鍵要求是在接種到支架上后細(xì)胞的保持。迄今為止，支架已經(jīng)被構(gòu)建成為在其上接種細(xì)胞，例如胰島，的替代物質(zhì)。盡管傳統(tǒng)的多孔基質(zhì)，如聚乙醇酸非紡織或聚乳酸泡沫，具有不太大或不太小的孔大小以充分保持胰島或胰島類似結(jié)構(gòu)。
對載有胰島素分泌細(xì)胞支架的另一個關(guān)鍵要求是可以獲得允許重要營養(yǎng)物交換和高氧壓維持的功能性微血管床。因此，仍需要可以接種大量胰島素生產(chǎn)細(xì)胞、植入后保持大多數(shù)細(xì)胞并為細(xì)胞存活提供血管環(huán)境的三維結(jié)構(gòu)。本發(fā)明中的可生物降解結(jié)構(gòu)提供了這樣一種三維多孔基質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及可植入式囊，其適于在包含胰島素生產(chǎn)細(xì)胞的多種哺乳動物細(xì)胞的接種及隨后的植入中使用。在一個優(yōu)選方式中，囊壁是生物相容的，由用生物相容性網(wǎng)加固的泡沫基質(zhì)組成。使用中，囊內(nèi)腔載有胰島素分泌細(xì)胞懸浮液。包埋網(wǎng)的生物相容性基質(zhì)優(yōu)選為多孔、聚合泡沫，優(yōu)選由凍干法制成。該結(jié)構(gòu)也可在導(dǎo)入胰島素分泌細(xì)胞前提供血管床。囊內(nèi)腔可用生物相容性塞(plug)填充以限制組織向內(nèi)腔生長，植入臨床相關(guān)位點(diǎn)稍晚時間后去除該塞并向囊內(nèi)腔注射胰島素分泌細(xì)胞。該囊任選地載有一種或多種生物活性化合物或水凝膠。囊壁優(yōu)選由玻璃化溫度低于生理溫度的聚合物制成，以使囊植入軟組織中時將刺激最小化。
本發(fā)明的結(jié)構(gòu)也可用作運(yùn)送細(xì)胞分泌的生物因子或合成藥物分子的載體。這些藥劑能指導(dǎo)生長因子、蛋白質(zhì)、細(xì)胞因子的上調(diào)或下調(diào)，或其它細(xì)胞類型的增殖。將囊植入患病哺乳動物之前或之后，可將大量細(xì)胞接種在這樣的囊上。


圖1顯示本發(fā)明的可植入式囊的一個實(shí)施方式的透視圖。
圖2是根據(jù)實(shí)施例1所述方法制備的本發(fā)明囊支架的一個實(shí)施方式的掃描電鏡圖。
圖3是此處所述可植入式囊的制備方法的一個實(shí)施方式的透視圖。
在此公開用于糖尿病治療的可植入式組織支架囊。圖1提供了該可植入組織支架囊的透視圖?？芍踩胧侥?由環(huán)繞內(nèi)腔5的壁2組成。壁2優(yōu)選由多孔泡沫基質(zhì)3組成，更優(yōu)選基質(zhì)3由網(wǎng)4加固。內(nèi)腔具有至少1×10-3cm3的容量。優(yōu)選至少0.1cm3。除了植入部位外，胰島素生成細(xì)胞的數(shù)量和大小支配囊1的大小。多孔囊1一般具有縱軸，橫界面可以是圓形、橢圓或多邊形。優(yōu)選便于制備的是橢圓形橫截面。
圖1顯示一個由兩個矩形片組成的、三邊密封一端開口的囊。顯然，根據(jù)圖1所示，由壁2構(gòu)成一個腔以形成一個足夠放置胰島或胰島樣細(xì)胞的空腔。因此，囊可以由一片或者多片構(gòu)成并以適合的方式密封在一起。
囊1的壁2包含約0.1至約500微米，優(yōu)選約5至約400微米的孔6?？芍踩胧侥?的腔5用水凝膠，或包含細(xì)胞懸浮液的基質(zhì)，或在移植后稍晚可以用細(xì)胞懸浮液替換的、由非降解材料的非多孔密實(shí)片填充。
