專利名稱：一種子宮頸癌基因工程重組疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種生物制劑。具體地說是種用基因方法獲取的治療和預(yù)防子宮頸癌的重組疫苗。
背景技術(shù)：
子宮頸癌是發(fā)病最廣泛的惡性腫瘤之一，世界范圍內(nèi)每年新增約500,000病例，且每年有約200,000人死于子宮頸癌。目前，對于子宮頸癌的治療采用的方法和技術(shù)手段主要包括手術(shù)治療；放射治療；化學(xué)藥物治療。這些方法給患者或多或少帶來痛苦或者預(yù)后不良作用，與此相比，特異性的預(yù)防或治療疫苗可以克服上述缺點。目前子宮頸癌的疫苗研究已經(jīng)在世界范圍內(nèi)展開，部分國家已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗階段，如美國、英國、日本、澳大利亞、法國以及我國；在美國和英國的臨床試驗中，經(jīng)過基因突變的重組疫苗的安全性已得到了證實。但是根據(jù)文獻(xiàn)報道子宮頸癌的疫苗大多是采用全病毒生產(chǎn)，病毒自身攜帶的致癌基因存在于產(chǎn)品當(dāng)中，有潛在的致癌作用；同時部分疫苗的免疫效果有待進(jìn)一步的確認(rèn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種僅一次注射、長期表達(dá)、免疫力高效持久的既具有堅強(qiáng)免疫效果又有良好治療效果的子宮頸癌基因工程疫苗。為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明人仔細(xì)研究和比較目前國際上有關(guān)類基因工程研究概況，并進(jìn)行了反復(fù)篩選和優(yōu)化組合，綜合了各種類似及相關(guān)疫苗的優(yōu)點，重組優(yōu)化而成。首先，本發(fā)明采用目前致子宮頸癌病毒最流行血清型HPV 16和18型的主要致癌基因E7，將其中的RB結(jié)合位點進(jìn)行了點突變，去除其致癌性，然后將兩段基因進(jìn)行融合，為加強(qiáng)疫苗的免疫效果，在18E7的后邊加上了免疫增強(qiáng)因子結(jié)核桿菌熱休克蛋白并使之與16E718E7相融合，組成完整的疫苗基因。在載體的使用方面，本發(fā)明采用兩種方式，其一是單一的質(zhì)粒，即是將上述基因HPV16E7、18E7HSP70克隆到質(zhì)粒載體PC1質(zhì)粒中，在提純質(zhì)粒后直接用于疫苗注射；其二，采用目前在基因治療領(lǐng)域國際范圍內(nèi)被廣泛使用、公認(rèn)無毒副作用而且具有免疫促進(jìn)作用的AAV作為載體，即將HPV16E718E7HSP70基因克隆到AAV載體UF1的NotI和SalI位點上，在輔助基因和包裝基因的輔助下，經(jīng)過磷酸鈣法轉(zhuǎn)染將DNA轉(zhuǎn)入293細(xì)胞中，完成重組AAV的生產(chǎn)后，再經(jīng)過HPLC或CsCl方法純化，再由病毒透析溶液透析，得到高純度的重組AAV病毒，即作為疫苗使用。
在本發(fā)明中我們利用了hsp肽疫苗作為佐劑的安全性和AAV載體作為基因轉(zhuǎn)導(dǎo)載體的優(yōu)點。因此，我們構(gòu)建了含有HPV-16 E7和HPV-18 E7 CTL抗原決定簇及hsp的嵌合基因的腫瘤疫苗。通過將AAV載體應(yīng)用于同基因的腫瘤來驗證其保護(hù)腫瘤的有效性。結(jié)果顯示AAV載體介導(dǎo)的這種嵌合基因經(jīng)肌肉接種(i.m.)能有效地消除腫瘤細(xì)胞，表明含HSP-16 E7和HSP-18E7的疫苗對子宮頸癌有治療效果。
本發(fā)明的培養(yǎng)物結(jié)核分支桿菌休克蛋白70與人乳頭瘤病毒第16抗原表位和18抗原表位融合蛋白基因的重組腺相關(guān)病毒HSP70+HPVE16+E18/AAV，已保存中國典型培養(yǎng)物保藏中心。其保藏編號，CCTCCNOV200309。
