專利名稱：血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2基因與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地涉及人血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2基因(Angiotensin converting enzyme 2 gene，ACE2)的單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotide polymorphism，SNP)及其與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性。本發(fā)明還涉及檢測(cè)這些SNP的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
原發(fā)性高血壓(essential hypertension，EH)是最常見的心血管疾病，其發(fā)病率逐年上升，并可引起嚴(yán)重的心、腦、腎并發(fā)癥，是腦卒中和冠心病的主要危險(xiǎn)因素。EH是一種由遺傳因素和環(huán)境因素相互作用而發(fā)病的多基因病，尋找EH相關(guān)基因進(jìn)而闡明高血壓發(fā)病的遺傳機(jī)制已經(jīng)成為目前研究的熱點(diǎn)(HarrapSB.Hypertensiongenes versus environment.Lancet，1994，344169-171)。
腎素-血管緊張素(RAS)系統(tǒng)是體內(nèi)調(diào)節(jié)血壓和水鹽代謝的重要系統(tǒng)。血管緊張素II(AngII)是RAS系統(tǒng)中一個(gè)重要的血管收縮劑，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)主要將血管緊張素I(AngI)轉(zhuǎn)換成AngII，而ACE2卻將AngI轉(zhuǎn)化成血管舒張劑Ang(1-7)，并且這種作用是不被ACE抑制劑所阻滯的(Tipnis SR，Hooper NM，Hyde R，et al.A human homolog of angiotensin-converting enzymecloningand functional expression as a captopril-insensitive carboxypeptidase.J Biol Chem 2000；27533238-33243)。近年來有許多研究提示ACE2與血壓和心血管結(jié)構(gòu)功能的關(guān)系密切。小鼠ace2基因的定位相當(dāng)于人的X染色體，該部位存在與血壓相關(guān)的數(shù)量性狀位點(diǎn)(Hilbert P，Lindpaintner K，BeckmannJS，et al.Chromosomal mapping of two genetic loci associated withblood-pressure regulation in hereditary hypertensive rats.Nature1991；353521-529)，ace2基因敲除小鼠的基礎(chǔ)血壓較正常小鼠高10-20mmHg(Allre AJ，Donoghue M，Acton S，et al.Regulation of blood pressureby the angiotensin converting enzyme homologue ACE2.Paper presentedat35th Annual Meeting of the American Society of Nephrology；November1-4，2002；Philadelphia，PA)，提示ace2可能是X染色體上與血壓相關(guān)的候選基因。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)ace2基因敲除小鼠的心臟功能發(fā)生了嚴(yán)重的損害，果蠅ACER基因(ACER相當(dāng)與人的ACE2基因)敲除后，也出現(xiàn)了心臟管的形成缺陷，導(dǎo)致心臟祖細(xì)胞數(shù)量減少和中胚層的發(fā)育異常(Crackower MA，Sarao R，Oudit GY，et al.Angiotensin-converting enzyme 2 is an essentialregulator of heart function.Nature 2002；417822-823)。因此，已有學(xué)者提出了ACE2基因調(diào)節(jié)血壓的假說機(jī)制，并認(rèn)為ACE2可能成為心血管治療中的一個(gè)重要的靶點(diǎn)，但目前沒有證實(shí)ACE2基因與原發(fā)性高血壓相關(guān)性的報(bào)道，更沒有證實(shí)ACE2基因的SNP與原發(fā)性高血壓相關(guān)性的報(bào)道。
綜上所述，為了最終實(shí)現(xiàn)治療高血壓，本領(lǐng)域迫切需要尋找原發(fā)性高血壓易感基因，并開發(fā)檢測(cè)原發(fā)性高血壓的方法、試劑盒，以及相關(guān)的治療藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種輔助性診斷(尤其是早期診斷)高血壓等高血壓的方法及檢測(cè)試劑盒。
本發(fā)明的另一目的是提供一種新的治療高血壓的方法。
本發(fā)明的再一目的是提供一種治療高血壓的藥物組合物。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種對(duì)個(gè)體的高血壓易感性進(jìn)行輔助性診斷的方法，它包括步驟檢測(cè)該個(gè)體的ACE2基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白，并與正常的ACE2基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白相比較，存在差異就表明該個(gè)體患高血壓的可能性高于正常人群。
