專利名稱：治療組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及適于對人和動物給藥的組合物，其特征特別在于，(i)增強(qiáng)心效力，尤其是心臟利用葡萄糖的效率，(ii)提供能源，尤其是在糖尿病和對胰島素耐受的病癥中提供能源，(iii)治療由腦細(xì)胞損害引起的病癥，尤其是通過延緩或阻止腦部記憶相關(guān)區(qū)域的腦損害，例如在患有阿耳茨海默民病及類似病癥的腦中發(fā)現(xiàn)的腦損害，來達(dá)到治療效果。這些組合物可作為營養(yǎng)品給例如運(yùn)動員使用，或用來治療痰病，尤其是與心力不足、胰島素耐受癥和記憶力損失有關(guān)的病癥。本發(fā)明還提供了治療方法以及包含在本發(fā)明組合物內(nèi)的新的酯和聚合物。
背景技術(shù)：
血糖的異常升高不僅發(fā)生在胰島素缺乏和非胰島素依賴型糖尿病中，而且還發(fā)生在多種其它疾病中。糖尿病患者的高血糖是由于不能新陳代謝和葡萄糖生產(chǎn)過剩所致。兩種類型的糖尿病都可以通過飲食治療；I型糖尿病幾乎總是需要補(bǔ)充胰島素，而非胰島素依賴型糖尿病，例如老年發(fā)病的糖尿病，可通過飲食和減肥來治療，雖然胰島素也日益被用來控制高血糖。
交感神經(jīng)刺激的增強(qiáng)或胰高血糖素水平的升高，除了會增強(qiáng)肝中糖原分解以外，還會刺激脂肪細(xì)胞釋放游離脂肪酸。在急性心肌梗塞后或心力衰竭期間，增強(qiáng)交感神經(jīng)作用或施用擬交感神經(jīng)藥會促進(jìn)糖原分解，減少胰島素從胰腺P細(xì)胞中的釋放，并會引起有關(guān)的抗胰島素癥。雖然在糖尿病的治療中，飲食的重要性、或底物的有效性已經(jīng)被認(rèn)識到并且采用，但是在臨床實(shí)踐中，抗胰島素癥中的底物選擇的關(guān)鍵作用沒有被廣泛認(rèn)識到或應(yīng)用。相反，現(xiàn)在人們把注意力集中在胰島素與其受體結(jié)合后發(fā)生的復(fù)合信號級聯(lián)上。此漸增的復(fù)合信號級聯(lián)包括蛋白酪氨酸激酶和磷酸酶、肌醇和其它磷脂，雖然還需要對非胰島素依賴型糖尿病進(jìn)行最終理解，但是此復(fù)合信號級聯(lián)已經(jīng)對糖尿病或抗胰島素癥提供了重要的新療法。
胰島素除了對生長有長期影響以外，胰島素的急性代謝影響被認(rèn)為是由于其在葡萄糖轉(zhuǎn)化成CO2的3個(gè)主要酶作用步驟中起作用。首先，胰島素促進(jìn)葡萄糖載體Glut4從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜中，因此就增強(qiáng)了葡萄糖從細(xì)胞外到細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸(參見對比文獻(xiàn)1和2)。第二，胰島素增強(qiáng)了糖原的積聚。這是由于蛋白磷酸酶1導(dǎo)致的糖原合酶(3)脫磷酸作用所致。第三，胰島素通過由Ca2+敏感性(6)線粒體蛋白磷酸酶所引起的脫磷酸作用而刺激線粒體內(nèi)丙酮酸脫氫酶多酶復(fù)合物(4和5)的活性。
胰島素一個(gè)重要但是了解不多的作用是其能與葡萄糖、氯化鉀和GIK聯(lián)合使用來治療心臟病，其能改善伴隨心肌梗塞的心電圖異常(7和8)，能改善泵過昏迷后心臟的機(jī)能。近來，胰島素已被建議用來治療其它多種嚴(yán)重心臟病(10和11)。注射GIK所產(chǎn)生的有益效果是由于其能減少游離脂肪酸的釋放以及能改善膜穩(wěn)定性(12)。然而，很多其它近期研究提出了更多的機(jī)理性原因。在缺氧狀態(tài)下的心臟細(xì)胞中，葡萄糖是唯一能提供維持生命力所需的ATP的能源(13)。
將葡萄糖和胰島素一起給藥能增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)葡萄糖在缺氧狀態(tài)下提供ATP生成來源的能力。雖然此說法能解釋一些有益效果，但是不能解釋用GIK治療后心臟的EKG異常被校正和心指數(shù)被改善，因?yàn)殡娀钚院托呐K的功能需要呼吸活躍的心臟細(xì)胞，而不是完全缺氧并且因此沒有電活性或進(jìn)行機(jī)械功能能力的心臟細(xì)胞。
知道胰島素作用的酶位點(diǎn)，不會單獨(dú)地定義出胰島素缺乏對于細(xì)胞代謝或生理功能的影響。通過了解自然本能處理胰島素缺乏的方式，可最好地懂得胰島素在較高水平下是怎樣作用的。在禁食期間，對于胰島素減少的自然補(bǔ)償促進(jìn)游離脂肪酸在肝中轉(zhuǎn)化成酮體，血液中D-β-羥基丁酸和乙酰乙酸的濃度增加到約6mM。在這些水平下，酮而不是葡萄糖成為大多數(shù)器官甚至包括腦的底物(14)。雖然輕微的酮病是對胰島素減少的正常反應(yīng)，但是醫(yī)師擔(dān)心酮體，因?yàn)橥w的大量生產(chǎn)過剩在糖尿病酮酸中毒患者中可威脅生命。
先前，本發(fā)明者已經(jīng)比較了生理水平的酮體的作用和胰島素的代謝和生理作用，尤其是比較了胰島素缺乏的實(shí)驗(yàn)大鼠僅灌注葡萄糖的心臟，和灌輸4mM的D-β-羥基丁酸/1mM的乙酰乙酸、飽和劑量的胰島素或其混合物的心臟，結(jié)果表明了提供的單純底物是怎樣模擬胰島素的作用，即在改變糖酵解和TCA循環(huán)中的這些中間體的濃度，以此來控制葡萄糖在此非常特定的組織中的流量的過程中所起的作用。此外，本發(fā)明者還確定，胰島素或酮的比率的一個(gè)主要但是以前沒有被認(rèn)識到的作用是以這種方式改變線粒體的氧化還原狀態(tài)，以增加ΔGATP水解，并且以此增加多種細(xì)胞位相之間的無機(jī)離子梯度以及增強(qiáng)心臟的生理功能。
本申請指出，這些酮體也可以提供治療抗胰島素癥的方法，其中在抗胰島素癥中，正常的胰島素信號傳導(dǎo)路徑被擾亂，并且由于代謝原因，心臟的液壓功能下降。本發(fā)明者已經(jīng)確定，與僅使用胰島素相比，使用酮體具有很大的優(yōu)點(diǎn)，通過閱讀下面的說明，其原因就很明顯，在一定程度上是因?yàn)橄朔駝t就會必需的碳水化物攝取控制。
本申請還提出了神經(jīng)變性病的問題，尤其是其中神經(jīng)元受到致病劑如蛋白斑塊的神經(jīng)毒害作用的疾病，并且還提供了用于治療這些和上述疾病的組合物。
阿耳茨海默氏病是遺傳性異基因組的進(jìn)行性致死性神經(jīng)病，其病理特征是，淀粉樣蛋白斑塊在腦內(nèi)積聚，臨床特征是近期記憶減弱，并可導(dǎo)致癡呆和死亡。阿耳茨海默氏病除了是由于遺傳原因以外，沒有明顯阿耳茨海默氏病家族史的散在性病例也有發(fā)生。例如，頭創(chuàng)傷后(73)，或刺激細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1生成的炎癥后(97)，發(fā)生的具有阿耳茨海默氏病特征的病理改變。
阿耳茨海默氏病的早期癥狀是近期記憶遺失，這與導(dǎo)致近期記憶減弱的海馬內(nèi)細(xì)胞的損傷和死亡有關(guān)。用磁共振成像法(MRI)對海馬體積進(jìn)行的測定表明，海馬的萎縮發(fā)生在記憶遺失臨床癥狀開始之前，并且在癥狀最先出現(xiàn)的2年期間每年約損失8％的體積(70)。
阿耳茨海默氏病是通過與顳葉海馬部位的損害有關(guān)的近期記憶減弱來進(jìn)行臨床診斷的。從神經(jīng)病理學(xué)上來說，此診斷依賴于發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)原纖維結(jié)、細(xì)胞外的淀粉樣蛋白或老年斑、以及神經(jīng)元數(shù)目的減少(61)。神經(jīng)原纖維結(jié)包含成對的高磷酸化τ蛋白，其中在沒有磷酸化時(shí)，τ蛋白在細(xì)胞內(nèi)的正常功能是，在微管蛋白在細(xì)胞內(nèi)形成微管的過程中結(jié)合并穩(wěn)定微管蛋白。除了其它激酶之外，τ蛋白的高磷酸化是由糖原合酶激酶3 β催化的，其去磷酸化是由蛋白磷酸酶2A-1、2B或1催化的(108)。
然而，在腦的病理變化和在阿耳茨海默氏病提早發(fā)作的記憶缺失之間，以及在腦部解剖結(jié)構(gòu)的病理變化和在“正常”老齡人口中發(fā)現(xiàn)的記憶功能之間，未必有清楚、明了的關(guān)系。更確切地說，此差別是依比例而定的定量關(guān)系(94)。在正常的老齡人口中，記憶功能的這種變化也伴有葡萄糖耐量的下降，這預(yù)示著不能代謝葡萄糖。在這種情況下，以校正阿耳茨海默氏病的病理生理進(jìn)程為目的的治療會有希望適于校正與正常的老齡化有關(guān)的代謝影響。
