專利名稱:人用雙價(jià)狂犬病純化疫苗及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及人用狂犬病疫苗及其生產(chǎn)方法。
背景技術(shù):
全球各地的狂犬病毒分為四個(gè)已知血清型(血清I-IV型)及二個(gè)尚待定的病毒株(EBL1、EBL2),同時(shí)根據(jù)分子生物學(xué)的基因分型,將其分為六個(gè)基因型,分別一一對(duì)應(yīng)六個(gè)血清型,狂犬病毒的基因測(cè)序表明各病毒株之間的核蛋白(N)基因有高度保守性,同源性在98%-99.6%。而糖蛋白(G)基因相差較大,同源性一般在82%-90%。
在我國(guó)分離的一些狂犬病野毒株和實(shí)驗(yàn)室的固定毒也進(jìn)行過(guò)G基因的序列分析和比較,結(jié)果表明野毒株間和野毒株與固定毒或生產(chǎn)疫苗用毒株間均存在一定差異,如核酸和蛋白水平的同源性,上海分離株與廣西分離株分別為93.1%和87.7%,與生產(chǎn)用aG株分別為88.5%和85.8%。二株寧夏分離株之間的核酸同源性較高為99.9%,氨基酸同源性為99.6%,但與aG株的同源性只有81.9%和90.5%,但與分離時(shí)間較短的CTN株的同源性則較高,分別為85.9%和92.4%。聚類分析可以將二株寧夏人分離株,一株廣西犬毒株和CTN歸于一類,而aG株和國(guó)外其他固定毒株(包括CVS株)歸在另一類。
各固定毒株G的氨基酸的同源性有差異,同源性最低的是aG/CVS為87%和SADB19/CVS為88.2%,同源性最高的是SADB19/ERA為99.4%,其他毒株之間的同源性在此范圍內(nèi)。而狂犬病毒糖蛋白(G)是狂犬病毒唯一能誘生宿主產(chǎn)生中和抗體的蛋白,它也能有效地刺激T淋巴細(xì)胞的增生。
自然界的狂犬病毒抗原性是不完全相同的,據(jù)武漢生物制品研究所收集到的我國(guó)各地區(qū)的狂犬病毒街毒株,將其病毒滴度調(diào)至同一個(gè)水平,經(jīng)甲醛滅活后再免疫小鼠,結(jié)果誘生的中和抗體效價(jià)不同,其誘生的抗體對(duì)其他病毒的中和活力不同,免疫小鼠的保護(hù)力也不同(朱家鴻、中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志,1997,11;14)。同時(shí)1995年Kissi等報(bào)道,傳統(tǒng)的狂犬病疫苗免疫的小鼠用死亡病人中分離的街毒攻擊,部分小鼠不被保護(hù)而導(dǎo)致死亡,表明狂犬病毒街毒株與疫苗株之間的抗原性有變異。其自然界的狂犬病毒抗原性也在不斷變異,無(wú)論是糖蛋白G還是核蛋白N。
狂犬病疫苗是目前預(yù)防狂犬病發(fā)生唯一有效的藥品,我國(guó)及全球當(dāng)今使用的狂犬病疫苗多為組織細(xì)胞培養(yǎng)疫苗,其生產(chǎn)工藝已經(jīng)接近成熟,只是不同的生產(chǎn)廠家所使用的毒種不同,且其所使用的都為單一毒株,正是由于不同的單一毒種其所制備的疫苗免疫后所產(chǎn)生的中和抗體對(duì)于侵入人體的病毒的親合性有一定的差異,所以其免疫效果不盡相同,其免疫結(jié)果也不盡人意。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種人用雙價(jià)狂犬病純化疫苗,它含有由毒種aG株及CTN株兩種單一毒株分別按常規(guī)方法制備的狂犬病純化疫苗原液,以及保護(hù)劑。