在另一優(yōu)選例中，檢測(cè)的是ACE2的基因或轉(zhuǎn)錄本，并與正常ACE2核苷酸序列比較差異。
在另一優(yōu)選例中，所述的差異是選自下組的單核苷酸多態(tài)性1790位A→G；16286位G→A；28308位A→G；36150位A→G；其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQ ID NO1。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種檢測(cè)樣品是否存在ACE2基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，包括步驟(a)用ACE2基因特異性引物擴(kuò)增樣品的ACE2基因，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；和(b)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在選自下組的單核苷酸多態(tài)性11790位A→G；16286位G→A；28308位A→G；36150位A→G；
其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQ ID NO1。
在另一優(yōu)選例中，所述的單核苷酸多態(tài)性是28308位AG。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的ACE2蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體。
還提供了嚴(yán)重ACE2基因和蛋白的用途，它們被用于(a)制備輔助性檢測(cè)的試劑；或(b)制備治療高血壓的藥物。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種用于輔助性檢測(cè)高血壓的試劑盒，它包括特異性擴(kuò)增ACE2基因或轉(zhuǎn)錄本的引物和說明書。
在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還含有選自下組的試劑(a)與突變部位結(jié)合的探針；(b)識(shí)別突變位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶。
在另一優(yōu)選例中，所述的突變選自11790位A→G；16286位G→A；28308位A→G；36150位A→G；其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQ ID NO1。
更佳地，所述的單核苷酸多態(tài)性是28308位AG。


圖1顯示了ACE2的一種SNP圖像(以SNP03為例)的測(cè)序結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過多年研究，首次發(fā)現(xiàn)和證明了ACE2基因與高血壓密切相關(guān)，而且發(fā)現(xiàn)了它的新功能ACE2的改變將導(dǎo)致高血壓，其中關(guān)聯(lián)研究結(jié)果顯示，在ACE2第28308位的SNP03(A/G)在病例和對(duì)照組中的分布存在顯著性差異(P＜0.05)，該SNP多態(tài)可改變氨基酸編碼進(jìn)而可能影響基因表達(dá)產(chǎn)物的功能，因此與高血壓發(fā)病存在密切的相關(guān)性?；诖税l(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了利用檢測(cè)ACE2基因、轉(zhuǎn)錄本或蛋白是否存在突變，從而為診斷高血壓提供輔助性或早期參考指標(biāo)的方法和試劑盒。
ACE2基因的總長(zhǎng)度為42975bp。其詳細(xì)序列可參見登錄號(hào)為NM_021804的核苷酸序列(可參見網(wǎng)址http//genome.ucsc.edu/或http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)或參見SEQ ID NO1。
基于本發(fā)明的新發(fā)現(xiàn)，ACE2蛋白或多肽有多方面的新用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療ACE2蛋白功能低下或喪失所致的疾病(如高血壓)，和用于篩選促進(jìn)ACE2蛋白功能的物質(zhì)，如抗體、多肽或其它配體。用表達(dá)的重組人ACE2蛋白篩選多肽庫(kù)可用于尋找有治療價(jià)值的能刺激人ACE2蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)人ACE2 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人ACE2基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人ACE2基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人ACE2蛋白的分子，也包括那些并不影響人ACE2蛋白功能的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的人ACE2基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)人ACE2蛋白或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動(dòng)物來生產(chǎn)抗體。多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。
本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人ACE2蛋白功能的抗體以及不影響人ACE2蛋白功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人ACE2基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人ACE2基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而獲得。
