專利名稱：一種牛分枝桿菌三聯(lián)核酸疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疫苗，特別涉及一種牛分枝桿菌三聯(lián)核酸疫苗。
背景技術(shù)：
結(jié)核病是一種人、畜共患的慢性消耗性傳染病。隨著愛滋病患者人數(shù)的增加、抗藥性菌株的產(chǎn)生等，結(jié)核病的發(fā)病率有逐年增加的趨勢。國外有關(guān)資料報(bào)導(dǎo)，目前世界上約有10-20億人口感染有結(jié)核桿菌，每年大約有3百萬人死于結(jié)核病，同時(shí)又有1000萬新病例出現(xiàn)。我國目前有上億人感染有結(jié)核分枝桿菌，結(jié)核病患者約600萬人，每年因治療不及時(shí)造成死亡的人數(shù)約25.6萬余人。如果不盡快改進(jìn)結(jié)核病的控制措施，將有2億多人發(fā)展成活動性肺結(jié)核。牛結(jié)核是家畜的一種慢性傳染病且能傳染給人。人、畜結(jié)核病的交叉?zhèn)鞑ナ窃斐山Y(jié)核病廣泛流行的重要原因，尤其是在畜牧業(yè)發(fā)達(dá)的地區(qū)，人、畜間結(jié)核病的交叉?zhèn)鞑ゲ粌H對人類的身體健康造成威脅，而且也影響著畜牧業(yè)的快速發(fā)展。世界范圍內(nèi)有5千萬牛感染有結(jié)核病，造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)30億美元。我國牛存欄數(shù)達(dá)到1億3千萬頭，牛結(jié)核病陽性率按2％計(jì)算，每頭按8000元計(jì)算，直接經(jīng)濟(jì)損失可達(dá)200億元人民幣以上。如果奶牛患有結(jié)核病，不但影響泌乳量和乳的營養(yǎng)成份，而且可通過各種途徑傳染給人。家畜中結(jié)核病的防治工作主要依靠PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)檢測，淘汰PPD陽性牛，沒有疫苗。因此，搞好牛結(jié)核病的防治工作最重要的是要研制成功合理有效的結(jié)核桿菌疫苗。
自Calmette和Guerin研究出卡介苗(BCG)之后，人類已將致弱的卡介苗用于預(yù)防結(jié)核病的感染。但卡介苗在世界許多地方使用效果不佳，尤其對成人的保護(hù)力容易喪失。對不同人群的保護(hù)效率不一致，一般為0-85％。因此，研制更全面有效的新疫苗是控制結(jié)核病的重要途徑?；蚬こ碳夹g(shù)為重組亞單位疫苗以及DNA疫苗的發(fā)展提供了一條新途徑，其中DNA疫苗兼有重組亞單位疫苗的安全性和減毒活疫苗誘導(dǎo)全面免疫應(yīng)答的高效力，已成為疫苗研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)之一(Bonato VLD，LimaVMF，Tascon R E，et al.Identification and Characterization of ProtectiveT Cells in hsp64 DNA-Vaccinated and Mycobacterium tuberculosi-Infected Mice.Infect.Immun.1998，66169-175)。
研究表明，結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白能刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生并誘導(dǎo)CD4+和CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。在結(jié)核病感染實(shí)驗(yàn)過程中，病人淋巴細(xì)胞早期識別的主要是一些分泌性蛋白，如Ag85復(fù)合體分布于大部分分枝桿菌中，其中Ag85B具有分枝酸轉(zhuǎn)移酶的活性，與分枝桿菌細(xì)胞壁的合成有關(guān)，并與人纖維連接蛋白結(jié)合后參與致病過程，在分枝桿菌分泌蛋白中含量占居首位，在一系列純化抗原試驗(yàn)中，該抗原的抗原性最強(qiáng)。MPT-83是一個(gè)附著在細(xì)胞表面促使抗原決定基暴露的脂化糖基化的蛋白(Wiker H G，uptyuioiloii S，Hewinson R G，RussellW P，and Harboe M.Heterogenous expression of the related MPB70 and MPB83proteins distinguish various substrains of Mycobacterium bovis BCG andMycobacterium tuberculosis H37Rv.Scand J.Immunol.1996，43374-380)。該蛋白還是一個(gè)從感染了M.bovis的牛身上發(fā)現(xiàn)的sero-dominant抗原，并且只在感染的T淋巴細(xì)胞內(nèi)可以檢測到，而在BCG免疫過的動物細(xì)胞中檢測不到(O’Loan CJ，Pollock J M，Hanna J，and Neill S D.Immunoblot analysis of humoral immuneresponses to Mycobacterium bovis in experimentally infected cattleearlyrecognition of a 26-kilodalton antigen.Clin.Diagn.Lab.Immunol.1994，1608-611；Vordermeier H M，Cockle P C，Whelan A，Rhodes S，Palmer N，BakkerD，and Hewinson R G.Development of diagnostic reagents to differentiatebetween Mycobacterium bovis BCG vaccination and M.bovis infection in cattle.Clin.Diagn.Lab.Immunol.1999，6675-682)。