專利名稱：松杉靈芝蛋白多糖及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從松杉靈芝(Ganoderma tsugae Murrill.)子實體提取的蛋白多糖及其制備方法，也涉及蛋白多糖在抗腫瘤藥物中的應用。
背景技術(shù)：
目前臨床上治療腫瘤疾病，主要采用手術(shù)，放療，化療。由于放療、化療嚴重殺傷人體正常細胞和組織，使許多患者體質(zhì)迅速下降，甚至不能持續(xù)治療。為此人們在不斷的尋找新的具有毒性小、抑瘤率高等特點的抗癌藥物。由于腫瘤的發(fā)生和擴散與人體的免疫功能有密切關(guān)系，所以產(chǎn)生了腫瘤免疫治療法。二十世紀中后期，來源于真菌類的多糖藥物，有云芝多糖，香菇多糖，裂褶菌多糖，均具有提高機體免疫力和抗腫瘤的作用，其作用機制是通過宿主中介，激活機體的各種免疫活性細胞，促進各種淋巴因子的分泌，提高機體的抵抗力，達到吞噬和消除腫瘤細胞的作用。其特點是有效劑量小，抑瘤效果高，毒性很小，甚至無毒。與化療相比，沒有白血球降低，嘔吐，免疫力下降等毒副作用。該類天然藥物與化療藥物共同使用還可以降低化療藥物的毒副作用。蛋白-多糖抗腫瘤藥物是與化療藥物完全不同的一類新的抗癌藥物。
松杉靈芝(Gamoderma tsugae Murrill.)屬于擔子菌綱，多孔菌科，靈芝屬的一種珍品，具有悠久的民間用藥歷史，藥理活性廣泛，且毒性極小。子實體即為地上部分，包括菌蓋和菌柄，一起入藥，松杉靈芝子實體的化學成分復雜，有三萜類，核苷類，生物堿類，呋喃類，氨基酸類及微量元素等等。水溶性成分主要有多糖類，糖-蛋白類，蛋白-多糖類等等。目前研究表明，多糖及糖-蛋白或蛋白-多糖類復合物具有提高機體免疫功能和抗癌作用。由于多糖的來源不同，分子量大小及空間三維螺旋結(jié)構(gòu)不同，特別是與蛋白質(zhì)結(jié)合方式不同，在藥理活性方面，表現(xiàn)出較大差異。MIZUNO等人從赤芝子實體中獲得分子量為100萬和45萬兩種水溶性多糖，經(jīng)小鼠腹腔注射給藥，以S180瘤株做實驗，具有顯著的抑瘤作用。李榮芷，何云慶等從赤芝中獲得分子量分別為16200，24500，35000，和40000四種多糖均能顯著增加小鼠脾細胞IL-2的產(chǎn)生。北京醫(yī)科大學藥學院分離出的分子量為7100-9300的靈芝多糖能促進TNFα、TNFγ mRNA的表達，增加TNFα、TNFγ mRNA的分泌等等。目前對赤芝(Ganoderma Lucidum)和紫芝(Ganoderma Sinersis)的研究比較多。對松杉靈芝(Ganoderma tsugae Murill.)的研究比較少。
臺灣國際揚明大學吳先生的美國專利(US 6613754)，“Polysaccharide-based extract from ganoderma，pharmaceuticaluse thereof，and process for preparing the same“，所采用的工藝以及提取物的部位和性質(zhì)均與本發(fā)明不同。
松杉靈芝子實體中含有數(shù)種生物活性大分子物質(zhì)，本專利主要涉及堿提水溶性的蛋白葡聚糖及其制備方法和在制備抗腫瘤藥物中的應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種有效劑量小，抑瘤效果高，毒性很小，甚至無毒的松杉靈芝蛋白多糖及其制備方法和在制備抗腫瘤藥物中的用途。