壁2的泡沫組分3優(yōu)選為具彈性的，孔大小為5～400μm。泡沫3可以載有生物活性或藥學(xué)活性化合物(例如，細(xì)胞因子(例如，白細(xì)胞介素1-18；干擾素α、β和γ；生長因子；菌落刺激因子，趨化因子等)、非細(xì)胞因子白細(xì)胞趨化劑(chemotactic agent)(例如，C5a，LTB4，等)、吸附因子、基因、肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、抗炎劑、抗凋亡劑、碳水化合物或合成分子。
在優(yōu)選實(shí)施方式中，壁2的加固組分4可由任何可吸收或不可吸收的生物相容性材料組成，包括紡織、針織、卷曲編織(即，花邊狀)、非紡織和編成麻花狀的結(jié)構(gòu)。在示例實(shí)施方式中，加固組分4具網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。
上述任一結(jié)構(gòu)中，材料的機(jī)械性質(zhì)可通過改變材料的密度或紋理、或在材料中包埋顆粒來改變。用于制造加固組分4的纖維可以是纖維的單絲、紗、線、辮或束。這些纖維可由生物相容性材料，包括可生物吸收的材料例如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己內(nèi)酯(PCL)、聚二噁烷酮(PDO)、三亞甲基碳酸酯(TMC)、聚乙烯基醇(PVA)、共聚物或其混合物。在一個實(shí)施方式中，纖維是由聚乙醇酸和聚乳酸以95∶5的摩爾比的共聚物制成。在另一個實(shí)施方式中，纖維由100％的PDO聚合物形成。
可植入式囊1的壁2由可吸收或不可吸收的生物相容性材料制成。壁2優(yōu)選由柔韌的生物相容性材料制成，從而將對病人的刺激最小化。優(yōu)選壁2由玻化溫度低于生理溫度的聚合物或聚合物混合物制成?？蛇x的是，囊可以由混合了能使其柔韌的增塑劑的聚合物制成。
多種生物相容性可吸收或不可吸收材料可用于制備泡沫組分3。適合的不可吸收材料包括但不限于，聚酰胺，聚酯(如，聚對苯二甲酸乙二酯，聚苯二甲酸丁酯，共聚物及其混合物)，含氟聚合物(如，聚四氟乙烯，聚偏1，1-二氟乙烯，共聚物及其混合物)，聚烯烴，聚乙烯基樹脂(如，聚苯乙烯，聚乙烯基吡咯烷酮，等)及其混合物。
多種可生物吸收性聚合物可以被用于制備本發(fā)明的壁2。適合的生物相容性和可生物吸收性聚合物的例子包括但不限于選自以下的聚合物脂肪族聚酯、聚(氨基酸)、共聚(醚-酯)、聚亞烷草酸鹽、聚酰胺、酪氨酸衍生的聚碳酸酯、聚(亞氨基碳酸鹽)、聚原酸酯、polyoxaesters、聚酰胺酯、含胺基團(tuán)的polyoxaesters、聚酐、聚磷腈、生物分子(即，生物聚合物例如膠原、彈性蛋白、可生物吸收的淀粉，等)及其混合物。
本發(fā)明中特別適用的生物相容性可吸收聚合物選自下列物質(zhì)脂肪族聚酯、共聚物和混合物，它們包括但不限于交酯均聚物和共聚物(包括D-、L-乳酸和D-、L-內(nèi)消旋丙交酯)、乙交酯(包括乙醇酸)、oxaesters、ε-己內(nèi)酯、p-二噁烷酮、烷基取代衍生的p-二噁烷酮(即，6，6-二甲基-1，4-二噁烷-2-酮、三亞甲基碳酸酯(1，3-二噁烷-2-酮)、烷基取代衍生的1，3-二噁烷酮、δ-戊內(nèi)酯、β-丁內(nèi)酯、γ-丁內(nèi)酯、ε-癸內(nèi)酯、羥丁酸(hydroxybutyrate)、羥戊酸(hydroxyvalerate)、1，4-二氧雜環(huán)庚-2-酮(1，4-dioxepan-2-one)及其二聚體1，5，8，12-四氧雜環(huán)十四烷-7，14-二酮、1，5-二氧雜環(huán)庚-2-酮(1，5-dioxepan-2-one)、及其聚合物混合物。