MPT64也為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體的組成部分。它為23KD的蛋白，存在于人結(jié)核分枝桿菌、強(qiáng)毒牛結(jié)核分枝桿菌和一些BCG疫苗的株系中(Oettinge T，Andersen A B，Cloning and B-Cell-epitopemapping of MPT64 from Mycobacterium tuberculosis H37Rv.Infection andImmunity.1994，622058-2064)。純化的天然MPT64能激發(fā)被結(jié)核分枝桿菌感染的老鼠和結(jié)核病人的T細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)。另外，天然的MPT64還能夠在結(jié)核分枝桿菌激活的豚鼠內(nèi)引發(fā)DTH反應(yīng)(Oettinger T，Holm A，Mtoni I M，et al.Mapping ofthe delayed-type hypersensitivity-inducing epitope of secreted protein MPT64from Mycobacterium tuberculosis.Infection and Immunity.1995，634613-4618)。因此，編碼這些蛋白的基因已成為核酸疫苗的首選對象。
國外有關(guān)結(jié)核分枝桿菌核酸疫苗的研究報(bào)道很多。1994年，Lowrie等人以麻風(fēng)分枝桿菌65kDa熱休克蛋白基因DNA疫苗免疫小鼠，結(jié)果表明DNA疫苗與卡介苗有相似的保護(hù)作用(Lowrie D B，Tascon R E，Colston M J，et al.Towards a DNAvaccine against tuberculosis.Vaccine，1994，121537-1540)。
1996年，Huygen等人制備了Ag85 DNA疫苗，經(jīng)Ag85 DNA疫苗免疫的鼠產(chǎn)生了體液和細(xì)胞應(yīng)答并獲得了明顯的保護(hù)(Huygen K，Content J，Denis O，et al.Immunogenicity and protective efficacy of a tuberculosis DNA vaccine.Nat.Med.1996，2893-897)。
1999年，Zhong M等人用編碼ESAT-6，MPT-83，KatG或HBHA蛋白的DNA疫苗，實(shí)驗(yàn)證明它們均誘導(dǎo)特異性體液免疫，產(chǎn)生大量的r-干擾素并具有明顯保護(hù)應(yīng)答(Zhong M，Howard A，Kelley C，et al.Immunogenicity of DNA VaccinesExpressing Tuberculosis Proteins Fused to Tissue Plasminogen ActivatorSignal Sequences.Infect.Immun.1999，674780-4786)。
2000年，Morris對單價(jià)和多價(jià)結(jié)核桿菌DNA疫苗投放后的免疫應(yīng)答進(jìn)行了評價(jià)。單價(jià)DNA疫苗包括編碼MPT-63和MPT-83的DNA疫苗，多價(jià)聯(lián)合DNA疫苗包括ESAT-6，MPT-83，MPT-63，KatG，結(jié)果表明多價(jià)聯(lián)合DNA疫苗比活苗BCG誘導(dǎo)的保護(hù)更為強(qiáng)烈(Morris S，Kelley C，Howard A，et al.The immunogenicity of singleand combination DNA vaccines against tuberculosis.Vaccine.2000，182155-2163)。
2000年，Vordermeier等用分枝桿菌抗原MPT70，MPT83，Ag85-A DNA疫苗對牛進(jìn)行免疫，結(jié)果表明MPT83 DNA免疫?？烧T導(dǎo)CD4+細(xì)胞應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答(Vordermeier H M，Cockle P J，Whelan A O，et al.Effective DNA vaccinationof cattle with the mycobacterial antigens MPB83 and MPB70 does not compromisethe specificity of the comparative intradermal tuberculin skintest.Vaccine，2000，191246-1255)。