所說(shuō)的保護(hù)劑有人血白蛋白、蔗糖、明膠、甘露醇、乳糖等。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種人用雙價(jià)狂犬病純化疫苗的生產(chǎn)方法,包括以下步驟(1)用aG株及CTN株兩種單一毒株分別按常規(guī)方法制備疫苗原液;(2)將兩種疫苗原液按一定的比例進(jìn)行混合;、(3)將混勻后的疫苗按液體劑型疫苗和凍干劑型疫苗進(jìn)行分裝;(4)將分裝后的產(chǎn)品經(jīng)成品檢定后進(jìn)行包裝,即得到所需的人用狂犬病雙價(jià)純化疫苗。
所說(shuō)的兩種疫苗原液按抗原含量的混合比例為含有aG株的狂犬病純化疫苗原液∶含有CTN株的狂犬病純化疫苗原液=1∶1。
本發(fā)明的生產(chǎn)方法,前期利用我國(guó)目前所使用的兩株毒種aG株及CTN株,分別生產(chǎn)狂犬病純化疫苗原液,其生產(chǎn)工藝與現(xiàn)有生產(chǎn)工藝一樣,后期按所含抗原量一定比例(1∶1)進(jìn)行抗原混合,得到人用雙價(jià)狂犬病純化疫苗,從而盡可能增加抗原的覆蓋范圍。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明實(shí)施例兩種單一毒株疫苗原液的制造工藝如下毒種庫(kù)(aG、CTN)的建立,根據(jù)國(guó)家GMP管理規(guī)范,分別建立毒株的原始種子庫(kù)、主種子庫(kù)及工作種子庫(kù),細(xì)胞庫(kù)(Vero細(xì)胞)的建立也是根據(jù)國(guó)家GMP管理規(guī)范,建立原始種子庫(kù)、主種子庫(kù)和工作種子庫(kù),也可只建立主種子庫(kù)和工作種子庫(kù)的兩級(jí)種子庫(kù)。原液制備時(shí),先自細(xì)胞工作種子庫(kù)中取出一支細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇,然后進(jìn)行細(xì)胞傳代,然后用取自工作種子庫(kù)的毒種對(duì)細(xì)胞進(jìn)行種毒。種毒后置33℃-35℃培養(yǎng)5-7天,收取病毒原液,可連續(xù)收取三次,對(duì)收取的病毒原液進(jìn)行病毒滅活然后超濾濃縮,再進(jìn)行4000轉(zhuǎn)離心30分鐘去除細(xì)胞碎片,最后進(jìn)行Sepharose分子篩柱層析獲得純化后的抗原,取樣進(jìn)行半成品檢定,補(bǔ)加保護(hù)劑(液體劑型疫苗為人血白蛋白、凍干劑型疫苗為人血白蛋白及蔗糖與明膠)。進(jìn)行半成品檢定后的兩種疫苗原液按抗原含量1∶1的比例進(jìn)行混合,然后對(duì)于混勻后的疫苗按兩種劑型進(jìn)行分裝液體劑型疫苗每劑1ml、凍干劑型疫苗每劑0.5ml,分裝后的產(chǎn)品進(jìn)行成品檢定,對(duì)于合格的產(chǎn)品進(jìn)行包裝,即得到所需的人用雙價(jià)狂犬病純化疫苗。
液體劑型疫苗的效期為一年,凍干劑型疫苗的效期為二年,其產(chǎn)品的免疫方式及免疫程序?yàn)楸┞肚叭樏庖?0、7、21)暴露后五針免疫(0、3、7、14、28),免疫部位為上臂三角肌,兒童可注射大腿外側(cè)肌肉。
用上述生產(chǎn)方法制成的產(chǎn)品進(jìn)行了一系列的與單一毒株制品的小鼠對(duì)照實(shí)驗(yàn),其結(jié)果如下1、不同的病毒原液攻擊小白鼠結(jié)果