本發(fā)明的優(yōu)越性和應(yīng)用前景表明，發(fā)明人成功地發(fā)展了編碼融合到hspDNA的HPV-16和HPV-18 E7 CTL肽的rAAV作為腫瘤疫苗。以hsp作為載體蛋白和以rAAV載體轉(zhuǎn)染是一種有潛力的子宮頸癌治療的疫苗。它是一種建立在基因工程基礎(chǔ)上的，以AAV作載體表達(dá)HPV16和18血清型的E7蛋白而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生對子宮頸癌的預(yù)防和治療作用。本疫苗對90％以上的子宮頸癌患者有效，并對由乳頭瘤狀病毒引起的尖銳濕疣有預(yù)防和治療作用。由于本發(fā)明已經(jīng)對目的基因E7做了點突變，而同時將結(jié)核桿菌的熱敏感蛋白與目的基因融合，加之所使用載體AAV，因而構(gòu)成了強(qiáng)大的免疫原，且可長期在體內(nèi)表達(dá)而無毒副作用，具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1.HPV 16 18E7基因在293細(xì)胞上的體外表達(dá)。
質(zhì)粒pC1-1618E7hsp70轉(zhuǎn)染293細(xì)胞48時小時，AAV11618E7hsp70感染293細(xì)胞24小時后，用抗16E7(B and C)或18 E7(E and F)多克隆抗體組化染色293細(xì)胞，視野中紅色細(xì)胞為陽性反應(yīng)，該照片放大200倍。
圖2.AAV LacZ載體在動物體內(nèi)的表達(dá)。
肌肉注射2×1011病毒粒子的AAV1LacZ(A and B)or AAV2LacZ(C andD)與C57BL/6小鼠的腓腸肌，在注射后的5周后16月后取注射部位肌肉組織樣品，進(jìn)行染色和H.E復(fù)染。藍(lán)色細(xì)胞為LacZ陽性表達(dá)細(xì)胞。
圖3.病毒載體免疫后動物無瘤率的對比試驗。
選擇不同的病毒載體分別為AAV1LacZ、AAV1-1618E7hsp70、AAV2-1618E7hsp70以及200ul PBS作為對照，肌肉注射同齡重量相近實驗小鼠。5周后給每只實驗鼠接種腫瘤細(xì)胞1×105TC-1，分別再接種腫瘤細(xì)胞后的12和24周，再次和第三次給沒有發(fā)生腫瘤的小鼠接種2×105TC-1，每三天一次觀察實驗鼠并測量腫瘤大小。
圖4.AAV1-1618E7hsp70誘導(dǎo)針對E7的特異免疫反應(yīng)。
20只C57BL/6(6-8周齡)小鼠用于該實驗。其中10只注射2×1011AAV1-1618E7hsp70免疫，另10只注射200ul PBS，5周后5只免疫AAV1-1618E7hsp70和5只注射PBS的小鼠接種1×105TC-1細(xì)胞，而另外10只接種2×101B16-1細(xì)胞，每三天觀察成瘤情況并記錄。
圖5.免疫AAV-1618E7hsp70激發(fā)動物強(qiáng)烈的CTL反應(yīng)。
小鼠免疫病毒載體后5周，取得脾細(xì)胞經(jīng)處理后，檢測CTL反應(yīng)指標(biāo)。AAV1-1618E7hsp70和AAV2-1618E7hsp70均誘導(dǎo)了較強(qiáng)的CTL反應(yīng)，而PBS和AAV1LacZ組均未顯示陽性反應(yīng)結(jié)果。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖及本發(fā)明的相關(guān)概念和方法進(jìn)行具體地闡述。
一.重組腺相關(guān)病毒的相關(guān)特性腺相關(guān)病毒(AAV)是一種單鏈病毒，它已被作為基因治療的載體廣泛研究。作為一種缺陷性的人類細(xì)小病毒，AAV擁有許多使其能成為人類基因治療載體的天然屬性，例如，非致病性、定點整合能力及廣泛的宿主范圍(人、類人猿、鼠、犬和鳥)等。同其他已在疫苗中應(yīng)用的病毒載體(如痘苗病毒或腺病毒等)不同的是，AAV載體并不表達(dá)任何病毒基因。AAV載體中必須包含的唯一的病毒DNA是其145bp的反向末端重復(fù)序列。由AAV載體攜帶的表達(dá)基因僅表達(dá)克隆基因本身。