雖然國內(nèi)外對結(jié)核分枝桿菌核酸疫苗的開發(fā)做了大量的研究，但所獲得的核酸疫苗保護(hù)力還不夠高。2001年，范雄林等報(bào)道了結(jié)核分枝桿菌Ag85B分泌蛋白單基因疫苗特異性抗體滴度僅為1∶200(范雄林，徐志凱，李元，等結(jié)核分枝桿菌Ag85B分泌蛋白基因疫苗的構(gòu)建和免疫原性的研究，中華結(jié)核和呼吸雜志，2001，24548-550)。2001年，游力等報(bào)道的結(jié)核分枝桿菌Ag85B分泌蛋白單基因疫苗第三次免疫45天的特異性抗體滴度為1∶100 000(游力，趙躍然，高春義等，結(jié)核分枝桿菌Ag85B DNA疫苗的構(gòu)建及其免疫作用的研究。中華結(jié)核和呼吸雜志，2001，24736-739)。研制更全面有效的新核酸疫苗對有效控制結(jié)核病的傳播和流行具有重要的意義。
牛分枝桿菌在生長特性、化學(xué)組成及毒力的潛在性上與結(jié)核桿菌有相似之處，牛分枝桿菌主要為牛的致病菌，引起牛的結(jié)核感染，人由于食入未經(jīng)消毒的污染了此菌的牛乳而被感染。但如由呼吸道吸入，亦可發(fā)生與結(jié)核桿菌完全相同的感染，難以區(qū)別。
動物表達(dá)載體pJW4303，其物理圖譜如圖7所示，帶有巨細(xì)胞病毒(CMV)早期基因啟動子，是保證目的基因在肌肉細(xì)胞中高效轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)啟動子。該載體還帶有組織血纖維蛋白溶酶原激活劑的胞外分泌信號序列，定向克隆在這一信號序列下游的外源基因產(chǎn)物能被成功地分泌到胞外，增加了抗原與巨噬細(xì)胞的接觸機(jī)會，加速了依賴于蛋白酶體的內(nèi)源性合成抗原的降解，導(dǎo)致體內(nèi)誘導(dǎo)的細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答增強(qiáng)。此外，pJW4303含有11個(gè)CpG序列，在DNA疫苗誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答中起重要作用，可在無T細(xì)胞存在的情況下直接激活B細(xì)胞，刺激分泌免疫球蛋白及白細(xì)胞介素6，也可直接激活單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞，上調(diào)共刺激分子的表達(dá)，有利于產(chǎn)生多種Th1型細(xì)胞因子，提高保護(hù)性免疫力。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種具有較好免疫原性的牛分枝桿菌三聯(lián)核酸疫苗。
本發(fā)明所提供的牛分枝桿菌三聯(lián)核酸疫苗，是將Ag85B、MPT-83和MPT-64基因或所述Ag85B、MPT-83和MPT-64三種基因分別與其它核酸序列融合或缺失部分序列或部分核苷酸突變后的且可編碼與Ag85B、MPT-83和MPT-64具有相同活性蛋白的核苷酸序列，分別克隆到真核表達(dá)載體中，將得到的表達(dá)載體進(jìn)行聯(lián)合形成的混合物。
上述疫苗中還含有佐劑DDA和/或MPL和/或Quil-A和/或RIBI佐劑和/或saline(生理鹽水)或其它佐劑，如鋁佐劑，福氏佐劑。該疫苗中牛分枝桿菌三聯(lián)核酸疫苗與DDA的重量份數(shù)比可為1-3∶1，優(yōu)選為3∶1。
其中，所述表達(dá)載體的啟動子可為pJW4303帶有的巨細(xì)胞病毒(CMV)早期基因啟動子或其它真核表達(dá)啟動子，如老鼠看家基因的啟動子。
上述牛分枝桿菌三聯(lián)核酸疫苗優(yōu)選為將MPT-64、MPT-83和Ag85B基因分別克隆到真核表達(dá)載體pJW4303聯(lián)合而成的多價(jià)牛分枝桿菌核酸疫苗；其中，該牛分枝桿菌三聯(lián)核酸疫苗優(yōu)選為相同重量份數(shù)比的MPT-64、MPT-83和Ag85B表達(dá)載體聯(lián)合而成的牛分枝桿菌三聯(lián)核酸疫苗。
本發(fā)明的牛分枝桿菌三聯(lián)核酸疫苗可用于預(yù)防和/或治療動物結(jié)核病特別是預(yù)防和/或治療人、牛、羊結(jié)核病。
三個(gè)基因的基因Bank收錄號分別為MPT-64X75361；MPT-83X94579；Ag85BX62398。
本發(fā)明將編碼結(jié)核分枝桿菌Ag85B、MPT-83和MPT-64分泌蛋白的結(jié)構(gòu)基因或包括信號肽的全基因序列定向克隆到真核表達(dá)載體pJW4303中，轉(zhuǎn)化到TOP10大腸桿菌，提取質(zhì)粒DNA經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶鑒定及序列分析證實(shí)含有正確的上述三種分泌蛋白的結(jié)構(gòu)基因(包括信號肽)全序列。三種重組表達(dá)質(zhì)粒與DDA同時(shí)肌注免疫牛導(dǎo)致牛體內(nèi)Ag85B、MPT-83和MPT-64的特異性IgG抗體反應(yīng)水平顯著提高，抗體水平在第三次免疫后2個(gè)月末達(dá)到高峰。PPD-B皮試試驗(yàn)表明，用本發(fā)明的牛分枝桿菌三聯(lián)核酸疫苗進(jìn)行免疫可以引發(fā)強(qiáng)的系統(tǒng)免疫應(yīng)答，但不能引起牛結(jié)核菌素PPD皮試反應(yīng)。用牛分枝桿菌三聯(lián)核酸疫苗對牛進(jìn)行氣管攻毒前后γ-干擾素水平的比較結(jié)果顯示，牛分枝桿菌三聯(lián)核酸疫苗免疫過的牛能夠產(chǎn)生對牛分枝桿菌有效的免疫性并激發(fā)顯著的高水平T細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)，IFN-γ的含量在第三次免疫后的第二個(gè)月末達(dá)到最高。