抗人ACE2蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測(cè)活檢標(biāo)本中的人ACE2蛋白。一種優(yōu)選的抗ACE2抗體是不識(shí)別正常ACE2但識(shí)別突變ACE2的抗體，或者識(shí)別正常ACE2但不識(shí)別突變ACE2的抗體。利用該抗體對(duì)正常和異常ACE2蛋白的特異性差異，可以方便地進(jìn)行蛋白質(zhì)水平的高血壓易感性檢測(cè)。
利用本發(fā)明ACE2蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與ACE2蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如抑制劑、激動(dòng)劑或拮抗劑等。
本發(fā)明ACE2蛋白及其抗體、抑制劑、激動(dòng)劑、拮抗劑等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無(wú)毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、或皮下給藥。
正常的ACE2多肽可直接用于疾病治療，例如，用于高血壓治療。在使用本發(fā)明ACE2蛋白時(shí)，還可同時(shí)使用其他治療高血壓的藥劑。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明ACE2蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無(wú)菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約0.1微克/千克體重-約10毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時(shí)，是將安全有效量的ACE2蛋白或其拮抗劑、激動(dòng)劑施用于哺乳動(dòng)物，其中該安全有效量通常至少約0.1微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約0.1微克/千克體重-約100微克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
人ACE2蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的。基因治療技術(shù)可用于治療由于ACE2蛋白的無(wú)表達(dá)或異常/無(wú)活性的ACE2蛋白的表達(dá)所致的細(xì)胞增殖、發(fā)育或代謝異常。構(gòu)建攜帶ACE2基因的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(xiàn)(Sambrook，et al.)。另外重組人ACE2基因可包裝到脂質(zhì)體中，然后再轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。
多聚核苷酸導(dǎo)入組織或細(xì)胞內(nèi)的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內(nèi)組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質(zhì)粒等)先將多聚核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞中，再將細(xì)胞移植到體內(nèi)等。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測(cè)人ACE2蛋白水平的診斷試驗(yàn)方法。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的，且包括FISH測(cè)定和放射免疫測(cè)定。
一種檢測(cè)檢測(cè)樣品中是否存在ACE2蛋白的方法是利用ACE2蛋白的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)，它包括將樣品與ACE2蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在ACE2蛋白。
ACE2蛋白的多聚核苷酸可用于ACE2蛋白相關(guān)疾病的診斷和治療。在診斷方面，ACE2蛋白的多聚核苷酸可用于檢測(cè)ACE2蛋白的表達(dá)與否或在疾病狀態(tài)下ACE2蛋白的異常表達(dá)。如ACE2 DNA序列可用于對(duì)活檢標(biāo)本的雜交以判斷ACE2蛋白的表達(dá)異常。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因診斷。用ACE2蛋白特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可檢測(cè)ACE2蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
檢測(cè)ACE2基因的突變也可用于診斷高血壓。檢測(cè)可以針對(duì)cDNA，也可針對(duì)基因組DNA。ACE2蛋白突變的形式包括與正常野生型ACE2 DNA序列相比的點(diǎn)突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等。一類優(yōu)選的突變是表2所示的SNP?？捎靡延械募夹g(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測(cè)突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達(dá)，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無(wú)突變。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于首次用實(shí)驗(yàn)證實(shí)了ACE2的改變與高血壓的密切相關(guān)性，進(jìn)而提供了輔助性診斷高血壓(或易感性)的方法和試劑盒。本發(fā)明可以為臨床診斷(尤其是早期診斷)高血壓提供極為有價(jià)值的輔助性參考指標(biāo)，從而有利于實(shí)現(xiàn)早診斷、早預(yù)防、早得益。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例11對(duì)象與方法1.1研究對(duì)象1.1.1中國(guó)人SNP發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)樣本樣本為來自24個(gè)核心漢族高血壓家系、無(wú)親緣關(guān)系的24例原發(fā)性高血壓病人。