雖然家族型和散在型阿耳茨海默氏病是在老齡人口中所發(fā)現(xiàn)的主要的癡呆癥，但是也發(fā)現(xiàn)了其它類型的癡呆癥。它們包括但不限于與皮克病有關(guān)的額顳變性，血管性癡呆，雷維小體型老年性癡呆，具有額萎縮的帕金森神經(jīng)機(jī)能障礙性癡呆，進(jìn)行性核上性麻痹，以及與阿耳茨海默氏病有關(guān)的皮層基底(corticobasal)變性和唐氏綜合征。在海綿狀腦病如CJD、癢病和BSE中也發(fā)現(xiàn)有斑塊形成。本發(fā)明涉及這類神經(jīng)變性病，尤其是與神經(jīng)毒害性蛋白斑例如淀粉樣蛋白斑有關(guān)的疾病的治療。
在上述這些表面上看沒有聯(lián)系的疾病中，有許多具有在阿耳茨海默氏病中發(fā)現(xiàn)的高磷酸化的τ蛋白(69)，這表示有這種可能性，即將τ蛋白磷酸化的相同激酶也會將PDH復(fù)合物磷酸化，這會在線粒體的能量合成和乙酰膽堿合成中導(dǎo)致類似的缺乏，這種不利影響雖然是在阿耳茨海默氏病中發(fā)現(xiàn)的，但是也涉及其它腦區(qū)域。本發(fā)明者已經(jīng)確定，出于這種原因，適用于阿耳茨海默氏病的治療也適用于上述這些疾病。此外，本發(fā)明者還確定，適用于阿耳茨海默氏病的這種治療方法也適用于外周神經(jīng)消耗病，例如重癥肌無力和肌肉營養(yǎng)不良。
目前沒有有效的治療阿耳茨海默氏病的方法。研究方向是集中在確定其致病的遺傳原因上，但是，迄今為止還沒有任何成功的基因療法。遺傳研究已經(jīng)將阿耳茨海默氏病與先天愚型以及其早發(fā)病型和21位染色體上的基因位點(diǎn)聯(lián)系在一起，其中21位染色體上的基因位點(diǎn)引起淀粉樣蛋白前體(APP)積聚(73)，且在8個(gè)同種型中存在跨膜糖蛋白。通過蛋白水解作用得到了大量的淀粉樣蛋白前體的片斷，并且已經(jīng)表明，作為阿耳茨海默氏病特征的斑塊中含有積聚的β淀粉樣蛋白低聚體(Aβ1-42)。早發(fā)病常染色體顯性型阿耳茨海默氏病與14染色體上的早老基因1(presenilin 1)位點(diǎn)有關(guān)。
晚發(fā)病型阿耳茨海默氏病與19染色體上的載脂蛋白E的第4類等位基因(69，98)有關(guān)，然而，其它研究人員認(rèn)為，此明顯的相互關(guān)系是由α1抗凝乳蛋白酶的基因位點(diǎn)所聯(lián)系在一起的(100)。所有年齡超過18個(gè)月、淀粉樣蛋白前體表達(dá)量增加了的轉(zhuǎn)基因小鼠，都表現(xiàn)出了海馬變性以及許多阿耳茨海默氏病的病理特征(90)。
最近，已經(jīng)總結(jié)出了當(dāng)前對于阿耳茨海默氏病中有缺陷的基因和基因產(chǎn)物的認(rèn)識(參考文獻(xiàn)96中的表1)。
染色體 基因缺陷發(fā)病年齡 Aβ表型21 βAPP突變 50歲 生成Aβ1-42的所有Aβ肽19 apoE4多形性 60歲或更大 Aβ斑的密度和血管沉積物14 老基因1突變 40歲&50歲生成Aβ1-421 早老基因2突變 50歲 生成Aβ1-42從上表中可以清楚地看出，與遺傳型阿耳茨海默氏病有關(guān)的共同表型是淀粉樣肽Aβ1-42的積聚(96)。在正常的專性葡萄糖消耗組織中，是Aβ1-42使PDH失活，并且因此減少了線粒體內(nèi)能量和檸檬酸的生成(95)，同時(shí)使具有關(guān)鍵作用的神經(jīng)遞質(zhì)，乙酰膽堿的合成減少(67，68)。神經(jīng)元細(xì)胞中出現(xiàn)Aβ1-42與抗細(xì)胞凋亡蛋白的下調(diào)有關(guān)，并且使bax的水平升高，其中bax是已知與細(xì)胞死亡有關(guān)的蛋白(92)。除了含有Aβ1-42的淀粉樣蛋白斑、含有高磷酸化T蛋白的神經(jīng)纖維結(jié)、腦中乙酰膽堿的水平下降以外，細(xì)胞死亡是阿耳茨海默氏病的第4個(gè)病理特征。這些病理特征與Aβ1-42過量以及其對PDH的抑制作用有關(guān)，至少部分有關(guān)。
通過用乙酰膽堿酯酶抑制劑進(jìn)行治療(57)，可使臨床癥狀有適當(dāng)改善，大概是通過增加膽堿能物質(zhì)的輸出而起作用的，其中膽堿能物質(zhì)是在中隔細(xì)胞核中產(chǎn)生，并且穿過布羅卡氏對角帶運(yùn)送到腦緣系統(tǒng)前面的海馬中。然而，這個(gè)在阿耳茨海默氏病分子生物學(xué)方面的進(jìn)展已經(jīng)使尋找新療法的研究集中在下述4個(gè)重要領(lǐng)域(96)(i)能部分降低將Aβ(β淀粉樣蛋白片斷)從βAPP(β淀粉樣蛋白前體)中裂解出來的酶(β和γ分泌酶)的活性的蛋白酶抑制劑；(ii)能與細(xì)胞外Aβ結(jié)合并阻止其細(xì)胞毒性作用的化合物；(iii)能阻滯小神經(jīng)膠質(zhì)(腦巨噬細(xì)胞)激活作用、細(xì)胞素釋放、發(fā)生在腦部受影響區(qū)域的急性相位響應(yīng)的腦特異性抗炎藥物；和(iv)干擾Aβ引發(fā)的神經(jīng)毒害作用機(jī)制的化合物，例如抗氧化劑、神經(jīng)元鈣通道阻滯劑、或抗細(xì)胞凋亡劑。
本發(fā)明者提出的療法與上述四種方法不同，本發(fā)明的療法是通過施用酮體或其前體，來繞過由Aβ1-42抑制PDH而導(dǎo)致的新陳代謝生成能量過程中的阻塞。神經(jīng)元細(xì)胞能代謝這類化合物，甚至在葡萄糖缺乏時(shí)也是如此，對于腦，這類化合物是正常的能量底物(63)。因?yàn)橥茉黾覣TP水解的ΔG，所以細(xì)胞內(nèi)Na+和Ca2+的梯度都能增加，因此就能阻止與細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加有關(guān)的細(xì)胞死亡。此外，增加由三羧酸循環(huán)所產(chǎn)生的檸檬酸鹽(酯)，當(dāng)運(yùn)輸?shù)桨麧{中時(shí)，就能在胞漿中提供乙酰CoA，這是補(bǔ)償作為阿耳茨海默氏病特征的腦中乙酰膽堿缺乏所需要的。
校正代謝缺陷所需的提高血內(nèi)酮的濃度可通過腸胃外、腸胃內(nèi)給藥途徑或飲食途徑來達(dá)到，并且不需要施用具有潛在毒性的藥物活性劑。
在兒童中食用生酮食物來治療癲癇已有很長的歷史。然而，這類食物對于成人則不適用，因?yàn)槠鋵ρh(huán)系統(tǒng)有不利作用。本發(fā)明所用的酮體能提供這類食物所具有的所有療效，但是沒有發(fā)現(xiàn)其本身對兒童有毒性，對以前從未用過的成人沒有任何副作用。此外，本發(fā)明者確定，在校正上述代謝缺陷的同時(shí)，細(xì)胞素反應(yīng)和細(xì)胞死亡肽在變性細(xì)胞中的增加都會下降，這是因?yàn)樵谏窠?jīng)元細(xì)胞中能態(tài)增加了，并且由于乙酰膽堿合成的增加，營養(yǎng)刺激增強(qiáng)了。
自本申請的優(yōu)先權(quán)日期以來，EP 0780123 A1已經(jīng)被公開了，其中涉及使用乙酰乙酸，β-羥基丁酸，β-羥基丁酸及其一元、二元或三元醇酯或β-羥基丁酸的低聚體來抑制腦水腫，保護(hù)腦功能，調(diào)節(jié)腦的能量代謝以及減輕腦梗塞的程度。然而，需要注意的是，從1979年就已經(jīng)知道，羥基丁酸鈉能使腦循環(huán)和局部血管舒縮能力增加高達(dá)40％(Biull.Eksp.Biol.Med Vol 88 11，pp555-557)?，F(xiàn)在本發(fā)明者提供的治療對腦循環(huán)的作用已超過了上述效果，因?yàn)槠鋵τ捎谏窠?jīng)變性，例如由神經(jīng)毒害劑如肽和蛋白引起的變性，和遺傳異常所引起的不能行使功能的細(xì)胞提供了治療方法。本發(fā)明的治療包括酮體對細(xì)胞自身和非血流部分的作用。
在將本發(fā)明付諸實(shí)施的過程中，本發(fā)明者還確定，通過以足以能使血中酮體總濃度升高的量，把酮體直接給藥或以其代謝前體的形式給藥，結(jié)果不是單純地維持細(xì)胞的存活力，實(shí)際上是以與血流或營養(yǎng)無關(guān)的方式使細(xì)胞的功能和生長改善到超過正常水平，即對照水平。從這方面來看，本發(fā)明還提供了酮體作為神經(jīng)興奮因子的用途，興奮因子即為神經(jīng)生長因子和能刺激神經(jīng)元功能增強(qiáng)的因子，例如代謝速度加快和功能性特征如軸突和樹突的范圍變寬的因子。本發(fā)明的這個(gè)方面對于改善神經(jīng)元功能和僅阻滯降解提供了機(jī)理。
Hoshi和合作者(77，78)的近期工作強(qiáng)有力地指出，其積聚是阿耳茨海默氏病證明的部分淀粉樣蛋白，Aβ1-42起線粒體組氨酸蛋白蛋白激酶的作用，其中線粒體組氨酸蛋白激酶能將丙酮酸脫氫酶多酶復(fù)合物磷酸化并使其失活。PDH復(fù)合物是線粒體中的酶，其作用是由丙酮酸生成乙酰CoA和NADH，其中丙酮酸是通過在胞漿中的糖酵解作用生成的。在線粒體中生成的乙酰CoA與草酰乙酸縮合來啟動三羧酸循環(huán)，將丙酮酸完全轉(zhuǎn)化成CO2，同時(shí)提供給線粒體還原當(dāng)量，還原當(dāng)量變成電子傳遞系統(tǒng)的底物，通過電子傳遞系統(tǒng)生成了在線粒體中合成ATP所需的能量。因此，PDH處于細(xì)胞兩個(gè)主要能量產(chǎn)生途徑，糖酵解和三羧酸循環(huán)的交叉路口，很明顯在活細(xì)胞中起著至關(guān)重要的作用。