對牛外周血單核細(xì)胞的增殖應(yīng)答檢測(淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn))表明，所有經(jīng)牛分枝桿菌三聯(lián)核酸疫苗免疫過的牛血液淋巴細(xì)胞都對Ag85B、MPT-64和MPT-83的刺激產(chǎn)生強(qiáng)烈的增殖應(yīng)答。對免疫牛和對照牛氣管攻毒后4個(gè)月肺組織病理組織變化進(jìn)行了觀察，結(jié)果表明經(jīng)空載體pJW4303 DNA免疫的對照牛肺部切片，肺實(shí)質(zhì)的纖維化明顯達(dá)50-70％且纖維母細(xì)胞和淋巴細(xì)胞增多，BCG免疫的牛肺部切片，肺實(shí)質(zhì)的纖維化明顯，纖維母細(xì)胞和淋巴細(xì)胞較多。經(jīng)本發(fā)明的牛分枝桿菌三聯(lián)核酸疫苗免疫的牛肺部切片，肺組織正常，肺泡清晰有少量的纖維母細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。對免疫牛和對照牛氣管攻毒后4個(gè)月的肺、肝、淋巴結(jié)組織進(jìn)行了牛分枝桿菌培養(yǎng)，八周后活菌記數(shù)，免疫牛肺臟的細(xì)菌數(shù)同空載體對照組相比有明顯的減少(p＜0.05)。其中經(jīng)本發(fā)明的牛分枝桿菌三聯(lián)核酸疫苗免疫的牛的肺內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量[(1.87±1.40)×101]比空載體對照組的數(shù)量減少了7,000倍以上，保護(hù)效率為80％，陽性對照BCG組的保護(hù)效率為60％，陰性對照組注射空載體的保護(hù)效率為16％，注射生理鹽水的保護(hù)效率為0％。這些結(jié)果充分證明本發(fā)明的牛分枝桿菌三聯(lián)核酸疫苗對牛具有很好的保護(hù)效率。本發(fā)明的牛分枝桿菌三聯(lián)核酸疫苗不僅增強(qiáng)了免疫動物的肌體體液應(yīng)答反應(yīng)，同時(shí)增強(qiáng)了細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，而后者是提高核酸疫苗效率的重要前提條件。另外，本發(fā)明中選用的佐劑DDA不僅提高了疫苗的免疫效率，而且可使免疫應(yīng)答向Th1-反應(yīng)進(jìn)行。
與活的BCG疫苗和亞單位疫苗相比較，本發(fā)明的牛分枝桿菌三聯(lián)核酸疫苗還具有其他潛在優(yōu)點(diǎn)容易生產(chǎn)，穩(wěn)定性強(qiáng)，較安全，不引起結(jié)核菌素的敏感反應(yīng)。此外，可免疫HIV免疫缺陷的病人，而BCG疫苗卻不能用于這種病人。本發(fā)明所用的佐劑DDA大大提高了疫苗的保護(hù)效率。本發(fā)明的牛分枝桿菌三聯(lián)核酸疫苗顯著提高了對動物特別是大型動物(如牛、羊等)的保護(hù)效率，而且不會發(fā)生結(jié)核菌素的敏感反應(yīng)，增強(qiáng)了疫苗的安全性。本發(fā)明對提高動物及人類對牛分枝桿菌的免疫力，更有效地控制結(jié)核病的傳播和流行，繁榮畜牧業(yè)及增強(qiáng)人類體質(zhì)具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。


圖1為牛免疫后的PPD-B皮試試驗(yàn)柱狀2為牛在三聯(lián)核酸疫苗免疫和牛分枝桿菌攻毒后體內(nèi)IgG抗體應(yīng)答的變化曲線圖3A為用三聯(lián)核酸疫苗最后免疫4周后的牛全血培養(yǎng)物中IFN-γ的含量柱狀3B為用三聯(lián)核酸疫苗最后免疫8周后的牛全血培養(yǎng)物中IFN-γ的含量柱狀3C為用三聯(lián)核酸疫苗免疫的牛氣管攻毒4周后的牛全血培養(yǎng)物中IFN-γ的含量柱狀4為用三聯(lián)核酸疫苗免疫后牛全血培養(yǎng)物中IFN-γ的變化曲線圖5為牛經(jīng)三聯(lián)核酸疫苗免疫后的全血培養(yǎng)物的增值應(yīng)答柱狀6A為pJW4303對照組的牛在牛分枝桿菌攻毒16周后肺臟組織切片的顯微照片(×10)。
圖6B為pJW4303對照組的牛在牛分枝桿菌攻毒16周后肺臟組織切片的顯微照片(×40)圖6C為pJW4303對照組的牛在牛分枝桿菌攻毒16周后肺臟組織切片的顯微照片(×100)圖6D為BCG免疫組的牛在牛分枝桿菌攻毒16周后肺臟組織切片的顯微照片(×10)圖6E為BCG免疫組的牛在牛分枝桿菌攻毒16周后肺臟組織切片的顯微照片(×40)圖6F為BCG免疫組的牛在牛分枝桿菌攻毒16周后肺臟組織切片的顯微照片(×100)圖6G為三聯(lián)核酸疫苗免疫組的牛在牛分枝桿菌攻毒16周后肺臟組織切片的顯微照片(×10)圖6H為三聯(lián)核酸疫苗免疫組的牛在牛分枝桿菌攻毒16周后肺臟組織切片的顯微照片(×40)圖6I為核酸三聯(lián)疫苗免疫組的牛在牛分枝桿菌攻毒16周后肺臟組織切片的顯微照片(×100)圖7為動物表達(dá)載體pJW4303的物理圖譜具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、真核表達(dá)載體的構(gòu)建用PCR方法擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)的Ag85B，MPT-83和MPT-64基因并克隆到真核表達(dá)載體pJW4303上用于在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
真核表達(dá)載體構(gòu)建的基本步驟為