壁2的加固成分4優(yōu)選由丙交酯和乙交酯組成，此處有時候單純指丙交酯和乙交酯的均聚物和共聚物，以及乙交酯和ε-己內(nèi)酯的共聚物，最優(yōu)選用作網(wǎng)的是約80至約100重量％乙交酯和剩余為丙交酯形成的共聚物。更優(yōu)選的是約85至約95重量％乙交酯和剩余為丙交酯形成的共聚物。另一優(yōu)選聚合物是100％PDO。
優(yōu)選的泡沫組分3為乙交酯、丙交酯、聚二噁烷酮和ε-己內(nèi)酯的均聚物、共聚物或混合物。更優(yōu)選的是乙交酯和己內(nèi)酯的共聚物。最優(yōu)選的是乙交酯∶己內(nèi)酯為65∶35的共聚物。
此處，所用術(shù)語“乙交酯”應(yīng)理解為包括聚乙醇酸。進(jìn)一步，術(shù)語“丙交酯”應(yīng)理解為包括L-丙交酯、D-丙交酯，及其混合物，以及乳酸聚合物和共聚物。
特別理想的組合物包括一種由約35至約45重量％的ε-己內(nèi)酯和約55至約65重量％的乙交酯、丙交酯(或乳酸)及其混合物形成的彈性共聚物。另一特別理想的組合物包括p-二噁烷酮均聚物，或包含約0至約80重量％p-二噁烷酮和約0至約20重量％丙交酯或乙交酯及其組合形成的共聚物。膜在體內(nèi)的降解時間優(yōu)選長于1個月但短于6個月，且更優(yōu)選長于1個月但短于4個月。
本發(fā)明使用的聚合物的分子量可以在本領(lǐng)域公知的范圍內(nèi)變化以提供令人滿意的特性。然而，優(yōu)選脂肪族聚酯具有可以使得25℃下在0.1g/dl六氟異丙醇溶液中測量時特性粘度介于約0.5至約5.0分升每克(dl/g)，優(yōu)選約0.7和3.5分升每克(dl/g)，的分子量。
或者，壁2的加固組分4可以是非紡織支架。該非紡織支架可由濕涂(wet-lay)或干涂(dry-lay)技術(shù)制成。用另一可生物降解的聚合物及使用熱處理方法將組織支架囊1的非紡織支架的纖維融熔，可以進(jìn)一步增強(qiáng)組織支架囊1的纖維非紡織支架的結(jié)構(gòu)完整性。例如，可以將可生物吸收的熱塑性聚合物或共聚物，例如粉末狀的聚己內(nèi)酯(PCL)，加入非紡織支架之后進(jìn)行溫和的熱處理，熔化PCL顆粒但不影響纖維結(jié)構(gòu)。該粉末具有低熔點(diǎn)，且在隨后的過程中作為粘合劑起作用，以提高非紡織支架抗張強(qiáng)度和剪切強(qiáng)度。優(yōu)選PCL顆?；勰┐笮〉闹睆椒秶?0～500μm，更優(yōu)選直徑為10～150μm。附加的粘合劑包括可生物降解的聚合粘合劑，選自聚乳酸、聚二噁烷酮和聚乙醇酸或其組合物。
或者，非紡織支架中的纖維可通過噴霧或?qū)⒃摲羌徔椫Ъ苡昧硪环N可生物降解的聚合物浸涂融在一起。
包繞本發(fā)明囊1的腔5的泡沫3可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過各種公知技術(shù)制備。例如，聚合起始材料可由凍干法形成泡沫、超臨界溶劑發(fā)泡、注氣擠壓、用可抽提的材料注氣成型或鑄造(如，鹽、糖或類似的合適材料)。
一種實(shí)施方式中，囊1的泡沫部分3可經(jīng)由聚合物-溶劑相分離技術(shù)制備，例如凍干法制備。然而一般地，聚合物溶液可由下列四種技術(shù)中的任一種分離為兩相(a)熱誘導(dǎo)的凝膠化/結(jié)晶化；(b)非溶劑誘導(dǎo)的溶劑相與聚合物相的分離；(c)化學(xué)誘導(dǎo)的相分離；和(d)熱誘導(dǎo)的旋節(jié)線分解。聚合物溶液以兩個清晰相或兩個雙連續(xù)相的控制方式進(jìn)行分離。隨后溶劑相的去除通常留下密度小于本體聚合物的多孔結(jié)構(gòu)，孔徑在微米范圍內(nèi)。