為實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種松杉靈芝蛋白多糖粗品GTP，它是包含三種單一的蛋白多糖P1，P2及P3的混合物，其中，它們的重量百分比分別為P11.50～3.00％，P2 52～58％，P3 20～25％，它們的多糖部分為均一的葡聚糖，糖苷鍵均為β-(1-3)構(gòu)型，其結(jié)構(gòu)式如下式表示， 其中，P1的n值為500～611，分子量為18～22萬；P2的n值為42～69，分子量為1.5～2.5萬；P3的n值為17～34，分子量為0.6～1.2萬；它們的蛋白質(zhì)部分均由以絲氨酸為主的14種氨基酸組成，并以整體形式結(jié)合在多糖部分的還原末端，14種氨基酸分別為天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸、脯氨酸、酪氨酸。
松杉靈芝蛋白多糖粗品GTP是按以下方法制備的，松杉靈芝子實體粉碎后用有機溶劑進行脫脂，然后熱水提取過濾后，或者不經(jīng)過脫脂直接用熱水提取并過濾，得到藥渣，將藥渣用含有四氫硼化鈉的稀堿溶液提取蛋白多糖，調(diào)節(jié)pH為中性，取上清液加無水醇沉淀，沉淀溶解于水，經(jīng)微濾、超濾濃縮后，冷凍干燥，獲得本發(fā)明松杉靈芝蛋白多糖粗品GTP，其平均分子量在0.6～22萬之間。進一步分離精制后，可獲得純品P1，P2，P3。
具體地說，制備上述松杉靈芝蛋白多糖粗品GTP的方法，是由下列步驟組成(1)取松杉靈芝子實體粉碎物，加其重量10～40倍去離子水，加熱攪拌，每次提取2～3小時，過濾，棄去濾液，重復3～6次，獲藥渣備用。
(2)在上述藥渣中，加入其子實體藥粉重量10～40倍的2～10％稀堿溶液，該溶液中含有四氫硼化鈉0.04～0.12％，充分攪拌后，于20～40℃浸提25～30小時，過濾。調(diào)節(jié)濾液pH為中性，放置澄清，離心，收集上清液，加入其體積2～4倍的無水醇，邊加邊攪拌，放置澄清，離心，將沉淀溶于去離子水中，經(jīng)20μm～1μm微濾膜過濾，濾液再經(jīng)過3～5KD超濾分離濃縮，冷凍干燥，獲得松杉靈芝蛋白多糖粗品GTP。
上述方法中所用的稀堿溶液可以是NaOH、KOH、LiOH、Na2CO3或者NaHCO3等的稀溶液；上述無水醇可以是無水甲醇或者無水乙醇。
松杉靈芝蛋白多糖粗品GTP，也可以用下列方法制備(1)取松杉靈芝子實體粉碎物，加其重量5-8倍的70～99％有機溶劑進行脫脂，加熱至70-80℃，回流提取，每次3-6小時，重復3-6次，過濾，合并濾液，回收有機溶劑，藥渣備用。
(2)向步驟(1)所得藥渣中加入子實體藥粉重量的10～40倍去離子水，加熱至98-100℃，每次提取3～4小時，重復4～6次，過濾，藥渣備用。
(3)在步驟(2)所得的藥渣中，加入其子實體藥粉重量的10～40倍的2～10％的稀堿溶液，該溶液中含有四氫硼化鈉0.04～0.12％，充分攪勻后，于20～40℃浸提25～30小時過濾，調(diào)節(jié)濾液pH為中性，放置澄清，離心收集上清液，加入其體積2～4倍的無水醇，邊加邊攪拌，放置澄清，離心后，將沉淀溶于去離子水中，3～1μm微濾后，再經(jīng)3～5KD超濾濃縮，冷凍干燥，獲得松杉靈芝蛋白多糖粗品GTP。
上述方法中所用的有機溶劑可以是甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、戊醇、異丁醇、丙酮、石油醚、乙醚、氯仿或者四氯化碳等；所用的稀堿溶液可以是NaOH、KOH、LiOH、Na2CO3或者NaHCO3等的稀溶液；上述無水醇可以是無水甲醇或者無水乙醇。
上述的松杉靈芝蛋白多糖粗品GTP可在制備抗腫瘤藥物中應用，它們可作為注射劑(粉針、水針)、片劑、膠囊劑、沖劑、散劑或者口服液使用，其動物實驗的有效劑量為5mg/kg。
三種松杉靈芝單一的蛋白多糖P1，P2，P3，它們的多糖部分均為均一的葡聚糖，糖苷鍵均為β-構(gòu)型，其結(jié)構(gòu)式如下式表示， 它們的蛋白質(zhì)部分均由以絲氨酸為主的14種氨基酸組成，并以整體形式結(jié)合在多糖部分的還原末端，14種氨基酸分別為天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸、脯氨酸、酪氨酸。