2、效力試驗(yàn)中小白鼠抗體檢測(cè)
3、相同抗原量(80μg/ml)不同疫苗的的中和效價(jià)試驗(yàn)
4、相同效力疫苗的中和效價(jià)試驗(yàn)
上述一系列實(shí)驗(yàn)說(shuō)明即使小鼠產(chǎn)生100%的中和抗體,但在用不同的毒株進(jìn)行效力檢定時(shí),不同的疫苗所保護(hù)的小鼠的數(shù)量有一定的差異,但可以看出本發(fā)明產(chǎn)品的效力測(cè)定是最高的,其效果是明顯的,因此本發(fā)明產(chǎn)品雖是在國(guó)內(nèi)目前廣泛使用的狂犬病疫苗生產(chǎn)的基礎(chǔ)之上,進(jìn)行兩種疫苗的混合,但其從目前的技術(shù)上解決了不同的單一毒株所誘生的中和抗體效價(jià)不同,其誘生的抗體對(duì)其他病毒的中和活力不同,免疫后的保護(hù)力也不同的狀況。其效果是明顯的,將在狂犬病的防治中起到重要的作用。
權(quán)利要求
1.一種人用雙價(jià)狂犬病純化疫苗,其特征是含有由毒種aG株及CTN株兩種單一毒株分別按常規(guī)方法制備的狂犬病純化疫苗原液,以及保護(hù)劑。
2.按權(quán)利要求1所述的一種人用雙價(jià)狂犬病純化疫苗,其特征是所說(shuō)的保護(hù)劑有人血白蛋白、蔗糖、明膠、甘露醇、乳糖等。
3.按權(quán)利要求1所述的一種人用雙價(jià)狂犬病純化疫苗的生產(chǎn)方法,其特征是包括以下步驟(1)用aG株及CTN株兩種單一毒株分別按常規(guī)方法制備疫苗原液;(2)將兩種疫苗原液按按抗原含量的一定比例進(jìn)行混合;(3)將混勻后的疫苗按液體劑型疫苗和凍干劑型疫苗進(jìn)行分裝;(4)將分裝后的產(chǎn)品經(jīng)成品檢定后進(jìn)行包裝,即得到所需的人用雙價(jià)狂犬病純化疫苗。
4.按權(quán)利要求所述3的一種人用雙價(jià)狂犬病純化疫苗的生產(chǎn)方法,其特征所說(shuō)的兩種疫苗原液按抗原含量的混合比例為含有aG株的狂犬病純化疫苗原液∶含有CTN株的狂犬病純化疫苗原液=1∶1。
全文摘要
本發(fā)明涉及人用狂犬病疫苗及其生產(chǎn)方法,主要解決現(xiàn)有的由單一毒種生產(chǎn)的疫苗免疫后所產(chǎn)生的中和抗體對(duì)于侵入人體的病毒的親合性有一定的差異,導(dǎo)致免疫效果不盡相同,免疫結(jié)果不盡人意的缺點(diǎn)。本發(fā)明的產(chǎn)品含有由毒種aG株及CTN株兩種單一毒株分別按常規(guī)方法制備的狂犬病純化疫苗原液,以及保護(hù)劑。本發(fā)明的生產(chǎn)方法包括(1)用aG株及CTN株兩種單一毒株分別按常規(guī)方法制備疫苗原液;(2)將兩種疫苗原液按一定的比例進(jìn)行混合;(3)將混勻后的疫苗按液體劑型疫苗和凍干劑型疫苗進(jìn)行分裝;(4)將分裝后的產(chǎn)品經(jīng)成品檢定后進(jìn)行包裝,即得到所需的人用雙價(jià)狂犬病純化疫苗。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1745849SQ20041006081
公開(kāi)日2006年3月15日 申請(qǐng)日期2004年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月9日
發(fā)明者楊曉明, 孫文, 劉俊生, 盧穎, 秦莉 申請(qǐng)人:武漢生物制品研究所