專利名稱：一種轉基因小鼠肝病動物模型、其制備方法及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)療評價、檢測技術領域，具體地說，本發(fā)明是關于一種轉基因小鼠肝病動物模型、其制備方法及應用。
背景技術：
肝臟疾病是人類最常見的疾病之一，嚴重威脅著人類健康。動物模型可容許復制某些不能直接在人類身上進行觀察與研究的疾病，作為醫(yī)學研究的重要手段。肝病動物模型的建立，為探討肝病的發(fā)病機制、病理生理過程、病理形態(tài)改變及藥物防治開拓了廣闊的前景。但要選擇性的殺死動物體的某些特定類型的細胞，從而模仿某種疾病，現(xiàn)在的方法很有限。例如，通過外科手術或激光，不能在分子水平上指定細胞，而能夠自動指向特定細胞的物質也很少?，F(xiàn)在常用于建立肝病模型的手段有通過外科手術膽總管結扎等機械刺激；免疫損傷(白蛋白尾靜脈注射、異種動物血清腹腔注射)；酒精或營養(yǎng)不良；病原體感染；化學物質中毒所致的損傷；較為常用的化學物質有D-氨基半乳糖(Gal-NH2)、刀豆素A、N-乙基亞硝胺(DEN)、硫代乙酰胺、四氯化碳(CCl4)。1979年，Galanos等采用半乳糖胺誘導小鼠中毒性肝損傷，肝損傷機制主要是干擾核酸及蛋白質的合成，造成內毒素血癥，產生氧自由基及脂質過氧化導致膜機能障礙，損傷線粒體致氧化磷酸化受損等(GalanosC.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1979 Nov；76(11)5939-43)。1992年Tiegs等發(fā)展的刀豆素A靜脈注射小鼠誘導肝臟損傷(Tiegs G.et al.J.Clin.Invest.1992 Jul；90(1)196-203)。這類模型類似于人類的病毒性肝炎，被廣泛用在藥物篩選的研究，然而，癥狀往往是暴發(fā)性的。使用N-乙基亞硝胺(DEN)、硫代乙酰胺不易掌握劑量。CCl4是最早最廣泛使用的誘發(fā)實驗性肝纖維化的肝毒素，被用于多種實驗動物，通過胃管灌食法、皮下注射或者吸入給藥產生慢性或急性肝中毒(Allis JW.et al.Fundamental and Applied Toxicology.15558-570，1990；Pritchard DJ et al.Journal of Applied Toxicology.7229-236，1987；Ray SD et al.Fundamental and Applied Toxicology.15429-440，1990)。然而，由于CCl4毒性較大，動物成活率不高、模型的穩(wěn)定性，可重復性較低。
轉基因動物技術是近二十年來發(fā)展起來的生命科學領域中的一個全新技術，在醫(yī)藥學領域中，既可作為“生物反應器”應用，也可作為疾病動物模型用于疾病發(fā)生機制及化療藥物篩選研究。轉基因動物的基本方法和原理都是建立在基因片段交換重組(質粒重組)，基因特異性表達及染色體體外基因轉移的基礎上。但當用基因工程的方法引起特定組織表達蛋白毒素時，動物會在生命的早期死亡，用這些方法不能在實驗上加以控制。如90年代中期，發(fā)展的肝臟疾病小鼠模型alb-uPA轉基因小鼠。Sangren等通過將尿激酶血纖維蛋白溶酶原激活因子uPA基因插入到白蛋白啟動子下游，以介導其在肝臟中特異的表達來產生肝臟毒性(Sangren EP.et al.Cell，1991，66245～256)。一般情況，大部分uPA分泌到血液，因而被認為是血栓溶解劑因子。在該模型，一些uPA仍保留在肝臟引起嚴重的炎癥。與uPA小鼠移植模型相似的另一模型是富馬酰乙酰乙酸鹽水解酶(FAH)基因敲除小鼠(Grompe M.et al.Genes.Dev.，1993，7(12A)2298～2307)。該模型由Grompe等發(fā)展作為人類遺傳性酪氨酸血癥I型(HT1)的動物模型。該模型小鼠缺乏FAH，酪氨酸分解代謝的最后一步受到阻礙，導致富馬酰乙酰乙酸鹽(FAA)和前體(MAA)底物的聚集，F(xiàn)AA與MAA對肝臟有毒性。這兩個模型均為肝臟遺傳性疾病小鼠。然而，alb-uPA轉基因小鼠和FAH-轉基因小鼠的飼養(yǎng)與繁殖有一定的局限性，因為只有在外加條件(藥物)的作用下，小鼠才不會死亡，也不發(fā)生肝臟功能衰竭。其肝臟功能的正常需要靠藥物維持。