其中，P1為淺褐色固形物，它的n值為500～611，分子量為18～22萬，比旋光度為c＝0.5％，多糖部分的重量含量為60.4～71.2％，蛋白質(zhì)部分的重量含量為39.6～28.8％P2為淺褐色固形物，它的n值為42～69，分子量為1.5～2.5萬，比旋光度為[α]D26(10%NaOH)=12.6-16.2,]]>c＝0.5％，多糖部分的重量含量為65～76％，蛋白質(zhì)部分的重量含量為35～24％，其14種氨基酸在P2中的含量(μg/mg)為天冬氨酸Asp(0.20-0.4)、蘇氨酸Thr(0.10-0.2)、絲氨酸Ser(0.3-0.4)、谷氨酸Glu(0.05-0.15)、甘氨酸Gly(0.4-0.55)、丙氨酸Ala(0.03-0.16)、半胱氨酸Cys(0.08-0.22)、甲硫氨酸Met(0.20-0.30)、苯丙氨酸Phe(0.10-0.22)、賴氨酸Lys(0.10-0.25)、組氨酸His(0.06-0.20)、精氨酸Arg(3.0-5.5)、脯氨酸Pro(0.1-0.23)、酪氨酸Tyr(0.01-0.07)；P3為淺褐色固形物，它的n值為17～34，分子量為0.6～1.2萬，比旋光度為[α]D26(10%NaOH)=185-199,]]>c＝0.5％，多糖部分的重量含量為56.6～78％，蛋白質(zhì)部分的重量含量為43.4～22％，其14種氨基酸在P3中的含量(μg/mg)為天冬氨酸Asp(3.4-.48)、蘇氨酸Thr(1.7-2.2)、絲氨酸Ser(4.8-5.6)、谷氨酸Glu(0.81-1.2)、甘氨酸Gly(4.8-6.2)、丙氨酸Ala(1.0-2.23)、半胱氨酸Cys(2.0-3.01)、甲硫氨酸Met(3-4.35)、苯丙氨酸Phe(0.51-1.8)、賴氨酸Lys(1.07-2.3)、組氨酸His(1.02-2.34)、精氨酸Arg(0.9-1.5)、脯氨酸Pro(1.1-1.94)、酪氨酸Tyr(1.6-2.90)。
三種單一的松杉靈芝蛋白多糖P1，P2，P3的制備方法是，由上述的松杉靈芝蛋白多糖粗品GTP溶于水后，上凝膠柱進行層析分離，用2～4倍柱體積的0.2～0.4mol/L NaOH溶液洗脫，分別收集第一流出液、第二流出液和第三流出液，再分別經(jīng)過3～5KD超濾膜濃縮，脫鹽后，分別冷凍干燥得本發(fā)明物松杉靈芝單一的蛋白多糖P1、P2、P3。
具體地說，制備松杉靈芝單一的蛋白多糖P1、P2、P3的方法，由下列步驟組成(1)將上述的松杉靈芝蛋白多糖粗品溶于20～60倍蒸餾水后，上凝膠柱進行層析分離，上樣速度0.2～0.8ml/min；
(2)上樣完畢后，用0.1～0.5mol/L NaOH溶液洗脫，洗脫速度0.4～8m1/min，分別收集第一組分、第二組分、第三組分流出液，并分別經(jīng)3～5KD超濾膜脫鹽濃縮后，冷凍干燥，獲得本發(fā)明單一蛋白多糖P1、P2、P3三個純品。
上述凝膠柱可以為Sephadex-G150柱、Sepharose F.F.柱、Sephadex G-50F柱、Sephadex G-50C柱、Sephadex G-75柱或者Sephadex G-100柱。
本發(fā)明所得單一的蛋白多糖P1、P2、P3三個純品可分別在制備抗癌藥物中應用，它們可作為注射劑(粉針、水針)、片劑、膠囊劑、沖劑、散劑或者口服液使用，其動物實驗的有效劑量為5mg/kg。
本發(fā)明松杉靈芝蛋白多糖粗品GTP和三個蛋白多醣純品P1，P2，P3的制備方法同樣可以用于制備其它靈芝的蛋白多醣，例如赤芝、紫芝、藏靈芝等。