PDH被抑制后有兩種主要后果。第一，對于在正常的代謝狀態(tài)下完全依靠葡萄糖來生成能量的神經(jīng)元組織，PDH被抑制會導(dǎo)致能量生成的效率下降，ATP的水解能降低，乙酰CoA和TCA循環(huán)前1/3段中的代謝產(chǎn)物都減少，以及線粒體中NADH缺乏(95)。ATP水解能的下降會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Na+和Ca2+增加，細(xì)胞的K+損失，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡(86)。對于近期記憶的固定至關(guān)重要的海馬細(xì)胞，對許多損傷特別敏感，海馬細(xì)胞的死亡是阿耳茨海默氏病的臨床和病理標(biāo)志。
PDH被抑制的第二個(gè)主要后果是，線粒體中缺乏檸檬酸(95)。檸檬酸或其代謝物被從線粒體運(yùn)輸?shù)桨麧{中，在胞漿中被ATP檸檬酸裂解酶(EC 4.1.3.8)將其轉(zhuǎn)化成胞液中的乙酰CoA，其反應(yīng)如下檸檬酸根3-+ATP4-+CoASH＞乙酰CoA+草酰乙酸根2-+ADp3-+HPO42-然后在下述反應(yīng)中，乙酰CoA通過膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶(EC 2.3.1.6)的作用與膽堿結(jié)合以生成乙酰膽堿膽堿++乙酰CoA＞CoASH+乙酰膽堿-將中隔細(xì)胞的神經(jīng)元培養(yǎng)物在1μm的Aβ1-42中放置24小時(shí)，結(jié)果顯示，乙酰膽堿的生成降低了5倍以上(78)，膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶的活性沒有任何下降。推斷乙酰膽堿生成減少的原因是，由于TPKI/GSP-3β蛋白激酶的作用，使PDH復(fù)合物被抑制，隨后PDH被磷酸化，導(dǎo)致乙酰CoA缺乏。
如上所解釋的那樣，分離的工作心臟僅用不含有胰島素的10mM葡萄糖灌注后，其變得沒有效力，并且線粒體中的能量生成減少。通過供給生理比例的、由4mM的D-β羥基丁酸和1mM的乙酰乙酸構(gòu)成的酮體，細(xì)胞內(nèi)能量生成的缺損可以完全恢復(fù)正常(95)。據(jù)認(rèn)為，腦只能利用葡萄糖作為其代謝能源，并且對胰島素的作用不敏感。然而，在1967年進(jìn)行的一項(xiàng)著名臨床研究中，George Cahill和其合作者(47)表明，在進(jìn)行長時(shí)間禁食的肥胖病人中，腦所需的代謝能量有高達(dá)60％可由酮體提供。更引人注目的是，Cahill表明，將胰島素以足以使病人的血糖從4mM降到2mM的劑量對這些病人給藥，這些病人的精神功能沒有任何損害，其中在這些病人中，D-β羥基丁酸的血中濃度是5.5mM，乙酰乙酸是2mM(參見參考文獻(xiàn)63中的圖3)。很明顯，當(dāng)酮體在血中存在的水平為5mM以上時(shí)，它們能成為腦通常所需的葡萄糖的替代物，并且能消除高血糖癥狀，其中當(dāng)血糖水平為1.5mM時(shí)預(yù)計(jì)會出現(xiàn)高血糖癥狀。
酮體在腦中的利用受運(yùn)輸?shù)南拗?，在基底神?jīng)節(jié)中，酮體在血中的水平低于1mM時(shí)，具有較低的利用率(76)。然而，在正常人中通過長時(shí)間禁食后達(dá)到的7.5mM的水平時(shí)，酮體進(jìn)入腦中的比率足以能滿足腦部主要的能量需要，并且能阻止高血糖癥狀，甚至當(dāng)血糖水平高到通常會引起驚厥和昏迷的程度時(shí)，也是如此(63)。
本發(fā)明者假定，在阿耳茨海默氏病中，即PDH被阻滯而阻礙了從葡萄糖中進(jìn)行正常的能量生成，如果可以增加酮體的水平，例如正常禁食后達(dá)到的酮體水平，就能繞過這些病人中PDH被阻滯所帶來的影響，因此就能阻止由于能量耗盡或缺乏膽堿能刺激而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡，并且因此能延緩記憶喪失和癡呆的發(fā)展進(jìn)程。
此外，利用神經(jīng)生長/酮體，尤其是D-β羥基丁酸或其與乙酰乙酸生理比例的混合物的刺激作用，可使仍然存活的細(xì)胞被改善到比其已經(jīng)退化的狀態(tài)要好的狀態(tài)，在這些病人中也將發(fā)現(xiàn)功能有一些改善。
在飼養(yǎng)動物和人中，乙酰乙酸在基本上由血組成的肝內(nèi)容物中的濃度很低，其濃度是0.09mM，D-β羥基丁酸的濃度是0.123mM，但是禁食24小時(shí)后，乙酰乙酸的濃度升至0.65mM，D-β羥基丁酸的濃度升至1.8mM(84)。在饑餓狀態(tài)下酮體水平增加的原因是，胰島素的水平下降，使得脂肪酸在脂肪組織中再酯化成甘油三酯的作用減弱，因此就使游離的脂肪酸釋放到血流中。釋放的游離脂肪酸可以被吸收，并且被用作肌肉、心臟、腎和肝臟進(jìn)行β氧化的能源。然而，肝臟能將游離脂肪酸轉(zhuǎn)化成代謝燃料，酮，以被肝外器官如腦在禁食期間用作葡萄糖的替代物。在下述一系列反應(yīng)中，酮體在肝臟中的合成從線粒體中的乙酰CoA開始，其中乙酰CoA是在肝臟將脂肪酸β氧化期間生成的
一旦在肝臟中合成后，酮體就通過下述反應(yīng)，由一元羧酸-H’共載體(20)將其從肝臟中轉(zhuǎn)運(yùn)到血流中
酮體在相同的載體上進(jìn)入肝外組織中，其中其它一元羧酸載體可起競爭性抑制劑的作用。非生理異構(gòu)體例如D-乳酸或L-β羥基丁酸也可以作為酮體運(yùn)輸?shù)母偁幮砸种苿?。因?yàn)橥w穿過血腦屏障的運(yùn)輸是酮體在腦中利用的限制性因素(76)，因此在生酮治療期間，應(yīng)作出所有努力以使這些非生理對映異構(gòu)體在血中的濃度保持低水平。當(dāng)體內(nèi)血液酮體濃度達(dá)到在饑餓狀態(tài)下所發(fā)現(xiàn)的濃度時(shí)，心臟、肌肉、腎和腦就利用酮體作為優(yōu)選的能量底物
檸檬酸根3-——→三羧酸TCA循環(huán)因此本發(fā)明者確定，在依靠葡萄糖的代謝來供給代謝能量的組織中，線粒體中從酮體產(chǎn)生的乙酰CoA因此能補(bǔ)充在PDH多酶復(fù)合物被抑制期間所導(dǎo)致的乙酰CoA缺乏。線粒體中所提供的檸檬酸也可以通過三羧酸或二羧酸載體運(yùn)輸?shù)桨麧{中，在胞漿中檸檬酸可以轉(zhuǎn)化成合成乙酰膽堿所需的胞漿乙酰CoA。流程式I顯示了三羧酸循環(huán)中的反應(yīng)，以幫助進(jìn)一步闡明這些概念。
肝臟不能利用酮體，因?yàn)槠淙狈π纬梢阴Ｒ阴oA所必需的3氧代酸CoA轉(zhuǎn)移酶。與游離脂肪酸相反，酮體在肝臟中不能產(chǎn)生乙酰CoA。因?yàn)橐阴oA是脂肪酸通過丙二酸單酰CoA的合成以及膽固醇通過胞漿HMG CoA的合成所必需的前體，所以酮體在肝臟中既不能使脂肪酸的合成增加，也不能使膽固醇的合成增加，通常這可以解釋為什么有一半以上的酮體不能合成這兩種潛在的致病物質(zhì)。肝臟對于其中的乙酰乙酸/D-β-羥基丁酸的比例敏感，并且將改變其線粒體中的[NAD+]/[NADH]，這是因?yàn)棣?羥基丁酸脫氫酶(EC 1.1.1.30)建立了一個(gè)近似平衡(55)。
流程式1
最早增加體內(nèi)酮體的方法是饑餓。通過長時(shí)間禁食，血液酮體水平可達(dá)到7.5mM(62，63)。然而，這種方法不能長期使用，因?yàn)橥ǔ＝?0天后就會導(dǎo)致死亡。
自1921年起，就已經(jīng)在兒童中使用主要含有脂質(zhì)的生酮食物來治療癲癇癥，尤其是肌陣攣癥和運(yùn)動不能癥的癲癇發(fā)作(109)，并且已經(jīng)證實(shí)對于用常規(guī)藥物很難治療的癲癇癥是有效的(71)。只要碳水化合物和胰島素的水平低到能阻止脂肪組織中的再酯化作用，口服或非腸胃給藥游離脂肪酸或甘油三酯就能提高血液酮體水平。給大鼠喂養(yǎng)含有70％的玉米油、20％的酪蛋白水解產(chǎn)物、5％的纖維素、5％的McCollums鹽混合物的食物，可使血液酮體水平達(dá)到約2mM。用豬油替代玉米油可使血液酮體水平幾乎升至5mM(Veech，未出版)。
傳統(tǒng)生酮飲食的一個(gè)實(shí)例是，由Marriott Corp.Health CareServices，Pediatric Diet Manual，Revised August 1987推薦，適用于4-6歲、患有癲癇癥的兒童，1500卡路里/天的生酮飲食，其中脂肪的食用量是，每食用1克碳水化合物和蛋白質(zhì)，就須食用3-4克脂肪。每3餐患者必須吃48-50g脂肪，僅吃6g蛋白質(zhì)和10-6.5g碳水化合物。實(shí)際上，這意味著每天患病兒童必須吃32g人造奶油(約1/4條)，并且每餐喝92g主要含有中鏈甘油三酯的濃乳油(約100ml)。