1.1.2SNP分型和關(guān)聯(lián)分析研究樣本所有受試者均為漢族。原發(fā)性高血壓組(EH組)和正常血壓組(NT組)各96例，均來自中國(guó)上海地區(qū)，彼此無(wú)親緣關(guān)系。EH組為上海市瑞金醫(yī)院高血壓科住院病人，均為漢族，無(wú)親緣關(guān)系。共390人，平均年齡為57.32±11.75歲。入選標(biāo)準(zhǔn)
收縮壓140mmHg和/或舒張壓90mmHg，或正在接受抗高血壓藥物治療至少一年以上；在30歲之前或60歲以后發(fā)病者除外；臨床上除外繼發(fā)性高血壓，如原發(fā)性醛固酮增多癥、嗜鉻細(xì)胞瘤、腎性高血壓等。
NT組為上海地區(qū)40歲以上居民，均為漢族，無(wú)親緣關(guān)系。共440例，平均年齡56.39±6.45歲。收縮壓＜140mmHg且舒張壓＜90mmHg，無(wú)服用抗高血壓藥物史，排除肝、腎功能障礙、甲狀腺疾病、糖尿病、冠心病史。
1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1DNA提取常規(guī)酚-氯仿法提取外周血白細(xì)胞DNA，并標(biāo)化DNA濃度值至20ng/μl。
1.2.2PCR及測(cè)序引物的設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中ACE2的基因組序列，應(yīng)用prime3軟件(美國(guó)麻省理工生物醫(yī)學(xué)白頭研究所，http//www-gonome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi)設(shè)計(jì)引物。具體引物如下表所示。
表1引物序列表


1.2.3ACE2基因的調(diào)控區(qū)和編碼區(qū)分段體外擴(kuò)增以提取的DNA為模板，用Taq酶，在GeneAmp 9700 PCR儀上以Touchdown程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2分鐘，94℃變性30秒，63℃退火40秒，72℃延伸40秒，共10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度遞減0.5℃；以后94℃變性30秒，58℃退火40秒，72℃延伸40秒，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7分鐘。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。
1.2.4SNP的發(fā)現(xiàn)和檢測(cè)PCR產(chǎn)物經(jīng)Resin樹脂純化后，用ABI-PRISMTM377 DNA測(cè)序儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司appliedbiosystems(ABI))進(jìn)行熒光標(biāo)記末端終止法雙向測(cè)序，用Polyphred軟件(美國(guó)華盛頓大學(xué)http//droog.mbt.washington.edu/Polyphred.html)進(jìn)行序列的判讀和SNP確認(rèn)。
1.2.5SNP基因分型和關(guān)聯(lián)分析用直接單向測(cè)序法進(jìn)行SNP基因分型。選擇外顯子區(qū)的SNP進(jìn)行初步分型，即在390個(gè)高血壓病人和440個(gè)正常血壓對(duì)照組中進(jìn)行分型和關(guān)聯(lián)分析。
1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法SNPs各基因型在病人和正常血壓對(duì)照中分布的比較采用R×C表x2檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。
2.結(jié)果2.1ACE2基因SNP的發(fā)現(xiàn)和分布ACE2的基因共有18個(gè)外顯子，測(cè)序總長(zhǎng)度是10539bp，共發(fā)現(xiàn)4個(gè)SNP，包括編碼區(qū)1個(gè)，內(nèi)含子3個(gè)，其中編碼區(qū)的1個(gè)是新發(fā)現(xiàn)的SNP。ACE2基因SNP分布情況見表2。測(cè)序確認(rèn)雜合子圖像見圖1。
表2中國(guó)人ACE2基因SNP的種類及其分布

說明(1)表中第一列為SNP的名稱；第二列為SNP在ACE2基因序列中的位置；第三列為SNP所屬基因區(qū)域，exon為外顯子區(qū)，intron為內(nèi)含子區(qū)；第四列為在等位基因中SNP的兩個(gè)堿基；第五列為測(cè)序所用引物。
(2)SNP03為新發(fā)現(xiàn)的SNP(圖1)。
2.2SNP位點(diǎn)的基因分型在390例EH和440例NT中，對(duì)SNP03進(jìn)行基因分型和關(guān)聯(lián)分析。
結(jié)果提示，SNP03等位基因分布在兩組中有顯著差異(P＜0.01)(表3)表明該SNP與高血壓顯著相關(guān)。
表3SNP03基因分型和關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