Heyman等最早在1989年提出TK敲除(TK obliteration)的概念(Heyman，R.A.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 862698-2702，1989)，即在轉基因小鼠體內通過細胞類型特異性啟動子敲除特定細胞。單純皰疹病毒胸苷嘧啶激酶(HSV-TK)不同于哺乳動物的核苷激酶，HSV-TK有效地磷酸化核苷以及核苷類似物如更昔洛韋(GCV)，阻礙DNA合成，從而導致細胞的死亡。其作用機理是HSV-TK基因編碼胸苷激酶，該酶可將核苷類似物(NA)無毒性抗病毒藥物GCV代謝為二磷酸化合物，后者在細胞內酶的作用下產生三磷酸GCV；三磷酸GCV有毒性，它可以明顯抑制細胞DNA聚合酶，從而抑制蛋白質的合成，殺傷細胞。單獨HSV-TK或者GCV對機體基本無影響。這一系統(tǒng)允許研究者通過GCV控制細胞敲除的時間與階段，是理解特定細胞類型的生理功能的有效手段。如在細胞特異性啟動子控制下敲除生長激素分泌細胞，T細胞和B細胞，白介2，4表達細胞，樹突狀細胞，纖維原細胞(Borrelli，E.et al.Nature(London)339538-541，1989；Dzierzak，E.et al.Int.Immunol.5975-984，1993；Kamogawa，Y.et al.Cell 75985-995，1993；Minasi，L.E.et al.J.Exp.Med.1771451-1459，1993；Salomon，B.et al.J.Immunol.152537-548，1994；Bin Tian et al.American Journal of Pathology，Vol.163，No.2，August2003)。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的就在于提供一種損傷可誘導與調控的轉基因小鼠肝病動物模型。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種損傷可誘導與調控的轉基因小鼠肝病動物模型的制備方法。
本發(fā)明的又一個目的在于提供一種損傷可誘導與調控的轉基因小鼠肝病動物模型的應用。
由于小鼠生長周期短，易于飼養(yǎng)管理，容易獲得已經(jīng)定性的近交交配鼠和遺傳突變體，作為實驗動物較為經(jīng)濟實惠，是基因組結構、個體發(fā)育過程、組織細胞結構等與人類相近的模式生物體系。
白蛋白基因啟動子ALB/pro在進化過程中的高度保守性，及其高度的肝臟細胞特異性調控機制使ALB/pro成為適于肝臟細胞特異表達調控研究的啟動子。
我們用白蛋白基因增強子ALB/en和ALB/pro調控單純皰疹病毒胸苷嘧啶激酶(HSV-TK)在成體肝臟特異表達，利用小鼠制造肝損傷實驗動物模型。該種模型如果僅有HSV-TK的表達而沒有人為給與GCV，對機體基本沒有影響，故易于飼養(yǎng)繁殖。
本發(fā)明的關鍵在于利用HSV-TK的GCV藥物敏感性與小鼠白蛋白基因啟動子與增強子的肝臟特異性調控，產生轉基因小鼠，通過GCV的注射產生肝臟損傷，并通過GCV給藥的時間與劑量實現(xiàn)肝臟損傷的可調控。
該轉基因小鼠的制備方法包括下列步驟一、小鼠白蛋白基因啟動子ALB/pro的克??；二、小鼠白蛋白基因增強子ALB/en的克??；三、PCR擴增得到HSV-TK cDNA；四、以HSV-TK cDNA為目的基因，ALB/pro與ALB/en為調控元件，構建肝臟特異性殺傷載體pLLTK；五、限制性內切酶酶切線性化pLLTK，回收并純化約4130bp的片段；六、顯微注射小鼠雄原核，得到陽性轉基因小鼠。
本方法產生的小鼠肝病模型損傷易控制，機制較明了，癥型較明確，模型穩(wěn)定可重復。由于在肝臟特異性調控元件的控制下目的基因組織特異性表達，損傷特異性強，與一般的毒素蛋白表達的轉基因動物模型相比，易于飼養(yǎng)繁殖。可用于篩選治療肝炎的藥物，評價治療肝炎的方法。


圖1為質粒pLLTK的構建流程圖。
圖2為pLLTK的酶切鑒定電泳圖譜，其中M1kb marker；1AgeI+XhoI1.9kb+6.5kb；2KpnI2.1kb+6.3kb。