制備壁2的泡沫成分3所涉及的步驟包括，為用于待凍干的聚合物選擇合適的溶劑以及制備在溶液中的聚合物的均質(zhì)溶液。然后對聚合物溶液實(shí)施冷凍和真空干燥循環(huán)。冷凍步驟相-分離聚合物溶液，真空干燥步驟通過升華和/或干燥去除溶劑，這樣就留下多孔聚合物結(jié)構(gòu)，或互相連接的開放細(xì)胞多孔泡沫。
可以用作制備泡沫支架組分3的適宜溶劑包括但不限于，四氫呋喃(THF)、二亞甲基氟化物(DMF)、和聚二噁烷酮(PDO)、p-二甲苯、N-甲基吡咯烷酮、二甲基甲酰胺、氯仿、1，2-二氯甲烷、二甲亞砜及其混合物。這些溶劑中，一種優(yōu)選溶劑是1，4-二噁烷酮。用常規(guī)技術(shù)制備聚合物在溶劑中的均質(zhì)溶液。
適用的聚合物濃度或使用的溶劑量隨各系統(tǒng)而不同。通常，溶液中聚合物量取決于一些因素，如聚合物在給定溶劑中的溶解度及在泡沫支架中的最終特性，其范圍從約0.01％至約90重量％，優(yōu)選地，從重量范圍從約0.05％至約30重量％。
如果使用了網(wǎng)狀加固材料4，其將被置于兩個薄(如，0.4mm)墊片(shims)之間；其應(yīng)當(dāng)以水平方向被置于模具中的合適深度處。在兩張展開的網(wǎng)層之間放置具有與囊1所需相同橫截面區(qū)域的金屬或Teflon插片。以允許氣泡從網(wǎng)狀部分之間溢出的方式灌注聚合物溶液。優(yōu)選地，模具以合適的角度傾斜且應(yīng)當(dāng)以最能阻止氣泡形成的控制速率進(jìn)行灌注。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道許多變量控制傾斜角度和灌注速率。通常，模具應(yīng)當(dāng)以大于約1度的角度傾斜以避免氣泡形成。此外，灌注速率應(yīng)當(dāng)慢到使任何氣泡能從模具中溢出，而不是困在模具中。
如果網(wǎng)狀材料被用于加固組分4，網(wǎng)狀開孔的密度是一個最終具有令人滿意機(jī)械性質(zhì)的組織移植物形成過程中的重要因素。優(yōu)選低密度或開放編結(jié)的網(wǎng)狀材料。一個特別優(yōu)選的材料是PGA/PLA為90/10的共聚物，出售商標(biāo)名為VICRYL(Ethicon，Inc.，Somerville，NJ)。作為示例的一個低密度、開放編織網(wǎng)是編織的VICRYL VKM-M，可從Ethicon Inc.Somerville，NJ購得。其它的適于用在囊中的編織或紡織網(wǎng)狀材料是PLA/PGA為95/5的共聚物，以商品名稱PANACRYL出售(Ethicon，Inc.，Somerville，NJ)，或100％PDO聚合物。
載入囊1的腔5的哺乳動物細(xì)胞可從包括胰腺的外分泌部、內(nèi)分泌部和導(dǎo)管成分的胰腺組織中分離?；蛘撸兴榈囊认俳M織或?qū)Ч芷我部梢员惠d入囊1的腔5。此外，細(xì)胞可以在常規(guī)培養(yǎng)條件中培養(yǎng)以擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)量，之后從培養(yǎng)平板上除去細(xì)胞并在植入前將其給予裝置中。或者，分離的細(xì)胞可以直接注入囊1然后于體內(nèi)植入前在具適宜生物基質(zhì)的促進(jìn)增殖及沉積的條件下培養(yǎng)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，分離的細(xì)胞直接注入囊1，在體內(nèi)植入前不經(jīng)進(jìn)一步體外培養(yǎng)。另一個實(shí)施方式中，細(xì)胞被接種于另一個多孔生物相容性基質(zhì)，例如非紡織墊、水凝膠或其組合，隨后置于囊的腔5中。