先前已有報道證實AAV載體能夠?qū)⒒蛴行У剞D(zhuǎn)入肌肉中，并可實現(xiàn)長期的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。在本發(fā)明中，我們通過AAV載體將設(shè)計的腫瘤疫苗導(dǎo)入肌肉中。因此，我們測試了編碼lacZ報告基因的AAV載體在巨細(xì)胞啟動子的調(diào)控下將載體轉(zhuǎn)入肌肉的有效性，lacZ報告基因具有核定位信號區(qū)。以2.5％的阿弗丁皮下注射麻醉C57BL/6(H-2h)小鼠。30微升rAAV lacZ(3×1010病毒顆粒)經(jīng)皮注入小鼠后腿的脛骨前肌。兩周后，處死該鼠，肌肉組織進(jìn)行冷凍切片和染色，以X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)為底物進(jìn)行β-半乳糖苷酶活性的測定。圖2A示β-半乳糖苷酶在大部分的肌管中核染(箭頭所示)，顯示AAV載體有效的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，同時顯示AAV1表達(dá)效率明顯高于AAV2。
二.構(gòu)建和生產(chǎn)編碼整合到hsp DNA的E7 CTL抗原決定簇的重組腺相關(guān)病毒(rAAV)人乳頭瘤狀病毒(HPV)感染是引起子宮頸癌的原因之一，它攜帶三個轉(zhuǎn)化癌基因E5、E6和E7。它們的產(chǎn)物都是獨特的腫瘤抗原，因此可用于腫瘤疫苗。因為癌蛋白E6和E7始終存在和表達(dá)，E6和E7癌基因也就成為子宮頸癌的以T細(xì)胞為基礎(chǔ)的免疫治療的受矚目的靶基因。HPV抗原介導(dǎo)的子宮頸癌的免疫治療已被證實是有效的，因為不論是實驗性的還是自然的乳頭狀瘤病毒相關(guān)的腫瘤均可被E7抗原的免疫所控制。先前的研究已使用了多種不同的免疫法，如重組E7痘苗病毒或以E7進(jìn)行的同基因的細(xì)胞轉(zhuǎn)染等，這些研究都顯示了CTLs可能是最有效的免疫效應(yīng)機(jī)制。本發(fā)明采用人乳頭瘤狀病毒的HPV16和18型E7全序列基因，并將此二基因通過分子克隆手段融合，此融合蛋白表達(dá)一融合蛋白兼含HPV16和HPV18 E7蛋白。目前報道中相似的研究則使用該基因的部分序列，或者單獨使用E6和E7基因。
HPV-16 E7是一種轉(zhuǎn)化癌蛋白，所以蛋白疫苗就可能出現(xiàn)像轉(zhuǎn)化這樣的不可預(yù)見的危險性的副作用，所以我們對E7的結(jié)合位點進(jìn)行了點突變從而去除了其致癌性。以細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)抗原決定簇的多肽接種來防止腫瘤的生長是一種安全有效的免疫治療的方法。然而，多肽疫苗與有毒的佐劑結(jié)合，如不完全的Freund佐劑，有時也可因特異性的T細(xì)胞耐受而導(dǎo)致腫瘤的快速生長。最近，結(jié)核分枝桿菌熱休克蛋白70(hsp70)已被應(yīng)用于無佐劑的刺激對人全長的免疫缺陷病毒p24蛋白或與hsp共價相連的卵清蛋白產(chǎn)生體液和細(xì)胞應(yīng)答的載體。已有報道，分枝桿菌hsp作為一種佐劑也可通過卵清蛋白肽疫苗增強(qiáng)誘導(dǎo)細(xì)胞免疫。
含HPV-16 E7的44～62aa編碼序列的DNA片斷通過PCR來合成，其模板為HPV-16 E7/pCEP4質(zhì)粒，它包含有HPV-16的540～885位核苷酸序列。PCR中應(yīng)用的上游引物是5’-GATGGTgaattcATGCAAGCAGAACCG-3’，它不僅覆蓋了啟動子區(qū)域(黑體字)和HPV-16 E7的44～47aa編碼序列，在其5’末端還含有一個EcoRI的位點(小寫字母)。下游引物是5’-AAACCGAAGggatccGTCACACTTGCA-3’，在HPV-16 E7的62aa編碼序列之后含一個BamHI的位點(小寫字母)。