使脂肪酸與碳水化合物和蛋白質(zhì)的混合物之間的比例達(dá)到3∶1的飲食的實(shí)例列在下面的表1中。
表1.其中脂質(zhì)/(碳水化合物+蛋白質(zhì))＝3∶1的1500卡路里飲食的實(shí)例量(g) 脂肪(g) 蛋白質(zhì)(g)碳水化合物(g)早餐雞蛋 32 44蘋果汁 70 7人造奶油 11 10濃乳油 92 34 23早餐的總量48 610午餐瘦牛肉 12 1.75 3.5
烹調(diào)好的胡蘿卜 45 0.6 3罐頭梨 40 4人造奶油 14 12.5濃乳油 92 3423午餐的總量 48.25 6.1 10晚餐牛肉香腸 22.5 6 3烹調(diào)好的花椰菜 50 12西瓜 75 5人造奶油 87.5濃乳油 92 3423晚餐的總量 47.5 610每天的總量 143.7518.1 30通常，食用這種飲食后獲得的酮體水平約為2mM的D-β-羥基丁酸和1mM的乙酰乙酸，同時(shí)游離脂肪酸的水平約為1mM。其它含有中鏈甘油三酯的不同組合物也已嘗試過。通常，兒童對這種被限制的飲食的順從性不好，因?yàn)槠湮兜啦缓?56)。高脂質(zhì)和低碳水化合物的食物也已經(jīng)被嘗試作為治療劑在癌癥病人中使用，以降低腫瘤對葡萄糖的利用效力(88)，作為體重減輕劑在患有及沒患有糖尿病的患者中使用(74，112)，以改善運(yùn)動耐受力(83)。
依靠脂質(zhì)來將血液酮體提高到神經(jīng)病學(xué)上的有效水平的飲食有很多局限性。首先，基于脂質(zhì)飲食的酮體水平趨向于3mM以下，比正常的肥胖人在禁食期間獲得的7.5mM的血液酮體水平要低很多。第二，未經(jīng)允許食入碳水化合物會增加胰島素的分泌量，使游離脂肪酸在肝臟中轉(zhuǎn)化成酮體的量迅速下降，結(jié)果使血液酮體水平下降，并且脂質(zhì)轉(zhuǎn)而被脂肪組織酯化成甘油三酯。在“用生日蛋糕破壞其飲食”的兒童中，有許多關(guān)于癲癇重新發(fā)作的軼事。第三，不可口，以及避免食用碳水化合物來維持高的血液酮體水平，使得這類高脂質(zhì)飲食很難在屬于或不屬于病人范疇的成人中使用，尤其在其傳統(tǒng)飲食是大量食用精煉糖、面包、意大利面食、米飯和馬鈴薯的社會中，更是如此。實(shí)際上，除了其年齡屬于所有的食物都是在家中在嚴(yán)格監(jiān)督下準(zhǔn)備的兒童以外，不可能強(qiáng)迫病人食用傳統(tǒng)的高酮飲食。第四，在成人中食用大量的脂質(zhì)物質(zhì)會導(dǎo)致嚴(yán)重的高甘油三酯血癥，其病理后果是增加患血管病、散發(fā)性肝病和胰腺病的危險(xiǎn)，因此脂質(zhì)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域不能開處方使用。在二十世紀(jì)七十年代，食用高脂質(zhì)、低碳水化合物飲食來減輕體重很流行，只要碳水化合物的攝取量少，即使攝取了高卡路里的熱量也不在乎。然而，因?yàn)閷Ω哐蛣用}粥樣硬化之間的聯(lián)系的認(rèn)識提高了，食用這種飲食的人口突然下降。
用葡萄糖或外消旋的1，3-丁二醇給流質(zhì)飲食補(bǔ)充47％的熱量，會使血液酮體濃度提高約10倍，達(dá)到0.98mM的D-β羥基丁酸和0.33mM的乙酰乙酸(107)。這些血液酮體濃度值比禁食48小時(shí)所通常獲得的值稍低，比在禁食的男性中獲得的7.5mM的血液酮體水平要低很多。外消旋的1，3-丁二醇被肝臟轉(zhuǎn)化成乙酰乙酸和非天然的L-β羥基丁酸及天然的D-β羥基丁酸(分別是(S)3-羥基丁酸和(R)3-羥基丁酸)。雖然外消旋1，3-丁二醇作為動物食物中的廉價(jià)熱量來源已廣泛研究過，并且甚至已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)上用于人的飲食中(81，101)，但是從長遠(yuǎn)來看，生成的非天然L-異構(gòu)體會產(chǎn)生嚴(yán)重毒性，就如在食用非天然的D-乳酸的人中所表現(xiàn)出來的毒性-樣(64)。施用非天然L-異構(gòu)體的一個(gè)缺點(diǎn)是，L-異構(gòu)體會與天然的D-β羥基丁酸競爭運(yùn)輸。因此(R)1，3-丁二醇作為酮體的前體的條件是避免施用或產(chǎn)生不需要的非天然異構(gòu)體。
已經(jīng)有人提出將外消旋的1，3-丁二醇的單酯或二酯作為熱量來源，并且在豬中試驗(yàn)過(67)。口服一大丸其中有30％的熱量是由所述酯產(chǎn)生的食物，可使血液酮體水平最高達(dá)到5mM。然而，由于上述原因，不建議使用外消旋的1，3-丁二醇及其異常的(S)3-羥基丁酸的產(chǎn)物。
雖然不建議將外消旋的1，3-丁二醇用于這種制劑，但是(R)1，3-丁二醇的酯可以使用，可以獨(dú)自使用，或作為乙酰乙酸的酯使用。通過將D-β羥基丁酸單體用例如LiAlH4還原，可以很容易地合成到(R)1，3-丁二醇。(R)1，3-丁二醇在肝臟中被氧化，生成了D-β羥基丁酸，其中肝的氧化還原狀態(tài)沒有明顯改變。在大鼠中進(jìn)行的試驗(yàn)表明，喂外消旋的1，3-丁二醇會使肝臟胞漿中的[NAD-]/[NADH]從1500降到1000(87)。作為比較，施用乙醇使[NAD-]/[NADH]降到約200(106)。
當(dāng)乙酰乙酸剛制備出來時(shí)，其可以用在輸液中，在輸液中可將其調(diào)至正常的生理比例以達(dá)到最佳效果(95)。因?yàn)樯a(chǎn)時(shí)通常需要長的保存期限和經(jīng)過加熱滅菌的流體，乙酰乙酸通常以酯的形式提供。這樣可以增加其保存期限并且在加熱滅菌期間可以提高其穩(wěn)定性。在血流中，據(jù)估計(jì)酯酶的活性約為0.1mmol/min/ml，在肝臟中約為15mmol/min/g(68)。除了1，3-丁二醇和乙酰乙酸形成的酯以外，在腸胃外和腸內(nèi)施用的營養(yǎng)品中，乙酰乙酸的甘油酯也已廣泛研究過。據(jù)報(bào)道，這種制劑能減輕腸萎縮，這是因?yàn)槟c細(xì)胞攝取了大量的乙酰乙酸酯，并且能用于治療燒傷(85)。
然而，無論是形成乙酰乙酸的1，3-丁二醇還是葡萄糖的前體甘油，都不是氧化還原對D-β羥基丁酸酯/乙酰乙酸還是中的-部分。對于本發(fā)明，在最佳條件下，應(yīng)當(dāng)提供生理比例的酮體。如果不這樣的話，在所有動物中，肝臟就會依據(jù)自己線粒體中游離的[NAD-]/[NADH]，來調(diào)節(jié)酮體的比例。如果提供了異常比例的酮體，很明顯就可能產(chǎn)生病理后果。在工作心臟中，將乙酰乙酸作為唯一的底物灌注，就會迅速地引發(fā)心力衰竭(99)，與之相反的是，用葡萄糖、乙酰乙酸和D-β羥基丁酸酯的混合物灌注大鼠的心臟，心臟的效力就會由于生理比例的酮體而提高(95)。
既不需要攝取大量的脂質(zhì)，也不使用能產(chǎn)生生理不相容異構(gòu)體L-β-羥基丁酸酯的物質(zhì)的酮體的最佳外源性來源是，酮體自身。然而，本發(fā)明也提供了在治療中用于給藥的替代物。
第一個(gè)替代物是D-β羥基丁酸的聚酯。天然的D-β羥基丁酸聚酯作為商品銷售，從產(chǎn)鹼桿菌屬eutrophus中得到的分子量為530000的聚合物(Sigma Chemical Co.St.Louis)，或從甜菜中得到的分子量為250000的聚合物(Fluka，瑞士)。細(xì)菌產(chǎn)生這種聚合物來作為儲備營養(yǎng)源。通過細(xì)菌來發(fā)酵這些聚合物的方法在二十世紀(jì)七十年代，是由聯(lián)合王國的ICI和比利時(shí)的Solvay et Cie開發(fā)出來的，當(dāng)時(shí)是作為具有潛在的生物可降解性的用于塞子蓋和其它用途的塑料?，F(xiàn)在，已經(jīng)克隆了用于合成聚D-β-羥基丁酸的系統(tǒng)，并且已證實(shí)，根據(jù)提供給細(xì)菌的底物的不同，所產(chǎn)生的聚合物的組成就不同。然而，這些聚合物未能與以塑料為基礎(chǔ)的石油競爭。雖然如此，用于合成聚鏈烷酸酯的基因已經(jīng)克隆出來了，并且已在多種微生物體(93，102，113)中表達(dá)，這種基因使得可以在各種各樣的微生物體中，在可變性非常強(qiáng)的條件下來生成聚鏈烷酸酯。
聚D-β-羥基丁酸隨著不同的生物來源而具有多種形式，如味道很輕且沒有任何氣味的不溶性粉末，適于加到用于口服或通過其它途徑給藥的組合物中。在血漿和大多數(shù)細(xì)胞中，能使這類材料中的酯鍵斷裂的酯酶是無所不在的。這些聚合物在體外通過堿水解也很容易裂解，使一系列聚合物最終能生成分子量為104單體，這些單體可通過正常的單羧酸酯載體從腸中運(yùn)輸?shù)介T靜脈中?；?，可用涉及Fluka增進(jìn)材料的已知方法進(jìn)行酸水解。