(1)以常規(guī)方法提取的結(jié)核桿菌基因組DNA為模板，用PCR擴(kuò)增Ag85B，MPT-83和MPT-64基因并定向克隆到pJW4303載體上的組織血纖維蛋白溶酶原激活劑(TPA)信號序列下游，形成融合蛋白。擴(kuò)增所用的引物序列如下Ag85B5’-AAATGGGGCACAGCTAGCCATATGACAGACGTGAGCC-3’，和5’-ACTAGGATCCTAAGCAACCTTCGGTTGATCCCGTCAGC-3’；MPT-835’-ATTGCTAGCATGATCAACGTTCAG-3’，和5’-TATGGATCCCGAACGTTACTGT-3’；MPT-645’-TAGAGTACTGCTAGCGTGCGCATCAAGATCTTC-3’，和5’-TAGAGTACTGGATCCTAGGCCAGCATCGAGTCG-3’。5’端引物都含Nhe I位點(diǎn)，3’端引物都含有BamHI位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后按QIAquick Gel Extraction Kit說明書操作回收，得到目的基因。
(2)分別用Nhe I和BamH I雙酶切經(jīng)凝膠純化的目的基因產(chǎn)物及pJW4303載體DNA，用T4 DNA連接酶處理16h(16℃)，取5μl連接產(chǎn)物(總體積20μl)轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α菌株。挑取轉(zhuǎn)化菌單菌落抽提質(zhì)粒，Nhe I和BamH I雙酶切鑒定后進(jìn)行序列分析以證實(shí)插入片段序列的正確性。將含有正確讀碼框的重組載體轉(zhuǎn)化到TOP10大腸桿菌中，在含Amp(100μg/ml)的瓊脂中再次篩選重組菌株，用QIAGEN Plasmid Maxi Kit和Mega Kit大量制備質(zhì)粒DNA，用DDA稀釋成濃度為1-2μg/μl，紫外分光光度計(jì)定量，得到重組質(zhì)粒pJW-Ag85B，pJW-MPT-83和pJW-MPT-64。
實(shí)施例2、用三聯(lián)DNA疫苗免疫牛并檢測該疫苗對牛的保護(hù)效率1)三聯(lián)DNA疫苗對牛的免疫把16頭牛隨機(jī)分成四組牛分枝桿菌三聯(lián)核酸疫苗免疫組、卡介苗免疫組和pJW4303空載體對照組各五頭，剩余的一頭牛接種生理鹽水作為非免疫對照。500μgDDA加熱到80℃使膠束形成，冷卻到室溫后與1500μg分別編碼Ag85B、MPT-64和MPT-83抗原的質(zhì)粒DNA(每種質(zhì)粒500μg)(即重組質(zhì)粒pJW-Ag85B，pJW-MPT-83和pJW-MPT-64)混合，然后對核酸疫苗免疫組的牛進(jìn)行頸部肌肉免疫接種，每次每頭接種2000μg。以按照上述方法處理的1500μg pJW4303質(zhì)粒DNA和500μg DDA的混合物對空載體對照組的牛進(jìn)行頸部肌肉免疫接種，每次每頭接種2000μg。在卡介苗免疫組的第一次和第三次注射時(shí)分別用1×106CFU BCG皮下接種，第二次注射時(shí)用1×106CFU BCG皮下接種。作為非免疫對照的那頭牛每次接種2ml生理鹽水。所有的接種都每隔一個(gè)月進(jìn)行一次，共進(jìn)行三次。在第三次免疫四周后，按常規(guī)方法分離抗血清。
2)酶聯(lián)免疫試驗(yàn)(ELISA)檢測核酸疫苗免疫后牛的抗原特異性免疫應(yīng)答分別用100μl(10μg/ml)溶于0.1M碳酸鹽緩沖液(pH9.6)的純化抗原Ag85B，MPT-64，MPT-83涂于聚苯乙烯96孔微滴定板(Nunclon，Roskilde，Denmark)的孔中4℃包被過夜。用經(jīng)脫脂牛奶飽和并含有0.05％Tween-20的PBS溶液在37℃洗板2小時(shí)，共洗滌5次。從1∶100開始用PBS-Tween緩沖液(含0.5M NaCl)兩倍系列稀釋血清樣品，再按100μl/孔加入到兩個(gè)重復(fù)的96孔板孔中。每個(gè)板在37℃溫育2小時(shí)并持續(xù)搖動，然后根據(jù)上述方法洗板。洗板后，將辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗牛抗血清IgG，IgG1和IgG2(Serotec Ltd，Oxford，UK)按1∶50000稀釋于PTN中分別加入到每個(gè)孔中，繼續(xù)在37℃溫育2小時(shí)。洗板后加入底物溶液3，3’，5，5’-tetramethylbenzidine(Chemicon，Harrow，UK)，37℃溫育10分鐘。用2MH2SO4終止反應(yīng)后，通過一個(gè)微板閱讀儀(BIO-RAD，Model 550，Japan)讀取的OD450值對顏色反應(yīng)情況進(jìn)行分析。結(jié)果用光密度(optical density)(OD)的比率來表示，即一個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品的OD450和0天樣品OD450間的比率。OD≥2時(shí)顯示為可靠的Ab應(yīng)答。OD值在1.5-1.9之間的樣品被記為弱Ab陽性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，表明三聯(lián)核酸疫苗免疫后的牛在第三次注射四周后產(chǎn)生顯著的IgG應(yīng)答；五頭三聯(lián)核酸疫苗免疫牛中的四頭產(chǎn)生對MPT-64抗原的強(qiáng)烈反應(yīng)，抗MPT-64的抗體可以在1∶100和1∶800稀釋度之間檢測到；五頭三聯(lián)核酸疫苗免疫牛中的三頭產(chǎn)生對Ag85B抗原的陽性反應(yīng)，抗體滴度范圍為1∶100至1∶400；五頭三聯(lián)核酸疫苗免疫牛中的四頭產(chǎn)生對MPT-83抗原的顯著IgG應(yīng)答，滴度范圍為1∶100至1∶800。三種抗原在兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中都誘導(dǎo)出相同的抗體滴度。同時(shí)，在三次免疫中經(jīng)BCG免疫的牛沒有產(chǎn)生特異的體液應(yīng)答。另外，用空載體pJW4303質(zhì)粒DNA免疫的五頭牛也沒有誘導(dǎo)出針對抗原的體液應(yīng)答。