圖3為F0和F1代轉基因小鼠的PCR檢測結果，其中1陽性對照；2陰性對照；3空白對照；4陽性轉基因小鼠F0代；Mmarker 100bp；5～13F1代轉基因小鼠后代。
圖4為F2代轉基因小鼠的PCR檢測結果，其中1～10F2代轉基因小鼠；11陽性轉基因小鼠F1代；12空白對照；13陰性對照14陽性對照；Mmarker 100bp。
圖5為F3代轉基因小鼠的PCR檢測結果，其中1～11F3代轉基因小鼠；12空白對照；13陰性對照；14陽性對照；15陽性轉基因小鼠F2代；Mmarker 100bp。
圖6為轉基因小鼠的HSV-TK表達的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中Mmarker100bp；1空白對照；2陰性對照；3陽性對照；4心；5肝；6脾臟；7腎臟；8腦；9胰腺；10腸；11血；12皮膚；13睪丸。
圖7為免疫組化分析HSV-TK蛋白表達情況示意圖，其中A為TK小鼠肝臟；C為TK小鼠腎臟；B為非轉基因小鼠肝臟；D為非轉基因小鼠肝臟腎臟。
圖8為GCV處理前后生化值的變化示意圖。
圖9為肝臟組織HE染色的結果示意圖，A、C為GCV處理后TK小鼠肝臟；B為未處理TK轉基因小鼠肝臟；D為GCV處理后ALB轉基因小鼠肝臟。
具體實施例方式
以下結合具體實施例，對本發(fā)明作進一步的說明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。
實施例1小鼠白蛋白啟動子ALB/pro的克隆尾靜脈采取昆明白小鼠外周血200μl，按照常規(guī)酚氯仿法提取基因組DNA，以基因組DNA為模板，通過巢式PCR擴增昆明白小鼠白蛋白基因啟動子ALB/pro，具體如下
1、引物prol kpn I5′-cttaggtacctccatgccaaggcccaca-3′pro2 Age I5′-cgtataccggtagtggggttgataggaaagg-3′2、反應體系模版1.0μl10×buffer2.5μldNTP(25mM)2.5μlpro3(10mM)1.0μlpro4(10mM)1.0μlTagE(5U/μl) 0.25μlddH2O 16.75μl25.0μl3、循環(huán)參數(shù)條件94℃ 5分鐘；95℃ 30秒-1分鐘，50℃-55℃ 30秒-1分鐘，72℃ 30秒-1分鐘，共28-35不個循壞；72℃ 10分鐘。
通過以上擴增得到SEQ ID No.1所示的昆明白小鼠白蛋白基因啟動子ALB/pro，全長335bp，位于轉錄起始點下游310bp到上游25bp。
實施例2鼠白蛋白基因增強子ALB/en的克隆以昆明白小鼠基因組DNA為模板，通過PCR擴增克隆小鼠白蛋白基因增強子ALB/en，具體如下1、引物en15′-acgag tctaga gtggagctta cttctttgatttga-3′en2kpnI5′-aaacggtaccatgccatgtaaatcaact-3′
2、反應體系DNA(20-100ng) 1.0μl10×buffer 2.5μldNTP(25mM) 2.5μlen1(10mM)1.0μlen2(10mM)1.0μlTagE(5U/μl) 0.25μlddH2O 16.25μl25.0μl3、循環(huán)參數(shù)條件94℃ 5分鐘；95℃ 30秒-1分鐘，50℃-55℃ 30秒-2分鐘，72℃ 30秒-2分鐘，共28-35個循壞；72℃ 10分鐘。
通過以上擴增得到SEQ ID No.2所示的昆明白小鼠白蛋白基因增強子ALB/en，全長約2059bp，位于轉錄起始點上游-9192bp到-11250bp。
實施例3PCR擴增得到單純皰疹病毒胸苷嘧啶激酶(HSV-TK)cDNA以質粒pTK-neo(novagen公司)為模板，通過PCR擴增HSV-TK cDNA，具體如下1、引物tk1 ageI 5‘-gtataccggtggcaccatggcttcgtaccccggc-3’tk2 5‘-ccg cgt cga cgg aaa agc gcc tcc cct ac-3’2、反應體系DNA(20-100ng) 1.0μl10×buffer 2.5μldNTP(25mM) 2.5μltk1(10mM) 1.0μl