本發(fā)明蛋白多糖經(jīng)藥理實驗研究表明它具有提高機體免疫功能、抗細胞突變作用，降血脂、降血糖，保護肝臟，安神、鎮(zhèn)靜，抗腫瘤等多方面的生理作用。經(jīng)分子生物學和細胞藥理學研究，它能調(diào)控細胞分裂、分化，調(diào)節(jié)細胞生長和衰亡。真菌多糖作為藥物的研究進展很快，在臨床上已用于癌癥的免疫治療，表現(xiàn)了良好的抗腫瘤活性。實驗也證明，與細胞毒類藥物合用，具有增效減毒，提高患者免疫功能，延長生命和根本治愈的光明前景。
本發(fā)明蛋白多糖抑瘤率較高，5mg/kg的劑量就已接近30mg/kg劑量的環(huán)磷酰胺(CTX)的抑瘤率。與背景技術(shù)中用的化療藥、放療藥相比，本發(fā)明蛋白多糖毒性極小，免疫活性和生命延長率高。其毒性為，口服動物實驗半數(shù)致死量LD50為32.50g/kg，注射劑最大耐受量為150mg/kg。GTP，P1，P2，P3與化療藥物環(huán)磷酰胺(CTX)的毒性、抑瘤率、生命延長率以及免疫活性比較如下(CTX 30mg/kg腹腔注射，10天；GTP以及P1，P2，P3，靜脈注射，10天)表1

生命延長率＝給藥組平均存活日數(shù)/空白組平均存活日數(shù)×100％本發(fā)明蛋白多糖的抑瘤率比相近的藥物相比都高，例如，山東師大學報第13卷P174，香菇多糖腹腔注射24mg/kg S180瘤株，抑瘤率為52.8％；天然產(chǎn)物研究與開發(fā)Vol.12 No.6 P74，逯海燕等。云芝多糖對S180瘤株，10mg/kg腹腔注射，抑瘤率達60～70％。香菇多糖對S180的抑瘤率為43％，對肝瘤H22為47％抑瘤率，豬苓多糖對S180瘤株為30％以上的抑瘤率。
藥理實驗結(jié)果部分1、GTP，P1，P2，P3蛋白多糖的抗腫瘤作用試驗方法無菌條件下取接種第7天瘤源動物的腹水，加無菌生理鹽水稀釋，使其濃度為1-2×107個活癌細胞/ml，取30只昆明小鼠，雌雄各半，每只小鼠右前肢腋下皮下接種0.2ml，約含活瘤細胞0.5ml。接種后次日將實驗動物隨機分成3組，空白對照組、陽性對照組、松杉靈芝多糖GTP(給藥5mg/kg)組?？瞻讓φ战M每日腹腔注射生理鹽水0.2ml/10g，連續(xù)給藥10天；陽性對照組腹腔注射環(huán)磷酰胺30mg/kg，隔日給藥；松杉靈芝多糖GTP靜脈注射，連續(xù)10天。荷瘤小鼠停藥后次日將動物處死一半，解剖皮下取瘤塊并稱重，分別計算各組的平均瘤重，計算抑瘤率。待空白組小鼠全部死亡計算生命延長率。
抑瘤率＝(空白對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/空白對照組平均瘤重×100％表2 松杉靈芝多糖GTP對小鼠肺癌Liweis的抑制作用(x±SD)

與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
表3 松杉靈芝多糖GTP對小鼠肝癌H22的抑制作用(x±SD)

與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
表4 松杉靈芝多糖GTP對小鼠S180的抑制作用(x±SD)

與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
2、GTP蛋白多糖的增效減毒作用2.1、GTP合并小劑量環(huán)磷酰胺(CTX)對小鼠肝癌H22的抑制作用明顯強于GTP或小劑量化療藥物單獨使用，見圖1。
注明GTP合并小劑量甲氨喋呤和絲裂霉素C對小鼠肝癌H22的抑制作用也明顯強于GTP或小劑量化療藥物單獨使用。
2.2、GTP合并放療對小鼠肝癌H22的抑制作用明顯強于GTP或放療單獨使用，見圖2。
2.3、GTP對于化療的粒細胞毒的保護作用小鼠被喂化療藥物環(huán)磷酰胺48小時或72小時后，給予GTP96、120、144小時，測定白血球的數(shù)量?；熜∈蠼M的白血球數(shù)量減少，而再喂GTP的小鼠組中得到恢復。見圖3。