可用在本發(fā)明的結(jié)構(gòu)上接種或培養(yǎng)的細(xì)胞包括但不限于表達(dá)至少一種胰腺β細(xì)胞特征標(biāo)記物(characteristic marker)的細(xì)胞。細(xì)胞可于植入前接種于如本發(fā)明的囊的腔5中一小段時間(＜1天)，或在植入前培養(yǎng)更長時間(＞1天)以允許在囊1發(fā)生細(xì)胞增殖和基質(zhì)合成。
為治療疾病，如糖尿病(DM)，可將接種了細(xì)胞的支架囊1置于臨床便利的部位，例如皮下空隙、腸系膜、網(wǎng)膜。在此特定病例中，本發(fā)明的囊1于體內(nèi)移植至異位后將作為載體以將處理細(xì)胞限制于適當(dāng)?shù)奈恢谩?br> 以往通過注射至門脈循環(huán)來直接移植胰島的嘗試在對糖尿病的長期治療上已經(jīng)顯示出不足。此外，用可降解或不可降解微球包埋異源或異種β細(xì)胞的諸多方法也未能保持對血糖水平的長期控制。這些失敗都?xì)w因于脈管系統(tǒng)不足和/或?qū)σ浦惨葝u的免疫排斥。
這些失敗可以通過將異種或異源胰島素生產(chǎn)細(xì)胞與異源或異種支持細(xì)胞(Sertoli cells)，這些支持細(xì)胞有助于胰島存活及阻止對移植胰島的免疫反應(yīng)，組合給予來避免。異種、異源、或轉(zhuǎn)化的支持細(xì)胞可以在腎膜中自我保護(hù)同時免疫保護(hù)異源或異種胰島。
本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，囊1的壁2可以通過物理或化學(xué)方法修飾以包含促進(jìn)附著、增殖、分化、和錨定細(xì)胞(targeted cell)類型的基質(zhì)合成的生物或合成因子。此外，生物活性因子也可包含部分基質(zhì)，其用于因子的受控釋放以產(chǎn)生理想的生物功能。另一實(shí)施方式包括影響內(nèi)源生長因子上或下調(diào)的小分子的運(yùn)送。可與本發(fā)明基質(zhì)一起使用的生長因子、胞外基質(zhì)蛋白、及生物相關(guān)肽片段包括但不限于，TGF-β族成員，包括TGF-β1、2和3，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-2、-4、6、-12、-13和-14)，成纖維細(xì)胞生長因子-1和-2，血小板衍生生長因子-AA和-BB，血小板富集血漿，胰島素生長因子(IGF-I、II)生長分化因子(GDF-5、-6、-8、-10)，血管生長素(angiogen)，促紅細(xì)胞生成素(erythropoiethin)，胎盤生長因子，血管生成因子如血管內(nèi)皮細(xì)胞衍生生長因子(VEGF)，cathelicidins，防御素，高血糖素樣肽I(glucacgon-like peptide I)，exendin-4，多效素，內(nèi)皮素，甲狀旁腺激素，干細(xì)胞因子，集落刺激因子，結(jié)合腕蛋白-C，彈性蛋白原，凝血酶衍生肽，抗排斥劑，止痛劑，抗炎劑如對乙酰氨基酚(acetoaminophen)，抗凋亡劑，statins，細(xì)胞生長抑制劑如雷帕霉素和包含胞外基質(zhì)粘著蛋白，如纖連蛋白和玻璃粘連蛋白的細(xì)胞-和肝素-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的生物肽。生物因子可通過商業(yè)途徑、從組織分離和純化或化學(xué)合成獲得。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例以下實(shí)施例舉例說明用于向哺乳動物中植入細(xì)胞或細(xì)胞材料的囊的構(gòu)建。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能意識到，這些特定實(shí)施例不限制本發(fā)明的范圍，而且也可以在本發(fā)明范圍內(nèi)產(chǎn)生多種囊1的其它形式。