tk2(10mM) 1.0μlTagE(5U/μl)0.25μlddH2O 16.25μl25.0μl3、循環(huán)參數(shù)條件94℃ 5分鐘；95℃ 30秒-1分鐘，45℃-55℃ 1分鐘-2分鐘，72℃ 1分鐘-2分鐘，共28-35個循壞；72℃ 10分鐘。
通過以上擴增得到HSV-TK cDNA(TK)，其序列如SEQ ID No.3所示。
實施例4肝臟特異性殺傷載體的構建如圖1所示，以HSV-TK cDNA為目的基因，以ALB/pro與ALB/en為調控元件，以pCDNA3.1(+)/Zeo質粒(Invitrogen公司)為框架，通過DNA兩端的酶切位點進行平、粘端連接，構建目標載體-肝臟特異性殺傷載體pLLTK，具體如下1、框架載體的線性化用限制性內切酶NruI與NheI酶切真核表達載體pCDNA3.1(+)/Zeo得到末端為平、粘端的線性片段。
2、連接片段的酶切a)用KpnI與AgeI酶切ALB/pro得到兩末端為粘端的線性片段；b)用KpnI酶切ALB/en得到兩末端分別為平端與粘端的線性片段；c)用AgeI酶切TK得到兩末端分別為平端與粘端的線性片段。
3、連接

Alb/pro 2μlTK2μlT4DNA ligase(3 weiss u/μl)(TakaRo公司) 1μl總共 10μl16℃連接過夜4、克隆構建按照分子克隆試驗指南(J.薩姆布魯克)進行，得到載體pLLTK。
5、酶切鑒定對載體pLLTK進行限制性內切酶消化，反應如下(1)選擇AgeI(10u/μl，buffer L，promega)，XhoI(10u/μl，buffer H，TakaRo)，DNA 2.0μl10×buffer5.0μl100×BSA 0.5μlAgeI(10U/μl) 1.0μlddH2O 41.5μl50μl37℃2小時↓2倍無水乙醇沉淀，自然風干DNA↓DNA+ddH2O 39.0μl10×buffer5.0μl10×BSA 5.0μlXhoI(10U/μl) 1.0μl50μl37℃2小時(2)選擇KpnI(10u/μl，buffer 4，NEB)DNA 2.0μl10×buffer2.0μl10×BSA 2.0μlKpnI(10U/μl) 0.5μlddH2O 13.5μl20.0μl37℃2小時
(3)將酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，其電泳圖譜如圖2所示，所獲片段長度與預期結果一致。
實施例5產生轉基因小鼠家系將實施例4得到的質粒用無內毒素質粒大量純化試劑盒進行質粒純化(按照QIAGEN公司、Protocol for EndoFree Plasmid Maxi Kit進行)；用限制性內切酶Hand III酶切線性化，瓊脂糖凝膠電泳回收約4130bp的DNA片段LLTK，然后進行純化(按照QIAGEN公司、QIAquick Gel Extraction Kit Protocol進行)；最后用Schleicher&Schuell公司的S&S ELUTIP Minicolumns純化(按照Basic Protocol for DNA for DNA Purification from 50bp-50Kb進行，Schleicher&Schuell公司)；將DNA溶于10mMTris，0.1mMEDTA，PH7.4，按照4ng/μl進行小鼠雄原核顯微注射；步驟按照常規(guī)轉基因小鼠制備步驟。
1、PCR初步分析證明原代及后代小鼠轉基因的整合；轉基因小鼠經(jīng)傳3代后，檢測其后代陽性率，PCR檢測引物設計如下stk15’-gtataccggtatgcccacgctactgcgg-3’SH5525‘-gatggcggtcgaagatgagg-3’產物長度390bp檢測結果如圖3-5所示由圖3可見，F(xiàn)0與F1代轉基因小鼠的PCR檢測結果為6、8、10、11、13F1代陽性轉基因小鼠后代；5、7、9、12F1代陰性轉基因小鼠后代，陽性率為5/9＝56％；由圖4可見，F(xiàn)2代轉基因小鼠的PCR檢測結果為1、2、3、5、7F2代陽性轉基因小鼠；4、6、8、9、10F2代陰性轉基因小鼠，陽性率為5/10＝50％。
由圖5可見，F(xiàn)3代轉基因小鼠的PCR檢測結果為1、4、5、7、8F2代陽性轉基因小鼠；2、3、6、9、10、11F2代陰性轉基因小鼠，陽性率為5/11＝45％。