3GTP，P1，P2，P3蛋白多糖的提高免疫力作用3.1、GTP，P1，P2，P3對荷Lewis肺癌細胞小鼠脾淋巴細胞增殖的影響試驗方法C57BL/6小鼠36只，每鼠腋皮下接種Lewis肺癌細胞，隨機分為6組，每組6只，即GTP，P1，P2，P3(5mg/kg)組，荷瘤對照組(生理鹽水對照組)，另設(shè)一組正常對照組。給藥結(jié)束后次日處死動物，無菌條件下取脾，計數(shù)脾細胞，并調(diào)整細胞濃度為1×107個/ml，在96孔培養(yǎng)板上每孔加細胞懸液100ul，ConA 50ul和培養(yǎng)液，每只動物設(shè)雙復孔，37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)18小時，加入3H-TdR0.5uci/孔，繼續(xù)培養(yǎng)18小時。用多頭細胞收集器收集細胞，在液閃儀上測CPM值，并與荷瘤對照組比較。
表5GTP、P1、P2、P3對荷瘤小鼠脾淋巴細胞增殖的影響

與荷瘤組比較**P＜0.01。
3.2、GTP，P1，P2，P3對荷瘤小鼠NK細胞活性的增強作用靶細胞的標記取傳代后24小時生長良好的YAC-1細胞，按1×106個/ml細胞懸液加3H-TdR 10uci，于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時，每30分鐘振蕩一次，標記后的細胞用培養(yǎng)液洗滌3次，重懸于培養(yǎng)液中，使細胞濃度為1×105/ml。
NK細胞活性測定C57BL/6小鼠36只，每鼠腋皮下接種Lewis肺癌細胞，隨機分為6組，每組6只，即GTP，P1，P2，P35mg/kg組，荷瘤對照組(生理鹽水對照組)，另設(shè)一組正常對照組。給藥結(jié)束后次日處死動物，無菌條件下取脾，制備脾細胞，調(diào)整細胞濃度為1×106個/ml作效應細胞，另取已培養(yǎng)24小時YAC-1細胞，調(diào)整細胞濃度為1×104個/ml作為靶細胞，以靶細胞與效應細胞之比為1∶100的細胞加在96孔細胞培養(yǎng)板上，加入3H-TdR 0.5uci/孔，每只動物設(shè)雙復孔，37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)24小時后，收集細胞，測CPM值，計算特異性抑制百分率(Pi)表示NK細胞活性。

表6 GTP、P1、P2、P3對荷瘤小鼠NK活性的影響

與生理鹽水組比較*P＜0.05，**P＜0.01。
3.3、GTP，P1，P2，P3對荷瘤小鼠IL-2產(chǎn)生的增強作用C57BL/6小鼠36只，每鼠腋皮下接種Lewis肺癌細胞，隨機分為6組，每組6只，即GTP 5mg/kg組，荷瘤對照組(生理鹽水對照組)，另設(shè)一組正常對照組。給藥結(jié)束后次日處死動物，無菌條件下取脾，制備脾細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×107個/ml，24孔板上每孔加2ml細胞及ConA 5ug/ml，37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)24小時收集上清液，用正常C57BL/6小鼠胸腺細胞，以3H-TdR摻入法測定IL-2活性，并以對照組及給藥組比較。
表7 GTP、P1、P2、P3對荷瘤小鼠產(chǎn)生IL-2的影響

與生理鹽水組比較*P＜0.05，**P＜0.01。


圖1GTP蛋白多糖對化療的增效減毒作用；圖2GTP蛋白多糖對放療的增效減毒作用；圖3為蛋白多糖粗品GTP對于化療的粒細胞毒的保護作用。
具體實施例方式