實(shí)施例1一種可植入式囊的制備制備待凍干于囊中的聚合物溶液。用于生成泡沫組分的聚合物是Birmingham Polymers Inc.(Birmingham，AL)公司生產(chǎn)的由35％PCL和65％PGA(35/65 PCL/PGA)形成的共聚物，30℃下于HFIP中測定該聚合物的I.V.為1.79dL/g。以95/5的重量比稱量1，4-二噁烷/(35/65 PCL/PGA)。將聚合物與溶劑置于長頸瓶中，依次于70℃下水浴并攪拌5小時。用抽提套管(超大孔徑，型號ASTM170-220(EC))過濾溶液并于長頸瓶中保存。
用壓鑄模于80℃下2分鐘，將由聚乙醇酸/聚乳酸(PGA/PLA)為90/10的共聚物形成的加固網(wǎng)狀材料編結(jié)(代碼VKM-M)制成的網(wǎng)熨平。制備該網(wǎng)后，將0.4mm的墊片置于15.3×15.3cm的鋁模每端，并調(diào)整兩個網(wǎng)的大小以制備合適的囊大小。如圖3所示在框架A和框架B之間拉伸兩個網(wǎng)層彼此的頂端，然后將該復(fù)合體置于墊片上以使網(wǎng)能夠懸浮于將要加入的溶液中。將具有與所需囊的開口(0.4×8.0或0.4×4.0mm2)對應(yīng)橫截面區(qū)域的金屬或Teflon插件置于兩片展開的網(wǎng)層之間。將加熱至50℃的聚合物溶液從側(cè)面緩慢注入直至上層網(wǎng)已經(jīng)被全部覆蓋。約有60ml聚合物被緩慢倒入模具中，確保溶液在模具中得到良好分散。隨后將模具置于Virtis，F(xiàn)reeze Mobile G凍干儀的擱架上。本實(shí)施例中的凍干程序是(1)-17℃60分鐘；(2)-5℃，100mT真空，60分鐘；(3)5℃，20mT真空，60分鐘；(4)20℃，20mT真空，60分鐘。
圖1顯示去除插件后最終獲得的囊，包含包繞囊內(nèi)腔的加固泡沫3，然后除去插件。圖2描繪的是囊橫截面的電鏡掃描圖(SEMs)。SEM清楚的顯示了囊內(nèi)部凍干的加固泡沫支架。之后將裝配模具從冷凍機(jī)中取出置于氮盒中過夜。完成這一過程后，將包含可去除插件的泡沫/網(wǎng)片的形式的模具中小心剝出。插件可以在載入細(xì)胞及體內(nèi)植入前去除或在移植后稍晚時去除。后一種情況下，細(xì)胞緊接著插件的去除載入囊內(nèi)腔。
實(shí)施例2一種可植入式囊的制備如實(shí)施例1所述方法制備一種可生物降解的囊，除了紡織Vicryl(代碼VWM-M)，使用由聚乙醇酸/聚乳酸(PGA/PLA)為90/10的共聚物形成的加固網(wǎng)狀材料。
實(shí)施例3一種可植入式囊的制備如實(shí)施例1所述方法制備一種可生物降解的囊，除了使用編織加固網(wǎng)狀材料，該材料由100％PDS形成。
實(shí)施例4帶有哺乳動物細(xì)胞的可植入式組織支架本實(shí)施例舉例說明本發(fā)明所述囊內(nèi)腔中鼠科動物胰島的接種。
經(jīng)膠原酶消化胰腺、Ficoll密度梯度離心及之后人工收集胰島自Balb/c小鼠分離獲得鼠科動物胰島。