表1.用編碼Ag85B，MPT-83，MPT-64的三聯(lián)核酸疫苗和佐劑DDA免疫牛而誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答產(chǎn)生的特異性抗體IgG的滴度

3)牛免疫后遲發(fā)性超敏反應(yīng)的檢測——PPD-B皮試試驗(yàn)所有16頭牛在最后免疫后的第四周都通過注射牛PPD(PPD-B)進(jìn)行了皮內(nèi)結(jié)核素試驗(yàn)。B-PPD誘發(fā)的反應(yīng)大小在注射牛PPD后的第3-4天進(jìn)行測定。用BCG免疫的牛作為正對照。結(jié)果用5頭三聯(lián)核酸疫苗免疫牛(或每組的5頭BCG免疫牛)的平均反應(yīng)大小來顯示。結(jié)果如圖1所示，表明經(jīng)BCG免疫的5頭牛對PPD的DTH反應(yīng)為3.3-6mm，從這些牛得到的平均反應(yīng)和標(biāo)準(zhǔn)差(4.56±2.27)高于三聯(lián)DNA疫苗免疫組的相應(yīng)數(shù)值(0.8±0.8)(P≤0.01)。三聯(lián)DNA疫苗免疫組和空載體pJW4303DNA免疫對照組的牛都沒有產(chǎn)生等于或超過0.82mm的DTH應(yīng)答。所以，用三聯(lián)核酸疫苗進(jìn)行免疫可以引發(fā)強(qiáng)的系統(tǒng)免疫應(yīng)答，但不能引起牛結(jié)核素PPD的變態(tài)反應(yīng)。三聯(lián)DNA疫苗免疫組與空載體pJW4303 DNA免疫組相比較，P≤0.05(Mann-Whitneytest)。
4)牛分枝桿菌攻毒實(shí)驗(yàn)在首免后的第17周，用1×107CFU強(qiáng)毒牛分枝桿菌M.bovis(購自中國人民解放軍第309醫(yī)院結(jié)核病研究中心)對每個(gè)免疫組的牛和一頭非免疫的牛都進(jìn)行氣管插管攻毒實(shí)驗(yàn)。即，一個(gè)長為80cm含很細(xì)套管的氣管內(nèi)管被深入到麻醉動物的氣管中，把1.5ml含有1×107CFU強(qiáng)毒牛分枝桿菌M.bovis的菌液通過套管注入并用2ml的生理鹽水沖入。
5)牛攻毒前后血清IgG抗體應(yīng)答變化趨勢分析抗體滴度的測定方法同2)中所述。對所有免疫和攻毒的牛都進(jìn)行了IgG抗體反應(yīng)檢測。結(jié)果用平均光密度來表示。結(jié)果如圖2所示，表明在攻毒時(shí)，與非免疫對照組的牛比較，三聯(lián)DNA疫苗免疫組的牛都顯著具有更高的抗體水平，并在第三次免疫后的第八周達(dá)到最高。所有免疫牛的抗體滴度都在攻毒后的第八周顯示一個(gè)輕微的下降，并在第16周顯示進(jìn)一步的降低。
6)牛攻毒前后γ-干擾素水平的測定和比較全血培養(yǎng)在96孔板(0.2ml/孔)中進(jìn)行。將1ml取自于頸靜脈的肝素化血與等體積的抗原溶液(10μg/ml)混合培養(yǎng)。一部分血與沒有抗原的溶液培養(yǎng)作為負(fù)對照。37℃下含5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)后收集上清，用BOVIGAMTMBovineγInterferon Test Kit(CSL，Victoria，Australia)測定γ-干擾素(IFN-γ)。結(jié)果如圖3A、圖3B、圖3C和圖4所示，表明在三免后第四周，與空載體及其它對照組比較，五頭三聯(lián)核酸疫苗免疫牛的T細(xì)胞對Ag85B特異抗原刺激產(chǎn)生顯著的應(yīng)答(P＜0.05)，但沒有顯示出對MPT-64和MPT-83特異抗原刺激產(chǎn)生的明顯應(yīng)答(圖3A)；而在三免后8周后，三聯(lián)核酸疫苗免疫組比空載體對照組顯現(xiàn)出更高水平的T細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)，其中免疫組對Ag85B和MPT-64的平均應(yīng)答顯著高于對照組的平均應(yīng)答(P＜0.01)，而對MPT-83的應(yīng)答也顯示出了差異(P＜0.05)(圖3B，3C)。其中，結(jié)果用光密度指數(shù)ODI(含抗原OD450∶不含抗原OD450)±S.D.表示；每組5頭牛；用Mann-Whitney test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，與pJW4303免疫組的反應(yīng)相比P＜0.05。圖4表明用三聯(lián)核酸疫苗免疫引發(fā)牛體內(nèi)產(chǎn)生很強(qiáng)的應(yīng)答，IFN-γ的含量在三免后的第二個(gè)月末達(dá)到最高。