EH，原發(fā)性高血壓NT，正常血壓對(duì)照3.討論高血壓是遺傳因素與多種環(huán)境因素相互作用而導(dǎo)致的多基因疾病，其遺傳機(jī)制的研究已經(jīng)成為目前的研究熱點(diǎn)。迄今研究者已經(jīng)成功地確定了幾種單基因遺傳性高血壓的候選基因，但占高血壓約95％的原發(fā)性高血壓的遺傳方式和易感基因仍未確認(rèn)。研究候選基因是原發(fā)性高血壓遺傳研究的主要策略之一。RAS系統(tǒng)是體內(nèi)調(diào)節(jié)血壓和水鹽代謝的重要系統(tǒng)，該系統(tǒng)中的AGT、ACE、AT1R、ACE2、REN、RENBP等均為原發(fā)性高血壓的候選基因。
人的ACE2基因位于X染色體上(Xp22)，基因組全長(zhǎng)40kb，有18個(gè)外顯子，在腎臟、心臟等組織高度表達(dá)(Tipnis SR，Hooper NM，Hyde R，et al.A humanhomolog of angiotensin-converting enzymecloning and functionalexpression as a captopril-insensitive carboxypeptidase.J Biol Chem2000；27533238-33243)。雖然與ACE同為鋅指蛋白酶，并有40％的同源結(jié)構(gòu)，但二者的生化活性卻大有差異。AngII是RAS系統(tǒng)中一個(gè)重要的血管收縮劑，ACE主要將AngI轉(zhuǎn)換成AngII，而ACE2卻將AngI轉(zhuǎn)化成血管舒張劑Ang(1-7)，并且這種作用是不被ACE抑制劑所阻滯的。近年來雖有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示ACE2與血壓和心血管結(jié)構(gòu)功能的關(guān)系密切，但對(duì)其的研究特別是多態(tài)性方面的研究很少。
本研究首次對(duì)中國(guó)漢族人群進(jìn)行了ACE2基因的SNP檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了位于編碼區(qū)的1個(gè)SNP和位于內(nèi)含子連接區(qū)的3個(gè)SNP。位于編碼區(qū)的該SNP尚未被收錄于NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫(kù)(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)中。本研究發(fā)現(xiàn)這是一個(gè)非同義的低頻SNP，通過A/G堿基的改變，導(dǎo)致了編碼的氨基酸由異亮氨酸(Ile)變?yōu)槔i氨酸(Val)。該SNP的G等位基因在高血壓病例中的頻率為4％，在正常人中不到1％。提示我們ACE2基因和原發(fā)性高血壓的關(guān)系是值得關(guān)注的，特別是這些低頻SNP在高血壓中的作用。近年來的研究提示低頻SNP在多基因疾病中的地位是不容忽視的。那些有功能意義的SNP，即改變氨基酸編碼或致無(wú)義突變的SNP將朝著等位基因頻率分布的低處移動(dòng)(Stephens JC，SchneiderJA，Tanguay DA，et al.Haplotype variation and linkage disequilibriumin 313 human genes.Sci ence 2001；293489-493)，并且往往伴隨早顯的相對(duì)嚴(yán)重的疾病(Botstein D，Risch N.Discovering genotypes underlyinghuman phenotypespast successes for mendelian disease，futureapproaches for complex disease.Nat Genet 2003；33228-237)。
由于多基因疾病表現(xiàn)型的復(fù)雜性、相關(guān)基因的微效性和人群的遺傳異質(zhì)性，其相關(guān)基因定位克隆研究一直是一個(gè)很大的挑戰(zhàn)。在原發(fā)性高血壓候選基因中篩選多態(tài)性標(biāo)記，然后在病例-對(duì)照中進(jìn)行相關(guān)分析是目前尋找疾病相關(guān)基因的重要方法之一。SNP數(shù)量多、分布廣、密度高，是進(jìn)行遺傳連鎖分析和關(guān)聯(lián)研究最理想的遺傳標(biāo)記。本研究從ACE2基因的4個(gè)SNP中選出一個(gè)外顯子區(qū)改變氨基酸編碼的SNP(SNP03)，在上海地區(qū)漢族中，通過病例-對(duì)照分析，進(jìn)行它與高血壓間的相關(guān)性研究。結(jié)果表明這個(gè)SNP(28308A/G)的2種等位基因頻率分布，在390例EH和440例NT之間有顯著性差異(P＜0.01)。ACE2基因的這個(gè)位于編碼區(qū)的SNP是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的SNP，該位點(diǎn)的變異涉及氨基酸編碼的改變，設(shè)想該位點(diǎn)能夠影響ACE2的功能。
實(shí)施例2原發(fā)性高血壓易感性輔助檢測(cè)試劑盒制備一試劑盒，它含有名稱序列(5’→3’)編號(hào) 濃度正向引物ctgttctgttccagggcttc SEQ ID NO30 干粉20D反向引物agtgtcacctgacccaagga SEQ ID NO31 干粉20DPCR反應(yīng)液 含Taq酶dNTP鎂離子PCR反應(yīng)緩沖液抽取待檢測(cè)男性病人的血液3ml，使用常規(guī)方法(或使用特定的試劑盒)從血液中提取DNA。將高血壓檢測(cè)試劑盒中的PCR引物稀釋到1μmol/μl，以所提取的DNA為模板與所提供的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物純化后，用ABI-PRISMTM 377 DNA測(cè)序儀進(jìn)行熒光標(biāo)記末端終止法雙向測(cè)序，用Polyphred軟件進(jìn)行序列的判讀和SNP確認(rèn)。檢測(cè)結(jié)果圖1所示。其中，含C表示高血壓易感性高于正常人群。
