專利名稱：注射的凝膠型骨修復生物活性材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種注射的凝膠型骨修復生物活性材料及其制備方法，屬于醫(yī)學生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
(1)可注射凝膠給藥系統(tǒng)將藥物與可降解材料復合，然后經(jīng)注射送達體內(nèi)特定部位，使之固化形成凝膠并釋放出藥物和發(fā)揮治療作用是一種較好的給藥系統(tǒng)。這種給藥體系使用方便，可以延長藥物在體內(nèi)的作用時間，減少藥物使用劑量以避免可能存在的副作用，而且不通過手術(shù)就將藥物植入體內(nèi)，減少了病人的痛苦。
(2)骨修復生物活性材料骨形態(tài)發(fā)生蛋白是一類細胞生長因子，它們能誘導未分化的間質(zhì)干細胞分化為成骨細胞并增殖，形成軟骨和新生骨，所以具有很強的骨誘導活性。雖然骨形態(tài)發(fā)生蛋白對骨缺損有明顯的修復作用，但為了使其在病灶部位持久發(fā)揮作用，通常將它與多種不同性質(zhì)的載體復合而制成各種類型的骨修復材料。這些骨修復材料可用于骨折、骨不連、骨缺損的修復，也可用于整形外科和牙科?，F(xiàn)有的骨修復材料需要通過手術(shù)植入到創(chuàng)傷部位，不僅操作復雜，使用費用高，病人受到很大痛苦，而且不適合臨床上出現(xiàn)最多的閉合性骨折和其他不需手術(shù)的骨科病例使用，發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種注射的凝膠型骨修復生物活性材料。
本發(fā)明的另一個目的是提供注射的凝膠型骨修復生物活性材料的制備方法。
本發(fā)明的注射的凝膠型骨修復生物活性材料，其特征是每個使用劑量由1毫升A組分和45～55mg B組分組成，其中，A組分的成分及其含量為每毫升蒸餾水中含有海藻酸鈉 10～40mg骨形態(tài)發(fā)生蛋白 0.1～1mg甘露醇 10～20mg
B組分的成分及其含量為每mg中含有水難溶性鈣化合物 0.05～0.15mg葡萄糖酸內(nèi)酯 0.05～0.3mg聚乙烯吡咯烷酮 0.004～0.016mg甘露醇 余量上述的A組分可以是經(jīng)過冷凍干燥的凍干品，B組分是過60目篩的顆粒。
注射的凝膠型骨修復生物活性材料的制備方法，包括以下步驟1)將1～4g的海藻酸鈉溶于100ml水中，然后在每毫升海藻酸鈉水溶液中加入0.1～1mg骨形態(tài)發(fā)生蛋白，再加入甘露醇10～20mg，凍干，此為A組分。
2)將500～1500mg水難溶性鈣化合物和500～3000mg葡萄糖酸內(nèi)酯混合，再加入稀釋劑甘露醇至總重量為10g，混合均勻；3)在步驟(2)所得混合物中加入1～2ml的濃度為4～8％的聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液，潤濕，混合，調(diào)制成軟膏，擠壓過20目篩成顆粒狀，80℃烘干，過60目篩整粒，此為B組分；4)A、B兩個組分分別用鈷60(60Co)照射進行滅菌，照射劑量是6Kgy；5)將A組分和B組分分裝成產(chǎn)品。
本發(fā)明中，所說的海藻酸鈉為大連雅威特生物公司產(chǎn)品；骨形態(tài)發(fā)生蛋白是從動物骨中提取的天然骨形態(tài)發(fā)生蛋白或是用基因工程方法生產(chǎn)的重組骨形態(tài)蛋白，例如可采用杭州華東醫(yī)藥集團基因技術(shù)所生產(chǎn)的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白無菌凍干粉末，葡萄糖酸內(nèi)酯來自SIGMA，聚乙烯吡咯烷酮來上海伯奧生物技術(shù)公司，羥基磷灰石來自默克公司，碳酸鈣、硫酸鈣、甘露醇均為分析純。
本發(fā)明的骨修復生物活性材料在治療修復骨缺損中的應(yīng)用。
使用時，將凍干的A組分用1ml無菌生理鹽水溶解，吸入注射器中待用，根據(jù)治療需要取B組分，并按1mg用1ul無菌生理鹽水潤濕，然后將注射器中A組分加入B組分中，均勻混合成混懸液，經(jīng)注射器注入病灶部位。經(jīng)過一定時間后在病灶部位形成凝膠。此后，凝膠中的骨形態(tài)發(fā)生蛋白緩慢釋出并發(fā)揮誘導新骨生成的作用。其原理是組分A中的載體海藻酸鈉是鈣離子介導的凝膠劑，組分B中葡萄糖酸內(nèi)酯在緩慢水解過程中產(chǎn)生的葡萄糖酸能控制水難溶性鈣化合物中鈣離子的釋放。被釋放的鈣離子則與海藻酸鈉反應(yīng)而使它形成凝膠，將骨形態(tài)發(fā)生蛋白保留在一定部位。