PKS70載體質(zhì)粒通過將結(jié)核桿菌hsp70基因亞克隆入pT7-7表達(dá)載體的BamHI和HindIII位點構(gòu)建而成，本質(zhì)粒由Richard A.Young饋贈。如上所述的E7抗原決定簇PCR產(chǎn)物被轉(zhuǎn)入pGEM-T載體(Promega，Madison，Wis.)以產(chǎn)生pGEM-T/E7CTL，然后再被亞克隆入pKS70的EcoRI和BamHI位點以產(chǎn)生pKS70/E7CTL-hsp。pKS70/E7CTL-hsp通過雙脫氧鏈終止法測序，HPV-16 E7的44～62aa編碼序列被證實在hsp70基因的框架內(nèi)。然后用EcoRI和HindIII消化pKS70/E7CTL-hsp質(zhì)粒以釋放E7CTL-hsp，再將它亞克隆入SK(+)載體(Stratagene)，并命名為pSK/E7CTL-hsp。從pSK/E7CTL-hsp上以SmaI和XhoI切下的DNA片斷被轉(zhuǎn)入pXX-UF1，后者含有綠色熒光蛋白基因，由人巨細(xì)胞病毒早期啟動子調(diào)控，其兩端是AAV145bp的反向末端重復(fù)序列。用PvuII和SalI消化pXX-UF1質(zhì)粒以去除綠色熒光蛋白基因，然后將E7CTL-hsp DNA片斷置于人巨細(xì)胞病毒早期啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控的下游，并命名為pXX/E7CTL-hsp。
rAAV E7CTL-hsp病毒載體依據(jù)先前所出版的共轉(zhuǎn)染的方法制備。簡要地說，每一個直徑15cm的細(xì)胞培養(yǎng)盤加入共49μg質(zhì)粒DNA(16μgpXX/E7CTL-hsp質(zhì)粒加上8μg編碼Rep和Cap蛋白的pXX2，以及25μg編碼腺病毒基因產(chǎn)物的pXX6)以磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48小時收獲80盤細(xì)胞，細(xì)胞混合物經(jīng)組織勻漿，CsCl加至終濃度為1.37g/ml。病毒顆粒再按照先前所出版的方法進(jìn)行CsCl密度梯度離心純化。rAAV E7CTL-hsp病毒顆粒的相對濃度由slot blot確定。該質(zhì)粒的滴度在1×1012～5×1012病毒顆粒/ml的范圍內(nèi)。
三.相關(guān)結(jié)果的分析1、AV載體介導(dǎo)的E7嵌合基因在293細(xì)胞中表達(dá)的免疫組化分析為了確定我們所設(shè)計構(gòu)建的16E718E7HSP 7 0基因能否通過AAV載體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，我們分別用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞和用病毒感染293細(xì)胞，分別在試驗后的48小時或24小時，用特異性抗體染色293細(xì)胞，從而檢測基因表達(dá)效果。圖1示16E718E7HSP7基因的表達(dá)結(jié)果。
2、以編碼16E718E7HSP70的rAAV進(jìn)行接種可預(yù)防腫瘤TC-1是E7表達(dá)的腫瘤細(xì)胞系。它來源于C57BL/6小鼠初級肺上皮細(xì)胞，由HPV-16 E6和E7實現(xiàn)其永生化，由激活的ras癌基因轉(zhuǎn)化。為了評估對已建立的腫瘤的預(yù)防效果，我們將每10只C57BL/6小鼠分為一組，我們先對小鼠接種rAAV病毒載體和磷酸鹽緩沖液對照肌肉注射，5周后，在其左側(cè)脅腹部皮下注射1×105TC-1細(xì)胞。觀察腫瘤形成情況并記錄腫瘤大小。圖3顯示，AAV 1-16E718E7HSP70和AAV 2-16E718E7HSP70均可以預(yù)防腫瘤的形成，同時AAV 1-16E718E7HSP70還可以100％抵抗TC-1細(xì)胞的第三次攻擊，而AAV 2-16E718E7HSP70則表現(xiàn)了較低的效率(70％)。