D-β-羥基丁酸聚合物的優(yōu)選形式是酮體易于被消化和/或被人或動物代謝的低聚體。這些低聚體優(yōu)選為2-100重復(fù)長度，一般是2-20重復(fù)長度，最合適的是3-10重復(fù)長度。需要認(rèn)識到的是，可以使用這種低聚體的混合物，其優(yōu)點(diǎn)是可以獲得一定范圍的吸收特征。
一旦單體被吸收到血流中，因?yàn)楦闻K不能代謝酮體，并且只能改變D-β-羥基丁酸/乙酰乙酸的比例，所以酮體就被運(yùn)輸?shù)狡淠鼙焕玫母闻K外組織中。達(dá)到的血液酮體水平不能因?yàn)槲赐瑫r(shí)攝入碳水化合物而發(fā)生改變，因?yàn)樵谶@種情況下存在有生酮飲食。而且，它們可以只作為正常飲食的添加劑，根據(jù)所要治療的疾病，它們以能足以在24小時(shí)期間內(nèi)產(chǎn)生恒定的血液酮體水平，一般是0.3-20mM，優(yōu)選為2-7.5mM的量提供。當(dāng)治療兒童癲癇癥時(shí)，2mM的血液酮體水平通常認(rèn)為已足夠了。對于阿耳茨海默氏病，可以使血液酮體水平維持在7.5mM，即在男人禁食試驗(yàn)中所達(dá)到的水平，以給其中PDH的功能被過量Aβ1-42淀粉樣肽(77，78)減弱的阿耳茨海默氏病人的腦組織提供代替能量和補(bǔ)充乙酰CoA。
本發(fā)明者確定，D-β-羥基丁酸和其與乙酰乙酸的混合物能起神經(jīng)興奮劑的作用，例如神經(jīng)生長興奮劑和/或軸突和樹突生長興奮劑，這使得可以選擇將酮體水平提高到比營養(yǎng)所需的水平要低的程度，以治療神經(jīng)變性。
本發(fā)明的組合物優(yōu)選無菌，并且不含有熱原，尤其是不含有內(nèi)毒素。其次，本發(fā)明的組合物優(yōu)選這樣配制，即當(dāng)其作為添加劑加到正常飲食中時(shí)，它們是可口的，以改善病人在攝取這些補(bǔ)充劑時(shí)的順應(yīng)性。低聚體和聚合物通常沒有味道和氣味。使用制藥領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)，D-β-羥基丁酸和其與乙酰乙酸的混合物可以用遮蔽劑包衣，或進(jìn)行腸包衣以使其在腸中定位釋放，或?qū)⑵溲b入膠囊中。
因?yàn)橥w含有約6卡路里熱量/g，因此優(yōu)選將其它營養(yǎng)成份的量補(bǔ)償性減少，以避免引起肥胖。
使用酮體或其前體例如D-β-羥基丁酸的聚合物或低聚體或乙酰乙酸酯的特別優(yōu)點(diǎn)是1)它們可以與正常的碳水化合物食物一起吃，而不會削弱其效果，2)它們不會增加血中VLDL的水平，如含有乳油和人造奶油的食物通常所引起的血VLDL的增加，因此能消除患血管病、脂肪肝和胰腺炎的可能性增加的危險(xiǎn)，3)它們具有很寬的作用范圍，能用在多種病人中，包括用在II型糖尿病人中以防止低血糖癥的發(fā)作和昏迷，用在阿耳茨海默氏病和其它神經(jīng)變性病人中以阻止神經(jīng)細(xì)胞例如海馬細(xì)胞死亡，用在因?yàn)槟X中葡萄糖載體減少、糖酵解缺損，或所謂的PDH先天缺損的利氏綜合征而引起的頑固性癲癇癥中。
第二類特別的替代物是D-β-羥基丁酸的乙酰乙酸酯。能提供生理比例，例如1∶1-1∶20，更優(yōu)選1∶1-1∶10的乙酰乙酸與D-β-羥基丁酸的酯是優(yōu)選的。具有末端乙酰乙酸殘基的D-β-羥基丁酸四聚體是特別優(yōu)選的。這類物質(zhì)具有的額外優(yōu)點(diǎn)是，具有生理比例的D-β-羥基丁酸/乙酰乙酸部分，因此就能消除肝臟必須調(diào)節(jié)給藥營養(yǎng)物的氧化還原狀態(tài)的負(fù)擔(dān)，不會誘導(dǎo)與過量的醇消耗一起發(fā)生的肝臟中[NAD+]/[NADH]的異常還原。隨著其長度的增加，聚酯的水溶性遞減，但是熱穩(wěn)定性更好。這類聚合物可以例如在乳劑中以口服或非腸道給藥，其中非酯化狀態(tài)的乙酰乙酸是較不優(yōu)選的，因?yàn)槠湟子谧园l(fā)地脫羧形成丙酮，在室溫下其半衰期約為30天。
下面給出能用作酮體前體的聚D-β-羥基丁酸或末端被氧化的聚D-β-羥基丁酸酯的實(shí)例。
聚(R)3-羥基丁酸 未端(R)(R)3-羥基 未端(R)3-羥-3-羥基丁?；鶜埢∷釟埢∷釟埢谎趸木?R)3-羥基丁酸 乙酰乙酸酯殘基 (R)3-羥基 未端(R)3-羥丁?；鶜埢∷釟埢诿恳环N情況下，n被選擇為，對人體或動物體給藥后，聚合物和低聚體能容易地被代謝，以提高血液酮體水平。n優(yōu)選為1-1000的整數(shù)，更優(yōu)選為0-200的整數(shù)，然而更優(yōu)選為1-50的整數(shù)，最優(yōu)選為1-20的整數(shù)，特別合適的是3-5的整數(shù)。
也可以嘗試多種這類物質(zhì)，包括D-β-羥基丁酸自身的聚酯在內(nèi)，來尋找具有合適制備特征的物質(zhì)。這種物質(zhì)是無味的白色粉末。經(jīng)過部分堿水解后，可以獲得具有不同鏈長度的聚合物的混合物，這種混合物可以使腸吸收平和，并且可以在24小時(shí)期間內(nèi)維持恒定的血液酮體水平。
治療可以包括，給病人提供占其熱量攝取量一大部分的制成緩釋劑型的聚D-β-羥基丁酸酯，以在24小時(shí)期間內(nèi)維持高血液酮體水平，例如0.5-20mM，優(yōu)選2-7.5mM。酮體釋放到血液的過程可以用多種技術(shù)來限制，例如制成微膠囊，吸收以及通常在多種藥物制劑的口服給藥中使用的技術(shù)。當(dāng)給藥物質(zhì)不需要在酸性環(huán)境下水解時(shí)，可以特別利用腸包衣以使藥物經(jīng)過胃在腸中定位釋放。當(dāng)需要一些這類水解時(shí)，可以采用未包衣形式。一些形式可包括能將酯裂解來釋放酮體的酶，例如在Doi.Microbial Polyester中提到的酶。
靜脈輸注D-β-羥基丁酸的鈉鹽已在正常的受試者和各種痰病的病人中進(jìn)行過，例如正在集中的醫(yī)療單位中治療膿毒病的病人。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其沒有毒性，并且能減少葡萄糖游離脂肪酸和甘油的濃度，但對于減少亮氨酸的氧化沒有效果。
D-β-羥基丁酸單體是白色、無氣味、且具有輕微辛辣或酸味的晶體，其酸味強(qiáng)度比醋或檸檬汁小。其可以配制成大多數(shù)食品，例如飲料、布丁、搗碎的蔬菜或惰性填料。D-β-羥基丁酸適于口服，因?yàn)槠鋚Ka為4.4。其酸性比pKal為3.1、pKa2為4.8的檸檬酸要弱，比pKa為4.7的乙酸要強(qiáng)一點(diǎn)。
優(yōu)選在制劑中只使用天然的D-或(R)異構(gòu)體。因?yàn)樵趯?shí)際中不能達(dá)到絕對異構(gòu)體純度，通常由Sigma，St.Louis MO或Fluka，Ronkonkoma，NY出售的這類商品最適于本發(fā)明的應(yīng)用。市售的D-β-羥基丁酸在Na波長處的旋光度是-25°±1，熔點(diǎn)是43-46℃。D-β-羥基丁酸的鈉鹽的旋光度是-14.5°，熔點(diǎn)是149-153℃。上述兩種市售產(chǎn)品都可以用D-β-羥基丁酸酯脫氫酶(EC 1.1.1.30)通過標(biāo)準(zhǔn)酶法分析來測定(5)。乙酰乙酸可用相同的酶測定(56)。非生理(S)異構(gòu)體不能用酶法分析測定，但可以用氣相色譜質(zhì)譜法測定(13)。
對于1500卡路里熱量的飲食，成年病人每天可以消耗198g酮體。對于相同比例的2000卡路里熱量的飲食，成年病人每天可以消耗264g酮體。食用生酮脂質(zhì)飲食，血液酮體水平能增加到約2mM。食用酮飲食，血液酮體水平會更高，這是因?yàn)橥w已經(jīng)被同等熱量的脂肪替代，即1.5g酮/1g脂肪。相應(yīng)地，血液酮體水平約為3mM，但仍比禁食男人所獲得的7.5mM要低。
直接使用酮體有一些優(yōu)點(diǎn)。首先，直接提供酮體不需要限制碳水化合物，因此能提高飲食制劑的可口性，尤其在通常食用高碳水化合物的民族中更是如此。其次，酮體能被肌肉、心臟和腦組織代謝，但不能被肝臟代謝。因此就避免了形成脂肪肝，而形成脂肪肝是食用生酮飲食的不利副作用。第三，在飲食制劑中可以包含碳水化合物，使得依從機(jī)會增加了，并且開辟了治療其中胰島素很高使得不能使用已知生酮飲食的II型糖尿病的實(shí)用方法。
本發(fā)明者已經(jīng)確定，雖然酮體的任何增加都是可取的，但是酮體優(yōu)選給藥的量是，其足以使血液酮體水平增加到0.5mM-20mM，優(yōu)選2mM-7.5mM，尤其當(dāng)希望能防止在疾病例如阿耳茨海默氏病中的腦細(xì)胞死亡時(shí)，更是如此。雖然已死亡的細(xì)胞不能被復(fù)活，但是阻止進(jìn)一步的惡化或至少恢復(fù)一些功能是可以預(yù)期達(dá)到的。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是，其提供了乙酰乙酸、D-β-羥基丁酸或二者中任一物質(zhì)的代謝前體在制備具有下述用途的藥物或營養(yǎng)補(bǔ)品中的應(yīng)用(i)用來增強(qiáng)心臟效力，尤其是利用葡萄糖的效力，(ii)用來提供能源，尤其在治療糖尿病和抗胰島素癥過程中提供能源或增強(qiáng)身體對胰島素的反應(yīng)性，(iii)用來逆轉(zhuǎn)、延緩或阻止與疾病有關(guān)的神經(jīng)細(xì)胞的損害或死亡，所述疾病尤其是神經(jīng)變性病，例如與記憶有關(guān)的疾病如阿耳茨海默氏病，癲癇發(fā)作或相關(guān)疾病如腦病例如CJD和BSE。