實施例1松杉靈芝蛋白多糖粗品GTP的制備稱取松杉靈芝子實體粉碎物1kg，加80％甲醇8L，加熱至75℃，回流3小時，重復3次，過濾，合并濾液，回收甲醇，向藥渣中加入相當子實體藥粉重量的去離子水15L，加熱煮沸提取，每次2小時，重復6次，過濾，得藥渣，向藥渣中加入8％(含有0.10％四氫硼化鈉)碳酸鈉溶液10L，充分攪拌后，40℃浸泡30小時，過濾，濾液用醋酸調(diào)節(jié)pH6～7，放置澄清，離心，收集上清液，加入其體積2倍的無水甲醇，邊加邊攪拌，放置澄清，離心后，將沉淀溶于去離子水中，經(jīng)過1μm微濾后，再經(jīng)5KD超濾，濃縮后，冷凍干燥，獲得本發(fā)明-松杉靈芝蛋白多糖粗品GTP。
將實施例1中甲醇濃度改為85％，回流每次2小時或4小時，重復6次或4次，碳酸鈉濃度改為5％或10％，浸提溫度為25℃或30℃，其它條件不變，同樣得到GTP粗品，得率基本相同。
實施例2松杉靈芝蛋白多糖粗品GTP的制備稱取松杉靈芝子實體粉碎物1kg，加99％乙醇9L，加熱80℃，回流提取，每次4小時，重復5次，過濾，得藥渣，向藥渣中加入去離子水10L，煮沸提取，每次3小時，重復4次，過濾，得藥渣，向藥渣中加入6％(含有0.08％四氫硼化鈉)的氫氧化鈉溶液12L，充分攪拌后，于30℃浸泡30小時，過濾，濾液用鹽酸調(diào)pH6～7，放置澄清，離心，收集上清液，加入其體積2倍的無水乙醇，邊加入邊攪拌，放置澄清，離心，將沉淀溶于去離子水中，經(jīng)3μm微濾后，經(jīng)3KD超濾，濃縮，冷凍干燥后，獲得本發(fā)明-松杉靈芝蛋白多糖粗品GTP。
實施例3將實施例2中乙醇濃度改為80％或95％，回流提取每次3小時或6小時，重復6次或4次，氫氧化鈉濃度改為3％或8％，浸提溫度改為25℃或40℃，其它條件不變，同樣可以得到GTP粗品，得率基本相同。
實施例4稱取松杉靈芝子實體粉碎物1kg，加其重量15倍去離子水，加熱煮沸攪拌，每次提取2小時，過濾，棄去濾液，重復3次。藥渣中，加入含有四氫硼化鈉0.04％的2～8％NaOH溶液10L，充分攪拌后，于20℃浸提25小時，過濾。濾液用鹽酸調(diào)節(jié)pH中性，放置澄清，離心，收集上清液，加入其體積2倍的無水乙醇，邊加邊攪拌，放置澄清，離心，將沉淀溶于去離子水中，經(jīng)3μm微濾膜過濾，濾液再經(jīng)過3～5KD超濾分離濃縮，冷凍干燥，獲得本發(fā)明物-松杉靈芝蛋白聚糖粗品GTP。
實施例5松杉靈芝子實體單一蛋白多糖P1、P2、P3的制備。
將松杉靈芝子實體蛋白多糖粗品GTP200mg溶于10ml蒸餾水中，上Sephadex-G150柱(2×80cm)，上樣速度0.25ml/min，以0.2mol/L NaOH溶液洗脫，洗脫速度0.5ml/min，用紫外檢測器檢測，記錄儀記錄流出曲線，分別收集第一組分、第二組分、第三組分流出液，重復精制三次，分別經(jīng)3KD超濾膜脫鹽濃縮后，分別冷凍干燥，獲得本發(fā)明單一蛋白多糖P1、P2、P3純品。
實施例6松杉靈芝子實體單一蛋白多糖P1、P2、P3的制備。
將松杉靈芝子實體蛋白多糖粗品GTP100mg溶于5ml蒸餾水中，上Sepharose F.F.(3×70cm)層析柱，上樣速度0.50ml/min，以0.3mol/L NaOH溶液洗脫，洗脫速度3ml/min，用紫外檢測器檢測，記錄儀記錄流出曲線，分別收集第一組分、第二組分、第三組分流出液，分別經(jīng)5KD超濾膜脫鹽濃縮后，分別冷凍干燥，獲得本發(fā)明松杉靈芝單一蛋白多糖P1、P2、P3純品。
實施例6松杉靈芝子實體單一蛋白多糖P1、P2、P3的理化性質(zhì)1.純度測定(均一性測定)用Sephadex-G150凝膠柱層析法進行純度測定，取上述三個純品適量溶于0.2mol/L NaOH溶液中，以0.2ml/min速度上柱，以3ml/min速度用0.2mol/L NaOH溶液洗脫，以分步收集器收集流出液，每管接2ml，收集160管，以苯酚硫酸法進行多糖含量測定，繪制吸光度值與管數(shù)之間的洗脫曲線。結(jié)果是P1、P2、P3采用HPLC，凝膠柱測定分別獲得單一的對稱峰，說明三個單一蛋白多糖純度很高。