本發(fā)明將骨形態(tài)發(fā)生蛋白和載體以液體形式通過注射器注入病灶部位，經(jīng)一定時間后在體內(nèi)形成凝膠，將骨形態(tài)發(fā)生蛋白固著在需要修復的骨損傷部位并發(fā)揮誘導骨生成的作用，這個骨修復材料生物相容性好，不僅使用簡單，可避免手術(shù)造成的新的創(chuàng)傷，減輕病人的痛苦，而且可以根據(jù)治療需要調(diào)整用量，多次注射。本發(fā)明中的載體無毒害作用，植入體內(nèi)無不良反應(yīng)。經(jīng)動物實驗證明本發(fā)明的成骨活性和含骨形態(tài)發(fā)生蛋白的固態(tài)骨修復材料相當，治療效果確切。
具體實施例方式
以下結(jié)合實施例從幾個方面對本發(fā)明作進一步的詳細描述。
實施例11)將1.5g海藻酸鈉溶于100ml水中，配置成濃度為1.5％的水溶液，在100ml該溶液中加入10mg骨形態(tài)發(fā)生蛋白，加入2g甘露醇，混勻，凍干，此為A組；2)取367mg碳酸鈣和436mg葡萄糖酸內(nèi)酯，加入4197mg甘露醇，混合均勻；3)在2)所得混合物中加入800ul濃度為8％的聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液，潤濕后混合均勻，調(diào)制成軟膏，擠壓過20目篩成顆粒狀，80℃烘干，過60目篩整粒。此為B組分；4)用60Co照射A組分和B組分，進行滅菌，照射劑量為6KGy；5)將A組分和B組分分裝成產(chǎn)品。
實施例21)將1.5g海藻酸鈉溶于100ml水中，配置成濃度為1.5％的水溶液，在100ml該溶液中加入50mg骨形態(tài)發(fā)生蛋白，加入甘露醇2g，混勻，凍干，此為A組分；2)440mg硫酸鈣，436mg葡萄糖酸內(nèi)酯，加入4124mg甘露醇，混合均勻。
3)在2)所得混合物中加入800ul 8％的聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液，潤濕后混合均勻，調(diào)制成軟膏，擠壓過20目篩成顆粒狀，80℃烘干，過60目篩整粒。此為B組分。
4)用60Co照射A組分和B組分，進行滅菌，照射劑量為6KGy。
5)將A組分和B組分分裝成產(chǎn)品。
實施例31)將1.5g海藻酸鈉溶于100ml水中，配置成濃度為1.5％的水溶液，在100ml該溶液中加入100mg骨形態(tài)發(fā)生蛋白，加入甘露醇1.5g，混勻，凍干，此為A組分；2)220.2mg碳酸鈣，261.6mg葡萄糖酸內(nèi)酯，加入2518.2mg甘露醇，混合均勻；3)在2)所得混合物中加入480ul 8％的聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液，潤濕后混合均勻，調(diào)制成軟膏，擠壓過20目篩成顆粒狀，80℃烘干，過60目篩整粒。此為B組分；4)用60Co照射A組分和B組分，進行滅菌，照射劑量為6KGy；5)將A組分和B組分分裝成產(chǎn)品。
實施例41)將4g海藻酸鈉溶于100ml水中，配置成濃度為4％的水溶液，在100ml該溶液中100mg骨形態(tài)發(fā)生蛋白，加入甘露醇2g，混勻，凍干，此為A組分；2)368.4mg羥基磷灰石，1307.3mg葡萄糖酸內(nèi)酯，加入3324.3mg甘露醇，混合均勻；3)在2)所得混合物中加入800ul 8％的聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液，潤濕后混合均勻，調(diào)制成軟膏，擠壓過20目篩成顆粒狀，80℃烘干，過60目篩整粒。此為B組分；4)用60Co照射A組分和B組分，進行滅菌，照射劑量為6KGy；5)將A組分和B組分分裝成產(chǎn)品。
實施例5細胞毒性實驗將實施例1和實施例4制得的A、B兩種組分，按照使用劑量1毫升A組分和50mg B組分的配比，混合成3ml混懸液，鋪到T-25細胞培養(yǎng)瓶中，在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中放置半小時。在凝固后，向瓶中輕輕加入10ml 1640培養(yǎng)液。繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中，浸提24小時。然后，取出培養(yǎng)液，2000g離心，直徑為0.22um的濾膜過濾，所得濾液就是浸提液。浸提液用1640培養(yǎng)基稀釋一倍后按GB/T16886.5.2003中規(guī)定的體外細胞毒性試驗方法進行。其結(jié)果應(yīng)符合該標準中4.6.5要求。
評價標準(采用L929細胞測試)


結(jié)果

細胞毒性實驗結(jié)果均為合格。說明此骨修復材料生物相容性好，無毒、安全。
實施例6異位成骨活性實驗試劑與材料1.5％戊巴比妥鈉，75％酒精，0/5#縫合線，15#手術(shù)刀片，止血鉗，縫合針，1ml注射器；18-22g ICR小鼠，同一性別。