術(shù)語“其代謝前體”尤其是指，包含1，3-丁二醇、乙酰乙酰基或D-β-羥基丁酸部分的化合物，例如乙酰乙?；?1，3-丁二醇、乙酰乙?；?D-β-羥基丁酸酯、和乙酰乙?；视?。這類化合物與一元、二元或三元醇形成的酯也包括在內(nèi)。
本發(fā)明的這個(gè)方面包括所述化合物作為神經(jīng)元興奮劑的用途，它們能例如尤其在神經(jīng)發(fā)生具有嚴(yán)重的臨床后果的疾病中，刺激軸突和/或樹突在神經(jīng)細(xì)胞中的生長，例如在海馬或黑質(zhì)的神經(jīng)細(xì)胞中的生長。
在糖尿病患者中，使用這些化合物可以維持低的血糖水平，而不用擔(dān)心發(fā)生低血糖并發(fā)癥。在正常的非糖尿病受試者中，禁食后的血糖水平是80-90mg％(4.4-5mM)，進(jìn)餐后增加到130mg％(7.2mM)。在糖尿病患者中，“嚴(yán)格控制”糖尿病長期以來都被推薦為阻止血管并發(fā)癥的方法，但是實(shí)際上，患者已發(fā)現(xiàn)，因?yàn)榈脱前l(fā)作，飯后很難使血糖水平嚴(yán)格地控制在150mg％(8.3mM)以下。在其血糖水平降到2mM的正常受試者中，會頻繁地發(fā)生低血糖休克。正如以前所討論的那樣(62，63)，在5mM的血液酮體存在下，當(dāng)血糖降到1mM以下時(shí)，不會有任何神經(jīng)病學(xué)上的癥狀。
本發(fā)明者已確定，給II型糖尿病患者補(bǔ)充酮體能更好地控制血糖水平，因此就能阻止眼睛和腎中的血管發(fā)生變化，而眼睛和腎中的血管變化在患糖尿病20年后會發(fā)生，并且在糖尿病患者中是導(dǎo)致發(fā)病和死亡的主要原因。
當(dāng)治療癲癇發(fā)作相關(guān)疾病，例如通過生酮飲食來治療的頑固性癲癇時(shí)，使用酮體、其聚合物或酯或前體例如丁二醇化合物能改善療效，這是因?yàn)楦咧|(zhì)和碳水化合物被減少或消除。這類病人包括，在腦中葡萄糖載體系統(tǒng)、在糖酵解中、或在PDH自身例如在利氏綜合征中有遺傳性缺陷的病人。
尤其能用這些藥物治療的疾病包括，涉及PDH阻滯的疾病，頭部創(chuàng)傷后發(fā)生的疾病，或與供給線粒體的乙酰CoA減少或消除有關(guān)的疾病，例如胰島素休克和低血糖癥，在腦中葡萄糖載體或糖酵解酶步驟或丙酮酸運(yùn)輸中有缺陷的疾病。
羥基丁酸優(yōu)選為非外消旋的D-β-羥基丁酸，更優(yōu)選的是，其以也能補(bǔ)充乙酰乙酸的形式給藥。優(yōu)選的代謝前體是，當(dāng)對人體或動物體給藥時(shí)，能被代謝例如被肝臟代謝，以生成D-β-羥基丁酸和乙酰乙酸中的一個(gè)或兩個(gè)，更優(yōu)選生成生理比例的D-β-羥基丁酸和乙酰乙酸的前體。特別優(yōu)選的是聚-D-β-羥基丁酸或乙酰乙?；?β-羥基丁酸酯低聚體，或它們其中一個(gè)或兩個(gè)的酯?？梢允褂玫图壨榛ト鏑1-4烷基酯，但是更優(yōu)選生理可更接受的酯，例如各自的1，3-丁二醇酯，尤其是(R)-1，3-丁二醇酯。最優(yōu)選的是乙酰乙酰基-三-、四-、和五-D-β-羥基丁酸酯。酯前體包括1，3-丁二醇的酯，優(yōu)選(R)構(gòu)型，特別是乙酰乙酸酯，例如乙酰乙?；视?。
優(yōu)選的聚D-β-羥基丁酸酯是具有2-100個(gè)重復(fù)單元，例如2-20重復(fù)單元，最優(yōu)選2-10個(gè)重復(fù)單元的低聚體酯。
當(dāng)本發(fā)明的藥物或營養(yǎng)品不用長時(shí)間貯存就使用時(shí)，將其制成液體或固體組合物的形式使用是方便的，其中組合物中含有被羥基取代的羧酸和/或酮，優(yōu)選兩者都含有，當(dāng)同時(shí)含有D-β-羥基丁酸和乙酰乙酸時(shí)，其比例優(yōu)選為約3∶1-5∶1，更優(yōu)選為約4∶1。
當(dāng)本發(fā)明的藥物或營養(yǎng)品含有乙酰乙酸時(shí)，優(yōu)選不長時(shí)間貯存或不在40℃以上貯存。乙酰乙酸加熱時(shí)不穩(wěn)定，在100℃會很劇烈地分解成丙酮和CO2。在這種情況下，優(yōu)選通過組合物在體內(nèi)代謝來生成乙酰乙酸。組合物優(yōu)選含有乙酰乙酸的酯前體。例如，乙酰乙酸乙酯相對穩(wěn)定，其沸點(diǎn)是180.8℃。
仍然更優(yōu)選的是，本發(fā)明的藥物或營養(yǎng)品含有D-β-羥基丁酸或其酯的乙酰乙?；?，或如上所述的D-β-羥基丁酸或其酯低聚體的乙酰乙?；?。這樣可以補(bǔ)充D-β-羥基丁酸或其酯或其聚合物，例如D-β-羥基丁酸的低聚體，以提供大約優(yōu)選比例的這兩種組分。當(dāng)酯或聚合物在使用組合物的人或動物的胃中或血漿中代謝時(shí)，這種組合物就能提供這兩種優(yōu)選的組分。乙酰乙酰基-D-β-羥基丁酸的(R)1，3-丁二醇酯可能是最優(yōu)選的，因?yàn)橹钡奖淮x或否則被去酯化為止，其親脂性更強(qiáng)，并且其中的所有構(gòu)成部分都能轉(zhuǎn)化成所需的酮體。
本發(fā)明的第二個(gè)方面是，其提供了用于治療或用作營養(yǎng)品的新的乙酰乙酸酯。這些酯可包括C1-4烷基酯，但最優(yōu)選的是上述D-β-羥基丁?；阴Ｒ宜狨?。
本發(fā)明的第三個(gè)方面是，其提供了用于治療的聚-D-β-羥基丁酸酯，尤其是選擇其在胃的酸性條件下或在體內(nèi)通過酯酶的作用能降解的形式。
本發(fā)明的第四個(gè)方面是，其提供了合成D-β-羥基丁酰基乙酰乙酸酯的方法，包括將乙酰乙?；u，例如乙酰乙酰氯，與D-β-羥基丁酸反應(yīng)。優(yōu)選通過用乙酰乙酸與活化劑，例如亞硫酰氯反應(yīng)，以生成酰氯來完成反應(yīng)。
本發(fā)明的第五個(gè)方面是，其提供了合成D-β-羥基丁酰基乙酰乙酸酯的方法，包括將D-β-鹵代丁酸或其低聚體與乙酰乙酸、其活化形式或雙烯酮反應(yīng)。
本發(fā)明的第六個(gè)方面是，其提供了D-β-羥基丁酰基乙酰乙酸酯，其生理可接受鹽，或其短鏈或中鏈一元、二元或三元醇或1，3-丁二醇的酯。
本發(fā)明的第七個(gè)方面是，其提供了聚-D-β-羥基丁酸和可藥用或生理可接受載體的混合物。
本發(fā)明的第八個(gè)方面是，其提供了組合物，其中含有相互之間的比例為1∶1-20∶1，更優(yōu)選2∶1-10∶1，最優(yōu)選3∶1-5∶1的D-β-羥基丁酸和乙酰乙酸，以及藥物或生理可接受載體。這些組分的比例優(yōu)選為約4∶1。這類組合物不是由已經(jīng)用作藥物或食品的血漿、血清或動物或植物組織組成，因此其優(yōu)選是無菌的并且不含有熱原。尤其是，酮體的含量至少占組合物重量的5％，更優(yōu)選20％或20％以上，最優(yōu)選50％-100％。組合物可以是口服劑型、腸道外給藥劑型，或其它常規(guī)的給藥劑型。
本發(fā)明的第九個(gè)方面是，其包括治療人或動物，以增強(qiáng)其心效力的方法，包括將至少一種在本發(fā)明第一到第八個(gè)方面使用的物質(zhì)對人或動物給藥。
本發(fā)明的第十個(gè)方面是，其包括治療人或動物，以增強(qiáng)其對胰島素的反應(yīng)的方法，包括將至少一種在本發(fā)明第一到第八個(gè)方面使用的物質(zhì)對人或動物給藥。
本發(fā)明的第十一個(gè)方面是，其包括治療人或動物，以治療抗胰島素癥的方法，包括將至少一種在本發(fā)明第一到第八個(gè)方面使用的物質(zhì)對人或動物給藥。
本說明書中的抗胰島素癥包括抗胰島素的各種糖尿病，尤其是對胰島素完全不反應(yīng)的糖尿病。
本發(fā)明的第十二個(gè)方面是，其提供了治療人或動物，以治療如本發(fā)明第一個(gè)方面所述的、與神經(jīng)細(xì)胞如腦細(xì)胞死亡或損傷有關(guān)的疾病，尤其是神經(jīng)變性病，例如與神經(jīng)毒性痰病如存在淀粉樣蛋白有關(guān)的疾病，例如與記憶有關(guān)的疾病如阿耳茨海默氏病、或癲癇發(fā)作，的方法，包括將至少一種在本發(fā)明第一到第八個(gè)方面使用的物質(zhì)對人或動物給藥。
本發(fā)明的第九個(gè)到第十二個(gè)方面中優(yōu)選的方法使用本發(fā)明優(yōu)選的酮和聚酸和聚酯。