用本實(shí)施例的試劑盒對(duì)近百例待測(cè)對(duì)象進(jìn)行了SNP28308的檢測(cè)，對(duì)于檢測(cè)發(fā)現(xiàn)存在28308位A→G的3個(gè)對(duì)象，再對(duì)其進(jìn)行血壓測(cè)量，結(jié)果證實(shí)具有28308位A→G的人的血壓高于正常人。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海市高血壓研究所國(guó)家人類基因組南方研究中心<120>血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2基因與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性<130>044610<160>47<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>42975<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1gtctttggat atattttttt actattgtat tctatcagag aggagatagg gcaggcagca 60tctgacttat tcctagtgaa ttcctaatgg accagagata tatttttcca agtgcaaatc 120acattctaaa aattttactt taggccgggt gcggtggctc atgcctgtaa tcccagcact 180ttgggaggcc gaggcgggca gatcacgagg tcagaagatc gagaccatcc tggctaacac 240agtgaaaccc cgtctctatt aaaaatacaa aaatattagc tgcgcatggt ggcgggcgcc 300tgtagtccca gctactcggg aggccgaggc aggagaatgg cgtgaacctg ggaggcggag 360cttgcagtga gcggagatcg cgccgctgca ctccagcctg ggtgacaaag cgagactccg 420tctcaaaaaa aaaaaaattt actttatagc tttactaggt gttaaggtca aacttccctt 480taccattatg aaatccaccc cctcctccaa tctttttgaa acatagaaca tctttcctgc 540atctttggtc ttctaatttt ttctgattct ccaatttttc tcaaagacaa tacattcctt 600tagaccaatt gtttttctgg gtctcatctc ctgagtcttc agtgaattct ttccattctc 660ggaatgcgct cagagagaac gcttctgggg aactatcaga acattgatat cttctcaaaa 720aagtgtgaac aaaaattcca ataattcagt cagtgcttgc agttggccat tctgggctag 780tttttctaca gaatcactgt agactattct cccttttccc ttgcttctca aagtttcttg 840gcttctagca ttttcctgcc tgcctcactg ctgtcccagg ctccttgttc atttattctt 900agctttcaga ttttatatct tgctttctcc atttcagttt gatcaagtta atcgtatttt 960ctgcctcagc gaattgaatt tggactactc ccattttttc cactaaaccc acgtgtttca 1020tttaggaact tacctgtgta gaaatttatt tccgctttta ttacagtaac atttcaacct 1080tttcttcaga tactcgtgtg ctgtcctctt tcttgcctgt tttttctcct attgtgtgca 1140aggagtgagt ggatctaggt ttcctggaat gtgggaggag cttttctgaa atttctgcac 1200tgattttttt tttttaccct catctcactt tcatttaaaa ttctttatta ttattactta 1260tatttgtgag ctgctttatt tttttaaaag gagagtatat tttgattcac atcaagggaa 1320gtaagagtcc acctcttttt gatgcagtgt aactaaatct gtcatcttca ctgaggcaca 1380aggccctctg tcacatttta tctatgcctc cactattgct tttagactgt tgactacaag 1440ttagttaaga gcctatactc tagaatcaga atacatagat ccatgttctg attccatcat 1500ttgttagctg agtgagatat agcaatttac ttaaacttag tttcataatt cataaaatgg 1560tgataaaata tttgcctata ggtttcttgt gatgctcaaa tgagatatta taacacaaag 1620cactttgaat agttacttat aattgttttt ttcctattct acaataatat acacaacttt 1680ggaataagga aaagcagtgg acattttttt aaaggcttga ttattgcaat gtcacctgaa 1740cctggaagac ttgtttttct gggtgaagaa atattttctc tgtgtcagag tttcacaatc 1800atcgtcaggt aggcccttga accctgccat ttaaagtgct cctctctttg atctgtggca 1860ctcatacata cactctggca atgaggacac tgagctcgct tctgaaattt gacaagataa 1920ccactaaaat ctctttgaat tctatgttgt tgtgatccca tggctacaga ggatcaggag 1980ttgacataga tactctttgg atttcatacc