7)牛外周血單核細(xì)胞的增殖應(yīng)答檢測在最后免疫注射的2個(gè)月后進(jìn)行檢測實(shí)驗(yàn)。具體過程為肝素化的牛血液先按1∶4用培養(yǎng)基稀釋，該培養(yǎng)基組成為RPMI-1640并含有5％CPSR-1(Sigma，Poole，UK)，非必需氨基酸(Sigma)，5×10-5M巰基乙醇，100U/ml青霉素，100μg/ml硫酸鏈霉素；然后按每孔100μl分配到平底96孔板中，其中每個(gè)孔中含有溶于培養(yǎng)基中的抗原溶液(Ag85B溶液、MPT-64溶液和MPT-83溶液的濃度均為5或10μg/ml)(100μl/孔，重復(fù)三次)。每板培養(yǎng)6天，用沒有任何處理和經(jīng)Con A(10μg/ml)處理過的細(xì)胞作為對照。用3-[4，5-dimethylthiazol-2-yl]-2，5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)染色法測定增殖應(yīng)答，即培育72小時(shí)后，在每個(gè)孔中加入20μl MTT繼續(xù)培育4小時(shí)。最后每個(gè)孔中加入150μl DMSO。吸打混合深色沉淀后，讀取650nm下的吸光度值。結(jié)果如圖5所示，表明與空載體對照組相比，所有經(jīng)三聯(lián)核酸疫苗免疫過的牛血液都對Ag85B、MPT-64和MPT-83的刺激產(chǎn)生強(qiáng)烈的應(yīng)答。相反，經(jīng)BCG免疫過的牛血液在PPD刺激后都沒有檢測到和空載體對照組有顯著差別的體外增值應(yīng)答。對照組牛的增值應(yīng)答沒有顯示出被抗原所激發(fā)。其中，結(jié)果用光密度指數(shù)ODI(含抗原培養(yǎng)物的OD450∶不含抗原培養(yǎng)物的OD450)±S.D.表示0。5頭牛/組。用Mann-Whitneytest進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，與pJW4303免疫組的反應(yīng)相比P＜0.01。
8)牛攻毒后的病理學(xué)分析在攻毒后第16周對所有的牛都進(jìn)行廣泛的病理檢測。淋巴結(jié)被取出切成薄片后進(jìn)行檢查。對肺部先進(jìn)行觸診以查看是否有節(jié)結(jié)，再切成約1cm厚的薄片觀察損傷情況。發(fā)現(xiàn)的損傷部位用組織病理學(xué)檢驗(yàn)來確定是否有結(jié)核病。做組織病理學(xué)檢驗(yàn)時(shí)，收集全部牛的左右肩前淋巴結(jié)，左右股前淋巴結(jié)，腸系膜淋巴結(jié)和肺門淋巴結(jié)樣品。另外的樣品來自在其它淋巴結(jié)或器官發(fā)現(xiàn)的損傷部位。用于組織病理學(xué)分析的組織先在中性的10％的甲醛緩沖液中固定，再用石蠟包埋，用蘇木精和曙紅染色后制成6μm切片在顯微鏡下觀察。結(jié)果如表2、圖6A-6I所示，表2表明在所有的pJW4303對照組牛的臟器都發(fā)現(xiàn)了結(jié)核病損傷，而在三聯(lián)核酸疫苗免疫組只發(fā)現(xiàn)1頭牛有損傷。肺臟損傷情況在核酸疫苗免疫組和空載體對照組之間有顯著的差異，且免疫組的分值(0.5±1.0)低于對照組的分值(2.6±1.7)。在BCG免疫組的5頭牛中的3頭中也發(fā)現(xiàn)了肺臟結(jié)核病損傷，平均肺臟損傷分值(1.8±1.8)也低于空載體對照組。牛分枝桿菌三聯(lián)核酸疫苗免疫組、卡介苗免疫組、pJW4303空載體對照組和非免疫對照組的所有損傷都沒有黃色的鈣干酪化中心。非免疫對照組和免疫組的損傷在大小上沒有顯著差異。另外，五頭pJW4303空載體對照組有顯微鏡可見結(jié)核病損傷的牛有培養(yǎng)陽性肺臟。BCG組的兩頭有培養(yǎng)陽性肺臟，其中一頭BCG免疫的牛有臟器損傷但顯示牛分枝桿菌培養(yǎng)陰性。圖6A-6I表明所有的免疫過的牛的炎癥程度都比對照組處理的牛的炎癥降低了，從三聯(lián)核酸疫苗和BCG疫苗免疫過的牛獲得的結(jié)果與空載體對照組的結(jié)果有顯著的不同?？蛰d體pJW4303處理過的牛的肺泡組織顯現(xiàn)不正常和趨向纖維化的肺器損傷，約70％肺實(shí)質(zhì)參與但無肉芽腫或干酪樣壞死出現(xiàn)(圖6A)，并有大量的與上皮樣巨噬細(xì)胞混合的淋巴細(xì)胞浸潤(圖6B&C)。相反，BCG免疫牛的肺纖維化只影響了一小部分肺實(shí)質(zhì)(約15-20％)，且小而緊湊(圖6D)，并有更多數(shù)量的淋巴細(xì)胞遍及損傷部位(圖6E&F)。經(jīng)三聯(lián)核酸疫苗免疫過的牛的肺泡組織顯得完整而清晰(圖6G)，并有與上皮樣巨噬細(xì)胞混合的淋巴細(xì)胞的少量浸潤(圖6H&I)。淋巴細(xì)胞的浸潤程度在不同組之間有很大的差異，在每個(gè)部位所有免疫過的牛都有比對照組更小范圍的淋巴細(xì)胞浸潤，且在統(tǒng)計(jì)上是顯著的。
表2.用牛分枝桿菌攻毒后的牛體內(nèi)肉眼可見的肺臟損傷情況及分值

a，免疫牛和對照牛的平均肺臟損傷分值±SE。損傷分值4，≥100小損傷或一個(gè)直徑＞60mm的損傷；3，25-99％的小損傷或一個(gè)直徑20-60mm的損傷；2，10-24％的小損傷；1，1-9％的小損傷；0，沒有損傷。
*，與空載體對照組有顯著差異(P＜0.05)。