操作1.對照組骨形態(tài)發(fā)生蛋白與明膠、卵磷脂復合材料——用1.5％戊巴比妥鈉麻醉小鼠，將左后肢剃毛和酒精消毒后，在肌肉陷窩表皮處割開一個長度為0.5cm的切口，用止血鉗分離皮膚，鈍性分離肌肉，暴露肌肉陷窩，植入含0.1mg重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋何(rhBMP-2)的復合材料，縫合。
2.實驗組本發(fā)明的注射的凝膠型骨修復材料——用1.5％戊巴比妥鈉麻醉小鼠，在其左后肢剃毛和酒精消毒后，將1毫升A組分和50mg B組分混合好的注射混懸劑注射到后肢肌肉陷窩內(nèi)，每個小鼠注射含1mg/ml rhBMP-2的凝膠型骨修復材料0.1ml。
3.21天后，解剖，取鮮骨，稱重。
成骨活性定義為每毫克rhBMP-2誘導產(chǎn)生的新骨重量，若1mg rhBMP-2誘導產(chǎn)生的新骨重量為1000mg時，其成骨活性就是1000U。
實驗結(jié)果如下表新骨重量以mg計

實驗結(jié)果表明本發(fā)明注射的凝膠型骨修復材料具有較好的誘骨活性。
權(quán)利要求
1.注射的凝膠型骨修復生物活性材料，其特征是，每個使用劑量由1毫升A組分和45～55mg B組分組成，其中，A組分的成分及其含量為每毫升無菌生理鹽水中含有海藻酸鈉10～40mg骨形態(tài)發(fā)生蛋白 0.1～1mg甘露醇 10～20mgB組分的成分及其含量為每mg中含有水難溶性鈣化合物0.05～0.15mg葡萄糖酸內(nèi)酯0.05～0.3mg聚乙烯吡咯烷酮 0.004～0.016mg甘露醇 余量
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的注射的凝膠型骨修復生物活性材料，其特征是所說的水難溶性鈣化合物為碳酸鈣、硫酸鈣或羥基磷灰石。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的注射的凝膠型骨修復生物活性材料，其特征是所說的骨形態(tài)發(fā)生蛋白是從動物骨中提取的天然骨形態(tài)發(fā)生蛋白或是用基因工程方法生產(chǎn)的重組骨形態(tài)蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的注射的凝膠型骨修復生物活性材料，其特征是所說的A組分為凍干品。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的注射的凝膠型骨修復生物活性材料，其特征是所說的B組分是過60目篩的顆粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的注射的凝膠型骨修復生物材料的制備方式，其特征是包括以下步驟1)將1～4g的海藻酸鈉溶于100ml水中，然后在每毫升海藻酸鈉水溶液中加入0.1～1mg骨形態(tài)發(fā)生蛋白，再加入甘露醇10～20mg，凍干，此為A組分；2)將500～1500mg水難溶性鈣化合物和500～3000mg葡萄糖酸內(nèi)酯混合，再加入稀釋劑甘露醇至總重量為10g，混合均勻；3)在步驟2)所得混合物中加入1～2ml的濃度為4～8％的聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液，潤濕，混合，調(diào)制成軟膏，擠壓過20目篩成顆粒狀，80℃烘干，過60目篩整粒，此為B組分；4)A、B兩個組分分別用鈷60照射進行滅菌，照射劑量是6Kgy；5)將A組分和B組分分裝成產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種注射的凝膠型骨修復生物活性材料及其制備方法，該材料每個使用劑量由1毫升A組分和45～55mg B組分組成，其中，A組分的組成為每毫升無菌生理鹽水中含有海藻酸鈉10～40mg，骨形態(tài)發(fā)生蛋白0.1～1mg，甘露醇10～20mg，B組分的組成為每mg中含有水難溶性鈣化合物0.05～0.15mg，葡萄糖酸內(nèi)酯0.05～0.3mg，聚乙烯吡咯烷酮0.004～0.016mg，余量為甘露醇。此注射型骨修復材料生物相容性好，使用簡便安全，無須手術(shù)就可以植入骨科患者需要治療的部位。動物實驗證明其成骨活性與需要通過手術(shù)植入的含骨形態(tài)發(fā)生蛋白的固態(tài)骨修復材料相當。
文檔編號A61L27/44GK1586621SQ20041005324
公開日2005年3月2日 申請日期2004年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月22日
發(fā)明者徐放, 潘綿立 申請人:徐放