上述結果表明，經(jīng)傳3代后，后代的陽性率為45％～56％，說明轉基因已穩(wěn)定整合在轉基因小鼠的基因組中，并通過生殖系在世代間穩(wěn)定遺傳。
實施例6HSV-TK的組織特異性表達分別以心、肝、脾臟、腎臟、腦、胰腺、腸、血、皮膚和睪丸為對象，以260bpβ-actin為內對照，通過RT-PCR分析HSV-TK的組織特異性表達，其結果如圖6所示其中引物如下β-actin引物actin15‘-ctacaatgagctgcgtgtggc-3’actin25‘-caggtccagacgcaggatggc-3’tk引物同上。
由圖6可知，390bp HSV-TK目的條帶僅在肝臟與睪丸出現(xiàn)表達。
實施例7免疫組化免疫組化步驟，按照常規(guī)步驟。
一抗HSV-TK兔多克隆抗體；二抗生物素標記的羊抗兔；三抗親和素偶聯(lián)過氧化物酶。
其結果如圖7所示，可見HSV-TK蛋白在肝臟表達，而在腎臟沒有表達。
實施例81、血液的生化指標檢查尾靜脈注射GCV，誘導轉基因小鼠的損傷。對照小鼠為乳腺表達ALB的轉基因小鼠。尾靜脈采血，連續(xù)三周每周測定血液的生化值，其結果如圖8所示，由圖可知，在GCV第一次注射后21天，與注射前相比，谷丙轉氨酶ALT、谷草轉氨酶AST、總膽紅素TBIL的檢測值在轉基因小鼠組顯著性增加(P＜0.05)，而對照小鼠沒有顯著性差異。肝酐CREA的檢測值均無顯著性差異(圖未列)。血液的生化檢查結果表明肝臟功能的損傷，腎臟功能的正常。
2、病理形態(tài)學檢查處死小鼠后，取肝臟組織進行病理形態(tài)學分析，方法按照常規(guī)HE染色步驟，結果如圖9所示，結果表明GCV處理TK轉基因小鼠后，肝臟組織出現(xiàn)肝小葉灶性壞死，個別凋亡小體，淋巴細胞浸潤等病理表現(xiàn)(A、C)，而未處理TK轉基因小鼠肝臟(B)，ALB轉基因小鼠肝臟在GCV處理后基本沒有出現(xiàn)組織病理形態(tài)學的改變(D)。
綜上所述，本發(fā)明的轉基因小鼠肝病動物模型損傷易控制，機制較明了，癥型較明確，模型穩(wěn)定可重復，且由于在肝臟特異性調控元件的控制下目的基因組織特異性表達，損傷特異性強，與一般的毒素蛋白表達的轉基因動物模型相比，易于飼養(yǎng)繁殖，因此可用于篩選治療肝炎的藥物，評價治療肝炎的方法。
序列表<110>上海交通大學附屬兒童醫(yī)院<120>一種轉基因小鼠肝病動物模型、其制備方法及應用<130>041317C<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>335<212>DNA<213>rat<220>
<221>promoter<222>(25)..(308)<223>
<400>1ggtacctcca tgccaaggcc cacactgaaa tgctcaaatg ggagacaaag agattaagct60cttatgtaaa atttgctgtt ttacataact ttaatgaatg gacaaagtct tgtgcatggg120ggtgggggtg gggttagagg ggaacagctc cagatggcaa acatacgcaa gggatttagt180caaacaactt tttggcaaag atggtatgat tttgtaatgg taggaaccaa tgaaatgcga240ggtaagtatg gttaatgatc tacagttatt ggttaaagaa gtatattaga gcgagtcttt300ctgcacacag atcacctttc ctatcaaccc cacta 335<210>2<211>2059<212>DNA<213>rat<220>
<221>enhancer<222>(1)..(2059)<223>
