專利名稱：蛇源去整合素突變體抗腫瘤藥安吉康蛋白的一級結(jié)構(gòu)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；涉及到重組旅順白眉蝮蛇蛇毒去整合素突變體蛋白的氨基酸殘基序列與相應(yīng)的核苷酸序列，及其抑制實(shí)體惡性腫瘤血管生成和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的抗腫瘤作用；抑制血小板聚集的抗血栓作用；以及促進(jìn)嗜中性白細(xì)胞趨向性的作用，特別涉及到蛇源去整合素突變體安吉康蛋白的氨基酸殘基序列及其相應(yīng)的核苷酸序列。
背景技術(shù)：
抑制惡性實(shí)體腫瘤的血管生成可有效地抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。腫瘤在1mm3以上時(shí)，便有血管生成和長入，腫瘤從血液獲取營養(yǎng)而迅速張大，并有利于轉(zhuǎn)移。如果沒有血管生長，腫瘤將發(fā)生退化。如果腫瘤的血管生成受到抑制，則腫瘤將不再生長，并可以進(jìn)一步發(fā)生萎縮和凋亡，不能對機(jī)體造成危害。國內(nèi)外雖有一些抑制惡性實(shí)體腫瘤血管生成的研究，但均不成熟。目前尚無這方面的基因重組藥物進(jìn)入市場。我們曾用基因工程手段，從旅順白眉蝮蛇(Gloydiusblomhoffi brevicaudus)的毒腺中克隆出一種可以編碼小分子量蛋白質(zhì)(艾丁比特)的cDNA，并在大腸桿菌和酵母菌中成功地表達(dá)。這方面的成果已經(jīng)申請了專利。艾丁比特含有模體RGD，可以與血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的粘附因子整合蛋白αvβ3結(jié)合，抑制其活性。艾丁比特與我國臺灣學(xué)者從Calloselasma rhodostoma提取純化(不是基因重組)出的rhodostomin序列相比，有28個(gè)氨基酸的差異。美國學(xué)者也曾經(jīng)從蛇毒中提取出一種小分子量的蛋白質(zhì)，稱為albolabrin，僅研究其對血小板聚集的抑制作用，而且不是用分子克隆的方法，是直接從蛇毒中提取的。艾丁比特僅與目前韓國Yonsei大學(xué)生物產(chǎn)品研究中心生物化學(xué)系研究的Saxatilin相似，但有9個(gè)核苷酸的差異和6個(gè)氨基酸的差異。韓國學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Saxatilin含有12個(gè)半胱氨酸，形成6個(gè)二硫鍵。我們將艾丁比特進(jìn)行定點(diǎn)突變修飾，產(chǎn)生出含有ECD模體和RGD模體，和含有11個(gè)半胱氨酸，形成含5個(gè)二硫鍵的安吉康。此物質(zhì)具有較強(qiáng)地抑制新生血管生長、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，較弱地抑制血小板聚集但不引起出血和有一定地促進(jìn)嗜中性白細(xì)胞趨向化的作用。因此，具有很好的抗實(shí)體腫瘤生長的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是給出比重組旅順白眉蝮蛇蛇毒艾丁比特更為優(yōu)化的小分子蛋白質(zhì)安吉康的氨基酸殘基順序，及其抑制實(shí)體腫瘤組織內(nèi)血管生成和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，較弱地抑制血小板聚集但不引起出血和有一定地促進(jìn)嗜中性白細(xì)胞趨向化的作用，進(jìn)而達(dá)到抑制腫瘤生長的作用。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是采用基因工程的技術(shù)手段，對用于抗腫瘤療法的重組白眉蝮艾丁比特分子進(jìn)行修飾，以增強(qiáng)其抑制實(shí)體腫瘤組織內(nèi)血管生成和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，進(jìn)而增強(qiáng)其抑制腫瘤生長的作用。安吉康為由73個(gè)氨基酸殘基組成的小分子量的蛋白質(zhì)，含有谷氨酸-半胱氨酸-天冬氨酸ECD模體和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸RGD模體，含11個(gè)半胱氨酸殘基，形成5個(gè)二硫鍵。二硫鍵的位置是Cys8-Cys16、Cys21-Cys35、Cys29-Cys59、Cys34-Cys38、Cys47-Cys66，其氨基酸殘基的序列(例)為1 EAGEECDCGS PGNPSCDAAT CKLRQGAQCA EGLCCDQCRF MKKGTVCRIA51 RGDDMDDYCN GISAGCPRNP FHA其二硫鍵的位置如下 上述的一級結(jié)構(gòu)中，第十五位為除半胱氨酸以外的以下十九種氨基酸中的任何一種這十九種氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸、纈氨酸、賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、精氨酸、組氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。
本發(fā)明的有益效果是，安吉康與野生型相比，存在游離的巰基，即存在ECD模體，具有比重組旅順白眉蝮蛇艾丁比特更強(qiáng)的抑制實(shí)體腫瘤組織內(nèi)血管生成和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，較弱地抑制血小板聚集但不引起出血和有一定地促進(jìn)嗜中性白細(xì)胞趨向化的作用。更有利于用于實(shí)體腫瘤的治療，可作為抗實(shí)體惡性腫瘤的藥物，進(jìn)一步開發(fā)。
具體實(shí)施例方式