2.平均分子量測定采用凝膠過濾法，在TOYOPERAL HW65F凝膠柱上進行，柱子Φ3.0×32.50cm，首先測定多糖標準品MW分別為10×103、40×103、70μ103、110×103、500×103、2000×103的洗脫體積，流出速度為38ml/hr，收集外水體積V0和洗脫體積Ve，單一蛋白的多糖樣品同樣測量，繪制Ve/V0與各分子量對數(shù)關(guān)系標準曲線，由標準曲線求得它們的分子量分別為P1約20萬、P2約2萬、P3約9000。
3.單糖組成分析樣品水解取P1、P2、P3適量，分別以稀硫酸水解，100℃，8小時，水解后，采用紙層析法和乙?；蟛捎脷庀嗌V分析，單糖標準為葡萄糖、甘露糖、木糖、半乳糖、半乳糖醛酸。結(jié)果三種單一蛋白多糖中的單糖均為葡萄糖組成，是葡聚糖。氣相色譜的結(jié)果三種單一蛋白多糖的乙?；锏谋Ａ魰r間均與標準品葡萄糖的乙酰化物的保留時間一致為32.142min，故多糖部分的單糖組成均為D-葡萄糖。
4.光譜分析4.1紅外光譜分析取單一蛋白多糖P1、P2、P3適量，采用溴化鉀壓片法，在2200～400cm-1范圍內(nèi)掃描，于890cm-1處有吸收峰，表明具有β-糖苷鍵結(jié)構(gòu)。
4.2核磁共振13C譜具有化學位移105.0、79.3、76.2、72.9、71.9、63.9等特征峰?？赏茢喑鼋Y(jié)果為(1→3)β-D葡聚糖。1H譜也提供了相同的信息。
權(quán)利要求
1.一種松杉靈芝蛋白多糖粗品GTP，其特征是，它是包含三種單一的蛋白多糖P1，P2及P3的混合物，其中，它們的重量百分比分別為P1 1.50～3.00％，P2 52～58％，P3 20～25％，它們的多糖部分為均一的葡聚糖，糖苷鍵均為β-(1-3)構(gòu)型，其結(jié)構(gòu)式如下式表示， 其中，P1的n值為500～611，分子量為18～22萬；P2的n值為42～69，分子量為1.5～2.5萬；P3的n值為17～34，分子量為0.6～1.2萬；蛋白質(zhì)部分以整體形式結(jié)合在多糖部分的還原末端。
2.一種制備權(quán)利要求1所述的松杉靈芝蛋白多糖粗品GTP的方法，其包括下列步驟(1)取松杉靈芝子實體粉碎物，加其重量10～40倍水，加熱攪拌，提取、過濾，獲藥渣備用；(2)在上述藥渣中，加入其子實體藥粉重量10～40倍的2～10％稀堿溶液，該溶液中含有四氫硼化鈉0.04～0.12％，充分攪拌后，于20～40℃浸提25～30小時，過濾。調(diào)節(jié)濾液pH為中性，放置澄清，離心，收集上清液，加入其體積2～4倍的無水醇，邊加邊攪拌，放置澄清，離心，將沉淀溶于水中，經(jīng)20～1μm微濾膜過濾，濾液再經(jīng)過3～5KD超濾分離濃縮，冷凍干燥，獲得松杉靈芝蛋白多糖粗品GTP。
3.一種制備權(quán)利要求1所述的松杉靈芝蛋白多糖粗品GTP的方法，其包括下列步驟(1)取松杉靈芝子實體粉碎物，加其重量5-8倍的70～99％有機溶劑進行脫脂，加熱至70-80℃，提取、過濾，藥渣備用；(2)向步驟(1)所得藥渣中加入子實體藥粉重量的10～40倍水，加熱至98-100℃，提取、過濾，藥渣備用；(3)在步驟(2)所得的藥渣中，加入其子實體藥粉重量的10～40倍的2～10％的稀堿溶液，該溶液中含有四氫硼化鈉0.04～0.12％，充分攪勻后，于20～40℃浸提25～30小時過濾，調(diào)節(jié)濾液pH為中性，放置澄清，離心收集上清液，加入其體積2～4倍的無水醇，邊加邊攪拌，放置澄清，離心后，將沉淀溶于水中，3～1μm微濾后，再經(jīng)3～5KD超濾濃縮，冷凍干燥，獲得松杉靈芝蛋白多糖粗品GTP。