制備聚D-β-羥基丁酸的方法在本申請中沒有具體要求保護(hù)，因?yàn)檫@些方法在本領(lǐng)域中是已知的。例如，Shang等人(1949)Appli.Environ.Microbial.601198-1205。這類聚合物可從Fluka ChemicalCo.P1082，cat#81329，1993-94 980.Second St.Ronkonkoma NY11779-7238，800 358 5287處購得。
使用本發(fā)明的生物可利用聚合物的特別優(yōu)點(diǎn)包括，減少必須與其一起給藥的相反離子例如鈉離子的量。減少鈉負(fù)荷對于健康狀況不好的病人特別有利。生物可利用表示，這些物質(zhì)可以被身體利用以產(chǎn)生D-β-羥基丁酸、乙酰乙酸兩種物質(zhì)中的至少一種，或其以上述生理比例存在的混合物。
用于治療神經(jīng)變性病例如阿耳茨海默氏病和帕金森氏綜合征的酮體的用量是，能優(yōu)選將血液酮體水平提高到0.5mM-20mM，例如上述的2 mM-7.5mM的量。本發(fā)明者估計(jì)，為了達(dá)到上述血液酮體水平，每一病人每天可能需要200-300g(0.5磅)酮體。當(dāng)治療是通過維持細(xì)胞抗神經(jīng)毒害作用進(jìn)行時(shí)，這樣血液酮體應(yīng)維持較高水平，例如2-7.5mM。當(dāng)治療是依賴于D-β-羥基丁酸所產(chǎn)生的神經(jīng)刺激因子作用進(jìn)行時(shí)，酮體給藥的量可以低一些，例如能提供0.2-4mM血液酮體水平的量，但是對于這種疾病或其它痰病，用量當(dāng)然可以更多一些。
需要認(rèn)識到的是，對于神經(jīng)變性病例如阿耳茨海默氏病的治療，當(dāng)確定出病人身上導(dǎo)致發(fā)展成這種疾病的因素后，再馬上進(jìn)行治療將是最有效的。因此，當(dāng)治療阿耳茨海默氏病時(shí)，得到與一種或多種下述病因有關(guān)的陽性測定結(jié)果時(shí)，再進(jìn)行治療是最有效的(i)在21位染色體上，淀粉樣蛋白前體的基因發(fā)生突變，(ii)在14位染色體上，早老基因發(fā)生突變，(iii)存在載脂蛋白E的同種型。當(dāng)然，表明阿耳茨海默氏病病因的其它測試也是適用的。
得到這種陽性測定結(jié)果后，通過用幾種方法中的一種方法，將酮體D-β-羥基丁酸和乙酰乙酸在病人的血液或血漿中的總濃度提高到1.5-10mM，優(yōu)選2-8mM，就能阻止記憶喪失和/或神經(jīng)機(jī)能障礙的發(fā)展。優(yōu)選讓病人食用含有足夠量D-β-羥基丁酸，其可代謝聚合物，其乙酰乙酸酯或其前體(R)1，3-丁二醇和其乙酰乙酸酯，例如乙酰乙?；视偷娘嬍?，或?qū)⑼wD-β-羥基丁酸和乙酰乙酸對病人進(jìn)行靜脈內(nèi)或動脈內(nèi)給藥。所有上述有機(jī)物質(zhì)可選擇性地以其鹽或酯的形式使用。典型的生理可接受鹽的實(shí)例選自鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、與L-賴氨酸和L-精氨酸成的鹽，或例如多種復(fù)鹽，例如其甲基葡糖氨鹽。酯是如前面本發(fā)明其它方面所述的酯。
本發(fā)明還提供了通過合適的飲食控制而提供本發(fā)明的酮體。因此本發(fā)明的這個(gè)方面提供了在人或動物中治療本發(fā)明第九個(gè)到第十二個(gè)方面所述的一種或多種痰病的方法，包括下面兩種方法中的一種(i)讓個(gè)體完全禁食，和(ii)讓個(gè)體食用生酮飲食，例如含有60-80％重量的脂質(zhì)、20％或20％以下重量的碳水化合物的飲食。
治療癲癇發(fā)作，例如癲癇時(shí)，通過口服或由腸內(nèi)途徑給予上述化合物，飲食可任意地包括攝取碳水化合物。
除了生酮飲食，本發(fā)明所有治療方法的改進(jìn)之處都在于，食入大量的碳水化合物不會導(dǎo)致血液酮體水平下降，避免了食入大量脂質(zhì)，而食入大量脂質(zhì)會促進(jìn)肝臟合成脂肪酸和膽固醇，從而引起血管病。
需要認(rèn)識到的是，用本發(fā)明的治療方法和組合物以及化合物也可以治療低血糖腦機(jī)能障礙。與本發(fā)明治療方法有關(guān)的另一特征是，通常能改善肌肉功能。
大量相當(dāng)廉價(jià)或可能廉價(jià)的、能生成(R)-3-羥基丁酸的原料(參見Microbial Polyester Yoshiharu Doi.ISBN 0-89573-746-9章1.1，3.2和8)，因?yàn)槠湟子诶?，所以有助于基于本發(fā)明的食品和藥物來提供酮體?？衫媚懿迦肷墒称肺⑸矬w內(nèi)的基因來提供生成食品例如酸乳和干酪的方法，而酸乳和干酪中富含有聚-(R)-3-羥基丁酸，或被能裂解這類聚合物的酶裂解后所生成的其單體化合物(參見Doi.第8章)。
具體實(shí)施例方式
下面通過下述附圖和實(shí)驗(yàn)實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，這僅是列舉性的。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明，能想到落在本發(fā)明范圍內(nèi)的其它實(shí)施方案。
附1顯示了通過管飼法將(R)-3-羥基丁酸，如實(shí)施例1中所制備的此化合物的低聚體，以及如實(shí)施例2中所制備的其乙酰乙?；鶈误w給藥后的不同時(shí)間內(nèi)，血中(R)-3-羥基丁酸的水平。
實(shí)施例實(shí)施例1(R)-3-羥基丁酸(D-β-羥基丁酸)低聚體的制備將(R)-3-羥基丁酸(Fluka-5.0g0.048摩爾)、對甲苯磺酸(0.025g)和苯(100ml)在迪安-斯達(dá)克分水器裝置中回流攪拌24小時(shí)。將反應(yīng)混合物冷卻，在真空內(nèi)(0.5mmHg)將苯蒸去。獲得了4.4g無色油狀物，取出20mg樣本轉(zhuǎn)化成其甲酯，以用NMR測定其重復(fù)單體的數(shù)目。這些實(shí)驗(yàn)表明，產(chǎn)物是重復(fù)單元的平均數(shù)目為3.75的D-β-羥基丁酸低聚體混合物，主要是三聚體、四聚體和五聚體的混合物，其中四聚體的含量最多。產(chǎn)物混合物能溶在1當(dāng)量的氫氧化鈉溶液中。
實(shí)施例2制備(R)-3-羥基丁酸低聚體的乙酰乙酰基酯將另一批得自實(shí)施例1的無色油狀物(4.5g)與雙烯酮(3.8g)和乙酸鈉(0.045g)在氮?dú)饬飨掠?0℃加熱1小時(shí)。再加入一些雙烯酮(3.8g)，并將反應(yīng)再加熱1小時(shí)，冷卻，用乙醚稀釋，用水洗滌，然后用飽和碳酸氫鈉(5×100ml)萃取。合并蘋取液，用乙醚洗滌，然后用濃鹽酸酸化(滴加)。用乙酸乙酯萃取(3×50ml)，接下來用硫酸鎂干燥，在真空下蒸發(fā)。獲得了黃色固體/油混合物(7.6g)，在硅柱上進(jìn)行色譜純化，用二氯甲烷/甲醇(98∶2)洗脫，得到了亮琥珀色油狀產(chǎn)物。分離到了流動速度較快的雜質(zhì)(1.6g)，將其用四氯化碳/甲醇(99∶1)再走一次分離柱，回收到了0.8g油狀物，通過NMR和質(zhì)譜分析表明，其是所要的乙酰乙酰化的D-β-羥基丁酸低聚體。產(chǎn)物混合物在二氯甲烷/甲醇(90∶1)中的Rf是0.44，能溶在1當(dāng)量的氫氧化鈉溶液中。實(shí)施例1和實(shí)施例2的產(chǎn)物都易于通過制備HPLC分離成單獨(dú)組分。
實(shí)施例3將D-β-羥基丁酸、D-β-羥基丁酸的低聚體和乙酰乙?；鵇-β-羥基丁酸低聚體對大鼠口服給藥按照下述方法，研究口服給藥D-β-羥基丁酸和實(shí)施例1和2中的低聚體對于提高血液酮體體水平的能力。將大鼠禁食過夜，然后將用甲基葡糖胺將PH調(diào)至7.74的4M D-β-羥基丁酸以100μl/100g體重的劑量對大鼠管飼給藥。使用《分析生物化學(xué)》(Anal.Biochem.)131，p478-482(1983)中的NAD+/EDTA分析方法，測定血中D-β-羥基丁酸的水平。將1.0ml用2-氨基-2-甲基丙醇(100mM PH 9.9，0.094g/10ml)、NAD+(30mM，0.199g/10ml)和EDTA(4mM，0.015g/10ml)制成的溶液、和4μl樣本或D-β-羥基丁酸對照加到各個(gè)比色杯中。
因?yàn)榇笫笠呀?jīng)禁食了一段時(shí)間，因此D-β-羥基丁酸的最初水平已比0.1mM的進(jìn)食狀態(tài)下水平有提高。然而，在每一實(shí)驗(yàn)例中，D-β-羥基丁酸在血清中的水平都一致性地增加了1-3.2mM。
用2M的、如實(shí)施例1和2所述的D-β-羥基丁酸低聚體的混合物和其乙酰乙?；サ幕旌衔锏娜芤褐貜?fù)上述實(shí)驗(yàn)過程。D-β-羥基丁酸低聚體(附