用于抗腫瘤療法的安吉康的克隆，包括定點(diǎn)突變，均采用分子生物學(xué)的手段進(jìn)行。安吉康的核苷酸序列含222個(gè)堿基對，此核苷酸序列為1 GAGGCCGGAG AAGAATGTGA CTGTGGCTCT CCTGGAAATC CGAGCTGTGA51 TGCTGCAACC TGTAAACTGA GACAAGGAGC ACAGTGTGCA GAAGGACTGT101 GTTGTGACCA GTGCAGATTT ATGAAAAAAG GAACAGTATG CCGGATAGCA151 AGGGGTGATG ACATGGATGA TTACTGCAAT GGCATATCTG CTGGCTGTCC201 CAGAAATCCC TTCCATGCCT AG蛋白質(zhì)安吉康由73個(gè)氨基酸組成，其氨基酸順序如下1 EAGEECDCGS PGNPSCDAAT CKLRQGAQCA EGLCCDQCRF MKKGTVCRIA52 RGDDMDDYCN GISAGCPRNP FHA以本實(shí)驗(yàn)室保存的含有野生型基因克隆載體pPET23b-Ad為模板，點(diǎn)突變的步驟是1.設(shè)計(jì)引物引物A5’-GCCAGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACG-3’(含限制性內(nèi)切酶Bgl II)引物B5’-CGGATTTCCAGGAGAGCCACAG-3’引物C5，-AGCTGTGATGCTGCAACCTG-3’
引物D5’-ATGAAGCTTGGCATGGAAGGGATTTC-3’(含限制性內(nèi)切酶Hind III)2.合成DNA片段1)以質(zhì)粒pPET23b-Ad為模板，利用引物A和B進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長度為138bp的DNA片段。其具體反應(yīng)體系是25mmol/L MgCl21.5μl10×PCR buffer 2.5μl無菌蒸餾水 18.35μldNTP mixture 2μlTaKaRa Taq 0.15μlPrimer A 0.25μlPrimer B 0.25μl總體積25μl反應(yīng)條件94℃ 2min 反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖電泳鑒定。在140bp附近有一條帶為目的基因片段帶。
2)以質(zhì)粒pPET23b-Ad為模板，利用引物C和D進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長度為180bp的DNA片段。其具體反應(yīng)體系是
25mmol/L MgCl21.6μl10×PCR buffer 2.5μl無菌蒸餾水 18.35μldNTP mixture 2μlTaKaRa Taq 0.15μlPrimer C 0.25μlPrimer D 0.25μl反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖電泳鑒定。在180bp附近有一條帶為目的基因片段帶。
3)連接電泳后將兩條帶進(jìn)行平端連接，通過T4連接酶可以連接成一條含約320bp的DNA片段。具體方法如下采用寶生物工程有限公司生產(chǎn)的DNA Ligation Kit Ver2進(jìn)行連接反應(yīng)，反應(yīng)混合物組成是兩個(gè)PCR產(chǎn)物的混合液沉淀+10μl DNA Ligation Kit Ver2+雙蒸水9μl，于室溫下反應(yīng)5小時(shí)，然后置于冰箱中。
4)構(gòu)建入質(zhì)粒pPET23b、擴(kuò)增并測序。
利用Bgl II和Hind III雙酶切將已連接的DNA片段構(gòu)建入質(zhì)粒pPET23b。并在大腸桿菌DH5α中擴(kuò)增。制備感受態(tài)細(xì)菌采用氯化鈣法。構(gòu)建后采用PCR和雙酶切片段電泳進(jìn)行鑒定。并送寶生物工程有限公司測序，以確定定點(diǎn)突變的正確結(jié)果。
權(quán)利要求
1.蛇源去整合素突變體抗腫瘤藥安吉康蛋白的一級結(jié)構(gòu)，其特征在于，由73個(gè)氨基酸殘基組成，含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸模體和谷氨酸-半胱氨酸-天冬氨酸模體，含11個(gè)半胱氨酸殘基和五個(gè)二硫鍵；安吉康的一級結(jié)構(gòu)中，這五個(gè)二硫鍵的位置分別是Cys8-Cys16、Cys21-Cys35、Cys29-Cys59、Cys34-Cys38、Cys47-Cys66；其一級結(jié)構(gòu)是1 EAGEECDCGS PGNPSCDAAT CKLRQGAQCA EGLCCDQCRF MKKGTVCRIA51 RGDDMDDYCN GISAGCPRNP FHA
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛇源去整合素突變體抗腫瘤藥安吉康蛋白的一級結(jié)構(gòu)，其特征在于，第15位為丙氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，苯丙氨酸，甘氨酸，組氨酸，異亮氨酸，賴氨酸，亮氨酸，蛋氨酸，天冬酰胺，脯氨酸，谷氨酰胺，精氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，纈氨酸，酪氨酸中的任一個(gè)氨基酸；即第6位的半胱氨酸為游離氨基酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛇源去整合素突變體抗腫瘤藥安吉康蛋白的一級結(jié)構(gòu)，其特征在于，在基因工程中所產(chǎn)生的含有安吉康氨基酸序列的融合蛋白或多肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛇源去整合素突變體抗腫瘤藥安吉康蛋白的一級結(jié)構(gòu)，其特征在于，在基因工程中所形成的與安吉康上述的氨基酸序列相對應(yīng)的核苷酸序列，含簡并密碼子，包括存在于載體上的可編碼安吉康氨基酸序列的核苷酸序列。
全文摘要
蛇源去整合素突變體抗腫瘤藥安吉康蛋白的一級結(jié)構(gòu)屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及到重組旅順白眉蝮蛇蛇毒去整合素突變體蛋白的氨基酸殘基序列與相應(yīng)的核苷酸序列，特別涉及到蛇源去整合素突變體安吉康蛋白的氨基酸殘基序列及其相應(yīng)的核苷酸序列。其抑制實(shí)體惡性腫瘤血管生成和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的抗腫瘤作用；抑制血小板聚集的抗血栓作用；以及促進(jìn)嗜中性白細(xì)胞趨向性的作用。
文檔編號A61P35/00GK1616488SQ20041005057
公開日2005年5月18日 申請日期2004年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月12日
發(fā)明者趙寶昌 申請人:趙寶昌