如實(shí)施例1所述制備囊，并接種入500個新鮮胰島，于添加了牛血清蛋白(0.5％)、煙酰胺(10mM)、D-葡萄糖(10mM)、L-谷氨酰胺(2mM)、IBMX(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，50mM)和青霉素/鏈霉素的Hams-F10(Gibco LifeTechnologies，Rockville，MD)中培養(yǎng)1周。一周后，用鈣黃綠素和乙啡啶二聚體(Molecular Probes，Oregon)對囊中定植的胰島染色以檢測接種細(xì)胞的活力。大部分胰島對鈣黃綠素染色呈陽性表明囊內(nèi)腔中存在活性細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.適于植入并適于用于疾病治療的囊，包含生物相容性壁和腔，其中，壁具有多個大小合適的孔以允許特定大小的細(xì)胞和營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)和出而不允許大于該特定大小的細(xì)胞進(jìn)和出。
2.權(quán)利要求1的囊，其中的疾病是糖尿病。
3.權(quán)利要求2的囊，其中孔大小為約0.1至約500微米。
4.權(quán)利要求3的囊，其中孔大小為約5至約400微米。
5.權(quán)利要求1的囊，其中腔具有至少約1×10-3cm3的容量。
6.權(quán)利要求5的囊，其中腔具有至少約0.1cm3的容量。
7.權(quán)利要求1的囊，進(jìn)一步包含加固組分。
8.權(quán)利要求7的囊，其中加固組分是網(wǎng)。
9.權(quán)利要求1的囊，其中壁是生物相容性材料。
10.權(quán)利要求1的囊，其中壁包含泡沫材料。
11.權(quán)利要求10的囊，其中泡沫是用生物相容性活性劑浸透。
12.適于植入并適于用于糖尿病治療的囊，包含生物相容性壁和腔，其中，壁具有多個大小合適的孔以允許特定大小的細(xì)胞和營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)和出而不允許大于該特定大小的細(xì)胞進(jìn)和出，且腔中充滿包含胰島素生產(chǎn)細(xì)胞的材料。
13.權(quán)利要求13的囊，其中腔還包含支持細(xì)胞。
14.制備適于植入并適于用于疾病治療的囊的方法，其中的囊包含生物相容性壁和腔、其中的壁具有多個大小合適的孔以允許特定大小的細(xì)胞和營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)和出而不允許大于該特定大小的細(xì)胞進(jìn)和出，方法包含選擇聚合物、凍干聚合物、使得到的凍干的聚合物形成于封套中。
15.權(quán)利要求14的方法，其中聚合物是泡沫。
16.權(quán)利要求15的方法，其中聚合物是乙交酯、丙交酯、聚二噁烷酮和ε-己內(nèi)酯的均聚物、共聚物、或混合物。
17.權(quán)利要求16的方法，其中聚合物是乙交酯和己內(nèi)酯的共聚物。
18.權(quán)利要求14的方法，進(jìn)一步包含形成與壁相鄰的網(wǎng)加固組分。
19.權(quán)利要求18的方法，其中網(wǎng)加固組分是丙交酯和乙交酯或乙交酯和ε-己內(nèi)酯的均聚物或共聚物。
20.權(quán)利要求19的方法，其中網(wǎng)加固組分由約80重量％至100重量％乙交酯，其余為丙交酯。
全文摘要
一種可植入式囊及在哺乳動物中植入細(xì)胞或細(xì)胞材料的方法，包含加固多孔泡沫和腔。該腔包含移植前可以或不可以除去的插件。該腔中可載有至少一種表達(dá)至少一個哺乳動物胰腺β細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子的細(xì)胞類型。
文檔編號A61L27/56GK1569236SQ20041004517
公開日2005年1月26日 申請日期2004年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月2日
發(fā)明者A·列扎尼亞, M·齊默曼, R·M·加布里爾 申請人:生命掃描有限公司