<400>2gaaattaccc atcttcctaa gcttctgctt ctctcagttt tctgcttgct cattccactt 60ttccagctga ccctgccccc taccaacatt gctccacaag cacaaattca tccagagaaa120ataaattcta agttttatag ttgtttggat cgcataggta gctaaagagg tggcaaccca180cacatcctta ggcatgagct tgattttttt tgatttagaa ccttcccctc tctgttccta240gactacacta cacattctgc aagcatagca cagagcaatg ttctacttta attactttca300ttttcttgta tcctcacagc ctagaaaata acctgcgtta cagcatccac tcagtatccc360ttgagcatga ggtgacacta cttaacatag ggacgagatg gtactttgtg tctcctgctc420tgtcagcagg gcactgtact tgctgatacc agggaatgtt tgttcttaaa taccatcatt480ccggacgtgt ttgccttggc cagttttcca tgtacatgca gaaagaagtt tggactgatc540aatacagtcc tctgccttta aagcaatagg aaaaggccaa cttgtctacg tttagtatgt600ggctgtagaa agggtataga tataaaaatt aaaactaatg aaatggcagt cttacacatt660tttggcagct tatttaaagt cttggtgtta agtacgctgg agctgtcaca gctaccaatc720aggcatgtct gggaatgagt acacggggac cataagttac tgacattcgt ttcccattcc780atttgaatac acacttttgt catggtattg cttgctgaaa ttgttttgca aaaaaaaccc840cttcaaattc atatatatta ttttaataaa tgaattttaa tttatctcaa tgttataaaa900aagtcaattt taataattag gtacttatat acccaataat atctaacaat catttttaaa960catttgttta ttgagcttat tatggatgaa tctatctcta tatactctat atactctaaa 1020aaagaagaaa gaccatagac aatcatctat ttgatatgtg taaagtttac atgtgagtag 1080acatcagatg ctccatttct cactgtaata ccatttatag ttacttgcaa aactaactgg 1140aattctagga cttaaatatt ttaagtttta gctgggtgac tggttggaaa attttaggta 1200agtactgaaa ccaagagatt ataaaacaat aaattctaaa gttttagaag tgatcataat 1260caaatattac cctctaatga aaatattcca aagttgagct acagaaattt caacataaga 1320taattttagc tgtaacaatg taatttgttg tctatttctt ttgagataca gttttttctg 1380
tctagctttg gctgtcctgg accttgctct gtagaccagg ttggtcttga actcagagat 1440ctgcttgcct ctgccttgca agtgctagga ttaaaagcat gtgccaccac tgcctggcta 1500caatctatgt tttataagag attataaagc tctggctttg tgacattaat ctttcagata 1560ataagtcttt tggattgtgt ctggagaaca tacagactgt gagcagatgt tcagaggtat 1620atttgcttag gggtgaattc aatctgcagc aataattatg agcagaatta ctgacacttc 1680cattttatac attctacttg ctgatctatg aaacatagat aagcatgcag gcattcatca 