3、AAV16E718E7HSP70誘導(dǎo)針對E7的特異性免疫反應(yīng)B161是一種來自C57BL/6小鼠的黑色素瘤細(xì)胞系，被視為無E7表達(dá)的同基因的細(xì)胞。實驗小鼠接種AAV16E718E7HSP70或磷酸鹽緩沖液5周后，5周后5只免疫AAV1-1618E7hsp70和5只注射PBS的小鼠接種1×105TC-1細(xì)胞，而另外10只(5只免疫AAV1-1618E7hsp70和5只注射PBS)接種2×104B16-1細(xì)胞，每三天觀察成瘤情況并記錄腫瘤。結(jié)果如圖4所示。rAAV1618E7hsp70接種能預(yù)防E7表達(dá)細(xì)胞(TC-1)的腫瘤生長，但在非E7表達(dá)的細(xì)胞則無此效應(yīng)。
4、AAV16E718E7HSP70免疫小鼠的細(xì)胞免疫應(yīng)答為了闡明針對TC-1腫瘤的保護(hù)機(jī)制，我們需判斷在以編碼16E718E7HSP70的rAAV免疫的小鼠中是否誘導(dǎo)了CTL應(yīng)答。將用編碼16E718E7HSP70的rAAV1、rAAV2、rAAV lacZ和PBS免疫的C57BL/6小鼠的脾細(xì)胞分離，并在體外以合成的E7 49～57aa肽刺激，該短肽被認(rèn)為是CTL抗原決定簇。這些被刺激的脾細(xì)胞再進(jìn)一步經(jīng)測試，以識別和溶解51Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞包括TC-1。圖5顯示從接種rAAV16E718E7HSP70的小鼠分離的脾細(xì)胞能被E7 44～62肽刺激，但從接種rAAV lacZ的小鼠分離的脾細(xì)胞則不能。
以前，結(jié)核桿菌hsp70已被用作分子佐劑來刺激對人全長的免疫缺陷病毒p24蛋白或與hsp共價相連的卵清蛋白產(chǎn)生體液和細(xì)胞應(yīng)答的載體。hsp70能夠與共價相連的多肽融合進(jìn)入MHC I類和II類抗原呈遞途徑和引起CD8 CTLs的機(jī)制被認(rèn)為是(i)hsp70幫助蛋白質(zhì)折疊和促進(jìn)蛋白質(zhì)進(jìn)入到亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的能力，(ii)hsp促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)裂開的能力，(iii)較高的T細(xì)胞針對分支桿菌hsp70的頻率。我們的研究進(jìn)一步證實了hsp能夠充當(dāng)促進(jìn)E7肽抗原誘導(dǎo)針對含E7的腫瘤的CD4-和CD8-依賴的CTL反應(yīng)的佐劑。
5、AAV在疫苗中的應(yīng)用中的優(yōu)勢我們的研究表明AAV載體，所有的病毒編碼序列(96％的基因組)去除后，在腫瘤疫苗的應(yīng)用中表現(xiàn)出很好的應(yīng)用前景。表達(dá)HPV-16和-18的E6和E7蛋白的活重組病毒疫苗一期臨床實驗已在實施中。對基因治療來說，由于AAV載體不表達(dá)病毒基因，故其優(yōu)于其他用于疫苗的病毒載體，如痘苗病毒和腺病毒等。像裸DNA一樣，由AAV載體攜帶的表達(dá)基因僅表達(dá)克隆基因本身。用痘苗病毒或腺病毒做疫苗的載體在刺激免疫系統(tǒng)方面具有一些優(yōu)點，但與之相關(guān)的病毒感染的危險，特別是在免疫缺陷的病人，或許遠(yuǎn)遠(yuǎn)勝于這些優(yōu)點。另外，先前也有報道AAV載體并不會誘導(dǎo)針對被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，因而可以實現(xiàn)基因的持續(xù)表達(dá)。