圖1中19/1)和其乙酰乙?；?附圖1中20/4)都用甲基葡糖胺將PH調(diào)至7.6，并且使用上述分析方法測定血中D-β-羥基丁酸的水平。結(jié)果顯示，在管飼給藥后的第60和120分鐘，血清中D-β-羥基丁酸的水平都增加了0.5-1.2mM。這些結(jié)果證實(shí)，口服給藥本發(fā)明的D-β-羥基丁酸和其前體，在給藥后幾小時(shí)期間內(nèi)，能使血液酮體水平提高很多。
需注意的是，寡聚酯19/1和20/4，雖然不能使血液酮體水平增加到其單體所能使其增加的程度，但能使高血液酮體水平維持更長時(shí)間，因此適于以比其單體要低的頻率給藥。
實(shí)施例4表2.使用酮體、其酯或聚合物的含有1500卡路里熱量的生酮飲食的樣本。假定酮含有6千卡熱量/g，脂肪含有9千卡熱量/g，碳水化合物和蛋白含有4千卡熱量/g。酮已經(jīng)被替代以給出等量熱量。
量(g) 脂肪(g) 蛋白質(zhì)(g) 糖(g) 酮(g)早餐雞蛋 32 44蘋果汁 70 7酮 66 66脫脂乳 92 02 3早餐的總量 46 10 66午餐瘦牛肉 12 1.75 3.5烹調(diào)好的胡蘿卜 45 0.63罐頭梨 40 4
酮 69.75 69.75脫脂乳 92 2 3午餐的總量 1.75 6.110 69.75晚餐牛肉香腸 22.563烹調(diào)好的花椰菜 50 1 2西瓜 75 5酮 62.25 62.25脫脂乳 92 2 3晚餐的總量 66 10 62.25每天的總量 11.7518.1 30 198實(shí)施例5提高血中D-β-羥基丁酸的水平對整個(gè)腦GABA水平的影響為了評定提高血中D-β-羥基丁酸的水平對整個(gè)腦GABA水平的影響，并且因此提供，目標(biāo)是提高血液酮體水平的、用酮體或其前體進(jìn)行治療的抗癲癇作用的方法，用如實(shí)施例3所述的D-β-羥基丁酸給藥后，將整個(gè)大鼠腦在設(shè)定的時(shí)間冷凍。用標(biāo)準(zhǔn)HPLC技術(shù)測定GABA，并用標(biāo)準(zhǔn)蛋白分析法測定相關(guān)蛋白含量。在t＝0時(shí)，GABA水平為191pmol/μg蛋白，而在第120分鐘時(shí)，則增加到466pmol/μg蛋白，這證明其具有抗癲癇能力。
實(shí)施例6方法培養(yǎng)基和化學(xué)試劑在第0天到第4天使用的、不含有血清的培養(yǎng)基中含有Neurobasal培養(yǎng)基，其中Neurobasal培養(yǎng)基具有下列加入到其中的稀釋了50倍的B27補(bǔ)充物(Life Technology，Gaithersburg，MD)0.5mM L-谷酰胺、25μM L-谷氨酸鈉、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素。第4天后，使用含有5μM胰島素、30nM 1-甲狀腺素、20nM黃體酮、30nM亞硒酸鈉、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基。
海馬微島培養(yǎng)物在第18天，從Wistar胚胎中分離出原海馬組織，通過在吸移管中輕微攪動來使其分散。把懸浮液在1500×g條件下離心10分鐘，棄去上清液。制備含有0.4-0.5×106個(gè)細(xì)胞/ml的新培養(yǎng)基。用吸移管將10μl此懸浮液置于涂有聚D-賴氨酸的培養(yǎng)孔的中央，把培養(yǎng)皿在38℃培養(yǎng)4小時(shí)，然后加入400μl新鮮的Neurobasal培養(yǎng)基。培養(yǎng)2天后，將一半培養(yǎng)基換成新鮮培養(yǎng)基，再繼續(xù)培養(yǎng)2天。第4天后，將培養(yǎng)基換成含有5μM胰島素、30nM 1-甲狀腺素、20nM黃體酮、30nM亞硒酸鈉、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基。將培養(yǎng)孔分成4組，一半培養(yǎng)孔加入D-β-羥基丁酸鈉至終濃度為8mM，另一半培養(yǎng)孔加入5nM β1-42淀粉樣蛋白(Sigma)。2天后(第8天)，把這些培養(yǎng)基交換，在第10天，將細(xì)胞固定，用抗MAP2(BoehringerManheim，Indianapolis IN)給視神經(jīng)元細(xì)胞著色，用波形蛋白和GFAP(Boehringer)給神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞著色。
結(jié)果細(xì)胞計(jì)數(shù)向培養(yǎng)物中加入D-β-羥基丁酸使得每微島(microisland)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目從平均30增加到平均70。向培養(yǎng)物中加入5nM β1-42淀粉樣蛋白使得每微島細(xì)胞數(shù)目從平均70減少到平均30，這證實(shí)了Hoshi等人以前的觀察結(jié)果，即β1-42淀粉樣蛋白對海馬神經(jīng)元有毒性。向含有β1-42淀粉樣蛋白的培養(yǎng)物中加入D-β-羥基丁酸使得每微島神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目從平均30增加到平均70。從這些數(shù)據(jù)中我們可以推斷，向其主要的營養(yǎng)物是葡萄糖、丙酮酸酯或鹽和L-谷酰胺的培養(yǎng)物中加入底物水平量的D-β-羥基丁酸，能減慢培養(yǎng)物中細(xì)胞死亡的速度。我們還可以推斷，D-β-羥基丁酸能降低由在培養(yǎng)物中加入β1-42淀粉樣蛋白所引起的增加了的海馬細(xì)胞死亡速度。
我們觀察到，無論β1-42淀粉樣蛋白存在與否，D-β-羥基丁酸的存在使樹狀分枝的數(shù)目和軸突的長度都增加了。這是其具有類似于神經(jīng)生長因子性能的象征。
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權(quán)利要求
1.一種或多種選自D-β-羥基丁酸、乙酰乙酸和包含選自R-1，3-丁二醇、乙酰乙?；虳-β-羥基丁酰基部分的部分的D-β-羥基丁酸或乙酰乙酸鹽的代謝前體的化合物及其生理可接受的鹽和酯在生產(chǎn)用于治療患者的癲癇病、糖尿病或胰島素抗性狀態(tài)的藥物中的用途。
2.一種或多種選自D-β-羥基丁酸、乙酰乙酸、作為D-β-羥基丁酸的低聚體的化合物、D-β-羥基丁酸的乙酰乙?；ズ虳-β-羥基丁酸低聚體的乙酰乙?；サ幕衔锘蚱渖砜山邮艿柠}在生產(chǎn)用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞、周圍神經(jīng)細(xì)胞或其它需要治療的胰島素不敏感細(xì)胞以治療一種或多種GABA可預(yù)防的發(fā)作或葡萄糖代謝能力不足的藥物中的用途。
3.如權(quán)利要求1或2中所述的用途，其中在給需要這種治療的未禁食的患者服用所述的化合物后，定義為D-β-羥基丁酸和乙酰乙酸總量的血液酮體水平被提高到0.3-20nM。
4.如權(quán)利要求1或2中所述的用途，其中所述代謝前體選自游離脂肪酸和包含1，3-丁二醇、乙酰乙?；駾-β-羥基丁酰基部分的化合物。
5.如權(quán)利要求4中所述的用途，其中所述代謝前體是D-β-羥基丁酸的聚合物或低聚體。
6.如權(quán)利要求4中所述的用途，其中所述代謝前體是乙酰乙?；?。
7.如權(quán)利要求中5所述的用途，其中所述代謝前體選自以下通式所示的化合物 或其生理可接受的鹽或酯，其中在每種情況下選擇n，使得在給人體或動物體服藥后，聚合物和低聚體能容易地被代謝，以提高血液酮體水平。
8.如權(quán)利要求7中所述的用途，其中n是0-1000的整數(shù)。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其中n是1-5的整數(shù)。
10.如權(quán)利要求1或2中所述的方法，其中在血液中產(chǎn)生的酮體水平是D-β-羥基丁酸與乙酰乙酸的比例為1∶1-20∶1。
全文摘要
適于對人和動物給藥的含有酮體和/或其代謝前體的組合物，其具有如下特征，(i)增強(qiáng)心效力，尤其是心臟利用葡萄糖的效率，(ii)提供能源，尤其是在糖尿病和抗胰島素癥中提供能源，(iii)治療由腦細(xì)胞損害引起的病癥，尤其是通過延緩或阻止腦部記憶相關(guān)區(qū)域的腦損害，例如在患有阿耳茨海默氏病及類似病癥的腦中發(fā)現(xiàn)的腦損害。這些組合物可作為營養(yǎng)品給例如運(yùn)動員使用，或用來治療疾病，尤其是與心力不足有關(guān)的病癥、抗胰島素癥和神經(jīng)元損害。本發(fā)明還提供了治療方法以及包含在本發(fā)明組合物內(nèi)的新的酯和聚合物。
文檔編號A61K31/765GK1552315SQ200410047358
公開日2004年12月8日 申請日期1998年3月17日 優(yōu)先權(quán)日1997年3月17日
發(fā)明者R·L·韋奇, R L 韋奇 申請人:英國技術(shù)集團(tuán)國際有限公司