1740tagttttctt tatctggaaa aacattaaat atgaaagaag cactttatta atacagttta 1800gatgtgtttt gccatctttt aatttcttaa gaaatactaa gctgatgcag agtgaagagt 1860gtgtgaaaag cagtggtgca gcttggcttg aactcgttct ccagcttggg atccttaacc 1920ccatgtatcc tctcctacct ttgaggacac cttctcatgc cgtaagactg tcacacgcca 1980cacgggaagc acacaatcgc agcatttcaa ggaggaagga ccccagggat aattttatcc 2040cagttgattt acatggcat2059<210>3<211>1795<212>DNA<213>rat<220>
<221>gene<222>(1)..(1795)<223>
<400>3gccaccatgg cttcgtaccc cggccatcag cacgcgtctg cgttcgacca ggctgcgcgt 60tctcgcggcc atagcaaccg acgtacggcg ttgcgccctc gccggcagca agaagccacg120gaagtccgcc cggagcagaa aatgcccacg ctactgcggg tttatataga cggtccccac180gggatgggga aaaccaccac cacgcaactg ctggtggccc tgggttcgcg cgacgatatc240gtctacgtac ccgagccgat gacttactgg cgggtgctgg gggcttccga gacaatcgcg300
aacatctaca ccacacaaca ccgccttgac cagggtgaga tatcggccgg ggacgcggcg360gtggtaatga caagcgccca gataacaatg ggcatgcctt ataccgtgac cgacgccgtt420ctggctcctc atatcggggg ggaggctggg agctcacatg ccccgccccc ggccctcacc480ctcatcttcg accgccatcc catcgccgcc ctcctgtgct acccggccgc gcgatacctt540atgggcagca tgacccccca ggccgtgctg gcgttcgtgg ccctcatccc gccgaccttg600cccggcacaa acatcgtgtt gggggccctt ccggaggaca gacacatcga ccgcctggcc660aaacgccagc gccccggcga gcggcttgac ctggctatgc tgaccgcgat tcgccgcgtt720tacgggctgc ttgccaatac ggtgcggtat ctgcagggcg gcgggtcgtg gcgggaggat780tggggacagc tttcggggac ggccgtgccg ccccagggtg ccgagcccca gagcaacgcg840ggcccacgac cccatatcgg ggacacgtta tttaccctgt ttcgggcccc cgagttgctg900gcccccaacg gcgacctgta caacgtgttt gcctgggcct tggacgtctt ggccaaacgc960ctccgtccca tgcacgtctt tatcctggat tacgaccaat cgcccgccgg ctgccgggac 1020gccctgctgc aacttacctc cgggatgatc cagacccacg tcaccacccc aggctccata 1080ccgacgatct gcgacctggc gcgcacgttt gcacgggaga tgggggaggc taactgaaac 1140acggaaggag acaataccgg aaggaacccg cgctatgtcg gcaataaaaa gacagaataa 1200aacgcacggg tgttgggtcg