AAV載體介導(dǎo)的基因在骨骼肌中的表達(dá)已顯示可持續(xù)1.5年以上。雖然AAV載體能夠引起體液免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致在第二次給藥后出現(xiàn)活性的中和，但重復(fù)的給藥并不認(rèn)為是必然導(dǎo)致原來的被轉(zhuǎn)染細(xì)胞能逃過CTL反應(yīng)并持續(xù)較長時間。因此AAV在人的病毒免疫方面是很有用的。最近，有關(guān)單純皰疹病毒作為疫苗發(fā)展的研究顯示AAV介導(dǎo)的免疫能引起特異性的CTL和抗體應(yīng)答。因此，我們的研究提供了一種針對HPV誘導(dǎo)的腫瘤的有潛力的疫苗。
權(quán)利要求
1.一種子宮頸癌基因工程重組疫苗，采用目前致子宮頸癌病毒最流行血清型HPV 16和18型的主要致癌基因E7，將其中的RB結(jié)合位點進(jìn)行了點突變，去除其致癌性，然后將兩段基因進(jìn)行融合，在18E7的后邊加上了免疫增強(qiáng)因子結(jié)核桿菌熱休克蛋白并使之與16E718E7相融合，組成完整的疫苗基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所說的一種子宮頸癌基因工程重組疫苗，在載體的使用方面，(1)單一的質(zhì)粒，即是將上述基因HPV16E7、18E7HSP70克隆到質(zhì)粒載體PCl質(zhì)粒中，在提純質(zhì)粒后直接用于疫苗注射；(2)采用AAV作為載體，即將HPV16E718E7HSP70基因克隆到AAV載體UF1的NotI和SalI位點上，在輔助基因和包裝基因的輔助下，經(jīng)過磷酸鈣法轉(zhuǎn)染將DNA轉(zhuǎn)入293細(xì)胞中，完成重組AAV的生產(chǎn)后，再經(jīng)過HPLC或CsCl方法純化，再由病毒透析溶液透析，得到高純度的重組AAV病毒，即作為疫苗使用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所說的一種子宮頸癌基因工程重組疫苗，利用了hsp肽疫苗作為佐劑的安全性和AAV載體作為基因轉(zhuǎn)導(dǎo)載體，構(gòu)建了含有HPV-16 E7和HPV-18 E7 CTL抗原決定簇及hsp的嵌合基因的腫瘤疫苗。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所說的一種子宮頸癌基因工程重組疫苗，培養(yǎng)物結(jié)核分支桿菌休克蛋白70與人乳頭瘤病毒第16抗原表位和18抗原表位融合蛋白基因的重組腺相關(guān)病毒HSP70+HPVE16+E18/AAV，已保存中國典型培養(yǎng)物保藏中心。其保藏編號，CCTCCNOV200309。
全文摘要
一種子宮頸癌基因工程重組疫苗，本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)。它是一種建立在基因工程基礎(chǔ)上的，以AAV作為載體表達(dá)HPV16和18血清型的E7蛋白而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對HPV的特異免疫反應(yīng)，從而產(chǎn)生對子宮頸癌的預(yù)防和治療作用。由于本發(fā)明已經(jīng)對目的基因E7做了點突變，而同時將結(jié)核桿菌的熱敏感融合與目的基因相融合，加之所使用載體AAV，因此構(gòu)成了良好的免疫原，且可長期在體內(nèi)表達(dá)而無毒副作用。
文檔編號A61K48/00GK1616107SQ20041006078
公開日2005年5月18日 申請日期2004年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月31日
發(fā)明者肖嘯, 周立橋 申請人:肖嘯, 周立橋