atgtggaggc tttcttactt ccacgtgacc 2040ttgactgagt tttgaatagg taagtgaagg agaaggaggc actcaaagaa gtcagccaca 2100gaaccagtgt gagaaatagg aaatgagctt ttttaagttt tgcaaaggca gatcaggaga 2160gttgacctgt ggagtggaga gtagtcataa ttttaaaaaa tggccatgga aattaaaact 2220gatcagaaat ggctgggcac agtggctcac gcctgtaatc ctagcacttt gggaggccga 2280gttgggcaga tcacaaggtc aggagataga gaccgtcctg actaacacgg tgaaaccccg 2340tctctattaa aaatacaaaa acttagctgg gcgtggtggt gggcacctgt agtcccagct 2400actcgggagg ctgaggcagg agaatggcgt gaacctggga ggcagagctt gcagtgagcc 2460gagatcgcgc cactgtgctc cagcctgggc gacagaccga gactcagtct caaaaaaaaa 2520aaaaaaaaaa aaactgatca gaaatatgaa ttccataaag acaagggcaa agtcatgtat 2580ttggaaggga aaatgttgcc caagtagaga gtttctggga atatgatctt gaaataaaaa 2640
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權(quán)利要求
1.一種對(duì)個(gè)體的高血壓易感性進(jìn)行輔助性診斷的方法，其特征在于，它包括步驟檢測(cè)該個(gè)體的ACE2基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白，并與正常的ACE2基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白相比較，存在差異就表明該個(gè)體患高血壓的可能性高于正常人群。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，檢測(cè)的是ACE2的基因或轉(zhuǎn)錄本，并與正常ACE2核苷酸序列比較差異。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的差異是選自下組的單核苷酸多態(tài)性11790位A→G；16286位G→A；28308位A→G；36150位A→G；其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQ ID NO1。
4.一種檢測(cè)樣品是否存在ACE2基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，包括步驟(a)用ACE2基因特異性引物擴(kuò)增樣品的ACE2基因，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；和(b)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在選自下組的單核苷酸多態(tài)性11790位A→G；16286位G→A；28308位A→G；36150位A→G；其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQ ID NO1。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的單核苷酸多態(tài)性是28308位A G。
6.一種ACE2基因和蛋白的用途，其特征在于，用于(a)制備輔助性檢測(cè)的試劑；或(b)制備治療高血壓的藥物。
7.一種用于輔助性檢測(cè)高血壓的試劑盒，其特征在于，它包括特異性擴(kuò)增ACE2基因或轉(zhuǎn)錄本的引物和說明書。
8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，它還含有選自下組的試劑(a)與突變部位結(jié)合的探針；(b)識(shí)別突變位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶。
9.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述的突變選自11790位A→G；16286位G→A；28308位A→G；36150位A→G；其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQ ID NO1。
10.如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述的單核苷酸多態(tài)性是28308位A G。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)原發(fā)性高血壓易感性的方法，它包括檢測(cè)個(gè)體的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2基因ACE2、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白與正常相比是否存在變異，存在變異就表明該個(gè)體患原發(fā)性高血壓的可能性大于正常人群。本發(fā)明還公開了相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒。
文檔編號(hào)A61K38/16GK1724687SQ20041005309
公開日2006年1月25日 申請(qǐng)日期2004年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月23日
發(fā)明者張怡, 朱鼎良, 王谷亮, 高平進(jìn), 黃薇 申請(qǐng)人:上海市高血壓研究所, 國(guó)家人類基因組南方研究中心