4.一種松杉靈芝蛋白多糖P1，其特征是其平均分子量為18～22萬，其多糖部分為均一的葡聚糖，糖苷鍵均為β-(1-3)構(gòu)型，其結(jié)構(gòu)式如下式表示， 其中，n為500～611；蛋白質(zhì)部分以整體形式結(jié)合在多糖部分的還原末端；其中，多糖部分的重量含量為60.4～71.2％，蛋白質(zhì)部分的重量含量為39.6～28.8％。
5.一種制備權(quán)利要求4所述的松杉靈芝蛋白多糖P1的方法，其包括下列步驟(1)將權(quán)利要求1所述的松杉靈芝蛋白多糖粗品溶于20～60倍蒸餾水后，上凝膠柱進行層析分離，上樣速度0.2～0.8ml/min；(2)上樣完畢后，用0.1～0.5mol/L NaOH溶液洗脫，洗脫速度0.4～8ml/min，收集第一流出液，經(jīng)3～5KD超濾膜脫鹽濃縮后，冷凍干燥，獲得松杉靈芝蛋白多糖P1。
6.一種松杉靈芝蛋白多糖P2，其特征是其平均分子量為1.5～2.5萬，其多糖部分為均一的葡聚糖，糖苷鍵均為β-(1-3)構(gòu)型，其結(jié)構(gòu)式如下式表示， 其中，n為42～69；蛋白質(zhì)部分以整體形式結(jié)合在多糖部分的還原末端；其中，多糖部分的重量含量為65～76％，蛋白質(zhì)部分的重量含量為35～24％。
7.一種制備權(quán)利要求6所述的松杉靈芝蛋白多糖P2的方法，其包括下列步驟(1)將權(quán)利要求1所述的松杉靈芝蛋白多糖粗品溶于20～60倍蒸餾水后，上凝膠柱進行層析分離，上樣速度0.2～0.8ml/min；(2)上樣完畢后，用0.1～0.5mol/L NaOH溶液洗脫，洗脫速度0.4～8ml/min，收集第二流出液，經(jīng)3～5KD超濾膜脫鹽濃縮后，冷凍干燥，獲得松杉靈芝蛋白多糖P2。
8.一種松杉靈芝蛋白多糖P3，其特征是其平均分子量為0.6～1.2萬，其多糖部分為均一的葡聚糖，糖苷鍵均為β-(1-3)構(gòu)型，其結(jié)構(gòu)式如下式表示， 其中，n為17～34；蛋白質(zhì)部分以整體形式結(jié)合在多糖部分的還原末端；其中，多糖部分的重量含量為56.6～78％，蛋白質(zhì)部分的重量含量為43.4～22％。
9.一種制備權(quán)利要求8所述的松杉靈芝蛋白多糖P3的方法，其包括下列步驟(1)將權(quán)利要求1所述的松杉靈芝蛋白多糖粗品溶于20～60倍蒸餾水后，上凝膠柱進行層析分離，上樣速度0.2～0.8ml/min；(2)上樣完畢后，用0.1～0.5mol/L NaOH溶液洗脫，洗脫速度0.4～8ml/min，收集第三流出液，經(jīng)3～5KD超濾膜脫鹽濃縮后，冷凍干燥，獲得松杉靈芝蛋白多糖P3。
10.權(quán)利要求1、4、6或8所述的蛋白多糖分別在制備抗腫瘤藥物中的應用。
全文摘要
一種松杉靈芝蛋白多糖粗品和三種蛋白多糖純品及其制備方法和它們在制備抗腫瘤藥物中的應用。松杉靈芝蛋白多糖粗品為包含三種單一的蛋白多糖P1，P2及P3的混合物，其中，它們的重量百分比分別為P1 1.50～3.00％，P2 52～58％，P3 20～25％，它們的多糖部分為均一的葡聚糖，糖苷鍵均為β－(1－3)構(gòu)型，其中，P1的n值為500～611，分子量為18～22萬；P2的n值為42～69，分子量為1.5～2.5萬；P3的n值為17～34，分子量為0.6～1.2萬；蛋白質(zhì)部分以整體形式結(jié)合在多糖部分的還原末端。
文檔編號A61K31/716GK1715298SQ20041005004
公開日2006年1月4日 申請日期2004年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月29日
發(fā)明者費曉方 申請人:長春市恒泰生物技術(shù)有限公司