tttgttcata aacgcggggt tcggtcccag ggctggcact 1260ctgtcgatac cccaccgaga ccccattggg gccaatacgc ccgcgtttct tccttttccc 1320caccccaacc cccaagttcg ggtgaaggcc cagggctcgc agccaacgtc ggggcggcaa 1380gcccgccata gccacgggcc ccgtgggtta gggacggggt cccccatggg gaatggttta 1440tggttcgtgg gggttattct tttgggcgtt gcgtggggtc aggtccacga ctggactgag 1500cagacagacc catggttttt ggatggcctg ggcatggacc gcatgtactg gcgcgacacg 1560aacaccgggc gtctgtggct gccaaacacc cccgaccccc aaaaaccacc gcgcggattt 1620ctggcgccgc cggacgaact aaacctgact acggcatctc tgccccttct tcgctggtac 1680
gaggagcgct tttgttttgt attggtcacc acggccgagt ttccgcggga ccccggccag 1740atcaagctta tcgataccgt cgaggaattc taccgggtag gggaggcgct tttcc179權利要求
1.一種轉基因小鼠肝病動物模型，其特征在于，所述轉基因小鼠動物模型的基因組整合有DNA片段LLTK，所述DNA片段LLTK由小鼠白蛋白基因啟動子ALB/pro與增強子ALB/en，以及受其調控的下游基因單純皰疹病毒胸苷嘧啶激酶cDNA構成。
2.如權利要求1所述的轉基因小鼠肝病動物模型，其特征在于，所述小鼠白蛋白基因啟動子ALB/pro具有SEQ ID No.1所示的序列。
3.如權利要求1所述的轉基因小鼠肝病動物模型，其特征在于，所述小鼠白蛋白基因增強子ALB/en具有SEQ ID No.2所示的序列。
4.如權利要求1所述的轉基因小鼠肝病動物模型，其特征在于，所述單純皰疹病毒胸苷嘧啶激酶cDNA的序列如SEQ ID No.3所示。
5.如權利要求1所述的轉基因小鼠肝病動物模型，其特征在于，所述DNA片段LLTK的長度約為4130bp。
6.一種轉基因小鼠肝病動物模型的制備方法，其特征在于包括以下步驟A、小鼠白蛋白基因啟動子ALB/pro的克??；B、小鼠白蛋白基因增強子ALB/en的克?。籆、PCR擴增得到單純皰疹病毒胸苷嘧啶激酶cDNA；D、以單純皰疹病毒胸苷嘧啶激酶cDNA為目的基因，ALB/pro與ALB/en為調控元件，構建肝臟特異性殺傷載體pLLTK；E、限制性內切酶酶切線性化pLLTK，回收并純化約4130bp的片段LLTK；F、顯微注射小鼠雄原核，得到陽性轉基因小鼠。
7.權利要求1的轉基因小鼠肝病動物模型用于篩選治療肝病的藥物的用途。
8.一種DNA片段LLTK，其特征在于，所述DNA片段LLTK由小鼠白蛋白基因啟動子ALB/pro與增強子ALB/en，以及受其調控的下游基因單純皰疹病毒胸苷嘧啶激酶cDNA構成。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種轉基因小鼠肝病動物模型，該轉基因小鼠動物模型的基因組整合有DNA片段LLTK，所述DNA片段LLTK由小鼠白蛋白基因啟動子ALB/pro與增強子ALB/en，以及受其調控的下游基因單純皰疹病毒胸苷嘧啶激酶(HSV－TK)cDNA構成。本發(fā)明還公開了該轉基因小鼠動物模型的制備方法以及應用，通過尾靜脈注射GCV誘導肝臟產生臨床生化指標與病理形態(tài)學與人類毒素誘導的肝炎有關疾病。該動物模型損傷易控制，機制較明了，癥型較明確，模型穩(wěn)定可重復?？捎糜诤Y選治療肝病(肝炎)的藥物，評價治療肝病(肝炎)的方法。
文檔編號A61P1/00GK1740315SQ20041005408
公開日2006年3月1日 申請日期2004年8月27日 優(yōu)先權日2004年8月27日
發(fā)明者曾溢滔, 張艷, 黃淑幀 申請人:上海交通大學附屬兒童醫(yī)院