9)三聯(lián)核酸疫苗對牛的遺傳性免疫對攻毒實(shí)驗(yàn)的保護(hù)性分析攻毒16周后宰殺所有的牛。摘取四個(gè)胸淋巴結(jié)(左右支氣管的和前后縱隔的淋巴結(jié))。組織樣品用Tenbroeck研磨器(Wheaton，Millville，N.J.)勻漿，在0.75％cetylpyridium chloride中處理1小時(shí)，3,500×g離心20min，然后按文獻(xiàn)(Buddle，B.M.，G.W.de Lisle，A.Pfeffer，and F.E.Aldwell.1995.Immunological responses and protection against Mycobacterium bovis in calvesvaccinated with a low dose of BCG.Vaccine 131123-1130)所述的方法分離牛分枝桿菌。10倍系列梯度稀釋的肺組織勻漿涂布到Lowenstein-Jensen培養(yǎng)基上培養(yǎng)。8周后對牛分枝桿菌克隆進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果如表3所示，表明和pJW4303對照組的((1.38±1.31)×105)相比，BCG免疫過的牛的細(xì)菌數(shù)目降低了2,000倍((6.82±0.11)×101)?？蛰d體DNA處理的牛都沒有表現(xiàn)任何保護(hù)效果。經(jīng)三聯(lián)核酸疫苗免疫的牛肺內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量((1.87±1.40)×101)比空載體對照組的數(shù)量減少了7,000倍以上。
表3、不同疫苗及空載體DNA對氣管攻毒實(shí)驗(yàn)后牛肺臟的保護(hù)效率分析(以存活細(xì)菌數(shù)為指標(biāo))

*細(xì)菌數(shù)目的幾何平均數(shù)(CFU/克組織)±SD。
序列表<110>北京大學(xué)<120>一種牛分枝桿菌三聯(lián)核酸疫苗<140>200410046101.9<141>申請日2004-05-31<160>2<210>1<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1aaatggggca cagctagcca tatgacagac gtgagcc37<210>2<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2actaggatcc taagcaacct tcggttgatc ccgtcagc 38
權(quán)利要求
1.一種牛分枝桿菌三聯(lián)核酸疫苗，是將Ag85B、MPT-83和MPT-64基因或所述Ag85B、MPT-83和MPT-64三個(gè)基因分別與其它核酸序列融合或缺失部分序列或部分核苷酸突變后的且可編碼與Ag85B、MPT-83和MPT-64具有相同活性蛋白的核苷酸序列，分別克隆到真核表達(dá)載體中，將得到的表達(dá)載體進(jìn)行聯(lián)合形成的混合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛分枝桿菌三聯(lián)核酸疫苗，其特征在于所述疫苗中還含有佐劑DDA和/或MPL和/或Quil-A和/或RIBI佐劑和/或生理鹽水和/或鋁佐劑和/或福氏佐劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的牛分枝桿菌三聯(lián)核酸疫苗，其特征在于所述牛分枝桿菌三聯(lián)核酸疫苗中核酸疫苗與DDA的重量份數(shù)比為1-3∶1。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的牛分枝桿菌三聯(lián)核酸疫苗，其特征在于所述牛分枝桿菌三聯(lián)核酸疫苗中核酸疫苗與DDA的重量份數(shù)比為3∶1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛分枝桿菌三聯(lián)核酸疫苗，其特征在于所述表達(dá)載體含有啟動子。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的牛分枝桿菌三聯(lián)核酸疫苗，其特征在于所述啟動子為pJW4303帶有的巨細(xì)胞病毒(CMV)早期基因啟動子或老鼠看家基因的啟動子。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的牛分枝桿菌三聯(lián)核酸疫苗，其特征在于所述牛分枝桿菌三聯(lián)核酸疫苗為將Ag85B、MPT-83和MPT-64基因分別克隆到真核表達(dá)載體pJW4303后并將表達(dá)產(chǎn)物聯(lián)合而成的牛分枝桿菌三聯(lián)核酸疫苗。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的牛分枝桿菌三聯(lián)核酸疫苗，其特征在于所述牛分枝桿菌三聯(lián)核酸疫苗為相同重量份數(shù)比的Ag85B、MPT-83和MPT-64的表達(dá)載體聯(lián)合而成的牛分枝桿菌三聯(lián)核酸疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種牛分枝桿菌三聯(lián)核酸疫苗，其目的是提供一種具有較好免疫原性的牛分枝桿菌三聯(lián)核酸疫苗。本發(fā)明所提供的牛分枝桿菌三聯(lián)核酸疫苗，是將Ag85B、MPT－83和MPT－64基因或所述Ag85B、MPT－83和MPT－64三個(gè)基因分別與其它核酸序列融合或缺失部分序列或部分核苷酸突變后的且可編碼與Ag85B、MPT－83和MPT－64具有相同活性蛋白的核苷酸序列，分別克隆到真核表達(dá)載體中，將得到的至少兩種表達(dá)載體進(jìn)行聯(lián)合形成的混合物。本發(fā)明所提供的牛分枝桿菌三聯(lián)核酸疫苗可用于預(yù)防和/或治療動物結(jié)核病特別是預(yù)防和/或治療牛、人、羊結(jié)核病。
文檔編號A61K39/04GK1704118SQ20041004610
公開日2005年12月7日 申請日期2004年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月31日
發(fā)明者蔡宏, 朱玉賢 申請人:北京大學(xué)